MX2012002100A - Inmunoglobulinas variantes con fabricacion mejorada. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la modificación de las secuencias de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina en ciertas posiciones clave dentro de regiones de los dominios de FR y CDR3 de VH y VL y/o el dominio CH1 que están propensas a agregación. Las inmunoglobulinas modificadas como se describe pueden mostrar producción mejorada, por ejemplo, propensión reducida a agregación y/o niveles incrementados de producción.

Description

I MÜNOGLOBULINAS VARIANTES CON FABRICACION MEJORADA Campo de la Invención Esta invención se refiere a la expresión de moléculas de anticuerpo, y en particular, a la producción de moléculas de anticuerpo con fabricación mejorada.

Antecedentes de la Invención El término "agregación" describe una amplia variedad de fenómenos, todos relacionados a la autoasociación de proteínas, que pueden presentarse en múltiples ambientes, desde cultivo y fermentación celular, a procesos de aislamiento, purificación y formulación. Por ejemplo, frecuentemente se usa "agregación" cuando se describe la formación de inclusiones; la acumulación de proteína en fracciones "insolubles" después del fraccionamiento celular; la aparición de turbidez, precipitación o formación de proteínas de partículas en muestras; o la formación de oligómeros solubles pequeños entre otros. En este contexto, la agregación de proteínas, entendida como "auto-asociación anormal" de cadenas de polipéptido, puede tener múltiples orígenes y manifestaciones que son bastante dependientes tanto de la naturaleza de las moléculas comprendidas como del ambiente en el cual se producen, aislan, almacenan y administran los polipéptidos .

La estructura tridimensional de un polipéptido determina su función fisiológica natural. Típicamente, las proteínas adquieren su estructura nativa después de que se sintetizan en el ribosoma. El proceso de plegado de proteínas se codifica fundamentalmente en la secuencia de aminoácidos de una proteína. Sin embargo, el plegado también se puede ayudar in vivo por varios auxiliares moleculares y mecanismos de control de calidad que aseguran que los polipéptidos logren su estructura biológicamente activa, propuesta, evitando la población de conformaciones anormales en el proceso. Estos auxiliares externos y elementos de control de calidad incluyen. chaperones, disulfuro- isomerasas , modificaciones postransduccionales (es decir, procesamiento proteolótico, acilación, glicosilación, etc.), y el sistema de ubiquitina-proteosoma .

Adicionalmente, se activa la agregación de proteínas por la estabilidad intrínseca de proteínas en solución. Las proteínas son sólo marginalmente estables en solución, y está relativamente baja estabilidad es crucial al conferir propiedades biológicas específicas en tanto que ofrece buenos mecanismos de regulación para controlar su acción. Sin embargo, extrayendo los polipéptidos de su ambiente natural, por ejemplo para desarrollarlos como fármacos, impone varias restricciones estrictas en su producción, aislamiento y formulación que puede tener un gran impacto en su comportamiento de estabilidad y agregación.

Las alteraciones al ambiente nativo de una proteína dada, particularmente debido a los requisitos específicos de producción y proceso, pueden tener un impacto dramático en su rendimiento y estabilidad en solución. Este problema se exacerba por requisitos de proceso para incrementar los rendimientos, por ejemplo: síntesis artificial, expresión heteróloga (es decir, expresión procariótica de proteínas de mamífero) , el uso de rutas secretorias versus no secretorias, saturación de la maquinaria de síntesis de proteínas; o dificultades adicionales presentadas por las proteínas no naturales, tal como fusiones o fragmentos de polipéptido. Por ejemplo, la expresión de proteínas de mamífero en sistemas heterólogos presenta numerosos riesgos. Esto es debido al hecho que estos sistemas carecen usualmente del ambiente molecular adecuado para garantizar un plegado y procesamiento "nativo" .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere al hallazgo que la modificación de la secuencia de aminoácidos de moléculas de inmunoglobulina en ciertas posiciones clave conduce a mejoras en la fabricación, y en particular a reducciones en la propensión de agregación y/o incrementa los niveles de producción .

Un aspecto de la invención proporciona un método para producir una inmunoglobulina variante, que comprende: proporcionar una inmunoglobulina progenitora, introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación de una región menos variable de dominio VL y/o CDR3 de VL de la inmunoglobulina progenitora; y/o introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación de una región menos variable de VH y/o una CDR3 de VH; y/o, introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación del dominio de región constante CHl de la cadena pesada (CH) de la inmunoglobulina progenitora, produciendo de este modo una inmunoglobulina variante .

La inmunoglobulina variante puede tener fabricación mejorada con relación a la inmunoglobulina progenitora. Por ejemplo, la inmunoglobulina variante puede presentar propensión reducida a agregación, y/o productividad incrementada en la expresión, con relación a la inmunoglobulina progenitora.

Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede presentar un incremento en la productividad de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, o al menos 500 % con relación a la inmunoglobulina progenitora y/o una disminución en la agregación (es decir, una reducción en la proporción de moléculas en el conjunto de estado nativo que se agregan) de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 99 % con relación a la inmunoglobulina progenitora. Una inmunoglobulina variante puede presentar una disminución en la agregación de hasta 100 % con relación a la inmunoglobulina progenitora (es decir, abolición completa de la agregación) .

Las mejoras en la fabricación pueden resultar completamente o parcialmente de propensión reducida de agregación con relación a la inmunoglobulina progenitora.

La propensión a la agregación se refiere a la tendencia de la inmunoglobulina para formar agregados insolubles después de la expresión en un sistema recombinante . Las reducciones en la propensión a agregación reducen la proporción de moléculas en el conjunto de estado nativo de la inmunoglobulina que existe en una forma agregada (Carpenter et al, 2009 J Pharm Sci Apr; 98 (4) : 1201-5) . En otras palabras, la proporción de moléculas dentro del conjunto de estado nativo de una inmunoglobulina variante que existe en una forma agregada o insoluble es menor que la proporción dentro del conjunto de estado nativo de la inmunoglobulina progenitora.

Una inmunoglobulina variante puede mostrar menos auto-asociación o agregación en comparación a una inmunoglobulina progenitora ya sea bajo condiciones nativas o a una temperatura incrementada (por ejemplo, 60 °C) (es decir, condiciones bajo las cuales no se despliega el sitio de unión a antígeno de una inmunoglobulina) . De manera preferente, la inmunoglobulina variante muestra menos auto—asociación o agregación que la inmunoglobulina progenitora bajo condiciones nativas (por ejemplo, condiciones que no conducen al desplegado de la inmunoglobulina) .

La propensión a la agregación como se describe en la presente es distinta de la eficiencia de replegado térmico (TRE por sus siglas en inglés) , que se refiere a la capacidad de una proteína para replegarse correctamente después de la desnaturalización térmica, y se mide típicamente usando dicroísmo circular (CD por sus siglas en inglés) (Tanha et al Protein Eng Des Sel. 2006 Nov; 19 (11) : 503-9) . Las reducciones en la propensión de agregación de una inmunoglobulina como se describe en la presente pueden tener poco o ningún efecto en la eficiencia de replegado térmico de la inmunoglobulina. Por lo tanto, la eficiencia de replegado térmico es independiente de la propensión a agregación y no tiene un impacto significativo en la fabricación de una inmunoglobulina.

Se puede medir la agregación por métodos convencionales. Las técnicas adecuadas incluyen GP-HPLC, HPLC y AUC (Gabrielson JP et al J Pharm Sci 2007 96(2) : 268-79), pérdida de proteína después de filtración; turbidez; unión a tinte fluorescente (por ejemplo, Rojo de Nilo, tioflavina T o ácido 8-anilino-l-naftalenosulfónico; ver por ejemplo Hawe, A. et al Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99 o Demeule, B et al 2007 Int J Pharm 329: 37-45), fraccionamiento de flujo de campo (FFF; Demeule, B et al. mAbs 2009 1(2): 142-150), y ultracentrifugación analítica (AU/AUC; Liu J et cal. AAPS J 2006 8 : 580-9).

Otros métodos adecuados se describen en Arvinte T. In "Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals" AAPS Press, 2005: 661-6 y Kiese S et al J Pharm Sci 2008 97(10): 4347-66.

Las mejoras en la fabricación pueden resultar completamente o parcialmente de productividad incrementada con relación a la inmunoglobulina progenitora.

Una inmunoglobulina variante puede presentar productividad incrementada con respecto a la inmunoglobulina progenitora. Por ejemplo, la inmunoglobulina variante puede mostrar rendimientos o títulos incrementados en comparación a una inmunoglobulina progenitora cuando se exprese en un sistema recombinante , por ejemplo, células bacterianas o mamíferas. La productividad se puede medir usando técnicas normales, tal como el ensayo de Bradford, espectrofotometría y ELISA.

Una inmunoglobulina variante también puede presentar uno o más de rendimientos mejorados de purificación; problemas reducidos de formulación; inmunogenicidad reducida y biodisponibilidad incrementada con relación a la inmunoglobulina progenitora.

En modalidades preferidas, las mejoras en la fabricación pueden resultar de tanto propensión reducida a agregación como de productividad incrementada con relación a la inmunoglobulina progenitora.

De manera preferente, una inmunoglobulina variante presenta la misma o sustancialmente la misma actividad como la inmunoglobulina progenitora (es decir, actividad de unión a antígeno) .

Una inmunoglobulina es un polipéptido o proteína que comprende un sitio de unión a antígeno. Un sitio de unión a antígeno es la parte de una inmunoglobulina que se une específicamente a y es espacialmente complementaria a parte o todo el antígeno. Donde un antígeno es grande, una inmunoglobulina puede unirse sólo a una parte particular del antígeno, parte que se llama un epítopo. De manera preferente un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina, que pueden estar en las mismas o diferentes cadenas de polipéptido.

Los ejemplos de inmunoglobulina incluyen anticuerpos enteros, incluyendo isótopos de anticuerpo, tal como IgG, IgA, IgD, IgM e IgE y sus subclases isotípicas, tal como IgGl e IgG4 ; fragmentos de anticuerpo; y derivados manejados de anticuerpo, tal como inmunoproteínas pequeñas (SIP por sus siglas en inglés), anticuerpos miniaturizados , dominios VHH de camélidos y diacuerpos .

Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen (i) el fragmentos Fab que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un anticuerpo individual; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste de un dominio VH o VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) moléculas de Fv de cadena individual (scFv) , en donde se enlazan un dominio VH y un dominio VL por un ligador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros de Fv de cadena individual bi-específicos (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecxficos construidos por fusión génica (W094/13804; P. Holliger et al, Proc . Nati. Acad. Sci USA 90 6444-6448, 1993) . Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo se pueden estabilizar por la incorporación de puentes de disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Y. Reiter et al. Nature Biotech 14 1239-1245 1996) . También se pueden producir minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (S. Hu et al, Cáncer Res. 56 3055-3061 1996) .

Las inmunoglobulinas pueden ser naturales, completa o parcialmente sintéticas. Las inmunoglobulinas quiméricas pueden comprender un dominio de unión a antígeno, o equivalente, fusionado a otro polipéptido que se incluyen. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en EP-A-0120694 y EP-A- 0125023. Varias inmunoglobulinas artificiales que incluyen uno o más sitios de unión a antígeno se han manejado, incluyendo por ejemplo Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos .

En algunas modalidades preferidas, las inmunoglobulinas progenitoras y variantes como se describe en la presente son anticuerpos enteros o fragmentos de anticuerpo que comprenden tanto los dominios VH como VL.

Las inmunoglobulinas se pueden aislar u obtener por purificación de fuentes naturales, o también obtener por recombinación genética, o por síntesis química, como se describe en la presente. Por ejemplo, se pueden crear inmunoglobulinas sintéticas por expresión de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y montados dentro de vectores adecuados de expresión, tal como se describe por Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86 o Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84.

Las inmunoglobulinas se pueden glicosilar, ya sea de manera natural, in vitro, o ex vivo, por ejemplo, usando sistemas de células eucarióticas heterólogas (por ejemplo, células CHO) , o pueden estar no glicosiladas (por ejemplo, si se producen por expresión en una célula procariótica) . De manera preferente, una inmunoglobulina glicosilada no comprende fucosa .

Una inmunoglobulina progenitora adecuada puede ser cualquier inmunoglobulina que tiene una secuencia conocida de aminoácidos y se produce por expresión recombinante en un sistema heterólogo de expresión. Los sistemas heterólogos de expresión incluyen células de mamífero, tal como células CHO, células insectiles, células de levadura y células bacterianas, tal como E. coli, en particular para fragmentos de anticuerpo, y se describen en más detalle más adelante.

Una inmunoglobulina progenitora adecuada para modificación como se describe en la presente puede presentar fabricación subóptima. En otras palabras, la inmunoglobulina progenitora puede presentar uno o más rasgos indeseables de producción, tal como agregación incrementada y/o productividad reducida con relación a inmunoglobulinas de control, cuando se expresa de forma recombinante a una escala de fabricación en un sistema heterólogo.

Las inmunoglobulinas de control adecuadas incluyen inmunoglobulinas del mismo tipo que presentan fabricación satisfactoria en el mismo sistema heterólogo. Cuando se expresa a una escala de fabricación en un sistema mamífero, una inmunoglobulina progenitora adecuada puede producir por ejemplo rendimientos de 1 g/L o menos de material soluble, como se mide por ELISA y/o 5 % o más de agregación, como se mide por GP-HPLC. Cuando se expresa una escala de fabricación en un sistema bacteriano, una inmunoglobulina progenitora puede producir, por ejemplo, rendimientos de 0.5 g/L o menos de material soluble, como se mide por ELISA, y/o 5 % o más de agregación, como se mide por GP-HPLC.

Un método puede comprender determinar la fabricación de una inmunoglobulina progenitora, por ejemplo al medir los niveles de producción y la propensión a agregación como se describe en la presente. Una inmunoglobulina progenitora que produce bajos rendimientos (por ejemplo, lg/L o menos de material soluble en un sistema mamífero) y/o alta propensión a agregación (por ejemplo, 5 % o más de agregación) se puede identificar como que presenta fabricación subóptima.

La modificación de la secuencia de la inmunoglobulina progenitora como se describe en la presente puede ser útil al incrementar u optimizar su fabricación.

En modalidades preferidas, la inmunoglobulina progenitora puede ser un anticuerpo terapéutico, es decir, un anticuerpo que se une a un antígeno terapéuticamente pertinente para lograr un efecto terapéutico benéfico. En la técnica se conocen numerosos ejemplos de anticuerpos terapéuticos .

Una inmunoglobulina variante es una inmunoglobulina que no se presenta de forma natural que se une al mismo antígeno objetivo o diana como la inmunoglobulina progenitora pero que posee una diferente secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia de la inmunoglobulina variante puede diferir en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 o más residuos de aminoácido, con relación a la secuencia de la inmunoglobulina progenitora. De manera preferente, la secuencia de la inmunoglobulina variante difiere de la secuencia de inmunoglobulina progenitora sólo por una o más sustituciones en segmentos propensos a agregación, como se describe en la presente. En otras palabras, con la excepción de una o más sustituciones descritas en la presente, la secuencia de la inmunoglobulina variante es preferentemente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina progenitora.

La inmunoglobulina variante se une al mismo epítopo como la inmunoglobulina progenitora y compite para la unión al antígeno con la inmunoglobulina progenitora. La competición entre inmunoglobulinas se puede valorar fácilmente in vitro, por ejemplo usando ELISA y/o al marcar una molécula indicadora específica a una inmunoglobulina que se puede detectar en la presencia de otra inmunoglobulina no marcada. Cuando la inmunoglobulina progenitora es un anticuerpo terapéutico, la inmunoglobulina variante logra preferentemente el mismo efecto terapéutico benéfico.

El dominio de unión a antígeno de una inmunoglobulina como se describe en la presente comprende de manera preferente un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) . Los dominios VH y VL de inmunoglobulina comprenden cada uno tres CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) que están separados por regiones menos variables (FR1, FR2, FR3 y FR4 ) . Las CDR son regiones hipervariables dentro del dominio variable que contienen la mayoría de los residuos de aminoácido responsables de la unión específica del anticuerpo al antígeno o epítopo que lo reconoce. La longitud de la CDR puede variar de 2 a 26 aminoácidos, dependiendo de la longitud que se pueda acomodar por la región menos variable subyacente, particular.

De manera preferente, las inmunoglobulina para el uso como se describe en la presente carecen de intra- o inter-enlaces de disulfuro de CDR.

Los dominios CD1, VH y VL de inmunoglobulina progenitora, adecuados para el uso como se describe en la presente se pueden obtener de cualquier línea germinal o dominio variable humano re-arreglado, o pueden ser un dominio variable sintético en base a secuencias de consenso de dominios variables humanos conocidos. En algunas modalidades, los dominios VH y VL de una inmunoglobulina variante que se produce pueden carecer de una o más secuencias de CDR (por ejemplo, CDR3) por ejemplo para el uso en manejo de anticuerpos, como se describe más adelante.

La inmunoglobuli a variante puede presentar fabricación mejorada tal como agregación reducida y/o productividad incrementada con relación a las inmunoglobulinas progenitoras cuando se expresa de forma recombinante a una escala de fabricación en un sistema heterólogo. Cuando se expresa a una escala de producción en un sistema mamífero, una inmunoglobulina variante puede producir por ejemplo rendimientos de más de lg/L de material soluble, como se mide por ELISA, y/o menos de 5 % de agregación, como se mide por GP-HPLC. De manera preferente, una inmunoglobulina variante como se describe en la presente produce tanto, rendimientos de más de lg/L de material soluble y presenta menos de 5 % de agregación. Cuando se expresa una escala de producción en un sistema bacteriano, una inmunoglobulina variante puede producir por ejemplo rendimientos de más de 0.5g/L de material soluble, como se mide por ELISA, y/o menos de 5 % de agregación, como se mide por GP-HPLC. De manera preferente, la inmunoglobulina variante como se describe en la presente produce tanto, rendimientos de más de 0.5g/L de material soluble y presenta menos de 5 % de agregación.

Un segmento propenso a agregación es una secuencia corta de residuos de aminoácido dentro de la secuencia de cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina que tiene una alta propensión a agregación con relación a una secuencia circundante y que afecta de forma adversa la fabricación de la inmunoglobulina. Un segmento propenso a agregación puede consistir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 residuos de aminoácido.

Un segmento propenso a agregación puede estar localizado, por ejemplo, en el dominio CH1, VH o VL de una inmunoglobulina. Un dominio o región individual de una inmunoglobulina, tal como una región FR1, FR2, FR3, FR4 o CDR3 de un dominio VH o VL o un dominio CH1 , puede poseer múltiples segmentos propensos a agregación dentro de su secuencia. La sustitución de uno o más residuos en uñó más de estos segmentos propensos a agregación como se describe en la presente puede mejorar la fabricación de la inmunoglobulina como se describe en la presente.

Las posiciones de los residuos de la inmunoglobulina, descritas más adelante, se enumeran de acuerdo al esquema expuesto en Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesmann, K.S & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological lnterest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242. U. S .Department of Health and Human Services .

Donde es apropiado, la posición de una sustitución se puede describir con relación a un residuo numerado por Kabat que es invariante en las secuencias de inmunoglobulina .

Un esquema alternativo de numeración de anticuerpos se describe en Honegger, A y Plückthun A. 40 (2001) . Yet Another Numbering Scheme for Immunoglobulin Variable Domains : An Automatic Modelling and Analysis Tool. J". Mol. Biol 309, 657-670. Las Tablas la y Ib muestran la correspondencia entre los esquemas de numeración de Honegger y Kabat .

Un aminoácido sustituido en un segmento propenso a agregación como se describe en la presente es de manera preferente uno de los 20 aminoácidos que se presentan de forma natural . Los aminoácidos que se presentan de forma natural y sus abreviaciones normales de una y tres letras son bien conocidos en la técnica (Principies of Protein Structure G. Schulz & R. Schirmer. (1979) Springer- Verlag NY Inc EUA) .

Se puede introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación dentro de una región menos variable de dominio VL de la inmunoglobulina progenitora. Un segmento adecuado propenso a agregación de una región menos variable de dominio VL se puede seleccionar del grupo que consiste del segmento propenso a agregación de la posición 20, el segmento propenso a agregación de la posición 37, el segmento propenso a agregación de la posición 45 y el segmento propenso a agregación de la posición 74.

El segmento propenso a agregación de la posición 20 está localizado en la región menos variable 1 de VL y se extiende desde la posición 15 a la posición 23 del dominio VL.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 20 puede presentarse en la posición 18 del dominio VL.

El residuo de aminoácido en la posición 18 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 18 se sustituye por R, S, o V.

Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 18 en la inmunoglobulina progenitora puede ser T. La inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución T18R, T18S o T18V.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 20 puede presentarse en la posición 20 del dominio VL.

El residuo de aminoácido en la posición 20 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 20 se sustituye por K, R, S o V.

Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 20 en la inmunoglobulina progenitora puede ser T. La inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución T20K, T20R, T20S o T20V.

El segmento propenso a error de la posición 37 está localizado en la región menos variable 2 de VL y se extiende desde la posición 36 a la posición 38 del dominio VL.

Una sustitución dentro del segmento propenso a error de la posición 37 puede presentarse en la posición 37.

El residuo de aminoácido en la posición 37 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 37 se sustituye por Q o N.

Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 37 en la inmunoglobulina progenitora puede ser L. La inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución L37Q.

El segmento propenso a error de la posición 45 está localizado en la región menos variable 2 de VL y se extiende desde la posición 42 a la posición 49 del dominio VL.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 45 puede presentarse en la posición 45.

El residuo de aminoácido en la posición 45 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 45 se sustituye por E, K, R, Q o V.

Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 45 en la inmunoglobulina progenitora puede ser T. La inmunoglobulina progenitora puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución T45E, T45K, T45R, T45Q o T45V. El residuo de aminoácido en la posición 45 en la inmunoglobulina progenitora puede ser Q. La inmunoglobulina progenitora puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución Q45E, Q45K o Q45R.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 45 puede presentarse en la posición 46.

El residuo de aminoácido en la posición 46 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 46 se sustituye por L, Y, K, R, H, F o S.

Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 46 en la inmunoglobulina progenitora puede ser T. La inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución T46L o T46Y. El residuo de aminoácido en la posición 46 en la inmunoglobulina progenitora puede ser L. La inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución L46K, L46R, L46H, L46F o L46S.

El segmento propenso a agregación de la posición 74 está localizado en la región menos variable 3 de VL y se extiende desde la posición 71 a la posición 77 de la secuencia de dominio VL.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 74 puede presentarse en la posición 74.

El residuo de aminoácido en la posición 74 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 74 está sustituido por V.

Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 74 en la inmunoglobulina progenitora puede ser T. La inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución T74V.

Se puede introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación dentro de una CDR3 de VL de la inmunoglobulina progenitora. Un segmento adecuado propenso a agregación se puede seleccionar del grupo que consiste del segmento propenso a agregación, N-terminal, de CDR3 de VL y el segmento propenso a agregación C-terminal de CDR3 de VL.

El segmento propenso a agregación N-terminal de CDR3 de VL se extiende desde el residuo invariante C88 a la posición C-terminal de ocho aminoácidos del residió C88 en la secuencia de dominio VL. Por ejemplo, el segmento propenso a agregación N-terminal de CDR3 de VL puede extenderse desde la posición 88 a la posición 95a del dominio VL.

El residuo de aminoácido en una o más de las posiciones 88 (C88) , 89 (C88+1; es decir, un residuo C-terminal del residuo C88) , 90 (C88+2) , 91 (C88+3) , 92 (C88+4), 93 (C88+5) , 94 (C88+6) , 95 (C88+7) y 95a (C88+8) en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. Las posiciones de CDR3 de VL numeradas con relación al residuo C88 invariante de Kabat se muestran entre paréntesis .

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación, N-terminal, de CDR3 de VL puede presentarse en la posición 91 (C88+3) .

El residuo de aminoácido en la posición 91 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 91 se sustituye por A, F, L, R, S o W. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 91 en la inmunoglobulina progenitora puede ser Y. La inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución Y91A, Y91F, Y91L, Y91R, Y91S o Y91W.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación, N-terminal , de CDR3 de VL puede presentarse en la posición 91 (C88+5) .

El residuo de aminoácido en la posición 93 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 93 se sustituye por D, F, L, Q, S, T, o Y. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 93 en la inmunoglobulina progenitora puede ser P y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución P93D, P93F, P93L, P93Q, P93S, P93T, P93W o P93Y.

El segmento propenso a agregación C-terminal de CDR3 de VL se extiende desde la posición N-terminal de tres aminoácidos del residuo invariante F98 (es decir, la posición F98-3 o 95) al a posición 99 de la secuencia del dominio VL.

El residuo de aminoácido en una o más de las posiciones 95 (F98-3), 96(F98-2), 97(F98-1), 98 o 99 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación, C-terminal de CDR3 de VL puede presentarse en la posición 96 (F98-2) . La posición de CDR3 de VL como se enumera por proximidad al residuo F98 de Kabat se muestra en paréntesis.

El residuo de aminoácido en la posición 96 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 96 se sustituye por E, L, V o W.

Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 96 en la inmunoglobulina progenitora puede ser R y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución R96E, R96L, R96V o R96W.

Se puede introducir una sustitución en el segmento propenso a agregación dentro de una región menos variable de dominio VH de la inmunoglobulina progenitora. Un segmento adecuado propenso a agregación de una región menos variable de dominio VH se puede seleccionar del grupo que consiste del segmento propenso a agregación de FR1; el segmento propenso a agregación de la posición 75; el segmento propenso a agregación de la posición 95; y el segmento propenso a agregación de la posición 102 (o segmento propenso a agregación de CDR3) .

El segmento propenso a agregación de FR1 está localizado en la región menos variable 1 de VH y se puede extender por ejemplo desde la posición 1 a la posición 21 de la secuencia de dominio VH.

Un segmento propenso a agregación de FR1 de VH puede comprender un segmento propenso a agregación seleccionado del grupo que consiste de las posiciones 1 a 3 ; posiciones 4 a 6, posiciones 11 a 13, y posiciones 16 a 21.

Un segmento propenso a agregación de FRl de VH puede extenderse de la posición 1 a la posición 3 de la secuencia de dominio VH.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de FRl de VH puede presentarse en la posición 1.

El residuo de aminoácido en la posición 1 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 1 se sustituye por E, Q, D, A o V. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 1 en la inmunoglobulina progenitora puede ser E y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución E1Q, E1D, E1A o E1V o el residuo de aminoácido en la posición 1 en la inmunoglobulina progenitora puede ser Q y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución Q1E, Q1D, Q1A o Q1V.

Un segmento propenso a agregación de FRl de VH puede extenderse desde la posición 4 a la posición 6 del dominio VH.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de FRl de VH puede presentarse en la posición 5 del dominio VH.

El residuo de aminoácido en la posición 5 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 5 se sustituye por V. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 5 en la inmunoglobulina progenitora puede ser L y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución L5V.

Un segmento propenso a agregación de FR1 de VH puede extenderse desde la posición 11 a la posición 13 del dominio VH.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de FR1 de VH puede presentarse en la posición 12 del dominio VH.

El residuo de aminoácido en la posición 12 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 12 se sustituye por VH. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la- posición 12 en la inmunoglobulina progenitora puede ser L y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución L12V.

Un segmento propenso a agregación de FR1 de VH puede extenderse desde la posición 16 a la posición 21 del dominio VH.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de FRl de VH puede presentarse en la posición 17.

El residuo de aminoácido en la posición 17 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 17 se sustituye por R. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 17 en la inmunoglobulina progenitora puede ser G y la inmunoglobulina progenitora puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución G17R.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de FRl de VH puede presentarse en la posición 19.

El residuo de aminoácido en la posición 19 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 19 se sustituye por T o V. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 19 en la inmunoglobulina progenitora puede ser L y la inmunoglobulina progenitora puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución L19T o L19V.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de FRl de VH puede presentarse en la posición 20.

El residuo de aminoácido en la posición 20 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 20 se sustituye por A, K, S o T. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 20 en la inmunoglobulina progenitora puede ser R y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución R20A, R20K, R20S o R20T.

Un segmento propenso a agregación de la posición 75 puede extenderse desde la posición 60 a la posición 85 del dominio VH.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 75 puede presentarse en la posición 61.

El residuo de aminoácido en la posición 61 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. Por ejemplo, el residuo en la posición 61 se puede sustituir por K R Q E D N o A. De manera preferente, el residuo en la posición 61 se sustituye por R. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 61 en la inmunoglobulina progenitora puede ser P y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución P61R.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 75 puede presentarse en la posición 85.

El residuo de aminoácido en la posición 85 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. Por ejemplo, el residuo en la posición 85 se puede sustituir pOor E, D, o A. De manera preferente, el residuo en la posición 85 se sustituye por E. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 85 en la inmunoglobulina progenitora puede ser V y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución V85E, V85D o V85A.

El segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH está localizado en la región menos variable 3 de VH y puede extenderse desde la posición 91 a la posición 99 o 100.

El residuo de aminoácido en una o más de las posiciones 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y/o 100 en el dominio VH de la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante .

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH puede presentarse en la posición 94.

El residuo de aminoácido en la posición 94 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. Por ejemplo, el residuo en la posición 94 se puede sustituir por R, o T. De manera preferente, el residuo en la posición 94 se sustituye por R. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 94 en la inmunoglobulina progenitora puede ser K y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución K94R o el residuo de aminoácido en la posición 94 en la inmunoglobulina progenitora puede ser H y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución H94R, H94K o H94T.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH puede presentarse en la posición 95.

El residuo de aminoácido en la posición 95 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. Por ejemplo, el residuo en la posición 95 se puede sustituir por E o D. De manera preferente, el residuo en la posición 95 se sustituye por D. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 95 en la inmunoglobulina progenitora puede ser R y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución R95E o R95D.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH puede presentarse en la posición 96.

El residuo de aminoácido en la posición 96 en la inraunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 96 se sustituye por A. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 96 en la inmunoglobulina progenitora puede ser G y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución G96A.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH puede presentarse en la posición 100.

El residuo de aminoácido en la posición 100 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. El residuo en la posición 100 se puede sustituir por F, G, L, M o P. De manera preferente, el residuo en la posición 100 se sustituye por F. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 100 en la inmunoglobulina progenitora puede ser V y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución V100F, V100G, V100L, V100M, o V100P.

Se puede introducir una sustitución en el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH de la inmunoglobulina progenitora .

El segmento propenso a agregación de CDR3 de VH se extiende desde la posición 100c (es decir, dos aminoácidos N-terminales del residuo invariante D101 o D101-2 como se enumera con relación al residuo D101 de Kabat) a la posición 102 o posición 103.

El residuo de aminoácido en una o más de las posiciones D101-2, D101-1, (dos o más aminoácidos N-terminales del residuo D101) , 101, 102 y 103 en el dominio VH de la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante .

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de CR3 de VH puede presentarse en la posición D101-2 (dos aminoácidos N-terminales del residuo D101) .

El residuo de aminoácido en la posición D101-2 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un residuo de aminoácido diferente en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición D101-2 se sustituye por D, E, F, G, P, S, T, W o Y. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición D101-2 en la inmunoglobulina progenitora puede ser A y la inmunoglobulina variante pude comprender un dominio VH que comprende una sustitución A(D101-2)D, A(D101-2)E, A(D101-2)F, A(D101-2)G, A(D101-2)P, A(D101-2)S, A(D101-2)T, o A(D101-2)W, o A(D101-2) Y. En otras palabras, una sustitución de A a D, ?, F, G, P, S, T, W, o Y en la posición dos aminoácidos N-término de D101, por ejemplo AlOOc.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de CDR3 de VH puede presentarse en la posición D101-1 (un aminoácido N-terminal de D101) .

El residuo de aminoácido en la posición D101-1 en la i munoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición D101-1 se sustituye por F, G, L, P o M. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición D101-1 en la inmunoglobulina progenitora puede ser S y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución S(D101-1)F, S(D101-1)G, S (D101-1) L, S(D101-1)P o S(D101-1)M. En algunas modalidades, el residuo S(D101-1) corresponde a SlOOd.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de CDR3 de VH puede presentarse en la posición 102.

El residuo de aminoácido en la posición 102 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 102 se sustituye por A, F, H, I, L, V o Y. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 102 de la inmunoglobulina progenitora puede ser P y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución P102A, P102F, P102H, P102I, P102L, P102Y o P102V o el residuo de aminoácido en la posición 102 en la inmunoglobulina progenitora puede ser S y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución S102A, S102F, S102H, S102I, S102L, S102Y o S102V.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de CDR3 de VH puede presentarse en la posición 103.

El residuo de aminoácido en la posición 103 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 103 se sustituye por I, L o V. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 103 en la inmunoglobulina progenitora puede ser W y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende una sustitución W103I, W103L o 103V.

El segmento propenso a agregación de CHl se extiende desde la posición 150 a la posición 156.

Una sustitución dentro del segmento propenso a agregación de CHl puede presentarse en la posición 153.

El residuo de aminoácido en la posición 153 en la inmunoglobulina progenitora se puede reemplazar por un diferente residuo de aminoácido en la inmunoglobulina variante. De manera preferente, el residuo en la posición 153 se sustituye por V. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 153 en la inmunoglobulina progenitora puede ser S y la inmunoglobulina variante puede comprender un dominio CH1 que comprende una sustitución S153V.

Una inmunoglobulina variante puede comprender hasta 10 sustituciones como se describe en la presente con relación a la secuencia de inmunoglobulina progenitora. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones.

Las sustituciones pueden estar en el mismo segmento propenso a agregación o en diferentes segmentos propensos a agregación. Por ejemplo, la inmunoglobulina variante puede comprender sustituciones en 1, 2, 3, 4 o más segmentos diferentes propensos a agregación como se describe en la presente. Una inmunoglobulina variante puede comprender sustituciones en el dominio VH, el dominio VL y/o la región CH1.

Cualquier combinación de las sustituciones descritas en la presente se puede emplear. Los ejemplos de combinaciones adecuadas de sustituciones se muestran en las Tablas 3a y 3b.

En algunas modalidades, una inmunoglobulina variante puede comprender dos sustituciones en el dominio de FR1 y/o FR2 de VL; 3 sustituciones en el dominio de CDR3 de VL; dos sustituciones en el dominio de FR2 de VL y 3 sustituciones en el dominio de CDR3 de VL; 2 sustituciones en el dominio de FRl de VL; 2 sustituciones en el dominio de FR2 de VL y 3 sustituciones en el dominio de CDR3 de VL; 2 sustituciones en el dominio de FRl de VH; 1 sustitución en el dominio de FRl de VH y l sustitución en el dominio de CDR3 de VH; 2 sustituciones en el dominio de CDR3 de VH; o 1 sustitución en el dominio CH1 y 1 sustitución en el dominio de FRl de VH.

Una inmunoglobulina variante puede comprender dos sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 20. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones en tanto las posiciones 18 como 20 como se describe anteriormente. Por ejemplo, los residuos en tanto las posiciones 18 como 20 se pueden sustituir por R. Por ejemplo, un dominio VL puede comprender sustituciones T18R y T20R.

Una inmunoglobulina variante puede comprender una sustitución en el segmento propenso a agregación de la posición 20 y una sustitución en el segmento propenso a agregación de la posición 74. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones tanto en las posiciones 18 como 74 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 18 se puede sustituir por R y el residuo en la posición 74 se puede sustituir por V. Por ejemplo, un dominio VL puede comprender las sustituciones T18R y T74V.

Una inmunoglobulina variante puede comprender dos sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 45. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones tanto en la posición 45 como 46 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 45 se puede sustituir por K o R y el residuo en la posición 46 se puede sustituir por L. Por ejemplo, un dominio VL puede comprender las sustituciones T45K (o T45R) y T46L.

Una inmunoglobulina variante puede comprender dos sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 20 y dos sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 45. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones en las posiciones 18, 20, 45 y 46 como se describe anteriormente. Por ejemplo, los residuos tanto en las posiciones 18 como 20 se puede sustituir por R y el residuo en la posición 45 se puede sustituir por K o R y el residuo en la posición 46 se puede sustituir por L. Por ejemplo, un dominio VL puede comprender sustituciones T18R, T20R, T45K y T46L o sustituciones T18R, T20R, T45K y T46L.

Una inmunoglobulina variante puede comprender dos sustituciones en el segmento propenso a agregación N-terminal de CDR3 de VL. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones en las posiciones 91 (C88+3) , 93 (C88+5) , y 96 (F98-2) como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 91 se puede sustituir por , el residuo en la posición 93 se puede sustituir por Q y el residuo en la posición 96 se puede sustituir por V. Un dominio VL puede comprender por ejemplo sustituciones Y91W (C88+3) , P93Q (C88+5) , y R96V (F98-2).

Una inmunoglobulina variante puede comprender dos sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 45 y dos sustituciones en el segmento propenso a agregación N-terminal de CDR3 de VL. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones en las posiciones 45, 46, 91 (C88+3), 93 (C88+5) , y 96 (F98-2) como se describe anteriormente. Por ejemplo, el ' residuo en la posición 45 se puede sustituir por K o R, el residuo en la posición 46 se puede sustituir por L, el residuo en la posición 91 se puede sustituir por W, el residuo en la posición 93 se puede sustituir por Q y el residuo en la posición 96 se puede sustituir por V. Un dominio VL puede comprender por ejemplo sustituciones T45K, T46L, Y91W (C88+3) , P93Q (C88+5), y R96V (F98-2) o sustituciones T45R, T46L, Y91W (C88+3) , P93Q (C88+5) , y R96V (F98-2) .

Una inmunoglobulina variante puede comprender dos sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 20, dos sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 45 y dos o tres sustituciones en el segmento propenso a agregación, N-terminal de CDR3 de VL. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones en las posiciones 18, 20, 45, 46, 91 (C83+3), 93 (C88 +5), y 96 (F98-2) como se describe anteriormente. Por ejemplo, los residuos tanto en las posiciones 18 como 20 se pueden sustituir por R, el residuo en la posición 45 se puede sustituir por K o R, el residuo en la posición 46 se puede sustituir por L, el residuo en la posición 91 se puede sustituir por , el residuo en la posición 93 se puede sustituir por Q y el residuo en la posición 96 se puede sustituir por V. Por ejemplo un dominio VL puede comprender sustituciones T18R, T20R, T45K, T46L, Y91 (C88+3), P93Q (C88+5) , y R96V (F98-2) o sustituciones T18R, T20R, T45R, T46L, Y91W (C88+3) , P93Q (C88+5), y R96V (F98-2).

Una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 37 de VL y en el segmento propenso a agregación de la posición 45 de VL. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende sustituciones en las posiciones 37 y 45 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 37 se puede sustituir por Q o N y el residuo en la posición 45 se puede sustituir por E, K o R. Un dominio VL puede comprender por ejemplo sustituciones L37Q y Q45R.

Una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende sustituciones en el segmento propenso a agregación de FR1 de VH y en el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH.

Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende sustituciones tanto en las posiciones 1 como 102 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 1 se puede sustituir por Q, A, E o V y el residuo en la posición 102 se puede sustituir por Y. Por ejemplo un dominio VH puede comprender sustituciones QIA y P102Y, sustituciones Q1E y P102Y, sustituciones Q1V y P102Y, sustituciones E1A y P102Y, sustituciones E1Q y P102Y, o sustituciones E1V y P102Y.

En otros ejemplos, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende sustituciones tanto en las posiciones 1 y 103 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 1 se puede sustituir por Q, A, D, E o V y el residuo en la posición 103 se puede sustituir por L. Por ejemplo un dominio VH puede comprender sustituciones QIA y W103L, sustituciones Q1E y W103L, sustituciones Q1D y W103L, sustituciones Q1V y W103L, sustituciones E1A y W103L, sustituciones E1Q y W103L, sustituciones E1D y W103L o sustituciones E1V y W103L.

Una inmunoglobulina variante puede comprender dos sustituciones en el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH.

Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende sustituciones tanto en las posiciones 100c (D101-2) como lOOd (D101-1) como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 100c se puede sustituir por W y el residuo en la posición lOOd se puede sustituir por F. Por ejemplo un dominio VH puede comprender sustituciones AlOOc y SlOOdF.

En otros ejemplos, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende sustituciones tanto en la posición lOOd (D101-1) como 102 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición lOOd se puede sustituir por F o M y el residuo en la posición 102 se puede sustituir por V o Y. Un dominio VH puede comprender por ejemplo sustituciones 5100dF y P102V, sustituciones SlOOdM y P102V, sustituciones SlOOdF y P102Y o sustituciones 5100dM y P102Y.

En otros ejemplos, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende sustituciones tanto en la posición 102 como 103 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 102 se puede sustituir para V o Y y el residuo en la posición 103 se puede sustituir por L, I o V. Un dominio VH puede comprender por ejemplo sustituciones P102Y y 103L, sustituciones P102Y y W103I, sustituciones P102Y y W103V, sustituciones P102V y W103L, sustituciones P102V y W103I, o sustituciones P102V y W103V.

Una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH y en el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH que comprende sustituciones tanto en la posición 95 como 102 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 95 se puede sustituir por E o D, y el residuo en la posición 102 se puede sustituir por A F H I L V o Y. por ejemplo un dominio VH comprende sustituciones R95D y S102V. Opcionalmente, un dominio VH puede comprender además sustituciones tanto en las posiciones 94 como 100 como se describe anteriormente. Por ejemplo., el residuo en la posición 94 se puede sustituir por R, K o T, y el residuo en a posición 100 se puede sustituir por F, G, L, o P. Un dominio VH puede comprender por ejemplo sustituciones H94R, R95D, V100F y S102V.

Una inmunoglobulina variante puede comprender sustituciones en el segmento propenso a agregación de CH1 y en el segmento propenso a agregación de la posición 19 de VH.

Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio CHl que comprende una sustitución en la posición 153 y un dominio VH que comprende una sustitución en la posición 19 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 153 se puede sustituir por V y el residuo en la posición 19 se puede sustituir por T. Una inmunoglobulina puede comprender por ejemplo una sustitución S153V en el dominio CHl y una sustitución L19T en el dominio VH.

En otros ejemplos, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio CHl que comprende una sustitución en la posición 153 como se describe anteriormente y un dominio VH que comprende una sustitución en la posición 20 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 153 se puede sustituir por V y el residuo en la posición 20 se puede sustituir por A. Una inmunoglobulina puede comprender por ejemplo sustituciones S153V y R20A.

Una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de la posición 20 de VL y un dominio VH que comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de FR1 de VH. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH con una sustitución en la posición 20 y un dominio VL con una sustitución en la posición 18. Por ejemplo, el residuo en la posición 20 en el dominio VH se puede sustituir por A y el residuo en la posición 18 en el dominio VL se puede sustituir por V. Por ejemplo, una inmunoglobulina puede comprender un dominio VL con la sustitución T18V y un dominio VH con una sustitución R20A o R20V.

Una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de la posición 45 de VL y un dominio VH que comprende una o más sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 75 de VH. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH con una sustitución en la posición 61 y 85 y un dominio VL con una sustitución en la posición 46. Por ejemplo, el residuo en la posición 61 en el dominio VH se puede sustituir por K, R, Q, E, D, N y A, de manera preferente R, el residuo en la posición 85 en el dominio VH se puede sustituir por E, D, o A, de manera preferente E, y el residuo en la posición 46 en el dominio VL se puede sustituir por K, R, H, F, o S, de manera preferente R. Por ejemplo, una inmunoglobulina puede comprender un dominio VL con una sustitución L46R y un dominio VH con sustituciones P61R y V85E.

Una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de la posición 45 de VL y un dominio VH que comprende una o más sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH y una o más sustituciones en el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH . Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH con sustituciones en las posiciones 95 y 102 y un dominio VL con sustituciones en las posiciones 37 y 45. Por ejemplo, el residuo en la posición 95 en el dominio VH se puede sustituir por E o D, preferentemente D, el residuo en la posición 102 en el dominio VH se puede sustituir por A, F, H, I, L, V o Y, de manera preferente Y; el residuo en la posición 37 en el dominio VL se puede sustituir por Q o N, de manera preferente Q; y el residuo en la posición 45 en el dominio VL se puede sustituir por R, K o E, de manera preferente R. Por ejemplo, una inmunoglobulina puede comprender un dominio VL con sustituciones L37Q y Q45R y un dominio VH con sustituciones R95D y S102V.

Una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VL que comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de la posición 45 de VL y un dominio VH que comprende una o más sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 45 de VH. Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH con una sustitución en la posición 94 y 95 y un dominio VL con una sustitución en la posición 46. Por ejemplo, el residuo en la posición 94 en el dominio VH se puede sustituir por R, K o T, de manera preferente R, el residuo en la posición 95 en el dominio VH se puede sustituir por E o D, de manera preferente D, y el residuo en la posición 46 en el dominio VL se puede sustituir por K, R, H, F, o S, de manera preferente R. Por ejemplo, una inmunoglobulina puede comprender un dominio VL con una sustitución L46R y un dominio VH con sustituciones H94R y R95D.

Las técnicas requeridas para hacer sustituciones con secuencias de aminoácidos de segmentos propensos a agregación de los dominios CH, VL y CH1 en general están disponibles en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica para la inmunoglobulina variante que comprende una o más sustituciones se puede producir usando técnicas normales de mutagénesis y manipulación de ADN; por ejemplo como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds . , John Wiley & Sons, 1992 or Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. El ácido nucleico entonces se puede expresar para producir la inmunoglobulina variante, como se describe más adelante.

Se pueden probar secuencias variantes para capacidad para unirse y/o neutralizar el antígeno objetivo de la inmunoglobulina progenitora y/o para fabricación mejorada.

La introducción de una o más de las sustituciones expuestas anteriormente puede incrementar la fabricación de una inmunoglobulina variante con relación a su inmunoglobulina progenitora tanto al incrementar la productividad en la expresión como al reducir la propensión a agregación de la inmunoglobulina variante con relación a su inmunoglobulina progenitora.

Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede presentar un incremento en la productividad de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, o al menos 500 % con relación a la inmunoglobulina progenitora y una disminución en la agregación de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 99 % con relación a la inmunoglobulina progenitora. Una inmunoglobulina variante puede presentar una disminución en la agregación de hasta 100 % con relación a una inmunoglobulina progenitora (es decir, abolición completa de la agregación) .

Un método para producir una inmunoglobulina variante como se describe en la presente puede comprender proporcionar una inmunoglobulina progenitora, introducir una sustitución en el dominio VL en el segmento propenso a agregación de la posición 37 de VL y/o en el segmento propenso de agregación de la posición 45 de VL y/o introducir una sustitución en el dominio VH en el segmento propenso a agregación de FR1 de VH; y el segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH; y el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH, produciendo de este modo una inmunoglobulina variante, en donde la inmunoglobulina variante presenta tanto productividad incrementada como agregación reducida con relación a la inmunoglobulina progenitora.

Por ejemplo, un método para producir una inmunoglobulina variante puede comprender; proporcionar una inmunoglobulina progenitora, introducir una o más sustitución A, D, E, Q o V en un la posición 1, R en la posición 17; R en la posición 94; D en la posición 95; A en la posición 96; F en la posición 100; F, G, L, M o P, de manera preferente F o M en la posición 100d; A, F, H, I, L, V o Y, preferentemente V o Y, en la posición 102 del dominio VH; y/o introducir una sustitución Q en la posición 37; E, K, R, Q o V, de manera preferente K o R, en la posición 45; L o Y, preferentemente L, en la posición 46, del dominio VL; produciendo de este modo una inmunoglobulina variante, en donde la inmunoglobulina variante presenta tanto productividad incrementada como agregación reducida con relación a la inmunoglobulina progenitora.

Por ejemplo, un dominio VH adecuado puede tener sustituciones en las posiciones 94 y 102 como se describe anteriormente, opcionalmente con sustituciones adicionales en las posiciones 94 y 100. Por ejemplo, el residuo en la posición 95 en el dominio VH se puede sustituir por D, y el residuo en la posición 102 se puede sustituir por A, F, H, I, L, V o Y, preferentemente V o Y; opcionalmente, el residuo en la posición 94 también se puede sustituir por R y el residuo en la posición 100 sustituir por F.

Un dominio VL adecuado puede tener sustituciones en las posiciones 37 y 45 como se describe anteriormente. Por ejemplo, el residuo en la posición 37 se puede sustituir por Q y el residuo en la posición 45 se puede sustituir por E, K, R, Q o V, de manera preferente K o R. Por ejemplo un dominio VL puede comprender sustituciones L37Q y Q45R.

Una inmunoglobulina variante puede comprender un dominio VH con sustituciones en las posiciones 94 y 95 como se describe anteriormente y un dominio VL con una sustitución en la posición 46. Por ejemplo, el residuo en las posiciones 94 y 95 en el dominio VH se puede sustituir por R y D, respectivamente y el residuo en la posición 46 en el dominio VL se puede sustituir por R. Por ejemplo, una inmunoglobulina puede comprender un dominio VL con la sustitución L46R y un dominio VH con sustituciones H94R y R95D.

Otras inmunoglobulina variantes pueden comprender un dominio VH con sustituciones en las posiciones 95 como 102 como se describe anteriormente y un dominio VL con sustituciones en las posiciones 37 y 45. Por ejemplo, los residuos en las posiciones 95 y 102 en el dominio VH se puede sustituir por D y V, respectivamente y los residuos en las posiciones 37 y 45 en el dominio VL se pueden sustituir por Q y R, respectivamente. Por ejemplo, una inmunoglobulina puede comprender un dominio VL con sustituciones L73Q y Q45R y un dominio VH con sustituciones R45D y S102V.

La presencia de segmentos propensos a agregación como se describe en la presente puede ser útil al identificar inmunoglobulinas que presentan fabricación reducida o subóptima .

Un método para valorar la fabricación de una inmunoglobulina puede comprender; identificar el residuo de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 18, 20, 45, 46, 74, 91, 93 y 96 en el dominio VL de la inmunoglobulina y posiciones 1, 5, 12, 17, 19, 20, 94, 96, 100c, lOOd, 102, 103 en el dominio VH de la inmunoglobulina, y posición 153 en el dominio CH1, en donde la presencia de un residuo diferente de R, S o V, preferentemente R o V en la posición 18, K, R, S o V, preferentemente R o V en la posición 20, E, K, R, Q o V, preferentemente K o R, en la posición 45, L o Y, preferentemente L, en la posición 46, V en la posición 74, A, F, L, R, S o W, preferentemente W en la posición 91, D, F, L, Q, S, T, o Y, preferentemente Q, en la posición 93 y/o E, L, V o , preferentemente V, en la posición 96 en el dominio VL de la inmunoglobulina, y/o; la presencia de un residuo diferente de A, D, E, Q o V en la posición 1, V en la posición 5 o posición 12, R en la posición 17, T o V, preferentemente T en la posición 19, A, K, S o T, preferentemente A, en la posición 20, R en la posición 94, A en la posición 96, D, E, F, G, P, S, T, W, o Y, preferentemente W en la posición 100c, F, G, L, o P, preferentemente F o M en la posición lOOd, A, F, H, I, L, V o Y, preferentemente V o Y, en la posición 102, I, L o V en la posición 103 en el dominio VH, y/o V en la posición 153 en el dominio CH1 de la inmunoglobulina es indicativa que la inmunoglobulina tiene fabricación subóptima.

En algunas modalidades, se puede determinar la identidad del residuo de aminoácido en la posición lOOd y/o 102, en el dominio VH de la inmunoglobulina. La presencia de un residuo diferente de F, G, L, M o P, preferentemente F o M en la posición lOOd, y/o un residuo diferente de A, F, H, I, L, V o Y, preferentemente V o Y, en la posición 102 es indicativa que es subóptima la fabricación de la inmunoglobulina .

Una inmunoglobulina cuya fabricación se identifica como está reducida o es subóptima con relación a inmunoglobulinas de control puede ser un candidato para modificación por un método descrito anteriormente para producir una inmunoglobulina variante que exhibe fabricación mejorada.

En particular, se pueden identificar uno o más residuos dentro de una secuencia de inmunoglobulina que tiene un efecto perjudicial en la fabricación. Los residuos identif cados entonces se pueden alterar o modificar como se describe en la presente para mejorar la fabricación.

Otro aspecto de la invención proporciona una variante de una inmunoglobulina progenitora que se produce por un método expuesto anteriormente.

Otro aspecto de la invención proporciona una variante de una inmunoglobulina progenitora; en donde la inmunoglobulina variante comprende; un dominio VL que comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 con relación a la secuencia de la inmunoglobulina progenitora; un dominio VH que comprende una sustitución en una región propensa a agregación de región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 con relación a la secuencia de la inmunoglobulina progenitora; y/o un dominio CHl que comprende una sustitución en una región propensa a agregación de CHl con relación a la secuencia de la inmunoglobulina progenitora.

Anteriormente se describen sustituciones y segmentos adecuados propensos a agregación.

Una sustitución en una posición en el dominio VL, VH o CHl comprende el reemplazo del residuo en la posición en la secuencia progenitora con un residuo diferente, de manera preferente un residuo expuesto anteriormente. Donde la inmunoglobulina progenitora contiene ya un residuo como se expone anteriormente en la posición apropiada en la secuencia de aminoácidos, esto no es una sustitución o un residuo sustituido como se describe en la presente. Por lo tanto las inmunoglobulina progenitoras o de línea germinal no son inmunoglobulinas variantes como se describe en la presente.

Como se describe anteriormente, una inmunoglobulina variante puede poseer actividad biológica similar o idéntica a la inmunoglobulina progenitora pero presenta fabricación mejorada, por ejemplo propensión reducida a agregación, y/o productividad incrementada en un sistema heterólogo de expresión.

Por ejemplo, una inmunoglobulina variante puede presentar un incremento en la productividad de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, o al menos 500 % con relación a la inmunoglobulina progenitora y/o una disminución en la agregación (es decir, una reducción en la proporción de moléculas en el conjunto de estado nativo que se agregan) de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 , al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 99 % con relación a la inmunoglobulina progenitora. Una inmunoglobulina variante puede presentar una disminución en la agregación de hasta 100 % con relación a la inmunoglobulina progenitora (es decir, abolición completa de la agregación) .

Como se describe anteriormente, una inmunoglobulina variante puede presentar biodisponibilidad mejorada y/o inmunogenicidad reducida con relación a la inmunoglobulina progenitora.

Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para una inmunoglobulina variante como se describe anteriormente o un dominio CH1, VH o VL del mismo.

El ácido nucleico puede comprender ADN o ARN y puede ser completamente o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se expone en la presente abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la cual U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera los contrario.

Una molécula de inmunoglobulina variante como se describe en la presente o un dominio CH1, VH y/o un dominio VL de la misma se puede preparar por un método que comprende expresar el ácido nucleico bajo condiciones para dar lugar a la producción de la molécula de inmunoglobulina variante o dominio CH1, VH y/o VL de la misma, y recuperarla.

Como se describe en más detalle más adelante, un ácido nucleico puede codificar para una inmunoglobulina variante o un dominio VH o VL de la misma que carece de una o más CDR. Una o más CDR tomadas de una inmunoglobulina donadora se pueden incorporar en la región menos variable de la inmunoglobulina variante al insertar un ácido nucleico adecuado que codifica para la CDR en el ácido nucleico que codifica para la inmunoglobulina variante o un dominio VH o VL de la misma.

De manera preferente se aislan las inmunoglobulinas variantes y el ácido nucleico codificador. Las inmunoglobulinas y el ácido nucleico estarán libres o sustancialmente libres de material con el cual están asociados tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en el ambiente en el cual se preparan (por ejemplo, caldo de cultivo) cuando esta preparación es por tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo.

Otros aspectos de la invención proporcionan construcciones de ácido nucleico en la forma de plásmidos, vectores, casetes de trascripción o expresión que comprenden al menos un ácido nucleico que codifica para una inmunoglobulina variante como se describe en la presente o un dominio CH1, VH y/o VL de la misma.

Se puede usar una construcción en un sistema de expresión a fin de expresar una inmunoglobulina como se describe anteriormente .

Son bien conocidos los sistemas para clonar y para la expresión de inmunoglobulinas en una variedad de diferentes células hospedadoras . Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células mamíferas, sistemas de baculovirus y de levadura. Las líneas de células mamíferas disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster Chino, células HeLa, células de riñon de de hámster neonato, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un hospedador bacteriano común y preferido para moléculas pequeñas de inmunoglobulina es E. coli .

La expresión de inmunoglobulinas, tal como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, en células procarióticas tal como E. coli está bien establecido en la técnica. Para una revisión, ver por ejemplo Plückthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991). La expresión en células eucarióticas en cultivo también está disponible para aquellos expertos en la técnica como una opción para la producción de una inmunoglobulina, ver para revisiones recientes, por ejemplo Ref, M.E. (1993) Curr. Opinión Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinión Biotech 6: 553-560. Las inmunoglobulinas, tal como anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, también se pueden expresar en sistemas libres de célula .

Se pueden elegir o construir vectores adecuados para la expresión de inmunoglobulinas, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras , secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes marcadores y otras secuencias como sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales por ejemplo fagos, o fagómidos, como sea apropiado. Para detalles adicionales ver, por ejemplo Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds . , John Wiley & Sons, 1992.

En una célula hospedadora puede estar contenido el ácido nucleico que codifica para una inmunoglobulina variante o un dominio CH1, VH y/o VL de la misma. Un aspecto aún adicional proporciona un método que comprende introducir el ácido nucleico en una célula hospedadora. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucarióticas , las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células insectiles, baculovirus. La introducción de ácido nucleico en la célula hospedadora, en particular una célula eucariótica, puede usar un sistema basado en virus o en plásmidos . El sistema de plásmidos se puede mantener de manera episomal o se puede incorporar en la célula hospedadora o en un cromosoma artificial. La incorporación puede ser ya sea por integración aleatoria o dirigida de una o más copias en un locus individual o múltiples locus. Para células bacterianas. Las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos.

La introducción se puede seguir al hacer o al permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo al cultivar células hospedadoras bajo condiciones para la expresión del gen.

El ácido nucleico que codifica para la inmunoglobulina variante o dominio CHl, VH y/o VL de la misma se puede integrar en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedadora. La integración se puede promover por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas normales.

Después de la producción por expresión, se puede aislar y/o purificar una inmunoglobulina variante o dominio CH1, VH y/o VL de la misma usando cualquier técnica adecuada, entonces se usa como sea apropiado. Por ejemplo, un método de producción puede comprender además formular el producto en una composición que incluye al menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se pueden usar inmunoglobulinas variantes en un método de tratamiento o diagnosis del cuerpo humano o animal, tal como un método de tratamiento (que puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en un paciente humano que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de la inmunoglobulina variante.

Otros aspectos de la invención proporcionan composiciones f rmacéuticas que comprenden una inmunoglobulina variante como se describe en la presente, métodos para producir medicamento o composición farmacéutica y que comprenden formular la inmunoglobulina variante con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y el uso de una inmunoglobulina variante en la elaboración de un medicamento para administración.

Además de la inmunoglobulina variante, las composiciones farmacéuticas pueden comprender un excipiente, portador, amortiguador, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficiencia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la ruta de administración, que puede ser oral, o por inyección, por ejemplo, intravenosa.

Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógenos y tiene pH, isotinicidad y estabilidad adecuada. Aquellos expertos en la técnica son bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactada. Como se requiera se pueden incluir conservadores, estabilizadores, amortiguadores, antioxidantes y/u otros aditivos.

Una composición se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea de forma simultánea o secuencialmente dependiendo de la condición que se trata. Otros tratamientos pueden incluir la administración de dosis adecuadas de fármacos de alivio de dolor tal como fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (por ejemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno o cetoprofeno) u opiatos tal como morfina o anti-eméticos .

Los indicadores clínicos en los cuales se puede usar una inmunoglobulina variante para proporcionar beneficio terapéutico incluyen cualquier condición o trastorno para el cual pueda ser útil la inmunoglobulina progenitora.

De acuerdo con la presente invención, las composiciones proporcionadas se pueden administrar a individuos. La administración es de manera preferente en una "cantidad terapéuticamente efectiva" , esto que es suficiente para mostrar beneficio a un paciente. Este beneficio puede ser al menos mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la velocidad y trascurso de tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y severidad de los que se trate. La prescripción del tratamiento, por ejemplo las decisiones de la dosis, etc., está dentro de la responsabilidad de los practicantes generales y otros doctores médicos. Son bien conocidas en la técnica las dosis apropiadas del anticuerpo; ver Ledermann J.A. et al. (1991) Int J. Cáncer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.

La dosis precisa dependerá de varios factores, que incluyen si el anticuerpo es para diagnosis o para tratamiento, el tamaño y ubicación del área que se va a tratar, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo entero, fragmento o diacuerpo) , y la naturaleza de cualquier marbete detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis típica de anticuerpo estará típicamente en el intervalo de 0.5mg a lg para aplicaciones sistémicas, y de 10µg a lmg para aplicaciones locales. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo entero, preferentemente del isotipo IgG . Esta es una dosis para un tratamiento individual de un paciente adulto, que se puede ajustar en proporción para niños e infantes, y también ajustar para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos se pueden repetir por día, dos veces por semana, semanalmente o a intervalos mensuales, a la discreción del medico.

Las inmunoglobulinas variantes que incluyen sustituciones dentro de segmentos propensos a agregación y ácido nucleicos codificadores como se describe en la presente pueden ser útiles en métodos de manejo de anticuerpos para producir inmunoglobulinas con fabricación mejorada. se puede usar tecnología de ADN recombinante para producir inmunoglobulinas variantes que poseen la fabricación mejorada. Estas técnicas pueden comprender introducir ADN que codifica para una o más secuencias de CDR de un anticuerpo donador a la región variable de una inmunoglobulina variante como se describe en la presente. Ver, por ejemplo EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y un anticuerpo grande de literatura subsiguiente. De manera alternativa, un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo se puede someter a manipulación genética dentro de las secuencias que codifican para los segmentos propensos a agregación de la inmunoglobulina que mejoran la fabricación de la inmunoglobulina producida. Esto puede ser útil al manejar o reformatear anticuerpos con fabricación adecuada para producción recombinante .

En algunas modalidades, los dominios VH y VL de la inmunoglobulina variante pueden carecer de una o más secuencias de CDR (por ejemplo CDR3 ) . Se pueden introducir CDR heterólogas o sintéticas en los dominios VH y/o VL de la inmunoglobulina variante que carecen de la correspondiente CDR (por ejemplo, CDR3) , usando tecnología de ADN recombinante. Esto puede alterar las propiedades de unión de la inmunoglobulina variante sin afectar la fabricación.

Por ejemplo, se pueden usar una o más secuencias de CDR (por ejemplo, CDR3) de una inmunoglobulina donadora para reemplazar las secuencias correspondientes de CDR en una inmunoglobulina variante como se describe en la presente. Se pueden reemplazar 1, 2, 3, 4, 5, o las 6 secuencias de CDR de una inmunoglobulina variante humana como se describe en la presente por secuencias de CDR tomadas de una inmunoglobulina donadora no humana, tal como una inmunoglobulina murina, para producir una inmunoglobulina humanizada. Una inmunoglobulina humanizada puede poseer la misma actividad de unión como la inmunoglobulina donadora no humana pero presenta inmunogenicidad reducida en un humano y por lo tanto puede tener utilidad terapéutica.

Un método para preparar una inmunoglobulina híbrida que se une a un antígeno objetivo o diana puede comprender; proporcionar una inmunoglobulina donadora que se une al antígeno objetivo, proporcionar una inmunoglobulina variante como se describe anteriormente, y reemplazar 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR de la inmunoglobulina variante con la correspondiente secuencia de CDR de la inmunoglobulina donadora, produciendo de este modo una inmunoglobulina híbrida que se une al antígeno objetivo.

De manera preferente, la CDR3 de VH y/o la CDR3 de VL de la inmunoglobulina variante se reemplazan con la correspondiente CDR de VH y/o CDR3 de VL de la inmunoglobulina donadora.

La inmunoglobulina variante puede ser una inmunoglobulina humana y la inmunoglobulina donadora puede ser una inmunoglobulina no humana.

Las técnicas adecuadas para inmunizar inmunoglobulinas por injerto de CDR son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo Riechman et al (1988) Nature 332 323-327; Queen et al PNAS USA (1989) 86 10029-10033) .

La CDR3 de VL de la inmunoglobulina híbrida puede comprender una sustitución en el segmento propenso a agregación, N-terminal de CDR3 de VL o el segmento propenso a agregación, C-terminal de CDR3 de VL como se describe anteriormente .

La CDR3 de VH de la inmunoglobulina híbrida puede comprender una sustitución en el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH, como se describe anteriormente.

Las inmunoglobulinas variantes adecuadas pueden comprender una o más sustituciones en regiones menos variables o regiones constantes, como se describe anteriormente .

En algunas modalidades, se pueden introducir sustituciones en las secuencias de CDR3 de VH y/o VL de donador. Las sustituciones se pueden hacer antes o después de la inserción en la inmunoglobulina variante usando técnicas normales .

Las inmunoglobulinas variantes como se describe en la presente también pueden ser útiles en métodos de humanización diferentes de injerto de CDR. Se pueden introducir una o más sustituciones como se describe en la presente en una inmunoglobulina durante la producción de un anticuerpo humanizado para mejorar su fabricación. Las técnicas de humanización que se pueden empelar son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo Padlan et al Mol Immunol. (1991) 28 489-498).

Las inmunoglobulinas variantes como se describe en la presente pueden ser útiles en la producción de bibliotecas o repertorios para el aislamiento de especificidades de unión.

Un método para preparar una biblioteca de inmunoglobulinas variantes puede comprender; proporcionar una población de inmunoglobulinas variantes como se describe anteriormente, reemplazar 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias de CDR de la población de inmunoglobulina variantes con un repertorio de secuencias de CDR, produciendo de este modo una biblioteca de inmunoglobulinas variantes.

La biblioteca de inmunoglobulinas variantes contendrá un repertorio diverso de secuencias de CDR de remplazo en el mismo antecedente de inmunoglobulinas variantes .

La biblioteca se puede examinar para una inmunoglobulina variante que se especifica para un antígeno obj etivo .

En algunas modalidades preferidas, la CDR3 de VH de una población de inmunoglobulinas variantes se puede reemplazar por un repertorio de secuencias de CDR3 de VH. Por ejemplo, un método para preparar una inmunoglobulina variante que se une a un antígeno objetivo o diana puede comprender-. (a) proporcionar una población de inicio de ácidos nucleicos que codifican para un dominio VH que incluye ya sea unas CDR3 que se va a reemplazar o carece de una región codificadora de CDR3 ; en donde el dominio VH comprende una o más sustituciones en uno o más segmentos propensos a agregación como se describe anteriormente, (b) combinar la población de dominios VH con una población de ácidos nucleicos donadores que codifican para un repertorio de secuencias de aminoácidos de CDR3 de VH tal que el ácido nucleico donador se inserte en la región CDR3 en la población de dominios VH, para proporcionar una población de productos de ácidos nucleicos que codifican para el repertorio de dominios VH que comprenden las secuencias de CDR3 de VH; (c) expresar los ácidos nucleicos de la población de productos; (d) seleccionar una inmunoglobulina específica para un antígeno objetivo; y (e) recuperar la inmunoglobulina o ácido nucleico que la codifica.

La población de ácidos nucleicos que codifican para un dominio VH puede comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio CH1 que comprende una o más sustituciones en un segmento propenso a agregación de CH1 como se describe anteriormente.

De la misma manera, se puede combinar un repertorio de secuencias de CDR3 de VL con una población de ácidos nucleicos que codifican para un dominio VL que comprende una o más sustituciones en los segmentos propensos a agregación como se describe en la presente, y que incluyen ya sea una CDR3 de VL que se va a reemplazar o carece de una región codificadora de CDR3 de VL.

Además de la CDR3, también se pueden injertar repertorios de secuencias de CDR1 y CDR2 en una población de dominios VH y/o VL que comprenden una o más sustituciones en segmentos propensos a agregación como se describe en la presente que entonces se examinan para inmunoglobulinas variantes específicas para el antígeno objetivo.

Los repertorios de secuencias derivadas de CDR se pueden transponer con poblaciones de dominios VH y VL como se describe en la presente que carecen de la correspondiente secuencia de CDR, y los dominios VH o VL, completos, transpuestos, combinados con un dominio VH o VL cognado (que también puede comprender una o más sustituciones como se describe en la presente) para proporcionar inmunoglobulinas variantes, manejadas. El repertorio entonces se puede presentar en un sistema hospedador adecuado tal como el sistema de visualización én fagos de la WO 92/01047 de modo que se puedan seleccionar inmunoglobulinas que poseen fabricación mejorada. Un repertorio puede consistir de cualquiera de los 104 miembros individuales hasta arriba, por ejemplo de 106 a 108 o 1010 miembros.

Son bien conocidas las técnicas de transposición de CDR y manejo de anticuerpos y la persona experta será capaz de usar estas técnicas para proporcionar inmunoglobulinas con fabricación mejorada usando metodología de rutina.

Un repertorio de secuencias de CDR puede incluir una diversidad residuos en una o más posiciones dentro de la secuencia de CDR. Por ejemplo, un repertorio de secuencia de CDR puede incluir una diversidad de residuos en 1, 2, 3, 4, 5 o más posiciones dentro de la secuencia de CDR.

El repertorio de secuencias de CDR puede incluir una o más posiciones variables dentro de la secuencia de CDR. Por ejemplo, un repertorio de secuencia de CDR puede incluir 1, 2, 3, 4, 5 o más posiciones variables dentro de la secuencia de CDR. El residuo en cada posición variable puede diferir entre diferentes miembros del repertorio. El residuo en una posición variable puede ser aleatorio (por ejemplo puede ser cualquier aminoácido que se presente de forma natural con igual probabilidad) o se puede seleccionar de un grupo o subconjunto predeterminado de aminoácidos. Por ejemplo, la CDR3 de VL de la inmunoglobulina variante se puede reemplazar por un repertorio de secuencias de CDR3 de VL de donador que comprenden A, F, L, R, S y en la posición 91, D, F, L, Q, S, T, W y Y en la posición 93, y/o E, L, V y W en la posición 96. La CDR3 de VH de la inmunoglobulina variante se puede reemplazar por un repertorio de secuencias de CDR3 de VH de donador que comprenden D, E, F, G, P, S, T, W y Y en la posición 100c, F, G, L, P y M en la posición lOOd, A, F, H, I, L, V y Y en la posición 102, y/o I, L y V en la posición 103.

La predisposición de los repertorios de CDR3 a estos residuos en estas posiciones puede ser útil al mejorar la fabricación.

Además de una o más posiciones variables, el repertorio de secuencias de CDR también puede incluir una o más posiciones no variables. El residuo en cada posición no variable puede ser el mismo en cada miembro del repertorio.

La incorporación de un repertorio de secuencias de CDR en una inmunoglobulina variante receptora puede ser útil en la producción de una biblioteca de inmunoglobulinas variantes con diversas propiedades de unión, con cada miembro de la biblioteca que comprende una o más sustituciones en uno o más segmentos propensos a agregación como se describe en la presente .

Una biblioteca de inmunoglobulina variante puede comprender; un dominio VL que comprende una sustitución en un segmento propenso a agregación de región menos variable y/o una región propensa a agregación de CDR3 como se describe anteriormente ; un dominio VH que comprende una sustitución en una región propensa a agregación de región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 como se describe anteriormente; y/o un dominio CHl que comprende una sustitución en una región propensa a agregación de CHl como se describe anteriormente ; en donde los miembros de la biblioteca difieren en una o más secuencias de CDR.

Una biblioteca de inmunoglobulinas variantes puede ser útil en la identificación de inmunoglobulinas con fabricación mejorada que son capaces de unirse a un antígeno objetivo. Un método para obtener una o más inmunoglobulinas que se unen a un antígeno objetivo o diana pueden comprender; poner en contacto una biblioteca de inmunoglobulinas como se describe anteriormente y el antígeno, y seleccionar una o más inmunoglobulinas de la biblioteca capaces de unirse al antígeno.

La biblioteca se puede presentar, por ejemplo, en la superficie de partículas de bacteriófago, cada partícula que contiene ácido nucleico que codifica para el dominio variable de VH de anticuerpo presentado en su superficie, y opcionalmente también un dominio VL presentado, si está presente .

Después de la selección de las inmunoglobulinas capaces de unirse al antígeno y presentadas en partículas de bacteriófago, el ácido nucleico se puede tomar de una partícula de bacteriófago que presenta esta inmunoglobulina . Este ácido nucleico se puede usar en la producción subsiguiente de una inmunoglobulina o un dominio o variable de VH de anticuerpo y/o dominio VL del mismo por la expresión del ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de una partícula de bacteriófago que presenta esta inmunoglobulina .

La inmunoglobulina se puede probar para la capacidad para unirse al antígeno; para competir con otras inmunoglobulinas para la unión al antígeno y/o para la capacidad para neutralizar el antígeno. La afinidad de unión y la potencia de neutralización de diferentes inmunoglobulinas se pueden comparar bajo condiciones apropiadas. También se puede probar la fabricación de la inmunoglobulina .

Varios aspectos y modalidades adicionales de la presente invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica en vista de la presente descripción. Todos estos documentos mencionados en esta especificación se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. "y/o" cuando se usa en la presente se va a tomar como descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo "A y/o B" se va a tomar como descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, tal como si cada uno se expusiera individualmente en la presente .

A menos que el contexto dicte lo contrario, las descripciones y definiciones de las características expuestas anteriormente no se limitan a ningún aspecto ni modalidad particular de la invención y aplican igualmente a todos los aspectos y modalidades que se describen.

Ahora se ilustrarán ciertos aspectos y modalidades de la invención a manera de ejemplo y con referencia a las tablas descritas a continuación.

Las Tablas la y Ib muestran la correspondencia entre los esquemas de numeración de Kabat y Honegger para dominios VH y VL de inmunoglobulina .

Las Tablas 2a y 2b muestran ejemplos de sustituciones de aminoácido con segmentos propensos a agregación que mejoran la fabricación. También se indican sustituciones preferidas.

Se usa la nomenclatura normal de una letra de IUPAC-IUB JCBN para los aminoácidos.

Las Tablas 3a y 3b muestran ejemplos de combinaciones y sustituciones con segmentos propensos a agregación que mejoran la fabricación.

La Tabla 4 muestra la fabricación de ejemplos de inmunoglobulinas variantes.

Experimentos Síntesis Génica Se optimizaron y sintetizaron secuencias por un proveedor comercial, y se sub-clonaron en pEE6.4 y pEE12.4. Se prepararon soluciones concentradas de ADN por transformación en células Top 10, cultivadas O/N en caldo LB y purificadas usando el equipo de purificación de plásmidos QIAGEN Endofree. 'El ADN se resuspendió en amortiguador TE y la concentración se determinó usando un espectrofotómetro Nanodrop .

Cultivo Celular de Rutina Se sub-culti aron células CHOK1SV cada 3-4 días en medio CD-CHO complementado con L-Glutamina 15mM, y se incubó al agitar en incubadora de C02 (140rpm) , 36.5°C, 10 % de C02, 85 % de humedad.

Transfecciones Transientes Se transfectaron células CHOK1SV usando Lipofectamina 2000. 72 horas después de la transfección, se recolectaron los sobrenadantes, se centrifugaron y almacenaron a 4°C antes del análisis.

Transfecciones Estables Se llevó a cabo la expresión a escala mayor usando células CHOK1SV establemente transfectadas bajo selección de MSX. Una vez recolectados, los sobrenadantes se almacenaron a 4°C antes de la purificación.

Purificación Los sobrenadantes se purificaron con proteína A usan do columnas HiTrap (GE) y se almacenaron a 4°C antes de la concentración e intercambio de amortiguador.

Concentración de Anticuerpo e Intercambio de Amortiguador Las muestras se concentraron por centrifugación a 2000g, 15-20 min. Al material se le intercambió el amortiguador 4-5 veces usando amortiguador de formulación (Fosfato 50mM, NaCl lOOmM, pH 7.4). Una vez que se intercambió el amortiguador, las muestras se diluyeron en amortiguador de formulación a una concentración apropiada de trabaj o .

GP-HPLC Las muestras en duplicado se analizaron por GP-HPLC en un sistema HPLC Agilent 1200 series. Se inyectaron alícuotas de 80µ1 de muestras de lmg/ml (mantenidas a 4°C) y se corrieron a lml/min durante 15 minutos . Los resultados se analizaron usando software chemstation.

Título de IgG Se determinaron rendimientos de expresión de anticuerpo usando un ELISA de intercalación. Los títulos se normalizaron a un control específico de cadena ligera.

Unión a Tioflavina T Se puede usar tioflavina T para monitorizar la agregación. Se incubó anticuerpo purificado a lmg/ml a 60° durante 1 hora luego se mezcló con una concentración final de Tioflavina T 30 µ?, y la fluorescencia se midió a Ex=305 Em=508nm (Hawe, A. , Sutter, M y Jiskoot, W. Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99) .

Unión- a ANS Se puede usar ácido 8 -Anilino- 1-naftalenosulfónico (ANS) para monitorizar la agregación. Se incubó anticuerpo purificado a lmg/ml a 60° durante 1 hora luego se mezcló con una concentración final de ANS 30µ? y se midió la fluorescencia a Ex=360 Em/508nm (Hawe, A., Sutter, M y Jiskoot, . Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99) .

Resultados Las secuencias de inmunoglobulina se analizaron por métodos in silico e in vitro para identificar segmentos propensos a agregación. Los segmentos propensos a agregación. Identificados, se muestran en la Tabla 2.

Las sustituciones dentro de los segmentos propensos a agregación, identificados, de los dominios VH y VL mostrados en SEQ ID NOS: 1 y 2 con propensión reducida a agregación se diseñaron y sintetizaron (Tabla 2) . Se probó el efecto de las sustituciones en la expresión, estabilidad y agregación de la inmunoglobulina (Tablas 3 y 4) .

La sustitución de residuos dentro de los segmentos propensos a agregación, identificados, se encontró que da por resultado una mejora en la fabricación, y en particular, una propensión reducida a la agregación, y/o niveles mejorados de producción.

Declaraciones Numeradas Adicionales de la Invención 1. Una inmunoglobulina variante, que comprende; un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de la región menos variable (FR) y/o un segmento propenso a agregación de la región 3 determinante de complementariedad (CDR3) ; un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una sustitución en un segmento propenso a agregación de la región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 ; y/o, un dominio de región 1 constante de cadena pesada (CHl) que comprende una sustitución en un segmento propenso a agregación de CHl. 2. Un método para mejorar la fabricación de una inmunoglobulina, que comprende; identificar una inmunoglobulina progenitora, introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación de la región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 en el dominio VL de la inmunoglobulina progenitora, y/o introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación de la región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 en el dominio VH de la inmunoglobulina progenitora, y/o; introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación de la región constante en el dominio CH1 de la inmunoglobulina progenitora, produciendo de este modo una inmunoglobulina variante que tiene fabricación mejorada con relación a la inmunoglobulina progenitora. 3. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en donde la inmunoglobulina variante tiene propensión reducida a agregación y/o productividad incrementada en la expresión, con relación a la inmunoglobulina progenitora. 4. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en donde el segmento propenso a agregación de región variable de dominio VL se selecciona del grupo que consiste del segmento propenso a agregación de la posición 20, el segmento propenso a agregación de la posición 45 y el segmento propenso a agregación de la posición 74. 5. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 4 en donde el segmento propenso a agregación de la posición 20, se extiende desde las posiciones 15 a 23 del dominio VL. 6. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 5 en donde el dominio VL comprende una sustitución en la posición 18 del dominio VL. 7. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 6, en donde el residuo en la posición 18 se sustituye por R, S o V. 8. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 7, en donde el dominio VL comprende una T18R, T18S o T18V. 9. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 5 a 8, en donde el dominio VL comprende una sustitución en la posición 20 del dominio VL. 10. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 9, en donde el residuo en la posición 20 se sustituye por K, R, S o V. 11. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 10, en donde el VL comprende una sustitución T20K, T20R, T20S o T20V. 12. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 4 a 11, en donde el segmento propenso a agregación de la posición 45 se extiende desde la posición 42 a la posición 49 del dominio VL. 13. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 12, en donde el dominio VL comprende una sustitución en la posición 45. 14. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 13, en donde el residuo en la posición 45 se sustituye por E, K, R, Q o V. 15. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 14, en donde el dominio VL comprende una sustitución T45E, T45K, T45R, T45Q o T45V. 16. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 12 a 15, en donde el dominio VL comprende una sustitución en la posición 46. 17. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 16, en donde el residuo en la posición 46 se sustituye por L o Y. 18. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 17, en donde el dominio VL comprende una sustitución T46L o T46Y. 19. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 4 a 18, en donde el segmento propenso a agregación de la posición 74 se extiende desde la posición 71 a la posición 77 de la secuencia de dominio VL. 20. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 19, en donde el dominio VL comprende una sustitución en la posición 74. 21. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 20, en donde el residuo en la posición 74 se sustituye por V. 22. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 21, en donde el dominio VL comprende una sustitución T74V. 23. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en donde el segmento propenso a agregación de CR3 del dominio VL se selecciona del grupo que consiste del segmento propenso a agregación N- terminal de CDR3 de VL y el segmento propenso a agregación C-terminal de CDR3 de VL. 24. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 23, en donde el segmento propenso a agregación, N- terminal, de CDR3 VL se extiende desde el residuo C88 a la posición ocho aminoácidos C-término del residuo C88 en la secuencia de dominio VL. 25. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 24, en donde el dominio VL comprende una sustitución en una o más posiciones 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 o 95a. 26. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 25, en donde el dominio VL comprende una sustitución en la posición 91. 27. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 26, en donde el residuo en la posición 91 se sustituye por A, F, L, R, S o W. 28. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 27, en donde el dominio VL comprende una sustitución Y91A, Y91F, Y91L, Y91R, Y91S o Y91W. 29. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 24 a 29, en donde el dominio VL comprende una sustitución en la posición 93. 30. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 29, en donde el residuo en la posición 93 se sustituye por D, F, L, Q, S, T, W o Y. 31. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 30, en donde el dominio VL comprende una sustitución P93D, P93F, P93L, P93Q, P93S, P93T, P93W o P93Y. 32. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 23, en donde el segmento propenso a agregación C-terminal, de CDR3 de VL se extiende desde la posición tres aminoácidos N-terminal del residuo F98 a la posición 99 en la secuencia de dominio VL. < 33. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo a la declaración 32, en donde el dominio VL comprende una sustitución en una o más posiciones de las 95, 96, 97, 98 o 99. 34. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 33, en donde el dominio VL comprende una sustitución en la posición 96. 35. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 34, en donde el residuo en la posición 96 se sustituye por E, L, V o W. 36. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 35, en donde el dominio VL comprende una sustitución R96E, R96L, R96V o R96W. 37. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en donde el segmento propenso a agregación, de región menos variable de dominio VH se selecciona del grupo que consiste del segmento propenso a agregación de FR1; el segmento propenso a agregación de la posición 95; y el segmento propenso a agregación de la posición 102. 38. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 37, en donde el segmento propenso a agregación de FR1 está localizado en la región 1 menos variable de la secuencia de dominio VH. 39. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 38, en donde el segmento propenso a agregación de FR1 es un segmento propenso a agregación seleccionado del grupo que consiste de las posiciones 1 a 3; posiciones 4 a 6, posiciones 11 a 13 , y posiciones 16 a 21. 40. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 39, en donde el segmento propenso a agregación de FR1 se extiende desde la posición 1 a la posición 3. 41. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 40, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 1 del dominio VH. 42. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 41 en donde el residuo en la posición 1 se sustituye por E, Q, D, A o V. 43. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 42, en donde el dominio VH comprende una sustitución Q1E, Q1D, Q1A o Q1V o una sustitución E1Q, E1D, E1A o E1V. 44. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 39, en donde el segmento propenso a agregación de FR1 se extiende desde la posición 4 a la posición 6 del dominio VH. 45. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 44, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 5 del dominio VH. 46. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 45, en donde el residuo en la posición 5 se sustituye por V. 47. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 46, en donde el dominio VH comprende una L5V. 48. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 39, en donde el segmento propenso a agregación de FR1 se extiende desde la posición 11 a la posición 13 del dominio VH. 49. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 48, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 12 del dominio VH. 50. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 49, en donde el residuo en la posición 12 se sustituye por V. 51. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 50, en donde el dominio VH comprende una L12V. 52. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 39, en donde el segmento propenso a agregación de FR1 se extiende desde la posición 16 a la posición 21 del dominio VH. 53. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 52, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 17. 54. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 53, en donde el residuo en la posición 17 se sustituye por R. 55. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 54, en donde el dominio VH comprende una sustitución G17R. 56. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 52 a 55 en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 19. 57. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 56, en donde el residuo en la posición 19 se sustituye por T o V. 58. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 57, en donde el dominio VH comprende una sustitución L19T o y L19V. 59. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 52 a 58, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 20. 60. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 59, en donde el residuo en la posición 20 se sustituye por A, K, S o T. 61. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 60 en donde el residuo en la posición en donde el dominio VH comprende una sustitución R20A, R20K o R20S o R20T. 62. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 37 a 61, en donde el segmento propenso a agregación de la posición 95 se extiende desde la posición 91 a la posición 99. 63. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 62, en donde el dominio VH comprende una sustitución en una o más posiciones 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y/o 99. 64. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 63, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 94. 65. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 64 en donde el residuo en la posición 94 se sustituye por R. 66. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 65 en donde el dominio VH comprende una sustitución K94R. 67. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 63 a 66, en donde el dominio VH comprende una sustitución de 96. 68. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 67, en donde el residuo en la posición 96 se sustituye por A. 69. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 68, en donde el dominio VH comprende una sustitución G96A. 70. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 69, en donde el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH se extiende desde la posición 100c a la posición 103. 71. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 70, en donde el dominio VH comprende una sustitución en una o más posiciones 100c, lOOd, 101, 102 y 103. 72. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 71, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 100c. 73. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 72, en donde el residuo en la posición 100c se sustituye por D, E, F, G, P, S, T, W, o Y. 74. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 73, en donde el dominio VH comprende una AlOOcD, AlOOcE, AlOOcF, AlOOcG, AlOOcP, AlOOcS, AlOOcT, o AlOOcW o AlOOcY. 75. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 70 a 74, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición lOOd. 76. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 75, en donde el residuo en la posición lOOd se sustituye por F, G, L, P o M. 77. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 76, en donde el dominio VH comprende una sustitución SlOOdF, SlOOdG, SlOOdL, SlOOdP o SlOOdM. 78. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 70 a 77, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 102. 79. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 78, en donde el residuo en la posición 102 se sustituye por A, F, H, I, L, V o Y. 80. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 79, en donde el dominio VH comprende una sustitución P102A, P102F, P102H, P102I, P102L, P102Y O P102V. 81. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 70 a 80, en donde el dominio VH comprende una sustitución en la posición 103. 82. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 81, en donde el residuo en la posición 103 se sustituye por I, L o V. 83. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 82, en donde el dominio VH comprende una sustitución W103I, W103L o 103V. 84 · Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 83, en donde el segmento propenso a agregación de CH1 se extiende desde la posición 150 a la posición 156. 85. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 84, en donde <el dominio CH1 comprende una sustitución en la posición 153. 86. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 85, en donde el dominio CH1 comprende una sustitución en la posición 153. 87. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 86, en donde el residuo en la posición 153 se sustituye por V. 88. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 87, en donde el dominio VH comprende una sustitución S153V. 89. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en donde la secuencia de la inmunoglobulina variante tiene hasta 10 sustituciones de aminoácido con relación a la secuencia de inmunoglobulina progenitora. 90. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en donde la secuencia de la inmunoglobulina variante comprende 2 sustituciones en el dominio de FR1 y/o FR2 de VL 3 sustituciones en el dominio de CDR3 de VL; 2 sustituciones en el dominio de FR2 de VL y 3 sustituciones en el dominio de CDR3 de VL; 2 sustituciones en el domino de FR1 de VL, 2 sustituciones en el domino de FR2 de VL y 3 sustituciones en el dominio de CDR3 de VL; 2 sustituciones en el dominio de FR1 de VH; 1 sustitución en el dominio de FR1 de VH y 1 sustitución en el dominio de CDR3 de VH; 2 sustituciones en el dominio de CDR3 de VH; o 1 sustitución en el dominio CH1 y 1 sustitución en el dominio de FR1 de VH. 91. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 90, en donde la secuencia del dominio VH comprende una sustitución lOOd (D101-1) y 102. 92. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 91, en donde el residuo en la posición 102 se sustituye por A, F, H, I, L, V o Y y en donde el residuo en la posición lOOd se sustituye por F, G, L, P o M. 93. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 92, en donde el dominio VH comprende una sustitución P102A, P102F, P102H, P102I, P102L, P102Y o P102V y una sustitución SlOOdFl SlOOdG, SlOOdL, SlOOdP o SlOOdM. 94. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con la declaración 93, en donde el dominio VH comprende las sustituciones SlOOdF y P102V, SlOOdM y P102V sustituciones, SlOOdF y P102Y o sustituciones SlOOdM y P102Y. 95. Una inmunoglobulina variante o un método de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en donde la inmunoglobulina variante está humanizada. 96. Un método para valorar la fabricación de una inmunoglobulina, que comprende; identificar el residuo de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 18, 20, 45, 46, 74, 91, 93 y 96 en el dominio VL de la inmunoglobulina, las posiciones 1, 5, 12, 17, 19, 20, 94, 96, 100c, 100d( 102, y 103, en el dominio VH, y la posición 153 en el dominio CHl de la inmunoglobulina, en donde la presencia de un residuo diferente de R, S o V, preferentemente R o V en la posición 18, K, R, S o V, preferentemente R o V en la posición 20, E, K, R, Q o V, preferentemente K o R, en la posición 45, L o Y, preferentemente L, en la posición 46, V en la posición 74, A, F, L, R, S, o W, preferentemente W en la posición 91, D, F, L, Q, S, T, W o Y, preferentemente Q, en la posición 93 y/o E, L, V o , preferentemente V, en la posición 96 en el dominio VL de la inmunoglobulina y/o; la presencia de un residuo diferente de A, D, E, Q o V en la posición 1, V en la posición 5 o posición 12, R en la posición 17, T o V, preferentemente T en la posición 19, A, K, S o T, preferentemente A, en la posición 20, R en la posición 94, A en la posición 96, D, E, F, G, P, S, T, , o Y, preferentemente W en la posición 100c, F, G, L, M o P, preferentemente F o M en la posición lOOd, A, F, H, I, L, V o Y, preferentemente V o Y, en la posición 102, I, L o V en la posición 103 en el dominio VH de la inmunoglobulina, y/o en la presencia de un residuo diferente de V en la posición 153 en el domino CHl de la inmunoglobulina, es indicativo que es subóptima la fabricación de la inmunoglobulina. 97. Un método para valorar la fabricación de una inmunoglobulina, que comprende; identificar el residuo de aminoácido en las posiciones lOOd y/o 102, en el dominio VH de la inmunoglobulina, en donde la presencia de una S en la posición lOOd y/o P en la posición 102, es indicativa que la inmunoglobulina tiene fabricación subóptima. 98. Un ácido nucleico aislado que codifica para una inmunoglobulina variante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 95, o un dominio VH, dominio VL o dominio CHl de la misma que comprende una o más de estas sustituciones. 99. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo a la declaración 98. 100. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión de acuerdo a la declaración 99. 101. Un método para preparar una inmunoglobulina variante , que comprende ,- expresar un ácido nucleico de acuerdo a la declaración 98 bajo condiciones para dar lugar a la producción de la inmunoglobulina variante o un dominio VH, dominio VL o dominio CHl de la misma, y recuperarla. 102. Un método de acuerdo a la declaración 101, que comprende formular la inmunoglobulina variante en una composición que incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable. 103. Una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina variante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 95 y un excipiente farmacéuticamente aceptable . 104. Una inmunoglobulina variante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 95, para el uso como un medicamento . 105. Un método para preparar una inmunoglobulina híbrida que se une a un antígeno objetivo o diana, que comprende; proporcionar una inmunoglobulina donadora que se une al antígeno objetivo, proporcionar una inmunoglobulina variante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 89, reemplazar 1 o más secuencias de CDR de la inmunoglobulina variante con la correspondiente secuencia de CDR de la inmunoglobulina donadora, produciendo de este modo una inmunoglobulina híbrida que se une al antígeno objetivo. 106. Un método de acuerdo con la declaración 105 en donde la CDR3 de VL de la inmunoglobulina híbrida comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación, N-terminal de CDR3 de VL o el segmento propenso a agregación, C-terminal de CD3 de VL. 107. Un método de acuerdo a la declaración 105 o declaración 106 en donde la CDR3 de VH de la inmunoglobulina híbrida comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH. 108. Un método para preparar una biblioteca de inmunoglobulinas variantes, que comprende; proporcionar una inmunoglobulina variante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 95, reemplazar 1 o más secuencias de CDR de la inmunoglobulina variante con una secuencia de CDR que comprende un residuo aleatorio en una o más posiciones en la misma, produciendo de este modo una biblioteca diversa de inmunoglobulinas variantes. 109. Un método de acuerdo a la declaración 108 en donde la CDR3 de VL de la inmunoglobulina variante se reemplaza por una secuencia aleatoria de CDR3 que comprende, F, L, R, S o W en la posición 91, D, F, L, Q, S, T, W o Y en la posición 93, y/o E, L, V o W en la posición 96. 110. Un método de acuerdo a la declaración 108 o declaración 109, en donde la CDR3 de VH de la inmunoglobulina variante se reemplaza por una secuencia aleatoria de CDR3 que comprende D, E, F, G, P, S, T, W, o Y en la posición 100c, F, G, L, P o M en la posición 100d, A, F, H, I, L, V o Y en la posición 102, y/o I, L o V en la posición 103. 111. Una biblioteca de inmunoglobulinas variantes, en donde cada miembro de la biblioteca comprende; un dominio VL que comprende una sustitución en el segmento propenso a agregación de región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 ; un dominio VH que comprende una sustitución en un segmento propenso a agregación de región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 ; y/o, un dominio CHl que comprende una sustitución en un segmento propenso a agregación de CHl en donde los miembros de la familia difieren en una o más secuencias de CDR. 112. Una población de ácidos nucleicos que codifica para una biblioteca de inmunoglobulinas variantes de acuerdo a la declaración 111. 113. Un método para obtener una o más inmunoglobulinas con fabricación mejorada que se unen a un antígeno objetivo, que comprende; poner en contacto una biblioteca de inmunoglobulinas variantes de acuerdo a la declaración 111 y el antígeno, y seleccionar una o más inmunoglobulinas de la biblioteca capaces de unirse al antígeno.

Breve Descripción de las Secuencias; VL NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPD RFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDPEMRVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 1), VH QVQLVESGGG QPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE VAVISYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAWYCAKTYEGPTYFASDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2) Tabla 1A numeración de dominio VL Tabla IB Numeración de dominio VH Tabla 2a Posiciones de Sustituciones *posiciones de CDR3 de VL: Y91, P93 también se numeran por proximidad a C88 de Kabat y R96 también se numera por proximidad a F98 de Kabat, respectivamente ** posiciones de CDR3 de VH: debido a la heterogeneidad de CDR3 (pesada) Las posiciones también se nombran de acuerdo a la proximidad a DI01 (invariable en Kabat) Tabla 2b Posiciones de Sustituciones Tabla 3a ?posiciones de CDR de VL: Y91, P93 también se numeran por proximidad a C88 de Kabat y R96 también se numera por proximidad a F98 de Kabat, respectivamente ** posiciones de CDR3 de VH: debido a heterogeneidad de CDR (pesada) . Las posiciones también se nombran de acuerdo a la proximidad a D101 (invariable en Kabat) Tabla 3b *posiciones de CDR de VL: Y91, P93 también se numeran por proximidad a C88 de Kabat y R96 también se numera por proximidad a F98 de Kabat, respectivamente ** posiciones de CDR3 de VH: debido a heterogeneidad de CDR (pesada) . Las posiciones también se nombran de acuerdo a la proximidad a D101 (invariable en Kabat) Todos los dados mostrados con relación a tipo silvestre.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (58)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para mejorar la fabricación de una inmunoglobulina, caracterizado porque comprende; identificar una inmunoglobulina progenitora que tiene un dominio VL y un dominio VH, introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación de región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 en el dominio VL de la inmunoglobulina progenitora, y/o introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación de región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3 en el dominio VH de la inmunoglobulina progenitora, y/o introducir una sustitución en un segmento propenso a agregación de región constante en el dominio CH1 de la inmunoglobulina progenitora, produciendo de este modo una inmunoglobulina variante que tiene un dominio VL y una dominio VH que presenta fabricación mejorada con relación a la inmunoglobulina progenitora.

2. Una inmunoglobulina variante, caracterizada porque comprende ; un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una sustitución en un segmento propenso a agregación de región menos variable (FR) y/o un segmento propenso a agregación de la región 3 determinante de complementariedad (CDR3) ; un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una sustitución en un segmento propenso a agregación de región menos variable y/o un segmento propenso a agregación de CDR3; y/o un dominio de región 1 constante de cadena pesada (CH1) que comprende una sustitución en un segmento propenso a agregación de CH1.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o una inmunoglobulina variante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la inmunoglobulina variante presenta tanto propensión reducida a agregación como productividad incrementada en la expresión con relación a la inmunoglobulina progenitora.

4. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la inmunoglobulina variante presenta un incremento en la productividad de al menos 20 % y una disminución en la propensión de agregación de al menos 30 % con relación a la inmunoglobulina progenitora.

5. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 3 o 4, caracterizada porque se introduce una sustitución en el dominio VL de la inmunoglobulina progenitora en el segmento propenso a agregación de la posición 37 de VL y/o el segmento propenso a agregación de la posición 45 de VL; y/o una sustitución se introduce en el dominio VH de la inmunoglobulina progenitora en el segmento propenso a agregación de FR1 de VH; el segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH; y el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH.

6. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la sustitución se introduce en una posición seleccionada del grupo que consiste de 1, 17, 94, 95, 96, 100, lOOd y 102 de la secuencia de dominio VH y/o una posición seleccionada del grupo que consiste de 37, 45 y 46 de la secuencia de dominio VL.

7. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el residuo en la posición 37 en la secuencia de dominio VL se sustituye por Q o N.

8. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el dominio VL comprende una sustitución L37Q.

9. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque el residuo en la posición 45 en la secuencia del dominio VL se sustituye por E, K, R, Q o V.

10. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el dominio VL comprende una sustitución T45E, T45K, T45R, T45Q o T45V.

11. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizada porque el residuo en la posición 46 en la secuencia del dominio VL se sustituye por L o Y.

12. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el dominio VL comprende una sustitución T46L o T46Y.

13. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizada porque el residuo en la posición 1 en la secuencia del dominio VH se sustituye por E, Q, D, A o V.

14. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución Q1E, Q1D, Q1A o Q1V o una sustitución E1Q, E1S, E1A o E1V.

15. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, caracterizada porque el residuo en la posición 17 en la secuencia del dominio VH se sustituye por R.

16. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución G17R.

17. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16, caracterizada porque el residuo en la posición 94 en la secuencia del dominio VH se sustituye por R.

18. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución H94R.

19. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 18, caracterizada porque el residuo en la posición 95 en la secuencia del dominio VH se sustituye por D.

20. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución R95D.

21. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 20, caracterizada porque el residuo en la posición 96 en la secuencia del dominio VH se sustituye por A.

22. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución G96A.

23. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 22, caracterizada porque el residuo en la posición lOOd en la secuencia del dominio VH se sustituye por F, G, L, P o M.

24. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución SlOOdF, SlOOdG, SOOdL, SlOOdP o SlOOdM.

25. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 24, caracterizada porque el residuo de la posición 102 en la secuencia del dominio VH se sustituye por A, F, H, I, L, V o Y.

26. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución P102A, P102F, P102H, P102I, P102L, P102Y, P102V o S102V.

27. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 26, caracterizada porque la secuencia de la inmunoglobulina variante tiene hasta 10 sustituciones de aminoácido con relación a la secuencia de inmunoglobulina progenitora.

28. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 27, caracterizada porque la secuencia del dominio VH comprende sustituciones en el segmento propenso a agregación de PR1 de VH y el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH.

29. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la secuencia del dominio VH comprende sustituciones en la posición 1 y la posición 102.

30. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el residuo en la posición 102 se sustituye por A, F, H, I, L, V o Y y en donde el residuo en la posición 1 se sustituye por E, Q, D, A o V.

31. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución P102Y y una sustitución Q1A o Q1E .

32. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 31, caracterizada porque la secuencia del dominio VH comprende sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH y el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH.

33. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la secuencia del dominio VH comprende sustituciones en la posición 95 y posición 102.

34. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque en el residuo en la posición 102 se sustituye por A, F, H, I, L, V o Y y en donde el residuo en la posición 95 se sustituye por E o D.

35. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución S102V y una sustitución R95D.

36. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, caracterizada porque el dominio VH comprende además sustituciones en las posiciones 94 y 100.

37. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el residuo en la posición 94 se sustituye por R y el residuo en la posición 100 se sustituye por F.

38. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución H94R y una sustitución V100F.

39. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 38, caracterizada porque la secuencia del dominio VL de la inmunoglobulina variante comprende sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 37 y el segmento propenso a agregación de la posición 45.

40. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la secuencia del dominio VL de la inmunoglobulina variante comprende sustituciones en la posición 37 y la posición 45.

41. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el residuo en la posición 37 se sustituye por Q o N y en donde el residuo en la posición 45 se sustituye por R, K o E.

42. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el dominio VL comprende una sustitución L37Q y una sustitución Q45R.

43. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 42, caracterizada porque el dominio VL comprende una sustitución S102V y una sustitución R95D y el dominio VL comprende una sustitución L37Q y una sustitución Q45R.

44. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 43, caracterizada porque el dominio VH comprende una o más sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 95 de VH y el dominio VL comprende una o más sustituciones en el segmento propenso a agregación de la posición 45.

45. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el dominio VH comprende sustituciones en las posiciones 94 y 95 y el dominio VL comprende una sustitución en la posición 46.

46. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el residuo en la posición 94 en el dominio VH se sustituye por R, K o T y el residuo en la posición 95 en el dominio VH se sustituye por E o D y el residuo en la posición 46 en el dominio VL se sustituye por K, R, H, F o S.

47. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque el dominio VH comprende una sustitución H94R y R95D y el dominio VL comprende una sustitución L46R.

48. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 47, caracterizada porque el dominio VH de la inmunoglobulina variante comprende dos o más sustituciones en el segmento propenso a agregación de CDR3 de VH.

49. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el dominio VH comprende sustituciones en las posiciones lOOd y 102.

50. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque el dominio VH comprende sustituciones SlOOdF y P102V; sustituciones SlOOdM y P102V; sustituciones SlOOdF y P102Y o sustituciones SlOOdM y P102Y.

51. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la inmunoglobulina variante está humanizada.

52. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la inmunoglobulina variante se expresa en un sistema recombinante .

53. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la inmunoglobulina variante se aisla y/o purifica después de la expresión.

54. Una inmunoglobulina variante o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la inmunoglobulina variante se formula con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

55. Un método para valorar la fabricación de una inmunoglobulina, caracterizado porque comprende; identificar el residuo de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones 37, 45 y 46 en el dominio VL de la inmunoglobulina, posiciones 1, 17, 94, 95, 96, 100, lOOd y 102 en el dominio VH, en donde la presencia de un residuo diferente de Q en la posición 37; E, K, R, Q, o V, preferentemente K o R, en la posición 45, L o Y preferentemente L, en la posición 46, en el dominio VL de la inmunoglobulina, y/o; la presencia de un residuo diferente de A, D, E, Q 0 V en la posición 1, R en la posición 17, R en la posición 94, A en la posición 96, F, G, L, o P, preferentemente F o M en la posición lOOd, A, F, H, I, L, V o Y, preferentemente V o Y, en la posición 102, en el dominio VH de la 1nmunoglobulina, es indicativa que es subóptima la fabricación de la inmunoglobulina.

56. Un método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende que la fabricación de la inmunoglobulina es subóptima y mejora la fabricación de la inmunoglobulina por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 54.

57. Un método para preparar una inmunoglobulina con fabricación mejorada, caracterizado porque comprende; proporcionar un ácido nucleico que codifica para una inmunoglobulina variante producida por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 46, expresar el ácido nucleico bajo condiciones para dar lugar a la producción de la inmunoglobulina variante, y recuperarla .

58. Un método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque comprende formular la inmunoglobulina variante en una composición que incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable.