CN102596994A - 具有改进的可产生性的变体免疫球蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫球蛋白分子的氨基酸序列在易于聚集的VH和VL FR和CDR3结构域和/或CH1结构域区中某些关键位置的修饰。按所述而修饰的免疫球蛋白可以表现出改进的可产生性，例如，降低的聚集倾向和/或增加的产生水平。

Description

具有改进的可产生性的变体免疫球蛋白
本发明涉及抗体分子的表达，并且具体而言，涉及具有改进的可产生性的抗体分子的制备。
术语“聚集”描述了多种现象，所有现象都涉及蛋白自缔合，能在多种环境中发生，从细胞培养和发酵至分离、纯化和制备过程中都能发生。例如，描述以下情况时通常使用“聚集”：包涵体的形成；细胞分级分离后“不溶”部分中的蛋白累积；样品中出现浑浊、蛋白沉淀或形成颗粒；或者小的可溶寡聚物的形成等等。在本文中，蛋白聚集理解为多肽链的“异常自缔合”，并且可以具有多种起因和表现，这主要取决于参与的分子的性质和产生、分离、保存和给予多肽的环境。
多肽的三维结构决定了其天然的生理功能。蛋白通常是在核糖体中合成后获得其天然结构。蛋白折叠的加工在根本上编码于蛋白的氨基酸序列中。然而，多种能确保多肽获得其预期的生物活性结构的分子辅助物和质量控制机制也能在体内帮助折叠，从而在加工中避免异常构象的群体。这些外部辅助物和质量控制元件包括分子伴侣、二硫键异构酶、翻译后修饰(即蛋白水解过程、酰化作用、糖基化等)以及泛素-蛋白酶体系统。
此外，蛋白聚集由溶液中蛋白的内在稳定性来驱动。蛋白在溶液中仅是低度稳定的，并且这种相对低的稳定性在赋予特定生物学性质同时提供良好的调节机制来控制其作用中是很重要的。然而，例如，为了将多肽开发为药物而使其脱离于其天然环境在多肽的产生、分离和配制中造成多种严格限制，这会对多肽的稳定性和聚集行为产生巨大影响。
对于指定蛋白的天然环境的改变，特别是由于特定的产生或工艺要求而导致的改变，会对蛋白的和溶液中的稳定性产生巨大影响。为了增加收率的工艺要求加重了这个问题，所述工艺要求例如：人工合成、异源表达(即哺乳动物蛋白的原核表达)、使用的是分泌途径还是非分泌途径、蛋白合成结构的饱和；或诸如多肽片段或融合体的非天然蛋白造成的其它障碍。例如，哺乳动物蛋白在异源系统中的表达会造成很多风险。这是由于该系统通常缺少合适的分子环境来保证“天然”折叠和加工这一事实造成的。
本发明涉及以下发现：修饰免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的某些关键位置会带来可产生性的改进，并且具体而言能使聚集倾向降低和/或增加产生水平。
本发明的一方面提供产生变体免疫球蛋白的方法，包括：
提供母体免疫球蛋白，
在所述母体免疫球蛋白的VL结构域框架区和/或VL CDR3的聚集倾向区段引入取代；和/或，
在VH框架区和/或VH CDR3的聚集倾向区段中引入取代；和/或
在所述母体免疫球蛋白重链(CH)的CH1恒定区结构域的聚集倾向区段中引入取代，
从而产生变体免疫球蛋白。
所述变体免疫球蛋白相对于所述母体免疫球蛋白可以具有改进的可产生性。例如，相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白在表达时可以表现出降低的聚集倾向和/或增加的产生能力。
例如，相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出产生能力增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％，和/或相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出聚集降低(即，天然状态组装中发生聚集的分子的比例的降低)至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少90％或至少99％。相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出聚集降低高达100％(即完全消除聚集)。
可产生性的改进可以完全地或部分地来自于相对于母体免疫球蛋白的降低的聚集倾向。
聚集倾向涉及免疫球蛋白在重组系统中表达后形成不溶聚集物的倾向。聚集倾向的降低能减少免疫球蛋白的天然状态系综中以聚集形式存在的分子的比例(Carpenter et al，2009 J Pharm Sci.Apr；98(4)：1201-5)。换言之，变体免疫球蛋白的天然状态系综中以聚集或不溶形式存在的分子的比例低于母体免疫球蛋白的天然状态系综中以聚集或不溶形式存在的分子的比例。
在天然条件下或在增加的温度下(例如60℃)(即免疫球蛋白的抗原结合位点不会展开的条件)，与母体免疫球蛋白相比，变体免疫球蛋白可以表现出较少的自缔合或聚集。优选地，在天然条件下(例如不会导致免疫球蛋白展开的条件)，变体免疫球蛋白表现出的自缔合或聚集少于母体免疫球蛋白。
本文所述的聚集倾向不同于热学再折叠效率(TRE)，热学再折叠效率涉及蛋白在热变性后正确再折叠的能力，并且通常利用圆二色性(CD)进行测定(Tanha et al Protein Eng Des Sel.2006 Nov；19(11)：503-9)。本文所述的免疫球蛋白的聚集倾向的降低对免疫球蛋白的热学再折叠效率可以具有很小影响或没有影响。因此，热学再折叠效率与聚集倾向无关，并且对免疫球蛋白的可产生性没有显著影响。
可以通过常规方法测定聚集。合适的技术包括GP-HPLC、HPLC和AUC(Gabrielson JP et al J Pharm Sci 200796(2)：268-79)，过滤后的蛋白丢失、浊度、荧光染料结合(例如尼尔红、硫磺素T或8-苯胺基-1-萘磺酸；参见，例如Hawe，A.et al Pharmaceutical Research 2008 25(7)1487-99或Demeule，B et al 2007 Int J Pharm 329：37-45)、场流分离(FFF；Demeule，Bet al.mAbs 20091(2)：142-150)和分析超离心(AU/AUC；Liu J et al.AAPS J2006 8：580-9)。
其它合适的方法描述于Arvinte T.In“Methods for structural analysisof protein pharmaceuticals”AAPS Press，2005：661-6和Kiese S et al J PharmSci 2008 97(10)：4347-66。
可产生性的改进可以完全地或部分地来自于相对于母体免疫球蛋白的增加的产生能力。
变体免疫球蛋白表现出的产生能力可以高于母体免疫球蛋白。例如，当在重组系统例如细菌或哺乳动物细胞中表达时，与母体免疫球蛋白相比，变体免疫球蛋白可以表现出增加的收率或滴度。可以利用标准技术测定产生能力，例如Bradford测定、分光光度法和ELISA。
相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白还可以表现出一种或多种下述性质：改进的纯化收率、降低的配置难度、降低的免疫原性和增加的生物利用度。
在优选实施方案中，可产生性的改进可以来自于相对于母体免疫球蛋白的降低的聚集倾向和增加的产生能力两者。
优选地，变体免疫球蛋白与母体免疫球蛋白表现出相同或基本上相同活性(即抗原结合活性)。
免疫球蛋白是包含抗原结合位点的多肽或蛋白。抗原结合位点是免疫球蛋白中与抗原的部分或全部特异性地结合并在空间上互补的部分。当抗原较大时，免疫球蛋白可以仅结合抗原的某一部分，该部分称为表位。优选地，抗原结合结构域包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)和免疫球蛋白重链可变区(VH)，它们可以在相同或不同的多肽链上。
免疫球蛋白的实例包括完整抗体，包括抗体同种型，例如IgG、IgA、IgD、IgM和IgE以及它们的同型亚类，例如IgG1和IgG4；抗体片段；以及工程化抗体衍生物，例如小免疫蛋白(SIP)、小型化抗体、骆驼VHH结构域和双链抗体。
抗体片段的实例包括(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward，E.S.et al.，Nature 341，544-546(1989))，其由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，其是包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接物连接，所述肽连接物允许两个结构域相联而形成抗原结合位点(Bird et al，Science，242，423-426，1988；Huston et al，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚物(PCT/US92/09965)和(ix)“双链抗体”，其是通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993)。可以通过引入连接VH和VL结构域的二硫键而使Fv、scFv或双链抗体分子稳定化(Y.Reiter et al.Nature Biotech 141239-1245 1996)。也可以制备包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(S.Hu et al，Cancer Res.56 3055-3061 1996)。
免疫球蛋白可以是天然的或完全合成的或部分合成的。因此也可以包括嵌合免疫球蛋白，其包含与另一多肽融合的抗原结合结构域或等同物。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023。已经对包含一个或多个抗原结合位点的各种人工免疫球蛋白进行了工程化，包括例如Fab2、Fab3、双链抗体、三链抗体、四链抗体和微型抗体。
在一些优选实施方案中，本文所述的母体和变体免疫球蛋白是完整抗体或包含VH和VL结构域的抗体片段。
可以通过从天然来源中纯化来分离或获得免疫球蛋白，或也可以如本文所述，通过基因重组或化学合成来获得免疫球蛋白。例如，通过借助于在合适的表达载体中合成并组装的寡核苷酸而产生的基因的表达可以产生合成免疫球蛋白，正如Knappik et al.J.Mol.Biol.(2000)296，57-86或Krebs et al.Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84所述。
免疫球蛋白可以是天然糖基化的，或体外或离体糖基化的，例如，利用异源真核细胞系统(例如CHO细胞)，或免疫球蛋白可以是未糖基化的(例如，当通过原核细胞中的表达而产生时)。优选地，糖基化的免疫球蛋白不包含岩藻糖。
合适的母体免疫球蛋白可以是具有已知氨基酸序列，并且可以通过异源表达系统中的重组表达而产生的任何免疫球蛋白。异源表达系统包括诸如CHO细胞的哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞(例如大肠杆菌，特别是对于抗体片段而言)，并且在下文中有更详细的描述。
适于如本文所述进行修饰的母体免疫球蛋白可以表现出次优的可产生性。换言之，母体免疫球蛋白可以表现出一个或多个不希望的产生性状，例如当以生产规模在异源系统中重组表达时，相对于对照免疫球蛋白的增加的聚集和/或降低的产生能力。
合适的对照免疫球蛋白包括在相同异源系统中表现出令人满意的可产生性的相同类型的免疫球蛋白。当以生产规模在哺乳动物系统中表达时，合适的母体免疫球蛋白可以，例如，产生1g/L或更小的可溶物质收率(通过ELISA测定)，和/或5％或更高的聚集(通过GP-HPLC测定)。当以生产规模在细菌系统中表达时，母体免疫球蛋白可以，例如，产生0.5g/L或更小的可溶物质收率(通过ELISA测定)，和/或5％或更高的聚集(通过GP-HPLC测定)。
方法可以包括测定母体免疫球蛋白的可产生性，例如通过测定本文所述的产生水平和聚集倾向。产生低收率(例如哺乳动物系统中1g/L或更少的可溶物质)和/或高聚集倾向(例如5％或更高的聚集)的母体免疫球蛋白可以被鉴定为表现出次优的可产生性。
本文所述的母体免疫球蛋白序列的修饰可以用于增加或优化其可产生性。
在优选实施方案中，母体免疫球蛋白可以是治疗性抗体，即，能结合治疗相关抗原而实现有益治疗效果的抗体。治疗性抗体的很多实例是本领域已知的。
变体免疫球蛋白是非天然存在的免疫球蛋白，其与母体免疫球蛋白结合相同的靶抗原，但具有不同的氨基酸序列。例如，相对于母体免疫球蛋白的序列，变体免疫球蛋白的序列可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基的不同。优选地，如本文所述，变体免疫球蛋白的序列与母体免疫球蛋白序列的不同之处仅在于聚集倾向区段中的一处或多处取代。换言之，除了本文所述的一处或多处取代，变体免疫球蛋白的序列优选与母体免疫球蛋白的氨基酸序列是相同的。
变体免疫球蛋白与母体免疫球蛋白结合相同的表位，并且与母体免疫球蛋白竞争结合抗原。可以容易地体外测定免疫球蛋白之间的竞争，例如，利用ELISA和/或通过将特异性报告分子标签添加于一种免疫球蛋白，从而在存在其它无标签的免疫球蛋白的情况下，可以检测到这种免疫球蛋白。当母体免疫球蛋白是治疗性抗体时，变体免疫球蛋白优选能实现相同的有益治疗效果。
本文所述的免疫球蛋白的抗原结合结构域优选包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。免疫球蛋白VH和VL结构域中的每一个都包含3个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)，其被框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)分隔开。CDR是可变结构域中的高度可变区，其含有大部分负责抗体与其识别的抗原或表位的特异性结合的氨基酸残基。CDR的长度可以为2-26个氨基酸，这取决于具体基础框架所能容纳的长度。
优选地，如本文所述使用的免疫球蛋白缺少CDR内或CDR间的二硫键。
适合如本文所述使用的母体免疫球蛋白CH1、VH和VL结构域可以获自任何种系或重新排列的人的可变结构域，或可以是基于已知的人的可变结构域的共有序列的合成可变结构域。在一些实施方案中，产生的变体免疫球蛋白的VH和VL结构域可以缺少一个或多个CDR序列(例如CDR3)，例如为了如下文所述用于抗体工程化。
变体免疫球蛋白可以表现出改进的可产生性，例如，当以生产规模在异源系统中重组表达时，相对于母体免疫球蛋白的降低的聚集和/或增加的产生能力。当以生产规模在哺乳动物系统中表达时，变体免疫球蛋白可以，例如，产生大于1g/L的可溶物质收率(通过ELISA测定)，和/或少于5％的聚集(通过GP-HPLC测定)。优选地，本文所述的变体免疫球蛋白同时产生大于1g/L的可溶物质收率和表现出少于5％的聚集。当以生产规模在细菌系统中表达时，变体免疫球蛋白可以，例如，产生大于0.5g/L的可溶物质收率(通过ELISA测定)，和/或少于5％的聚集(通过GP-HPLC测定)。优选地，本文所述的变体免疫球蛋白同时产生大于0.5g/L的可溶物质收率和表现出少于5％的聚集。
聚集倾向区段是免疫球蛋白的轻链或重链序列中的短氨基酸残基序列，所述短氨基酸残基序列相对于周围序列具有高的聚集倾向并且对免疫球蛋白的可产生性产生不利影响。聚集倾向区段可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基组成。
聚集倾向区段可以，例如，位于免疫球蛋白的CH1、VH或VL结构域中。免疫球蛋白的单个结构域或区，例如来自VH或VL结构域或CH1结构域的FR1、FR2、FR3、FR4或CDR3区，在其序列内可以具有多个聚集倾向区段。一个或多个本文所述的这些聚集倾向区段中的一处或多处残基取代可以改进本文所述的免疫球蛋白的可产生性。
下文所述的免疫球蛋白残基位置是按照下述资料中所示的方案进行编号：Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesmann，K.S & Foeller，C.(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目的蛋白的序列)，第5版，NIH出版号91-3242，美国健康和人类服务部。
在合适的情况下，取代位置可以相对于免疫球蛋白序列中未变异的Kabat编号残基进行描述。
备选抗体编号方案描述于Honegger，A and Plückthun A.(2001)。免疫球蛋白可变结构域的另一编号方案：An Automatic Modelling and AnalysisTool.J.Mol.Biol 309，657-670。表1a和1b显示了Honegger和Kabat编号方案之间的对应情况。
本文所述的聚集倾向区段中的氨基酸取代优选是20种天然存在的氨基酸中的一种。天然存在的氨基酸以及它们的标准单字母和三字母缩写是本领域公知的(Principles of Protein Structure G.Schulz & R.Schirmer，(1979)Springer-Verlag NY Inc USA)。
可以在母体免疫球蛋白的VL结构域框架区的聚集倾向区段中引入取代。VL结构域框架区的合适的聚集倾向区段可以选自第20位聚集倾向区段、第37位聚集倾向区段、第45位聚集倾向区段和第74位聚集倾向区段。
第20位聚集倾向区段位于VL框架区1中，并且从VL结构域的第15位延伸至第23位。
第20位聚集倾向区段中的取代可以发生在VL结构域的第18位。
母体免疫球蛋白中第18位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第18位的残基被取代为R、S或V。
例如，母体免疫球蛋白中第18位的氨基酸残基可以是T。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域中包含T18R、T18S或T18V取代。
第20位聚集倾向区段中的取代可以发生在VL结构域的第20位。
母体免疫球蛋白中第20位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第20位的残基被取代为K、R、S或V。
例如，母体免疫球蛋白中第20位的氨基酸残基可以是T。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域中包含T20K、T20R、T20S或T20V取代。
第37位聚集倾向区段位于VL框架区2中，并且从VL结构域的第36位延伸至第38位。
第37位聚集倾向区段中的取代可以发生在第37位。
母体免疫球蛋白中第37位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第37位的残基被取代为Q或N。
例如，母体免疫球蛋白中第37位的氨基酸残基可以是L。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含L37Q取代。
第45位聚集倾向区段位于VL框架区2中，并且从VL结构域的第42位延伸至第49位。
第45位聚集倾向区段中的取代可以发生在第45位。
母体免疫球蛋白中第45位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第45位的残基被取代为E、K、R、Q或V。
例如，母体免疫球蛋白中第45位的氨基酸残基可以是T。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含T45E、T45K、T45R、T45Q或T45V取代。母体免疫球蛋白中第45位的氨基酸残基可以是Q。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含Q45E、Q45K或Q45R取代。
第45位聚集倾向区段中的取代可以发生在第46位。
母体免疫球蛋白中第46位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第46位的残基被取代为L、Y、K、R、H、F或S。
例如，母体免疫球蛋白中第46位的氨基酸残基可以是T。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含T46L或T46Y取代。母体免疫球蛋白中第46位的氨基酸残基可以是L。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含L46K、L46R、L46H、L46F或L46S取代。
第74位聚集倾向区段位于VL框架区3中，并且从VL结构域的第71位延伸至第77位。
第74位聚集倾向区段中的取代可以发生在第74位。
母体免疫球蛋白中第74位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第74位的残基被取代为V。
例如，母体免疫球蛋白中第74位的氨基酸残基可以是T。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含T74V取代。
可以在母体免疫球蛋白的VL CDR3中的聚集倾向区段中引入取代。合适的聚集倾向区段可以选自VL CDR3 N末端聚集倾向区段和VLCDR3 C末端聚集倾向区段。
VL CDR3 N末端聚集倾向区段从VL结构域序列中的非变体残基C88延伸至残基C88C末端的第8位氨基酸。例如，VL CDR3 N末端聚集倾向区段可以从VL结构域的第88位延伸至第95a位。
母体免疫球蛋白中第88位(C88)、第89位(C88+1；即残基C88C末端的一个残基)、第90位(C88+2)、第91位(C88+3)、第92位(C88+4)、第93位(C88+5)、第94位(C88+6)、第95位(C88+7)和第95a位(C88+8)中的一个或多个氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。相对于非变体Kabat残基C88进行编号的VL CDR3位置显示在括号中。
VL CDR3 N末端聚集倾向区段中的取代可以发生在第91位(C88+3)。
母体免疫球蛋白中第91位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第91位的残基被取代为A、F、L、R、S或W。例如，母体免疫球蛋白中第91位的氨基酸残基可以是Y。变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含Y91A、Y91F、Y91L、Y91R、Y91S或Y91W取代。
VL CDR3 N末端聚集倾向区段中的取代可以发生在第93位(C88+5)。
母体免疫球蛋白中第93位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第93位的残基被取代为D、F、L、Q、S、T、W或Y。例如，母体免疫球蛋白中第93位的氨基酸残基可以是P，并且变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含P93D、P93F、P93L、P93Q、P93S、P93T、P93W或P93Y取代。
VL CDR3 C末端聚集倾向区段从所述VL结构域序列中非变体残基F98的N末端第3位氨基酸(即第F98-3位或第95位)延伸至第99位。
母体免疫球蛋白中第95位(F98-3)、第96位(F98-2)、第97位(F98-1)、第98位或第99位中的一个或多个氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。
VL CDR3 C末端聚集倾向区段中的取代可以发生在第96位(F98-2)。相对于变体Kabat残基F98进行编号的VL CDR3位置显示在括号中。
母体免疫球蛋白中第96位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第96位的残基被取代为E、L、V或W。
例如，母体免疫球蛋白中第96位的氨基酸残基可以是R，并且变体免疫球蛋白可以包含的VL结构域包含R96E、R96L、R96V或R96W取代。
可以在母体免疫球蛋白的VH结构域框架区中的聚集倾向区段引入取代。VH结构域框架区的合适的聚集倾向区段可以选自FR1聚集倾向区段、第75位聚集倾向区段、第95位聚集倾向区段、以及第102位聚集倾向区段(或CDR3聚集倾向区段)。
FR1聚集倾向区段位于VH框架区1中，并且可以，例如从VH结构域序列的第1位延伸至第21位。
VH FR1聚集倾向区段可以包含选自第1位至第3位、第4位至第6位、第11位至第13位和第16位至第21位的聚集倾向区段。
VH FR1聚集倾向区段可以从VH结构域序列的第1位延伸至第3位。
VH FR1聚集倾向区段中的取代可以发生在第1位。
母体免疫球蛋白中第1位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第1位的残基被取代为E、Q、D、A或V。例如，母体免疫球蛋白中第1位的氨基酸残基可以是E，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含E1Q、E1D、E1A或E1V取代；或母体免疫球蛋白中第1位的氨基酸残基可以是Q，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含Q1E、Q1D、Q1A或Q1V取代。
VH FR1聚集倾向区段可以从VH结构域序列的第4位延伸至第6位。
VH FR1聚集倾向区段中的取代可以发生在VH结构域的第5位。
母体免疫球蛋白中第5位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第5位的残基被取代为V。例如，母体免疫球蛋白中第5位的氨基酸残基可以是L，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含L5V取代。
VH FR1聚集倾向区段可以从VH结构域序列的第11位延伸至第13位。
VH FR1聚集倾向区段中的取代可以发生在VH结构域的第12位。
母体免疫球蛋白中第12位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第12位的残基被取代为V。例如，母体免疫球蛋白中第12位的氨基酸残基可以是L，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含L12V取代。
VH FR1聚集倾向区段可以从VH结构域序列的第16位延伸至第21位。
VH FR1聚集倾向区段中的取代可以发生在第17位。
母体免疫球蛋白中第17位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第17位的残基被取代为R。例如，母体免疫球蛋白中第17位的氨基酸残基可以是G，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含G17R取代。
VH FR1聚集倾向区段中的取代可以发生在第19位。
母体免疫球蛋白中第19位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第19位的残基被取代为T或V。例如，母体免疫球蛋白中第19位的氨基酸残基可以是L，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含L19T或L19V取代。
VH FR1聚集倾向区段中的取代可以发生在第20位。
母体免疫球蛋白中第20位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第20位的残基被取代为A、K、S或T。例如，母体免疫球蛋白中第20位的氨基酸残基可以是R，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含R20A、R20K、R20S或R20T取代。
第75位聚集倾向区段可以从VH结构域的第60位延伸至第85位。
第75位聚集倾向区段中的取代可以发生在第61位。
母体免疫球蛋白中第61位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。例如，第61位的残基可以被取代为K、R、Q、E、D、N或A。优选地，第61位的残基被取代为R。例如，母体免疫球蛋白中第61位的氨基酸残基可以是P，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含P61R取代。
第75位聚集倾向区段中的取代可以发生在第85位。
母体免疫球蛋白中第85位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。例如，第85位的残基可以被取代为E、D或A。优选地，第85位的残基被取代为E。例如，母体免疫球蛋白中第85位的氨基酸残基可以是V，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含V85E、V85D或V85A取代。
VH第95位聚集倾向区段位于VH框架区3中，并且可以从第91位延伸至第99位或第100位。
母体免疫球蛋白的VH结构域中第91位、第92位、第93位、第94位、第95位、第96位、第97位、第98位、第99位和/或第100位中的一个或多个氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。
VH第95位聚集倾向区段中的取代可以发生在第94位。
母体免疫球蛋白中第94位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。例如，第94位的残基可以被取代为R、K或T。优选地，第94位的残基被取代为R。例如，母体免疫球蛋白中第94位的氨基酸残基可以是K，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含K94R取代，或母体免疫球蛋白中第94位的氨基酸残基可以是H，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含H94R、H94K或H94T取代。
VH第95位聚集倾向区段中的取代可以发生在第95位。
母体免疫球蛋白中第95位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。例如，第95位的残基可以被取代为E或D。优选地，第95位的残基被取代为D。例如，母体免疫球蛋白中第95位的氨基酸残基可以是R，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含R95E或R95D取代。
VH第95位聚集倾向区段中的取代可以发生在第96位。
母体免疫球蛋白中第96位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第96位的残基被取代为A。例如，母体免疫球蛋白中第96位的氨基酸残基可以是G，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含G96A取代。
VH第95位聚集倾向区段中的取代可以发生在第100位。
母体免疫球蛋白中第100位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。第100位的残基可以被取代为F、G、L、M或P。优选地，第100位的残基被取代为F。例如，母体免疫球蛋白中第100位的氨基酸残基可以是V，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含V100F、V100G、V100L、V100M或V100P取代。
可以在母体免疫球蛋白的VH CDR3聚集倾向区段中引入取代。
VH CDR3聚集倾向区段从第100c位(即相对于Kabat残基D101进行编号的非变体残基D101或D101-2的N末端的两个氨基酸)延伸至第102位或第103位。
母体免疫球蛋白的VH结构域中第D101-2位(残基D101的N末端的两个氨基酸)、第D101-1位(残基D101的N末端的一个氨基酸)、第101位、第102位和第103位中的一个或多个氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。
VH CDR3聚集倾向区段中的取代可以发生在第D101-2位(残基D101的N末端的两个氨基酸)。
母体免疫球蛋白中第D101-2位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第D101-2位的残基被取代为D、E、F、G、P、S、T、W或Y。例如，母体免疫球蛋白中第D101-2位的氨基酸残基可以是A，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含A(D101-2)D、A(D101-2)E、A(D101-2)F、A(D101-2)G、A(D101-2)P、A(D101-2)S、A(D101-2)T或A(D101-2)W或A(D101-2)Y取代。换言之，D101的N末端的两个氨基酸位置处的从A至D、E、F、G、P、S、T、W或Y的取代，例如A100c。
VH CDR3聚集倾向区段中的取代可以发生在第D101-1位(D101的N末端的一个氨基酸)。
母体免疫球蛋白中第D101-1位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第D101-1位的残基被取代为F、G、L、P或M。例如，母体免疫球蛋白中第D101-1位的氨基酸残基可以是S，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含S(D101-1)F、S(D101-1)G、S(D101-1)L、S(D101-1)P或S(D101-1)M取代。在一些实施方案中，残基S(D101-1)对应于S100d。
VH CDR3聚集倾向区段中的取代可以发生在第102位。
母体免疫球蛋白中第102位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第102位的残基被取代为A、F、H、I、L、V或Y。例如，母体免疫球蛋白中第102位的氨基酸残基可以是P，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含P102A、P102F、P102H、P102I、P102L、P102Y或P102V取代，或母体免疫球蛋白中第102位的氨基酸残基可以是S，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含S102A、S102F、S102H、S102I、S102L、S102Y或S102V取代。
VH CDR3聚集倾向区段中的取代可以发生在第103位。
母体免疫球蛋白中第103位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第103位的残基被取代为I、L或V。例如，母体免疫球蛋白中第103位的氨基酸残基可以是W，并且变体免疫球蛋白可以包含的VH结构域包含W103I、W103L或W103V取代。
CH1聚集倾向区段从第150位延伸至第156位。
CH1聚集倾向区段中的取代可以发生在第153位。
母体免疫球蛋白中第153位的氨基酸残基可以被取代为变体免疫球蛋白中的不同氨基酸残基。优选地，第153位的残基被取代为V。例如，母体免疫球蛋白中第153位的氨基酸残基可以是S，并且变体免疫球蛋白可以包含的CH1结构域包含S153V取代。
相对于所述母体免疫球蛋白序列，变体免疫球蛋白可以包含多至10处本文所述的取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含多至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处取代。
取代可以在相同的聚集倾向区段中或在不同的聚集倾向区段中。例如，变体免疫球蛋白可以在1、2、3、4或更多个不同的本文所述的聚集倾向区段中包含取代。变体免疫球蛋白可以在VH结构域、VL结构域和/或CH1区中包含取代。
可以采用本文所述的取代的任意组合。合适的取代组合的实例示于表3a和3b中。
在一些实施方案中，变体免疫球蛋白可以在VL FR1和/或FR2结构域中包含2处取代；在VL CDR3结构域中包含3处取代；在VL FR2结构域中包含2处取代和在VL CDR3结构域中包含3处取代；在VL FR1结构域中包含2处取代、在VL FR2结构域中包含2处取代和在VL CDR3结构域中包含3处取代；在VH FR1结构域中包含2处取代；在VH FR1结构域中包含1处取代和在VH CDR3结构域中包含1处取代；在VHCDR3结构域中包含2处取代；或在CH1结构域中包含1处取代和在VHFR1结构域中包含1处取代。
变体免疫球蛋白可以在第20位聚集倾向区段中包含2处取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第18位和第20位包含取代的VL结构域。例如，第18位和第20位的残基可以被取代为R。VL结构域可以，例如，包含T18R和T20R取代。
变体免疫球蛋白可以在第20位聚集倾向区段包含取代并且在第74位聚集倾向区段包含取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第18位和第74位包含取代的VL结构域。例如，第18位的残基可以被取代为R，并且第74位的残基可以被取代为V。VL结构域可以，例如，包含T18R和T74V取代。
变体免疫球蛋白可以在第45位聚集倾向区段包含2处取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第45位和第46位包含取代的VL结构域。例如，第45位的残基可以被取代为K或R，并且第46位的残基可以被取代为L。 VL结构域可以，例如，包含T45K(或T45R)和T46L取代。
变体免疫球蛋白可以在第20位聚集倾向区段包含2处取代并且在第45位聚集倾向区段包含2处取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第18位、第20位、第45位和第46位包含取代的VL结构域。例如，第18位和第20位的残基可以被取代为R，第45位的残基可以被取代为K或R，第46位的残基可以被取代为L。VL结构域可以，例如，包含T18R、T20R、T45K和T46L取代或T18R、T20R、T45R和T46L取代。
变体免疫球蛋白在VL CDR3N末端聚集倾向区段可以包含2处取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第91位(C88+3)、第93位(C88+5)和第96位(F98-2)包含取代的VL结构域。例如，第91位的残基可以被取代为W，第93位的残基可以被取代为Q，第96位的残基可以被取代为V。VL结构域可以，例如，包含Y91W(C88+3)、P93Q(C88+5)和R96V(F98-2)取代。
变体免疫球蛋白可以在第45位聚集倾向区段包含2处取代并且在VL CDR3 N末端聚集倾向区段包含2处取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第45位、第46位、第91位(C88+3)、第93位(C88+5)和第96位(F98-2)包含取代的VL结构域。例如，第45位的残基可以被取代为K或R，第46位的残基可以被取代为L，第91位的残基可以被取代为W，第93位的残基可以被取代为Q，第96位的残基可以被取代为V。VL结构域可以，例如，包含T45K、T46L、Y91W(C88+3)、P93Q(C88+5)和R96V(F98-2)取代，或T45R、T46L、Y91W(C88+3)、P93Q(C88+5)和R96V(F98-2)取代。
变体免疫球蛋白可以在第20位聚集倾向区段包含2处取代、在第45位聚集倾向区段包含2处取代，并且在VL CDR3 N末端聚集倾向区段包含2处或3处取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第18位、第20位、第45位、第46位、第91位(C88+3)、第93位(C88+5)和第96位(F98-2)包含取代的VL结构域。例如，第18位和第20位的残基可以被取代为R，第45位的残基可以被取代为K或R，第46位的残基可以被取代为L，第91位的残基可以被取代为W，第93位的残基可以被取代为Q，并且第96位的残基可以被取代为V。VL结构域可以，例如，包含T18R、T20R、T45K、T46L、Y91W(C88+3)、P93Q(C88+5)和R96V(F98-2)取代，或T18R、T20R、T45R、T46L、Y91W(C88+3)、P93Q(C88+5)和R96V(F98-2)取代。
变体免疫球蛋白可以包含在VL第37位聚集倾向区段和VL第45位聚集倾向区段包含取代的VL结构域。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第37位和第45位包含取代的VL结构域。例如，第37位的残基可以被取代为Q或N，第45位的残基可以被取代为E、K或R。VL结构域可以，例如，包含L37Q和Q45R取代。
变体免疫球蛋白可以包含在VH FR1聚集倾向区段和VH CDR3聚集倾向区段包含取代的VH结构域。
例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第1位和第102位包含取代的VH结构域。例如，第1位的残基可以被取代为Q、A、E或V，第102位的残基可以被取代为Y。VH结构域可以，例如，包含Q1A和P102Y取代、Q1E和P102Y取代、Q1V和P102Y取代、E1A和P102Y取代、E1Q和P102Y取代或E1V和P102Y取代。
在其它实例中，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第1位和第103位包含取代的VH结构域。例如，第1位的残基可以被取代为Q、A、D、E或V，第103位的残基可以被取代为L。VH结构域可以，例如，包含Q1A和W103L取代、Q1E和W103L取代、Q1D和W103L取代、Q1V和W103L取代、E1A和W103L取代、E1Q和W103L取代、E1D和W103L取代或E1V和W103L取代。
变体免疫球蛋白在VH CDR3聚集倾向区段可以包含2处取代。
例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第100c位(D101-2)和第100d位(D101-1)包含取代的VH结构域。例如，第100c位的残基可以被取代为W，第100d位的残基可以被取代为F。VH结构域可以，例如，包含A100cW和S100dF取代。
在其它实例中，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第100d位(D101-1)和第102位包含取代的VH结构域。例如，第100d位的残基可以被取代为F或M，第102位的残基可以被取代为V或Y。VH结构域可以，例如，包含S100dF和P102V取代、S100dM和P102V取代、S100dF和P102Y取代或S100dM和P102Y取代。
在其它实例中，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第102位和第103位包含取代的VH结构域。例如，第102位的残基可以被取代为V或Y，第103位的残基可以被取代为L、I或V。VH结构域可以，例如，包含P102Y和W103L取代、P102Y和W103I取代、P102Y和W103V取代、P102V和W103L取代、P102V和W103I取代或P102V和W103V取代。
变体免疫球蛋白可以包含在VH第95位聚集倾向区段和VH CDR3聚集倾向区段包含取代的VH结构域。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第95位和第102位包含取代的VH结构域。例如，第95位的残基可以被取代为E或D，第102位的残基可以被取代为A、F、H、I、L、V或Y。VH结构域可以，例如，包含R95D和S102V取代。任选地，VH结构域还可以在上文所述的第94位和第100位包含取代。例如，第94位的残基可以被取代为R、K或T，第100位的残基可以被取代为F、G、L、M或P。VH结构域可以，例如，包含H94R、R95D、V100F和S102V取代。
变体免疫球蛋白可以在CH1聚集倾向区段和VH第19位聚集倾向区段包含取代。例如，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第153位包含取代的CH1结构域，以及在上文所述的第19位包含取代的VH结构域。例如，第153位的残基可以被取代为V，第19位的残基可以被取代为T。免疫球蛋白可以，例如，在CH1结构域中包含S153V取代并且在VH结构域中包含L19T取代。
在其它实例中，变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第153位包含取代的CH1结构域，以及在上文所述的第20位包含取代的VH结构域。例如，第153位的残基可以被取代为V，第20位的残基可以被取代为A。变体免疫球蛋白可以，例如，包含S153V和R20A取代。
变体免疫球蛋白可以包含在VL第20位聚集倾向区段包含取代的VL结构域，以及在VH FR1聚集倾向区段包含取代的VH结构域。例如，变体免疫球蛋白可以包含在第20位具有取代的VH结构域，并且变体免疫球蛋白可以包含在第18位具有取代的VL结构域。例如，VH结构域中第20位的残基可以被取代为A，VL结构域中第18位的残基可以被取代为V。例如，免疫球蛋白可以包含具有T18V取代的VL结构域，以及具有R20A或R20V取代的VH结构域。
变体免疫球蛋白可以包含在VL第45位聚集倾向区段包含取代的VL结构域，以及在VH第75位聚集倾向区段包含一处或多处取代的VH结构域。例如，变体免疫球蛋白可以包含在第61位和第85位具有取代的VH结构域，以及在第46位具有取代的VL结构域。例如，VH结构域中第61位的残基可以被取代为K、R、Q、E、D、N和A，优选R；VH结构域中第85位的残基可以被取代为E、D或A，优选E；VL结构域中第46位的残基可以被取代为K、R、H、F或S，优选R。例如，免疫球蛋白可以包含具有L46R取代的VL结构域，以及具有P61R和V85E取代的VH结构域。
变体免疫球蛋白可以包含在VL第45位聚集倾向区段包含取代的VL结构域，以及在VH第95位聚集倾向区段包含一处或多处取代并且在VH CDR3聚集倾向区段包含一处或多处取代的VH结构域。例如，变体免疫球蛋白可以包含在第95位和第102位具有取代的VH结构域，以及在第37位和第45位具有取代的VL结构域。例如，VH结构域中第95位的残基可以被取代为E或D，优选D；VH结构域中第102位的残基可以被取代为A、F、H、I、L、V或Y，优选Y；VL结构域中第37位的残基可以被取代为Q或N，优选Q；以及VL结构域中第45位的残基可以被取代为R、K或E，优选R。例如，免疫球蛋白可以包含具有L37Q和Q45R取代的VL结构域，以及具有R95D和S102V取代的VH结构域。
变体免疫球蛋白可以包含在VL第45位聚集倾向区段包含取代的VL结构域，以及在VH第95位聚集倾向区段包含一处或多处取代的VH结构域。例如，变体免疫球蛋白可以包含在第94位和第95位具有取代的VH结构域，以及在第46位具有取代的VL结构域。例如，VH结构域中第94位的残基可以被取代为R、K或T，优选R；VH结构域中第95位的残基可以被取代为E或D，优选D；VL结构域中第46位的残基可以被取代为K、R、H、F或S，优选R。例如，免疫球蛋白可以包含具有L46R取代的VL结构域，以及具有H94R和R95D取代的VH结构域。
在VH、VL和CH1结构域的聚集倾向区段的氨基酸序列中产生取代所需的技术是本领域公知的。例如，利用DNA操控和诱变的标准技术可以产生编码包含一处或多处取代的变体免疫球蛋白的核酸；例如，如Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术)，第二版，Ausubel et al.eds.，John Wiley & Sons，1992，或Molecular Cloning：aLaboratory Manual(分子克隆：实验手册)：第二版，Sambrook et al.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press中所述。然后，可以如下文所述使核酸表达而产生变体免疫球蛋白。
可以测试变体序列结合和/或中和母体免疫球蛋白的靶抗原的能力和/或测试其改进的可产生性。
引入一个或多个上文所示的取代可以通过增加表达时的产生能力和降低变体免疫球蛋白相对于其母体免疫球蛋白的聚集倾向而增加变体免疫球蛋白相对于其母体免疫球蛋白的可产生性。
例如，变体免疫球蛋白可以相对于母体免疫球蛋白表现出产生能力增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％，以及相对于母体免疫球蛋白，表现出聚集降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少90％或至少99％。变体免疫球蛋白可以相对于母体免疫球蛋白表现出聚集降低高达100％(即，聚集完全消除)。
产生本文所述的变体免疫球蛋白的方法可以包括提供母体免疫球蛋白，在VL结构域中的VL第37位聚集倾向区段和/或VL第45位聚集倾向区段中引入取代；和/或
在VH结构域中的VH FR1聚集倾向区段、VH第95位聚集倾向区段以及VH CDR3聚集倾向区段中引入取代，
从而产生变体免疫球蛋白，其中相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白表现出增加的产生能力和降低的聚集。
例如，产生变体免疫球蛋白的方法可以包括：
提供母体免疫球蛋白，
在VH结构域中引入一处或多处下述取代：第1位的A、D、E、Q或V取代；第17位的R取代；第94位的R取代；第95位的D取代；第96位的A取代；第100位的F取代；第100d位的F、G、L、M或P取代，优选F或M取代；第102位的A、F、H、I、L、V或Y取代，优选V或Y取代；和/或
在VL结构域中引入下述取代：第37位的Q取代；第45位的E、K、R、Q或V取代，优选K或R取代；第46位的L或Y取代，优选L取代；
从而产生变体免疫球蛋白，其中变体免疫球蛋白表现出相对于母体免疫球蛋白的增加的产生能力和降低的聚集。
例如，合适的VH结构域可以在上文所述的第94位和第102位具有取代，任选地在第94位和第100位具有其它取代。例如，VH结构域中第95位的残基可以被取代为D，第102位的残基可以被取代为A、F、H、I、L、V或Y，优选V或Y；任选地，第94位的残基还可以被取代为R，第100位的残基被取代为F。
合适的VL结构域可以在上文所述的第37位和第45位具有取代。例如，第37位的残基可以被取代为Q，第45位的残基可以被取代为E、K、R、Q或V，优选K或R。VL结构域可以，例如，包含L37Q和Q45R取代。
变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第94位和第95位具有取代的VH结构域，以及在第46位具有取代的VL结构域。例如，VH结构域中第94位和第95位的残基分别可以被取代为R和D，VL结构域中第46位的残基可以被取代为R。例如，免疫球蛋白可以包含具有L46R取代的VL结构域，以及具有H94R和R95D取代的VH结构域。
其它变体免疫球蛋白可以包含在上文所述的第95位和第102位具有取代的VH结构域，以及在第37位和第45位具有取代的VL结构域。例如，VH结构域中第95位和第102位的残基分别可以被取代为D和V，并且VL结构域中第37位和第45位的残基分别可以被取代为Q和R。例如，免疫球蛋白可以包含具有L73Q和Q45R取代的VL结构域，以及具有R95D和S102V取代的VH结构域。
本文所述的聚集倾向区段的存在可以有助于鉴定表现出降低的或次优的可产生性的免疫球蛋白。
评价免疫球蛋白的可产生性的方法可以包括：
鉴定一个或多个选自以下的位置处的氨基酸残基：所述免疫球蛋白的VL结构域中的第18位、第20位、第45位、第46位、第74位、第91位、第93位和第96位，所述免疫球蛋白的VH结构域中的第1位、第5位、第12位、第17位、第19位、第20位、第94位、第96位、第100c位、第100d位、第102位和第103位，以及CH1结构域中的第153位，
其中在所述免疫球蛋白的VL结构域中，如果第18位的残基不是R、S或V，优选不是R或V，第20位的残基不是K、R、S或V，优选不是R或V，第45位的残基不是E、K、R、Q或V，优选不是K或R，第46位的残基不是L或Y，优选不是L，第74位的残基不是V，第91位的残基不是A、F、L、R、S或W，优选不是W，第93位的残基不是D、F、L、Q、S、T、W或Y，优选不是Q和/或第96位的残基不是E、L、V或W，优选不是V；和/或
在所述免疫球蛋白的VH结构域中，如果第1位的残基不是A、D、E、Q或V，第5位或第12位的残基不是V，第17位的残基不是R，第19位的残基不是T或V，优选不是T，第20位的残基不是A、K、S或T，优选不是A，第94位的残基不是R，第96位的残基不是A，第100c位的残基不是D、E、F、G、P、S、T、W或Y，优选不是W，第100d位的残基不是F、G、L、M或P，优选不是F或M，第102位的残基不是A、F、H、I、L、V或Y，优选不是V或Y，第103位的残基不是I、L或V；和/或在所述免疫球蛋白的CH1结构域中，如果第153位的残基不是V；则表明所述免疫球蛋白具有次优的可产生性。
在一些实施方案中，可以确定免疫球蛋白的VH结构域中第100d位和/或第102位的氨基酸残基。如果第100d位的残基不是F、G、L、M或P，优选不是F或M，和/或第102位的残基不是A、F、H、I、L、V或Y、优选不是V或Y，则表明所述免疫球蛋白的可产生性是次优的。
相对于对照免疫球蛋白，可产生性被鉴定为降低或次优的免疫球蛋白可以是用于通过上文所述的方法进行修饰的候选物，从而产生表现出改进的可产生性的变体免疫球蛋白。
具体而言，可以鉴定出免疫球蛋白序列中对可产生性会造成不利影响的一个或多个残基。然后，可以如本文所述改变或修饰所鉴定出的残基，从而改进可产生性。
本发明的另一方面提供通过上文所述的方法产生的母体免疫球蛋白变体。
本发明的另一方面提供母体免疫球蛋白的变体，
其中所述变体免疫球蛋白包含：
VL结构域，其在框架聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段包含相对于所述母体免疫球蛋白序列的取代；
VH结构域，其在框架聚集倾向区和/或CDR3聚集倾向区段包含相对于所述母体免疫球蛋白序列的取代；和/或，
CH1结构域，其在CH1聚集倾向区包含相对于所述母体免疫球蛋白序列的取代。
合适的聚集倾向区段和取代如上文所述。
VL、VH或CH1结构域中某一位置的取代涉及将母体序列中该位置的残基用不同的残基替代，优选用上文所示的残基替代。如果母体免疫球蛋白在氨基酸序列中合适的位置已经含有上文所示的残基，则这不是本文所述的取代或取代残基。因此，母体或种系免疫球蛋白不是本文所述的变体免疫球蛋白。
如上文所述，变体免疫球蛋白可以与母体免疫球蛋白具有相似或相同的生物学活性，但表现出改进的可产生性，例如降低的聚集倾向和/或异源表达系统中的增加的产生能力。
例如，相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出产生能力增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％，和/或相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出聚集降低(即，天然状态系综中发生聚集的分子的比例降低)至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少90％或至少99％。相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出聚集降低高达100％(即，聚集完全消除)。
如上文所述，相对于母体免疫球蛋白，变体免疫球蛋白可以表现出改进的生物利用度和/或降低的免疫原性。
本发明的另一方面提供分离的核酸，其编码上文所述的变体免疫球蛋白或其CH1、VH或VL结构域。
核酸可以包含DNA或RNA，并且可以是完全合成的或部分合成的。除非文中另作要求，涉及本文所述的核苷酸序列时，其包括具有指定序列的DNA分子并且包括具有指定序列的RNA分子，其中U被替换为T。
可以通过下述方法制备本文所述的变体免疫球蛋白分子或其CH1、VH结构域和/或VL结构域：所述方法包括在能引起所述变体免疫球蛋白分子或其CH1、VH和/或VL结构域产生的条件下表达所述核酸，并将所述变体免疫球蛋白分子或其CH1、VH和/或VL结构域回收。
如下文更详细地描述，核酸可以编码变体免疫球蛋白或所述变体免疫球蛋白的缺少一个或多个CDR的VH或VL结构域。通过将编码CDR的合适的核酸插入编码变体免疫球蛋白或其VH或VL结构域的核酸中，可以将从供体免疫球蛋白获取的一个或多个CDR合并到变体免疫球蛋白的框架中。
变体免疫球蛋白和编码核酸优选是分离的。免疫球蛋白和核酸不含或基本上不含与其相关的物质，所述相关的物质例如在制备所述免疫球蛋白和核酸的环境(例如细胞培养物)中与所述免疫球蛋白和核酸共同存在的其它多肽或核酸(如果所述制备是利用体外或体内实施的重组DNA技术)。
本发明的其它方面提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的核酸构建体，其包含至少一种编码本文所述的变体免疫球蛋白或其CH1、VH和/或VL结构域的核酸。
构建体可用于表达系统中，从而表达上文所述的免疫球蛋白。
用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达免疫球蛋白的体系是公知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒体系。本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞以及很多其它细胞系。用于小的免疫球蛋白分子的常见优选细菌宿主是大肠杆菌(E.coli)。
在原核细胞(例如大肠杆菌)中表达免疫球蛋白(例如抗体和抗体片段)已是本领域中的成熟技术。综述可参见例如Plückthun，A.Bio/Technology9：545-551(1991)。在培养的真核细胞中的表达对于本领域技术人员也是产生免疫球蛋白的可用选择，近期综述可参见例如Ref，M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4：573-576；Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。还可以在无细胞体系中表达免疫球蛋白，例如抗体和抗体片段。
可以选择或构建适于表达免疫球蛋白的载体，所述载体含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及其它合适的序列。载体可以是合适的质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒。更详细的内容可以参见，例如，Molecular Cloning：aLaboratory Manual(分子克隆：实验手册)，第二版，Sambrook et al.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。例如，核酸构建体制备、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白分析中的很多已知的操控核酸的技术和方法详细描述于Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)，第二版，Ausubel et al.eds.，John Wiley & Sons，1992。
宿主细胞中可以含有编码变体免疫球蛋白或其CH1、VH和/或VL结构域的核酸。另一方面提供的方法包括将所述核酸引入宿主细胞中。所述引入可以利用任何可获得的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和利用逆转录病毒或其它病毒(例如牛痘病毒)的转导，或者对于昆虫细胞，利用杆状病毒的转导。将核酸引入宿主细胞中，特别是引入真核细胞中，可以利用基于病毒或质粒的体系。质粒体系可以保持为附加体，或可以被合并入宿主细胞或合并入人工染色体。可以通过将一个或多个拷贝随机整合或靶向整合到单一或多个基因座进行合并。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和利用噬菌体的转染。
引入之后，可以引起或允许核酸表达，例如，通过在适于基因表达的条件下培养宿主细胞。
编码变体免疫球蛋白或其CH1、VH和/或VL结构域的核酸可以被整合到宿主细胞的基因组中(例如染色体)。可以按照标准技术，通过包含促进与基因组进行重组的序列来促进整合。
通过表达产生后，可以利用任何合适的技术来分离和/或纯化变体免疫球蛋白或其CH1、VH和/或VL结构域，然后视需要使用。例如，产生方法还可以进一步包括将产物配制到组合物中，所述组合物包含至少一种其它组分，例如药学上可接受的赋形剂。
变体免疫球蛋白可以用于人体或动物体的治疗或诊断方法中，例如人类患者的疾病或病症的治疗方法(可以包括预防性治疗)，所述方法包括将有效量的变体免疫球蛋白给予所述患者。
本发明的其它方面提供了包含本文所述的变体免疫球蛋白的药物组合物、制备药物或药物组合物的方法和变体免疫球蛋白在制备用于给药的药物中的用途，所述方法包括将变体免疫球蛋白与药学上可接受的赋形剂一起配制。
除变体免疫球蛋白之外，药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其它物质。所述物质应当是无毒性的，并且应当不影响活性成分的功效。载体或其它物质的确切性质取决于给药途径，所述途径可以是口服或注射，例如静脉内注射。
对于静脉内注射或受累位点注射，活性成分是胃肠外可接受的水溶液形式，所述溶液无致热源并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员能容易地利用例如等渗介质来制备合适的溶液，所述介质例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格氏注射液。如果需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
可以单独给予或与其它治疗联合给予组合物，所述联合给予可以是同时的或依次的，这取决于所要治疗的疾病状态。其它治疗可以包括给予合适剂量的缓解疼痛药物，例如非甾体类抗炎药(例如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或阿片类药物(例如吗啡)或止吐药。
变体免疫球蛋白可以用于提供治疗益处的临床适应症包括任何可使用母体免疫球蛋白的疾病状态或病症。
按照本发明，可以将所提供的组合物给予个体。给药优选是“治疗有效量”，即足以对患者表现出益处的量。所述益处可以至少是至少一种症状的缓解。实际给药量以及给药速率和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如剂量决定等)由全科医师及其他医师负责。抗体的合适剂量是本领域公知的；参见，Ledermann J.A.et al.(1991)Int J.Cancer 47：659-664；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915-922。
确切剂量取决于多种因素，包括抗体是用于诊断还是治疗、所要治疗的区域的大小和位置、抗体的确切性质(例如完整抗体、片段或双链抗体)和与抗体连接的任何可检测的标记或其它分子的性质。通常，典型的抗体剂量为：系统施用时为0.5mg-1g，局部施用时为10μg-1mg。通常，抗体是完整抗体，优选IgG4同种型。以上是成年患者单次治疗的剂量，对儿童和婴儿其可以按比例进行调整，并且还可以对其它抗体形式根据分子量按比例进行调整。医师可以根据判断每天一次、每周两次、每周一次或每月一次间隔重复治疗。
本文所述的在聚集倾向区段中包含取代的变体免疫球蛋白和编码核酸可以用于抗体工程化方法中来产生具有改进的可产生性的免疫球蛋白。
重组DNA技术可以用于产生变体具有改进的可产生性的免疫球蛋白。所述技术可以涉及将编码供体抗体的一个或多个CDR序列的DNA引入本文所述的变体免疫球蛋白的可变区。参见，例如，EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400以及大量的后续文献。或者，可以将产生免疫球蛋白的杂交瘤或其它细胞进行编码免疫球蛋白聚集倾向区段的序列中的基因突变，这可以改进所产生的免疫球蛋白的可产生性。这可以用于改造或重构具有适于重组产生的可产生性的抗体。
在一些实施方案中，变体免疫球蛋白的VH和VL结构域可以缺少一个或多个CDR序列(例如CDR3)。可以利用重组DNA技术将异源CDR或合成CDR引入变体免疫球蛋白的缺少相应CDR(例如CDR3)的VH和/或VL结构域。这可以改变变体免疫球蛋白的结合性质，而不会影响可产生性。
例如，来自供体免疫球蛋白的一个或多个CDR序列(例如CDR3)可以用于替换本文所述的变体免疫球蛋白中对应的CDR序列。来自本文所述的人变体免疫球蛋白的1、2、3、4、5或所有6个CDR序列可以被获自非人供体免疫球蛋白(例如鼠免疫球蛋白)的CDR序列取代，从而产生人源化的免疫球蛋白。人源化的免疫球蛋白可以具有与非人供体免疫球蛋白相同的结合活性，但是表现出在人中的降低的免疫原性并因此可以具有治疗功效。
制备能结合靶抗原的杂合免疫球蛋白的方法可以包括：
提供能结合所述靶抗原的供体免疫球蛋白，
提供上文所述的变体免疫球蛋白，以及
将所述变体免疫球蛋白的1、2、3、4、5或6个CDR序列替换为来自所述供体免疫球蛋白的对应CDR序列，
从而产生能结合所述靶抗原的杂合免疫球蛋白。
优选地，将变体免疫球蛋白的VH CDR3和/或VL CDR3替换为来自供体免疫球蛋白的对应VH CDR3和/或VL CDR3。
变体免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白，并且供体免疫球蛋白可以是非人免疫球蛋白。
适于通过CDR移植将免疫球蛋白人源化的技术是本领域公知的(参见例如，Riechman et al(1988)Nature 332 323-327；Queen et al PNAS USA(1989)86 10029-10033)。
杂合免疫球蛋白的VL CDR3可以在上文所述的VL CDR3 N末端聚集倾向区段或VL CDR3 C末端聚集倾向区段中包含取代。
杂合免疫球蛋白的VH CDR3可以在上文所述的VH CDR3聚集倾向区段中包含取代。
合适的变体免疫球蛋白可以在上文所述的框架区或恒定区中包含一处或多处取代。
在一些实施方案中，可以在供体VH和/或VL CDR3序列中引入取代。可以使用标准技术在插入变体免疫球蛋白之前或之后进行取代。
本文所述的变体免疫球蛋白还可以用于除CDR移植之外的人源化方法。可以在人源化抗体的产生过程中在免疫球蛋白中引入本文所述的一处或多处取代，从而改进其可产生性。可用的人源化技术是本领域公知的(参见例如Padlan et al Mol Immunol.(1991)28489-498)。
本文所述的变体免疫球蛋白可以用于产生用于分离结合特异性的文库或库。
制备变体免疫球蛋白库的方法可以包括：
提供上文所述的变体免疫球蛋白群体，
将所述变体免疫球蛋白群体的1、2、3、4、5或6个CDR序列替换为CDR序列库，
从而产生变体免疫球蛋白库。
变体免疫球蛋白库会含有相同变体免疫球蛋白背景中的不同替代CDR序列的库。
可以筛选所述库中对靶抗原具有特异性的变体免疫球蛋白。
在一些优选实施方案中，变体免疫球蛋白群体的VH CDR3可以被取代为VH CDR3序列库。例如，制备能结合靶抗原的变体免疫球蛋白方法可以包括：
(a)提供编码VH结构域的核酸的起始群体，所述VH结构域包含待替换的CDR3或缺少CDR3编码区；其中所述VH结构域在一个或多个上文所述聚集倾向区段中包含一处或多处取代，
(b)使所述VH结构域群体与编码VH CDR3氨基酸序列库的供体核酸群体组合，使得所述供体核酸被插入VH结构域群体的CDR3区中，从而提供编码包含所述VH CDR3序列的VH结构域库的核酸的产物群体；
(c)表达所述产物群体的核酸；
(d)选择对靶抗原具有特异性的免疫球蛋白；以及
(e)回收所述免疫球蛋白或编码其的核酸。
编码VH结构域的核酸群体还可以包含编码CH1结构域的核苷酸序列，所述CH1结构域在上文所述的CH1聚集倾向区段中包含一处或多处取代。
按照相同方式，VL CDR3序列库可以与编码VL结构域的核酸群体组合，所述VL结构域在本文所述的聚集倾向区段中包含一处或多处取代，并且包含待替换的VL CDR3或缺少VL CDR3编码区。
除CDR3之外，也可以将CDR1和CDR2序列的库移植到VH和/或VL结构域群体中，然后筛选对靶抗原具有特异性的变体免疫球蛋白，所述VH和/或VL结构域在本文所述的聚集倾向区段中包含一处或多处取代。
可以将CDR来源的序列库用本文所述的缺少对应的CDR序列的VH或VL结构域的群体改组，并且将改组后的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域(其也可以包含本文所述的一处或多处取代)组合，从而提供工程化的变体免疫球蛋白。然后，可以将库在合适的宿主系统(例如WO92/01047的噬菌体展示系统)中展示，从而可以选择具有改进的可产生性的合适的免疫球蛋白。库可以由来自104个以上的个体成员(例如106至108或1010个成员)中的任意个组成。
CDR改组和抗体工程化的技术是本领域公知的，并且本领域技术人员能够利用常规方法使用这些技术来提供具有改进的可产生性的免疫球蛋白。
CDR序列库可以包括CDR序列中一个或多个位置处的多种残基。例如，CDR序列库可以包括CDR序列中1、2、3、4、5或更多个位置处的多种残基。
CDR序列库可以包括CDR序列中的一个或多个可变位置。例如，CDR序列库可以包括CDR序列中1、2、3、4、5或更多个可变位置。每个可变位置处的残基可以在库的不同成员之间是不同的。可变位置处的残基可以是随机的(例如，其可以是具有相同概率的任何天然存在的氨基酸)或可以选自预定的氨基酸组或子集。例如，变体免疫球蛋白的VLCDR3可被取代为供体VL CDR3序列的库，所述供体VL CDR3序列在第91位包含A、F、L、R、S和W，在第93位包含D、F、L、Q、S、T、W和Y，和/或在第96位包含E、L、V和W。变体免疫球蛋白的VH CDR3可以被取代为供体VH CDR3序列的库，所述供体VH CDR3序列在第100c位包含D、E、F、G、P、S、T、W和Y，在第100d位包含F、G、L、P和M，在第102位包含A、F、H、I、L、V和Y，和/或在第103位包含I、L和V。
使CDR3库偏向于这些位置处的这些残基可以有助于改进可产生性。
除一个或多个可变位置之外，CDR序列库还可以包括一个或多个非可变位置。每个非可变位置处的残基可以在库的每个成员中是相同的。
将CDR序列库并入受体变体免疫球蛋白可用于产生具有不同结合性质的变体免疫球蛋白的库，库的每个成员在本文所述的一个或多个聚集倾向区段中包含一处或多处取代。
变体免疫球蛋白库可以包含：
VL结构域，其在上文所述的框架聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区中包含取代；
VH结构域，其在上文所述的框架聚集倾向区和/或CDR3聚集倾向区段中包含取代；和/或，
CH1结构域，在上文所述的CH1聚集倾向区中包含取代；
其中库的成员在一个或多个CDR序列中是不同的。
变体免疫球蛋白的库可以用于鉴定具有改进的可产生性、能结合靶抗原的免疫球蛋白。获得一种或多种能结合靶抗原的免疫球蛋白的方法可以包括：
使上文所述的免疫球蛋白库和所述抗原接触，以及
选择库中能结合所述抗原的一个或多个免疫球蛋白。
所述库可以，例如，展示在噬菌体颗粒的表面上，每个颗粒都含有编码展示在其表面上的抗体VH可变结构域以及任选地所展示的VL结构域(如果存在)的核酸。
选择能结合抗原并展示在噬菌体颗粒上的免疫球蛋白之后，可以从展示所述免疫球蛋白的噬菌体颗粒获取核酸。通过表达具有从展示所述免疫球蛋白的噬菌体颗粒获取的核酸序列的核酸，所述核酸可以用于后续产生免疫球蛋白或其抗体VH可变结构域和/或VL结构域。
可以测试免疫球蛋白结合抗原的能力、与其它免疫球蛋白竞争结合抗原的能力和/或中和抗原的能力。在合适的条件下，可以比较不同免疫球蛋白的结合亲和力和中和能力。还可以测试免疫球蛋白的可产生性。
根据本文公开内容，本发明的各个其它方面和实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。将本说明书中提及的所有文件通过引用整体并入本文。
本文中所用的“和/或”应当理解为两个规定的特征或组分中每一个的具体公开内容，可以具有另一个或没有另一个。例如，“A和/或B”应当理解为(i)A、(ii)B和(iii)A和B中每一个的具体公开内容，就如同其中每一个在本文中被单独列出一样。
除非上下文另作规定，上文所示的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并可以等同地应用于所描述的所有方面和实施方案。
现在，通过举例并结合下文所述的表描述本发明的某些方面和实施方案。
表1a和1b显示出免疫球蛋白VH和VL结构域的Kabat和Honegger编号方案之间的对应。
表2a和2b显示出能改进可产生性的聚集倾向区段中的氨基酸取代的实例。还标出了优选取代。使用标准IUPAC-IUB JCBN的氨基酸单字母缩写。
表3a和3b显示出能改进可产生性的聚集倾向区段中的取代组合的实例。
表4显示出变体免疫球蛋白的实例的可产生性。
实验
基因合成
由商业供应商优化和合成序列，并将序列亚克隆到pEE6.4和pEE12.4中。通过转化到Top10细胞、将细胞在LB培养基中O/N培养、并利用QIAGEN Endofree质粒纯化试剂盒进行纯化来制备DNA储备物。将DNA重悬于TE缓冲液中，并利用Nanodrop分光光度计测定浓度。
常规细胞培养
每3-4天将CHOK1SV细胞在补充了15mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培养基中次培养，并在CO2摇床(140rpm)中、36.5℃、10％CO2、85％湿度下孵育。
瞬时转染
利用Lipofectamine 2000转染CHOK1SV细胞。转染后72小时，收集上清、将上清离心并在进行分析前保存在4℃下。
稳定转染
利用稳定转染的CHOK1SV细胞，在MSX选择下进行大规模表达。收集后，在纯化之前将上清保存在4℃下。
纯化
利用HiTrap柱(GE)将上清进行蛋白A纯化，并在浓缩和缓冲液交换之前保存在4℃下。
抗体浓缩和缓冲液交换
通过2000g下离心15-20分钟浓缩样品。利用配制缓冲液(50mM磷酸盐、100mM NaCl、pH7.4)将材料进行4-5次缓冲液交换。缓冲液交换后，将样品在配制缓冲液中稀释至合适的工作浓度。
GP-HPLC
在Agilent 1200系列HPLC系统上，利用GP-HPLC分析重复样品。将80μl等分式样的1mg/ml样品(保存在4℃下)上样，并以1ml/分钟运行15分钟。利用chemstation软件分析结果。
IgG滴度
利用夹心ELISA测定抗体表达收率。将滴度以轻链特异性对照进行标准化。
硫磺素T结合
硫磺素T可用于监测聚集。将1mg/ml的纯化抗体在60°下孵育1小时，然后与终浓度为30μM的硫磺素T混合，并以Ex＝305、Em＝508nm测定荧光(Hawe，A.，Sutter，M and Jiskoot，W.Pharmaceutical Research 200825(7)1487-99)。
ANS结合
8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)可用于监测聚集。将1mg/ml的纯化抗体在60°下孵育1小时，然后与终浓度为30μM的ANS混合，并以Ex＝360、Em/508nm测定荧光(Hawe，A.，Sutter，M and Jiskoot，W.PharmaceuticalResearch 200825(7)1487-99)。
结果
通过计算机方法和体外方法分析免疫球蛋白序列来鉴定聚集倾向区段。鉴定出的聚集倾向区段显示在表2中
设计并合成了在VH和VL结构域(如SEQ ID NO：1和2所示)中鉴定出的聚集倾向区段中的能降低聚集倾向的取代(表2)。测试了取代对免疫球蛋白的表达、稳定性和聚集的影响(表3和4)。
发现鉴定出的聚集倾向区段中的残基取代能实现可产生性的改进，特别是能实现降低的聚集倾向和/或改进的产生水平。
本发明的其它编号的声明：
1.变体免疫球蛋白，包含：
轻链可变(VL)结构域，其在框架(FR)聚集倾向区段和/或互补决定区3(CDR3)聚集倾向区段包含取代；
重链可变(VH)结构域，其在框架区聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段包含取代；和/或
重链恒定区1(CH1)结构域，其在CH1聚集倾向区段包含取代。
2.改进免疫球蛋白的可产生性的方法，包括：
鉴定母体免疫球蛋白，
在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中的框架聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段中引入取代，和/或
在所述母体免疫球蛋白VH结构域中的框架区聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段中引入取代，和/或
在所述母体免疫球蛋白的CH1结构域中的恒定区聚集倾向区段中引入取代，
从而产生相对于所述母体免疫球蛋白具有改进的可产生性的变体免疫球蛋白。
3.如前述声明中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白在表达时具有降低的聚集倾向和/或增加的产生能力。
4.如前述声明中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域的框架聚集倾向区段选自：第20位聚集倾向区段、第45位聚集倾向区段和第74位聚集倾向区段。
5.如声明4中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第20位聚集倾向区段从所述VL结构域的第15位延伸至第23位。
6.如声明5中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在其第18位包含取代。
7.如声明6中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第18位的残基被取代为R、S或V。
8.如声明7中所述的变体免疫球蛋白或方法，中所述VL结构域包含T18R、T18S或T18V。
9.如声明5-8中任一项中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在其第20位包含取代。
10.如声明9中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第20位的残基被取代为K、R、S或V。
11.如声明10中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL包含T20K、T20R、T20S或T20V取代。
12.如声明4-11中任一项中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第45位聚集倾向区段从所述VL结构域的第42位延伸至第49位。
13.如声明12中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在第45位包含取代。
14.如声明13中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第45位的残基被取代为E、K、R、Q或V。
15.如声明14中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含T45E、T45K、T45R、T45Q或T45V取代。
16.如声明12-15中任一项中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在第46位包含取代。
17.如声明16中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第46位的残基被取代为L或Y。
18.如声明17中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含T46L或T46Y取代。
19.如声明4-18中任一项中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第74位聚集倾向区段从所述VL结构域序列的第71位延伸至第77位。
20.如声明19中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在第74位包含取代。
21.如声明20中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第74位的残基被取代为V。
22.如声明21中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含T74V取代。
23.如前述声明中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域CDR3聚集倾向区段选自：VL CDR3 N末端聚集倾向区段和VL CDR3 C末端聚集倾向区段。
24.如声明23中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL CDR3N末端聚集倾向区段从所述VL结构域序列中的残基C88延伸至残基C88C末端的第8位氨基酸。
25.如声明24中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在第88位、第89位、第90位、第91位、第92位、第93位、第94位、第95位或第95a位中的一个或多个包含取代。
26.如声明25中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在第91位包含取代。
27.如声明26中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第91位的残基被取代为A、F、L、R、S或W。
28.如声明27中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含Y91A、Y91F、Y91L、Y91R、Y91S或Y91W取代。
29.如声明24-29中任一项中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在第93位包含取代。
30.如声明29中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第93位的残基被取代为D、F、L、Q、S、T、W或Y。
31.如声明30中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含P93D、P93F、P93L、P93Q、P93S、P93T、P93W或P93Y取代。
32.如声明23中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL C末端CDR3聚集倾向区段从所述VL结构域序列中残基F98的N末端第3位氨基酸延伸至第99位。
33.如声明32中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在第95位、第96位、第97位、第98位或第99位中的一个或多个包含取代。
34.如声明33中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域在第96位包含取代。
35.如声明34中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第96位的残基被取代为E、L、V或W。
36.如声明35中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含R96E、R96L、R96V或R96W取代。
37.如前述声明中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域框架聚集倾向区段选自：FR1聚集倾向区段、第95位聚集倾向区段以及第102位聚集倾向区段。
38.如声明37中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述FR1聚集倾向区段位于所述VH结构域序列的框架区1中。
39.如声明38中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述FR1聚集倾向区段是选自以下的聚集倾向区段：第1位至第3位、第4位至第6位、第11位至第13位以及第16位至第21位。
40.如声明39中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中FR1聚集倾向区段从第1位延伸至第3位。
41.如声明40中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在其第1位包含取代。
42.如声明41中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第1位的残基被取代为E、Q、D、A或V。
43.如声明42中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含Q1E、Q1D、Q1A或Q1V取代或E1Q、E1D、E1A或E1V取代。
44.如声明39中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述FR1聚集倾向区段从所述VH结构域的第4位延伸至第6位。
45.如声明44中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在其第5位包含取代。
46.如声明45中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第5位的残基被取代为V。
47.如声明46中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含L5V。
48.如声明39中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述FR1聚集倾向区段从所述VH结构域的第11位延伸至第13位。
49.如声明48中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在其第12位包含取代。
50.如声明49中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第12位的残基被取代为V。
51.如声明50中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含L12V。
52.如声明39中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述FR1聚集倾向区段从所述VH结构域的第16位延伸至第21位。
53.如声明52中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第17位包含取代。
54.如声明53中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第17位的残基被取代为R。
55.如声明54中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含G17R取代。
56.如声明52-55中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第19位包含取代。
57.如声明56中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第19位的残基被取代为T或V。
58.如声明57中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含L19T或和L19V取代。
59.如声明52-58中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第20位包含取代。
60.如声明59中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第20位的残基被取代为A、K、S或T。
61.如声明60中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述残基的位置，其中所述VH结构域包含R20A、R20K或R20S或R20T取代。
62.如声明37-61中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第95位聚集倾向区段从第91位延伸至第99位。
63.如声明62中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第91位、第92位、第93位、第94位、第95位、第96位、第97位、第98位和/或第99位中的一个或多个包含取代。
64.如声明63中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第94位包含取代。
65.如声明64中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第94位的残基被取代为R。
66.如声明65中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含K94R取代。
67.如声明63-66中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第96位包含取代。
68.如声明67中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第96位的残基被取代为A。
69.如声明68中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含G96A取代。
70.如声明1-69中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH CDR3聚集倾向区段从第100c位延伸至第103位。
71.如声明70中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第100c位、第100d位、第101位、第102位和第103位中的一个或多个包含取代。
72.如声明71中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第100c位包含取代。
73.如声明72中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第100c位的残基被取代为D、E、F、G、P、S、T、W或Y。
74.如声明73中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含A100cD、A100cE、A100cF、A100cG、A100cP、A100cS、A100cT、或A100cW或A100cY。
75.如声明70-74中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第100d位包含取代。
76.如声明75中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第100d位的残基被取代为F、G、L、P或M。
77.如声明76中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含S100dF、S100dG、S100dL、S100dP或S100dM取代。
78.如声明70-77中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第102位包含取代。
79.如声明78中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第102位的残基被取代为A、F、H、I、L、V或Y。
80.如声明79中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含P102A、P102F、P102H、P102I、P102L、P102Y或P102V取代。
81.如声明70-80中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第103位包含取代。
82.如声明81中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第103位的残基被取代为I、L或V。
83.如声明82中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含W103I、W103L或W103V取代。
84.如声明1-83中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述CH1聚集倾向区段从第150位延伸至第156位。
85.如声明84中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述CH1结构域在第153位包含取代。
86.如声明85中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述CH1结构域在第153位包含取代。
87.如声明86中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第153位的残基被取代为V。
88.如声明87中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含S153V取代。
89.如前述声明中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中相对于所述母体免疫球蛋白序列，所述变体免疫球蛋白的序列具有多至10个氨基酸取代。
90.如前述声明中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述变体免疫球蛋白的序列在VL FR1和/或FR2结构域中包含2处取代；在VLCDR3结构域中包含3处取代；在VL FR2结构域中包含2处取代并在VL CDR3结构域中包含3处取代；在VL FR1结构域中包含2处取代、在VL FR2结构域中包含2处取代并在VL CDR3结构域中包含3处取代；在VH FR1结构域中包含2处取代；在VH FR1结构域中包含1处取代并在VH CDR3结构域中包含1处取代；在VH CDR3结构域中包含2处取代；或在CH1结构域中包含1处取代并在VH FR1结构域中包含1处取代。
91.如声明90中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域的序列包含100d(D101-1)和102处取代。
92.如声明91中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第102位的残基被取代为A、F、H、I、L、V或Y，并且其中第100d位的残基被取代为F、G、L、P或M。
93.如声明92中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含P102A、P102F、P102H、P102I、P102L、P102Y或P102V取代和S100dF、S100dG、S100dL、S100dP或S100dM取代。
94.如声明93中所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含S100dF和P102V取代、S100dM和P102V取代、S100dF和P102Y取代或S100dM和P102Y取代。
95.如前述声明中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述变体免疫球蛋白是人源化的。
96.评价免疫球蛋白的可产生性的方法，包括：
鉴定一个或多个选自以下的位置处的氨基酸残基：所述免疫球蛋白的VL结构域中的第18位、第20位、第45位、第46位、第74位、第91位、第93位和第96位，所述免疫球蛋白的VH结构域中的第1位、第5位、第12位、第17位、第19位、第20位、第94位、第96位、第100c位、第100d位、第102位和第103位，以及所述免疫球蛋白的CH1结构域中的第153位，
其中在所述免疫球蛋白的VL结构域中，如果第18位的残基不是R、S或V，优选不是R或V，第20位的残基不是K、R、S或V，优选不是R或V，第45位的残基不是E、K、R、Q或V，优选不是K或R，第46位的残基不是L或Y，优选不是L，第74位的残基不是V，第91位的残基不是A、F、L、R、S或W，优选不是W，第93位的残基不是D、F、L、Q、S、T、W或Y，优选不是Q和/或第96位的残基不是E、L、V或W，优选不是V；和/或
在所述免疫球蛋白的VH结构域中，如果第1位的残基不是A、D、E、Q或V，第5位或第12位的残基不是V，第17位的残基不是R，第19位的残基不是T或V，优选不是T，第20位的残基不是A、K、S或T，优选不是A，第94位的残基不是R，第96位的残基不是A，第100c位的残基不是D、E、F、G、P、S、T、W或Y，优选不是W，第100d位的残基不是F、G、L、M或P，优选不是F或M，第102位的残基不是A、F、H、I、L、V或Y，优选不是V或Y，第103位的残基不是I、L或V；和/或
在所述免疫球蛋白的CH1结构域中，如果第153位的残基不是V；
则表明所述免疫球蛋白的可产生性是次优的。
97.评价免疫球蛋白的可产生性的方法，包括：
鉴定所述免疫球蛋白的VH结构域中第100d位和/或第102位处的氨基酸残基，
其中如果第100d位是S和/或第102位是P，则表明所述免疫球蛋白具有次优的可产生性。
98.分离的核酸，其编码声明1-95中任一项所述的变体免疫球蛋白，或编码所述变体免疫球蛋白的包含一个或多个所述取代的VH结构域、VL结构域或CH1结构域。
99.表达载体，包含声明98所述的分离的核酸。
100.宿主细胞，包含声明99所述的表达载体。
101.制备变体免疫球蛋白的方法，包括：
在能引起所述变体免疫球蛋白或其VH结构域、VL结构域或CH1结构域的产生的条件下，表达声明98所述的核酸，并将所述变体免疫球蛋白或其VH结构域、VL结构域或CH1结构域回收。
102.如权利要求101所述的方法，包括将所述变体免疫球蛋白配制在组合物中，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。
103.药物组合物，包含声明1-95中任一项所述的变体免疫球蛋白和药学上可接受的赋形剂。
104.如声明1-95中任一项所述的变体免疫球蛋白，其用作药物。
105.制备能结合靶抗原的杂合免疫球蛋白的方法，包括：
提供能结合所述靶抗原的供体免疫球蛋白，
提供声明1-89中任一项所述的变体免疫球蛋白，
将所述变体免疫球蛋白的一个或多个CDR序列替换为所述供体免疫球蛋白的对应CDR序列，
从而产生能结合所述靶抗原的杂合免疫球蛋白。
106.如声明105所述的方法，其中所述杂合免疫球蛋白的VL CDR3在VL CDR3 N末端聚集倾向区段或VL CDR3 C末端聚集倾向区段中包含取代。
107.如声明105或106所述的方法，其中所述杂合免疫球蛋白的VHCDR3在VH CDR3聚集倾向区段中包含取代。
108.制备变体免疫球蛋白库的方法，包括：
提供声明1-95中任一项所述的变体免疫球蛋白，
将所述变体免疫球蛋白的一个或多个CDR序列替换为在其中一个或多个位置包含随机残基的CDR序列，
从而产生具有多种变体免疫球蛋白的库。
109.如声明108所述的方法，其中所述变体免疫球蛋白的VL CDR3被取代为随机CDR3序列，所述随机CDR3序列在第91位包含A、F、L、R、S或W，在第93位包含D、F、L、Q、S、T、W或Y，和/或在第96位包含E、L、V或W。
110.如声明108或109所述的方法，其中所述变体免疫球蛋白的VHCDR3被取代为随机CDR3序列，所述随机CDR3序列在第位100c包含D、E、F、G、P、S、T、W或Y，在第位100d包含F、G、L、P或M，在第位102包含A、F、H、I、L、V或Y，和/或在第位103包含I、L或V。
111.变体免疫球蛋白库，其中所述库的每个成员包含：
VL结构域，其在框架聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段中包含取代；
VH结构域，其在框架区聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段中包含取代；和/或
CH1结构域，其在CH1聚集倾向区段中包含取代，
其中所述库的成员在一个或多个CDR序列中是不同的。
112.核酸群体，其编码声明111所述的变体免疫球蛋白库。
113.获得一个或多个具有改进的可产生性的、能结合靶抗原的免疫球蛋白的方法，包括：
使声明111所述的变体免疫球蛋白库与所述抗原接触，以及
选择所述库中能结合所述抗原的一个或多个免疫球蛋白。
序列：
VL
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDPEMRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：1)
VH
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTYEGPTYFASDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)
表1A：VL结构域编号
 序列B   Kabat   Honegger  序列B   Kabat   Honegger
  N   1   1   V   33   41
  F   2   2   Q   34   42
  M   3   3   W   35   43
  L   4   4   Y   36   44
  T   5   5   Q   37   45
  Q   6   6   Q   38   46
  P   7   7   R   39   47
  8   8   P   40   48
  H   9   9   G   41   49
  S   10   10   S   42   50
  V   11   11   S   43   51
  S   12   12   P   44   52
  E   13   13   T   45   53
  S   14   14   T   46   54
  P   15   15   V   47   55
  G   16   16   I   48   56
  K   17   17   Y   49   57
  T   18   18   E   50   58
  V   19   19   59
  T   20   20   60
  I   21   21   61
  S   22   22   62
  C   23   23   63
  T   24   24   64
  R   25   25   65
  S   26   26   66
  S   27   27   D   51   67
  G   27a   28   N   52   68
  S   27b   29   Q   53   69
  27c   30   R   54   70
  27d   31   P   55   71
  27e   32   S   56   72
  27f   33   G   57   73
  34   V   58   74
  35   P   59   75
  I   28   36   D   60   76
  A   29   37   R   61   77
  S   30   38   F   62   78
  N   31   39   S   63   79
  Y   32   40   G   64   80
  序列B   Kabat   Honegger  序列B   Kabat   Honegger
  S   65   81   121
  I   66   82   122
  D   67   83   123
  S   68   84   124
  S   68a   85   125
  S   68b   86   126
  N   69   87   127
  S   70   88   128
  A   71   89   129
  S   72   90   130
  L   73   91   131
  T   74   92   132
  I   75   93   133
  S   76   94   134
  G   77   95   135
  L   78   96   136
  K   79   97   R   96   137
  T   80   98   V   97   138
  E   81   99   F   98   139
  D   82   100   G   99   140
  E   83   101   G   100   141
  A   84   102   G   101   142
  D   85   103   T   102   143
  Y   86   104   K   103   144
  Y   87   105   L   104   145
  C   88   106   T   105   146
  Q   89   107   V   106   147
  S   90   108   L   107   148
  Y   91   109
  D   92   110
  P   93   111
  E   94   112
  M   95   113
  95a   114
  95b   115
  95c   116
  95d   117
  95e   118
  95f   119
  120
表1B：VH结构域编号
 序列B   Kabat   Honegger  序列B   Kabat   Honegger
  Q   1   1   41
  V   2   2   42
  Q   3   3   W   36   43
  L   4   4   V   37   44
  V   5   5   R   38   45
  E   6   6   Q   39   46
  S   7   7   A   40   47
  8   8   P   41   48
  G   9   9   G   42   49
  G   10   10   K   43   50
  G   11   11   G   44   51
  V   12   12   L   45   52
  V   13   13   E   46   53
  Q   14   14   W   47   54
  P   15   15   V   48   55
  G   16   16   A   49   56
  R   17   17   V   50   57
  S   18   18   I   51   58
  L   19   19   S   52   59
  R   20   20   Y   52a   60
  L   21   21   52b   61
  S   22   22   52c   62
  C   23   23   63
  A   24   24   D   53   64
  A   25   25   G   54   65
  S   26   26   S   55   66
  G   27   27   N   56   67
  F   28   28   K   57   68
  T   29   29   Y   58   69
  F   30   30   Y   59   70
  S   31   31   A   60   71
  S   32   32   D   61   72
  Y   33   33   S   62   73
  G   34   34   V   63   74
  M   35   35   K   64   75
  H   35a   36   G   65   76
  35b   37   R   66   77
  38   F   67   78
  39   T   68   79
  40   I   69   80
  序列B   Kabat   Honegger  序列B   Kabat   Honegger
  S   70   81   100g   121
  R   71   82   100h   122
  D   72   83   100i   123
  N   73   84   124
  S   74   85   125
  K   75   86   126
  N   76   87   127
  T   77   88   128
  L   78   89   129
  Y   79   90   130
  L   80   91   131
  Q   81   92   132
  M   82   93   133
  N   82a   94   134
  S   82b   95   135
  L   82c   96   136
  R   83   97   D   101   137
  A   84   98   P   102   138
  E   85   99   W   103   139
  D   86   100   G   104   140
  T   87   101   Q   105   141
  A   88   102   G   106   142
  V   89   103   T   107   143
  Y   90   104   L   108   144
  Y   91   105   V   109   145
  C   92   106   T   110   146
  A   93   107   V   111   147
  K   94   108   S   112   148
  T   95   109   S   113   149
  Y   96   110
  E   97   111
  G   98   112
  P   99   113
  T   100   114
  Y   100a   115
  F   100b   116
  A   100c   117
  S   100d   118
  100e   119
  100f   120
表2a
Figure BPA00001517010400551
*VL CDR3位置：Y91，P93还按照与Kabat的C88的距离进行编号；
              R96还按照与Kabat的F98的距离进行编号。
**VH CDR3位置：由于CDR3(重链)的异质性，位置还按照与
               D101(在Kabat中不变)的距离进行命名。
表2b
Figure BPA00001517010400561
表3a
Figure BPA00001517010400571
*VL CDR3位置：Y91，P93还按照与Kabat的C88的距离进行编号；
              R96还按照与Kabat的F98的距离进行编号。
**VH CDR3位置：由于CDR3(重链)的异质性，位置还按照与
               D101(在Kabat中不变)的距离进行命名。
表3b
  变体组合   测试的组合
  HC
  R95 S102   R95D  S102V
  H94R95  V100 S102   H94R R95D  V100F S102V
  HC/LC
  P61 V85/L46   P61R V85E/L46R
  R95 S102/L37 Q45   R95D S102V/L37Q Q45R
  H94 R95/L46   H94R R95D/L46R
  LC
  L37 Q45   L37Q Q45R
表4
Figure BPA00001517010400591
Figure BPA00001517010400601
Figure BPA00001517010400611
VL CDR3位置：Y91、P93还按照与Kabat的C88的距离进行编号，R96还按照与Kabat的F98的距离进行编号。
**VH CDR3位置：由于CDR3(重链)的异质性，位置还按照与D101(在Kabat中不变)的距离进行命名。
所有显示的数据是相对于野生型。

Claims (58)

1.改进免疫球蛋白的可产生性的方法，包括：
鉴定具有VL结构域和VH结构域的母体免疫球蛋白，
在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中的框架聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段中引入取代，和/或
在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中的框架区聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段中引入取代，和/或
在所述母体免疫球蛋白的CH1结构域中的恒定区聚集倾向区段中引入取代，
从而产生具有VL结构域和VH结构域的变体免疫球蛋白，相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白表现出改进的可产生性。
2.变体免疫球蛋白，包含：
轻链可变(VL)结构域，其在框架(FR)聚集倾向区段和/或互补决定区3(CDR3)聚集倾向区段中包含取代；
重链可变(VH)结构域，其在框架区聚集倾向区段和/或CDR3聚集倾向区段中包含取代；和/或，
重链恒定区1(CH1)结构域，其在CH1聚集倾向区段中包含取代。
3.如权利要求1所述的方法或如权利要求2所述的变体免疫球蛋白，其中相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白在表达时表现出降低的聚集倾向和增加的产生能力。
4.如权利要求3所述的变体免疫球蛋白或方法，其中相对于所述母体免疫球蛋白，所述变体免疫球蛋白表现出产生能力增加至少20％和聚集倾向降低至少30％。
5.如权利要求3或4所述的变体免疫球蛋白或方法，其中在所述母体免疫球蛋白的VL结构域中的VL第37位聚集倾向区段和/或VL第45位聚集倾向区段中引入取代；和/或
在所述母体免疫球蛋白的VH结构域中的VH FR1聚集倾向区段、VH第95位聚集倾向区段以及VH CDR3聚集倾向区段中引入取代。
6.如权利要求5所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述取代在选自所述VH结构域序列的第1位、第17位、第94位、第95位、第96位、第100位、第100d位和第102位的位置和/或选自所述VL结构域序列的第37位、第45位和第46位的位置引入。
7.如权利要求6所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域序列中第37位的残基被取代为Q或N。
8.如权利要求7所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含L37Q取代。
9.如权利要求6-8中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域序列中第45位的残基被取代为E、K、R、Q或V。
10.如权利要求9所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含T45E、T45K、T45R、T45Q或T45V取代。
11.如权利要求6-10中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域序列中第46位的残基被取代为L或Y。
12.如权利要求11所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含T46L或T46Y取代。
13.如权利要求6-12中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域序列中第1位的残基被取代为E、Q、D、A或V。
14.如权利要求13所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含Q1E、Q1D、Q1A或Q1V取代或E1Q、E1D、E1A或E1V取代。
15.如权利要求6-14中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域序列中第17位的残基被取代为R。
16.如权利要求15所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含G17R取代。
17.如权利要求6-16中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域序列中第94位的残基被取代为R。
18.如权利要求17所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含H94R取代。
19.如权利要求6-18中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域序列中第95位的残基被取代为D。
20.如权利要求19所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含R95D取代。
21.如权利要求6-20中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域序列中第96位的残基被取代为A。
22.如权利要求21所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含G96A取代。
23.如权利要求6-22中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域序列中第100d位的残基被取代为F、G、L、P或M。
24.如权利要求23所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含S100dF、S100dG、S100dL、S100dP或S100dM取代。
25.如权利要求6-24中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域序列中第102位的残基被取代为A、F、H、I、L、V或Y。
26.如权利要求25所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含P102A、P102F、P102H、P102I、P102L、P102Y、P102V或S102V取代。
27.如权利要求3-26中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中相对于所述母体免疫球蛋白序列，所述变体免疫球蛋白的序列具有多至10处氨基酸取代。
28.如权利要求3-27中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域的序列在VH FR1聚集倾向区段和VH CDR3聚集倾向区段中包含取代。
29.如权利要求28所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域的序列在第1位和第102位包含取代。
30.如权利要求29所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第102位的残基被取代为A、F、H、I、L、V或Y，并且其中所述第1位的残基被取代为E、Q、D、A或V。
31.如权利要求30所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含P102Y取代和Q1A或Q1E取代。
32.如权利要求3-31中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域的序列在VH第95位聚集倾向区段和VH CDR3聚集倾向区段包含取代。
33.如权利要求32所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域的序列在第95位和第102位包含取代。
34.如权利要求33所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第102位的残基被取代为A、F、H、I、L、V或Y，并且其中第95位的残基被取代为E或D。
35.如权利要求34所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含S102V取代和R95D取代。
36.如权利要求33-35中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域还在第94位和第100位包含取代。
37.如权利要求36所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第94位的残基被取代为R，并且所述第100位的残基被取代为F。
38.如权利要求37所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含H94R取代和V100F取代。
39.如权利要求3-38中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述变体免疫球蛋白的VL结构域序列在第37位聚集倾向区段和第45位聚集倾向区段包含取代。
40.如权利要求39所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述变体免疫球蛋白的VL结构域序列在第37位和第45位包含取代。
41.如权利要求40所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述第37位的残基被取代为Q或N，并且其中所述第45位的残基被取代为R、K或E。
42.如权利要求41所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含L37Q取代和Q45R取代。
43.如权利要求3-42中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VL结构域包含S102V取代和R95D取代，并且所述VL结构域包含L37Q取代和Q45R取代。
44.如权利要求3-43中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在VH第95位聚集倾向区段包含一处或多处取代，并且所述VL结构域在第45位聚集倾向区段包含一处或多处取代。
45.如权利要求44所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第94位和第95位包含取代，并且VL结构域在第46位包含取代。
46.如权利要求45所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域中第94位的残基被取代为R、K或T，并且VH结构域中第95位的残基被取代为E或D，并且VL结构域中第46位的残基被取代为K、R、H、F或S。
47.如权利要求46所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含H94R和R95D取代，并且所述VL结构域包含L46R取代。
48.如权利要求3-47中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述变体免疫球蛋白的VH结构域在VH CDR3聚集倾向区段包含两处或更多处取代。
49.如权利要求48所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域在第100d位和第102位包含取代。
50.如权利要求49所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述VH结构域包含S100dF和P102V取代；S100dM和P102V取代；S100dF和P102Y取代；或S100dM和P102Y取代。
51.如前述权利要求中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述变体免疫球蛋白是人源化的。
52.如前述权利要求中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述变体免疫球蛋白在重组系统中表达。
53.如前述权利要求中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中所述变体免疫球蛋白在表达后进行分离和/或纯化。
54.如前述权利要求中任一项所述的变体免疫球蛋白或方法，其中将所述变体免疫球蛋白与药学上可接受的赋形剂一起配制。
55.评价免疫球蛋白的可产生性的方法，包括：
鉴定一个或多个选自以下的位置处的氨基酸残基：所述免疫球蛋白的VL结构域中的第37位、第45位和第46位，VH结构域中的第1位、第17位、第94位、第95位、第96位、第100位、第100d位和第102位，
其中在所述免疫球蛋白的VL结构域中，如果第37位的残基不是Q，第45位的残基不是E、K、R、Q或V，优选不是K或R，第46位的残基不是L或Y，优选不是L；和/或
在所述免疫球蛋白的VH结构域中，如果第1位的残基不是A、D、E、Q或V，第17位的残基不是R，第94位的残基不是R，第96位的残基不是A，第100d位的残基不是F、G、L、M或P，优选不是F或M，第102位的残基不是A、F、H、I、L、V或Y，优选不是V或Y；
则表明所述免疫球蛋白的可产生性是次优的。
56.如权利要求55所述的方法，包括所述免疫球蛋白的可产生性是次优的，以及通过权力要求1和3至54中任一项所述的方法来改进所述免疫球蛋白的可产生性。
57.制备具有改进的可产生性的免疫球蛋白的方法，包括：
提供编码通过权力要求1和3至46中任一项所述的方法产生的变体免疫球蛋白的核酸，
在能引起所述变体免疫球蛋白产生的条件下表达所述核酸，并且将所述变体免疫球蛋白回收。
58.如权利要求57所述的方法，包括将所述变体免疫球蛋白配制在组合物中，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。
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