TW201116626A - Variant immunoglobulins with improved manufacturability - Google Patents

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7 ' , 201116626 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗體分子之表現，且尤其係關於製備具有 改良之可製造性之抗體分子。 ' 【先前技術】 . 術語「聚集」描述可發生於多種環境（從細胞培養及發 酵至分離、純化及調配過程）中之各種現象，所有該等現 ㈣與蛋白質自締合有關。例如，通常使用「聚集」來描 述（尤其）内含體之形成；細胞分級分離後「不溶性」部分 中之蛋白質積聚；混濁外觀、蛋白質沉殿或在試樣中形成 顆粒；或形成小的可溶性寡聚物。在該背景下，理解為多 肽鏈之「異常自締合」之蛋白質聚集可能具有多種起因及 表現，其很大程度上取決於所涉及分子的性質以及產生、 分離、儲存及投予多肽之環境。 多肽之三 -維結構决定不缺4 I®斑_丨

150388.doc 狀甲之内在穩定性而 且此相對低的穩定性 201116626 對於賦予特定生物特性 ^ m 5 Μ ^ Φ 、鉸供良好的調節機制以控制Α 作用至關重要。然而， 收甘. 多狀自其天然環境取出以（例如、 將其研發成藥物在其生產 （]如） κρ 刀離及調配中會施加諸多嚴辂 限制’此可輯其穩定性及聚純質產生巨大影響 工=蛋白f之天然環境的改變(尤其由於特定製備或加 要求而引起)可能對其產量及溶液中之穩定性產生顯著 影響。增加產量之加工要求使此& /r 頌者 文々使此問；4加劇，例如：人工人

成、異源表現（即哺乳動物蛋白質之原核表現）、使用分I ^ ^ it ^ f ^ (protein synthesis machinery) 之飽和’或由非天然蛋白質(例如多肽片段或融合物)造成 之其他障礙。例如’哺乳動物蛋白質在異源系統中之表現 造成巨大風險。此乃因該等系統通常缺少適當之分子環境 來確保「天然」摺疊及加工之事實。 【發明内容】 本發明係關於以下發現：在某些重要位置處對免疫球蛋 白分子之胺基酸序列進行修飾使得可製造性改良，且尤其 使得聚集傾向降低及/或生產量增加。 【實施方式】 本發明之一態樣提供製備免疫球蛋白變異體之方法，其 包含： 提供親代免疫球蛋白； 向親代免疫球蛋白之VL結構域框架區及/或VL CDR3之 易於聚集之區段中引入取代；及/或 向VH框架區及/或VH CDR3之易於聚集之區段中引入取 150388.doc 201116626 代；及/或 向親代免疫球蛋白重鏈（CH)之CH1恆定區結構域之易於 聚集之區段中引入取代， 由此製備免疫球蛋白變異體。 該免疫球蛋白變異體相對於親代免疫球蛋白可具有改良 之可製造性。例如，該免疫球蛋白變異體在表現後相對於 親代免疫球蛋白可呈現降低之聚集傾向及/或提高之生產 率〇 例如，免疫球蛋白變異體可呈現相對於親代免疫球蛋白 至少10%、至少20%、至少30。/。、至少40°/。、至少50。/。、至 少100%、至少200%或至少500%之生產率提高及/或相對於 親代免疫球蛋白至少10%、至少20%、至少3〇%、至少 40%、至少50%、至少80%、至少9〇%或至少99%之聚集減 少（即在天然狀態總體中聚集分子之比例降低）。免疫球蛋 白變異體相對於親代免疫球蛋白可呈現至多1〇〇%之聚集 減少（即聚集完全消除）。 可製造性之改良可能完全或部分由相對於親代免疫球蛋 白降低之聚集傾向而引起。 聚集傾向係指免疫球蛋白於重組系統中表現後形成不溶 性聚集體之趨勢。聚集傾向之降低使得免疫球蛋白之天然 狀態總體中以聚集形式存在之分子的比例降低（Carpenter 等人，2009 J Pharm Sci. Apr; 98(4):1201-5)。換言之，免 疫球蛋白變異體之天然狀態總體内以聚集或不溶性形式存 在之分子的比例低於親代免疫球蛋白之天然狀態總體内的 150388.doc 201116626 比例。 在天然條件下或在高溫（例如60°C )下（即在免疫球蛋白之 抗原結合位點不會解摺疊之條件下），免疫球蛋白變異體 相比於親代免疫球蛋白可顯示較少自締合或聚集。較佳 地，在天然條件（例如不會導致免疫球蛋白解摺疊之條件） 下，免疫球蛋白變異體顯示較親代免疫球蛋白為少之自締 合或聚集。 本文所述之聚集傾向與熱重摺疊效率（TRE)不同，該熱 重摺疊效率係指蛋白質在熱變性後正確重摺疊之能力，且 通常利用圓二色性（CD)來量測（Tanha等人，Protein Eng Des Sel. 2006年11月；19(1 1):503-9)。本文所述之免疫球 蛋白聚集傾向之降低可對免疫球蛋白之熱重摺疊效率具有 很少影響或無影響。因此，熱重摺疊效率獨立於聚集傾向 且對免疫球蛋白之可製造性無明顯影響。 聚集可藉由習用方法來量測。適宜技術包括GP-HPLC、 HPLC 及 AUC(Gabrielson JP等人，J Pharm Sci 2007 96(2): 268-79)、過濾後之蛋白質損失；混濁度；螢光染料結合 (例如尼羅紅（Nile Red)、硫代黃素T (thioflavin T)或8-苯胺 基-1-萘續酸；參見例如Hawe, A.等人，Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99或Demeule, B等人，2007 Int J Pharm 329: 3 7-45)、場流分級分離（FFF ; Demeule, B等 人，mAbs 2009 1(2): 142-150)及分析超速離心（AU/AUC ; Liu J等人，AAPS J 2006 8 : 580-9)。 其他適宜方法闡述於 Arvinte Τ·，「Methods for structural 150388.doc 201116626 analysis 〇f pr〇tein pharinaceuticals」AAPS Press, 2005: 661-6及Kiese S等人，J Pharm Sci 2008 97(10): 4347-66 中。 可製造性之改良可能完全或部分由相對於親代免疫球蛋 白提高之生產率而引起。 免疫球蛋白變異體相比於親代免疫球蛋白可呈現提高之 生產率。例如，當在重組系統（例如細菌或哺乳動物細胞） ◎ 中表現時，免疫球蛋白變異體相比於親代免疫球蛋白可顯 示提高之產量或滴度。生產率可利用標準技術來量測，例 如Bradford分析、分光光度法及ELISA。 免疫球蛋白變異體相對於親代免疫球蛋白亦可呈現以下 中的一或多種：純化產量提高；調配問題減少；免疫原性 降低及生物利用度提高。 在較佳實施例中，可製造性之改良可能由相對於親代免 疫球蛋白降低之聚集傾向及提高之生產率二者而引起。 〇 較佳地，免疫球蛋白變異體呈現與親代免疫球蛋白相同 或基本上相同之活性（即抗原結合活性）。 免疫球蛋白係包含抗原結合位點之多肽或蛋白質。抗原 結合位點係免疫球蛋白之特異性結合抗原之—部分或全部 且與抗原之一部分或全部在空間上互補之部分。在抗原較 大的情況下，免疫球蛋白可僅結合抗原之特定部分該2 分稱為表位。較佳地，抗原結合結構域包含免疫球蛋白和 鏈可變區（VL)及免疫球蛋白重鏈可變區（VH)，其可在相= 或不同多肽鏈上。 150388.doc 201116626 免疫球蛋白之實例包括全抗體，包括抗體同種型，例如 IgG、IgA、IgD、IgM及IgE及其同種型亞類，例如igGi及 IgG4 ;抗體片段；及改造抗體衍生物，例如小免疫蛋白 (SIP)、微型化抗體、駱駝科動物VHH結構域及雙鏈抗體。 抗體片段之實例包括⑴由VL、VH、CL及CH1結構域 組成之Fab片段；（ii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段； (iii)由單一抗體之VL及VH結構域組成之Fv片段；（iv)由 VH或VL結構域組成之dAb片段（Ward, E.S.等人，Nature 341，544-546 (1989)); (v)分離的 CDR 區；（Vi) F(ab’）2 片 段’其為包含兩個相連接之Fab片段的二價片段；（νϋ)單 鏈Fv分子（scFv)，其中VH結構域與VL結構域藉由肽連接 體相連接，該肽連接體使得該兩個結構域締合形成抗原結 合位點（Bird等人 ’ Science, 242，423-426，1988 ; Huston等 人 ’ PNAS USA，85, 5879-5883，1988); (viii)雙特異性單 鏈Fv二聚體（PCT/US92/09965);及（ix)「雙鏈抗體」，其為 藉由基因融合而構建之多價或多特異性片段 (WO94/13804 ; P. Holliger等人 ’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448，1993)。Fv、scFv或雙鏈抗體分子可藉 由納入連接VH與VL結構域之二硫鍵而穩定化（γ· 人，Nature Biotech 14 1239-1245 1996)。亦可製備包含相 連結之scFv與CH3結構域之微抗體（s. Hu等人，Cancer Res. 56 3055-3061 1996) ° 免疫球蛋白可為天然的或完全或部分合成的。因此，其 中包括嵌合免疫球蛋白，其可包含融合至另一多肽之抗原 150388.doc 201116626 、’Ό &、纟°構域或等效物。嵌合抗體之選殖及表現闡述於EP-A-0120694及中。已設計包括一或多個抗原 結合位點之各種人工免疫球蛋白，包括例如Fab2、Fab3、 雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體及微抗體。 在一些較佳實施例中，本文所述之親代免疫球蛋白及免 疫球蛋白變異體係包含¥1^及VL結構域二者之全抗體或抗 體片段。 ^ 免疫球蛋白可藉由純化自天然來源分離或獲得，或者可 如本文所述藉由遺傳重組或藉由化學合成而獲得。例如， 合成的免疫球蛋白可藉由自藉助在適宜表現載體内合成及 組裝之募核苷酸而產生之基因表現來製備，如£肛卯比等 人 ’ J. Mol. Biol. (2000) 296，57-86或 Krebs等人，J0urnal of Immunological Methods 254 2001 67-84所述。 免疫球蛋白可天然地、在活體外或離體使用例如異源真 核細胞系統（例如CHO細胞）經糖基化，或者其可未經糖基 Q 化（例如若藉由在原核細胞中表現來製備）。較佳地，糖基 化之免疫球蛋白不包含岩藻糖。 適宜的親代免疫球蛋白可為具有已知胺基酸序列且藉由 在異源表現系統中重組表現而製備之任何免疫球蛋白。異 ' 源表現系統包括哺乳動物細胞，例如CHO細胞、昆蟲細 胞、酵母細胞及細菌細胞，例如大腸桿菌（E c〇li)(尤其用 於抗體片段），且在下文中予以更詳細闡述。 本文所述之適用於修飾之親代免疫球蛋白可呈現亞最佳 之可製造性。換言之，該親代免疫球蛋白可呈現一或多種 150388.doc 201116626 不期望之製備特徵， 表現時相對於對照 低。 例如當以製造規模在異源系統中重組 免疫球蛋白聚集增加及/或生產率降 口 =且對照免疫球蛋白包括在相同異源系統中呈現滿意之 〇製迨ί生之相f§]類型的免疫球蛋自。當以製造規模在哺乳 動物系統中表現時，適宜親代免疫球蛋白可例如產生1 g/L 或更 > 產量之可溶性物質（如藉由ELISA所量測）及/或5%或 更多之聚集（如藉由GP_HPLC所量測）。當以製造規模在細 囷系先中表現4，親代免疫球蛋白可例如產生0.5 g/L或更 )產量之可溶性物質（如藉由EUSA所量測）及/或5%或更多 之聚集（如藉由GP-HPLC所量測）。 —種方法可包含藉由例如如本文所述量測生產量及聚集 傾向來測定親代免疫球蛋白之可製造性。產生低產量（例 如在哺乳動物系統中1 g/L或更少之可溶性物質）及/或高聚 集傾向（例如5%或更多之聚集）之親代免疫球蛋白可被認為 呈現亞最佳之可製造性。 本文所述親代免疫球蛋白序列之修飾可用於提高或優化 其可製造性。 在較佳實施例中，親代免疫球蛋白可為治療抗體，即結 合治療相關抗原以達成有益治療效果之抗體。治療抗體之 諸多實例已為熟習此項技術者所習知。 免疫球蛋白變異體係與親代免疫球蛋白結合相同乾抗原 但具有不同胺基酸序列之非天然存在的免疫球蛋白。例 如，免疫球蛋白變異體序列相對於親代免疫球蛋白序列可 150388.doc -10· 201116626 有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸殘 基不同。較佳地，如本文所述，免疫球蛋白變異體序列與 親代免疫球蛋白序列之不同之處僅在於易於聚集之區段中 的一或多處取代。換言之，除本文所述之一或多處取代以 外’免疫球蛋白變異體之序列較佳與親代免疫球蛋白之胺 • 基酸序列一致。 免疫球蛋白變異體與親代免疫球蛋白結合相同表位且與 ^ 親代免疫球蛋白競爭結合抗原。免疫球蛋白間之競爭可容 易地在活體外例如利用ELISA及/或藉由使特定報告分子附 於一種免疫球蛋白上使其可在其他未經標記免疫球蛋白存 在下檢測到來進行分析。當親代免疫球蛋白係治療抗體 時，免疫球蛋白變異體較佳達成相同的有益治療效果。 本文所述免疫球蛋白之抗原結合結構域較佳包含重鏈可 變結構域（VH)及輕鏈可變結構域（VL)。免疫球蛋白之VH 及VL結構域各包含三個CDR(CDR1、CDR2及CDR3)，該 Q 等CDR被框架區（FR1、FR2、FR3及FR4)隔開。CDR係可 變結構域内之超變區’其含有負責抗體對其所識別抗原或 表位之特異性結合的大多數胺基酸殘基。CDR之長度可在 2個至26個胺基酸之間變化’此端視特定潛在框架所能夠 容納之長度而定。 較佳地，如本文所述使用之免疫球蛋白缺少Cdr内或 CDR間二硫鍵。 如本文所述使用之適宜親代免疫球蛋白之CH1、VH及 VL結構域可自任何種系或重排人類可變結構域獲得，或 150388.doc 201116626 可為基於已知人類可變結構域之共有序列之合成的可變結 構域。在一些實施例中’如下文所述，所製備免疫球蛋白 變異體之VH及VL結構域可能缺少一或多個CDR序列（例如 CDR3)以用於例如抗體改造。 當以製造規模在異源系統中重組表現時，免疫球蛋白變 異體相對於親代免疫球蛋白可呈現改良之可製造性，例如 減少之聚集及/或提高之生產率。當以製造規模在哺乳動 物系統中表現時’免疫球蛋白變異體可例如產生多於1 g/L 產量之可溶性物質（如藉由ELISA所量測）及/或少於5%之聚 集（如藉由GP-HPLC所量測）。較佳地，本文所述之免疫球 蛋白變異體產生多於1 g/L產量之可溶性物質且呈現少於 5。/〇之聚集。當以製造規模在細菌系統中表現時，免疫球 蛋白變異體可例如產生多於0.5 g/L產量之可溶性物質（如 藉由ELISA所量測）及/或少於5%之聚集（如藉由GP-HPLC所 量測）。較佳地，本文所述之免疫球蛋白變異體產生多於 0.5 g/L產量之可溶性物質且呈現少於5%之聚集。 易於t集之區段係免疫球蛋白輕鍵或重鍵序列内相對於 周圍序列具有較高聚集傾向且不利地影響免疫球蛋白之可 叙性的較短胺基酸殘基序列。易於聚集之區段可由1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基組成。 易於聚集之區段可例如位於免疫球蛋白之CHI、VH或 VL結構域中。免疫球蛋白之單一結構域或區域（例如vh或 VL結構域之FR1、FR2、FR3、FR4或CDR3區或者CH1結構 域）可在其序列内具有多個易於聚集之區段。本文所述之 150388.doc 12- 201116626 該等易於聚集之區段中之一或多者中一或多個殘基之取代 可改良本文所述免疫球蛋白之可製造性。 按照 Kabat，Ε·Α.，Wu, T.T.，Perry, H.M., Gottesmann，K.S & Foeller，C. (1991)中陳述之方案對下文所述之免疫球蛋 白殘基位置進行編號。Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH出版號為 91-3242. U.S.Department of Health and Human Services ° 若適宜，可相對於在免疫球蛋白序列中不變之Kabat編 號殘基來描述取代位置。 替代抗體編號方案闡述於Honegger，A及Pliickthun A. (2001)中。免疫球蛋白可變結構域之再一編號方案：An Automatic Modelling and Analysis Tool. J. Mol. Biol 309, 657-670。表la及lb展示Honegger與Kabat編號方案間之對 應。 取代至本文所述易於聚集之區段中的胺基酸較佳係20種 天然存在胺基酸之一。天然存在胺基酸及其標準單字母及 三字母縮寫已為熟習此項技術者所熟知（Principles of Protein Structure G. Schulz & R. Schirmer, (1979) Springer-Verlag NY公司，USA)。 取代可引入至親代免疫球蛋白之VL結構域框架區内的 易於聚集之區段中。VL結構域框架區之適宜的易於聚集 之區段可選自由下列組成之群：位置20易於聚集之區段、 位置37易於聚集之區段、位置45易於聚集之區段及位置74 易於聚集之區段。 150388.doc -13- 201116626 位置20易於聚集之區段位於VL框架區i中且自vl結構域 之位置15延伸至位置23。 位置20易於聚集之區段内的取代可發生在構域之 位置18處。 親代免疫球蛋白中位置18處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體t可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置18處之 殘基被R、S或V取代。 例如’親代免疫球蛋白中位置〗8處之胺基酸殘基可為 τ。免疫球蛋白變異體可包含含有T18R、T18S或T18V取代 之VL結構域。 位置20易於聚集之區段内的取代可發生在結構域之 位置20處。 親代免疫球蛋白甲位置20處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置2〇處之 殘基被Κ、R、S或V取代。 例如’親代免疫球蛋白中位置20處之胺基酸殘基可為 Τ。免疫球蛋白變異體可包含含有Τ20Κ、T20R、T20S或 T20V取代之VL結構域。 位置37易於聚集之區段位於VL框架區2中且自VL結構域 之位置36延伸至位置38。 位置37易於聚集之區段内的取代可發生在位置37處。 親代免疫球蛋白中位置37處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置37處之 殘基被Q或Ν取代。 150388.doc • 14- 201116626 例如，親代免疫球蛋白中位置37處之胺基酸殘基可為 L。免疫球蛋白變異體可包含含有L3 7Q取代之VL結構域。 位置45易於聚集之區段位於VL框架區2中且自VL結構域 之位置42延伸至位置49。 位置45易於聚集之區段内的取代可發生在位置45處。 親代免疫球蛋白中位置45處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置45處之 殘基被E ' K、R、Q或V取代。 例如，親代免疫球蛋白中位置45處之胺基酸殘基可為 T。免疫球蛋白變異體可包含含有T45E、T45K、T45R、 T45Q或T45V取代之VL結構域。親代免疫球蛋白中位置45 處之胺基酸殘基可為Q。免疫球蛋白變異體可包含含有 Q45E、Q45K或Q45R取代之VL結構域。 位置45易於聚集之區段内的取代可發生在位置46處。 親代免疫球蛋白中位置46處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置46處之 殘基被L、Y、K、R、H、F或S取代。 例如，親代免疫球蛋白中位置46處之胺基酸殘基可為 T。免疫球蛋白變異體可包含含有T46L或T46Y取代之VL 結構域。親代免疫球蛋白中位置46處之胺基酸殘基可為 L。免疫球蛋白變異體可包含含有L46K、L46R、L46H、 L46F或L46S取代之VL結構域。 位置74易於聚集之區段位於VL框架區3中且自VL結構域 序列之位置71延伸至位置77。 150388.doc -15- 201116626 位置74易於聚集之區段内的取代可發生在位置74處。 親代免疫球蛋白中位置74處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置74處之 殘基被V取代。 例如，親代免疫球蛋白中位置74處之胺基酸殘基可為 T。免疫球蛋白變異體可包含含有T74V取代之VL結構域。 取代可引入至親代免疫球蛋白之VL CDR3内的易於聚 之區段中。適宜的易於聚集之區段可選自由下列組成之 群：VL CDR3 N端易於聚集之區段及VL CDR3 C端易於聚 集之區段。 VL CDR3 N端易於聚集之區段在VL結構域序列中自不 變殘基C88延伸至距殘基C88之C端8個胺基酸位置處。例 如，VL CDR3 N端易於聚集之區段可自VL結構域之位置88 延伸至位置9 5 a。 親代免疫球蛋白中位置88 (C88)、89(C88+1 ;即距殘基 C88 之 C 端一個殘基）、90 (C88+2)、91 (C88+3)、92 (C88 + 4)、93 (C88 + 5)、94 (C88+6)、95 (C88 + 7)及 95a (C 8 8 + 8)中之一或多個位置處的胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。相對於不變的Kabat 殘基C88進行編號的VLCDR3位置顯示於括號中。 VL CDR3 N端易於聚集之區段内的取代可發生在位置91 (C88+3)處。 親代免疫球蛋白中位置91處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換°較佳地’位置91處之 150388.doc -16- 201116626 殘基被八、？、1^、11、3或贾取代。例如，親代免疫球蛋白 中位置91處之胺基酸殘基可為Y。免疫球蛋白變異體可包 含含有 Υ91Α、Y91F、Y91L、Y91R、Y91S 或 Y91W取代之 VL結構域。 VL CDR3 Ν端易於聚集之區段内的取代可發生在位置93 (C88 + 5)處。 親代免疫球蛋白中位置93處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置93處之 殘基被D、F、L、Q、S、Τ、W或Υ取代。例如，親代免疫 球蛋白中位置93處之胺基酸殘基可為Ρ且免疫球蛋白變異 體可包含含有 P93D、P93F、P93L、P93Q、P93S、Ρ93Τ、 P93W或Ρ93Υ取代之VL結構域。 VL CDR3 C端易於聚集之區段在VL結構域序列中自距不 變殘基F98之Ν端3個胺基酸位置（即位置F98-3或95)延伸至 位置99。 親代免疫球蛋白中位置95 (F98-3)、96 (F98-2)、97 (F98-1)、98或99中之一或多個位置處的胺基酸殘基在免疫 球蛋白變異體中可由不同胺基酸殘基替換。 VL CDR3 C端易於聚集之區段内的取代可發生在位置96 (F98-2)處。藉由與Kabat殘基F98之接近度進行編號之VL CDR3位置顯示於括號中。 親代免疫球蛋白中位置96處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置96處之 殘基被E、L、V或W取代。 150388.doc -17- 201116626 例如，親代免疫球蛋白中位置96處之胺基酸殘基可為r 且免疫球蛋白變異體可包含含有r96E、r96l、R96V或 R96W取代之VL結構域。 取代可引入至親代免疫球蛋白之VH結構域框架區内的 易於聚集之區段中。VH結構域框架區之適宜的易於聚集 之區段可選自由下列組成之群：FR1易於聚集之區段；位 置75易於聚集之區段；位置95易於聚集之區段；及位置 102易於聚集之區段（或CDR3易於聚集之區段）。 FR1易於聚集之區段位於vh框架區1中，且可例如自VH 結構域序列之位置1延伸至位置21。 VH FR1易於聚集之區段可包含選自由下列組成之群的 易於聚集之區段：位置1至3、位置4至6、位置11至13及位 置16至21。 VH FR1易於聚集之區段可自VH結構域序列之位置1延伸 至位置3。 V H F R1易於聚集之區段内的取代可發生在位置1處。 親代免疫球蛋白中位置1處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置1處之 殘基被Ε、Q、D、Α或V取代。例如，親代免疫球蛋白中 位置1處之胺基酸殘基可為E且免疫球蛋白變異體可包含含 有E1Q、E1D、E1A或E1V取代之VH結構域；或者親代免 疫球蛋白中位置1處之胺基酸殘基可為Q且免疫球蛋白變異 體可包含含有Q1E、Q1D、Q1A或Q1V取代之VH結構域。 VH FR1易於聚集之區段可自VH結構域之位置4延伸至位 150388.doc -18- 201116626 置6。 VH FR1易於聚集之區段内的取代可發生在乂只結構域之 位置5處。 親代免疫球蛋白中位置5處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置5處之 殘基被V取代。例如，親代免疫球蛋白中位置5處之胺基酸 殘基可為L且免疫球蛋白變異體可包含含有L5v取代之vh 結構域。 〇 VH FR1易於聚集之區段可自VH結構域之位置11延伸至 位置13。 VH FR1易於聚集之區段内的取代可發生在結構域之 位置12處。 親代免疫球蛋白中位置12處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置12處之 殘基被V取代。例如，親代免疫球蛋白中位置^處之胺基 Ο 酸殘基可為L且免疫球蛋白變異體彳包含含有L12V取代之 VH結構域。 VH FR1易於聚集之區段可自VH結構域之位置延伸至 位置21。 VHFR1易於聚集之區段内的取代可發生在位置17處。 親代免疫球蛋自巾位置17處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置Η處之 殘基被R取代。例如，親代免疫球蛋白中位置17處之胺基 酸殘基可為G且免疫球蛋白變異體可包含含有⑴化取代之 150388.doc -19· 201116626 VH結構域。 VH FR1易於聚集之區段内的取代可發生在位置19處。 親代免疫球蛋白中位置19處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置19處之 殘基被T或V取代。例如’親代免疫球蛋白中位置19處之 胺基酸殘基可為L且免疫球蛋白變異體可包含含有L19T或 L19V取代之VH結構域。 VH FR1易於聚集之區段内的取代可發生在位置2〇處。 親代免疫球蛋白中位置20處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置2〇處之 殘基被A、K、S或T取代。例如，親代免疫球蛋白中位置 20處之胺基酸殘基可為r且免疫球蛋白變異體可包含含有 R20A、R20K、R20S或R20T取代之結構域。 位置75易於聚集之區段可自VH結構域之位置60延伸至 位置85。 位置75易於聚集之區段内的取代可發生在位置61處。 親代免疫球蛋白中位置6 1處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。例如，位置6丨處之殘 基可被KRQEDN或A取代。較佳地，位置6丨處之殘基被 R取代。例如’親代免疫球蛋白中位置61處之胺基酸殘基 可為P且免疫球蛋白變異體可包含含有p61R取代之VH結構 域。 位置75易於聚集之區段内的取代可發生在位置85處。 親代免疫球蛋白中位置85處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 150388.doc •20- 201116626 變異體中可由不同胺基酸殘基替換，例如，位置85處之殘 基可被E、D或A取代。較佳地，位置85處之殘基被E取 代。例如，親代免疫球蛋白中位置85處之胺基酸殘基可為 V且免疫球蛋白變異體可包含含有V85£、V85D或V85A取 ' 代之VH結構域。 VH之位置95易於聚集之區段位於vh框架區3中且可自位 置91延伸至位置99或1〇〇。 〇 親代免疫球蛋白之VH結構域中位置91、92、93、94、 96 97 98、99及/或100中之一或多個位置處的胺基 酸殘基在免疫球蛋白變異體中可由不同胺基酸殘基替換。 VH之位置95易於聚集之區段内的取代可發生在位置 處。 親代免疫球蛋白巾位置94處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。例如，位置94處之殘 基可被R、κ或τ取代。較佳地，位置94處之殘基被尺取 〇 代。例如，親代免疫球蛋白中位置94處之胺基酸殘基可為 '且免疫球蛋白變異體可包含含有K94r取代之結構 域’或者親代免疫球蛋白中位置94處之胺基酸殘基可為Η 且免疫球蛋白變異體可包含含有H94R、則伙或Η術取代 之VH結構域。 VH之位置951(於咿隹七r- 约於I集之區段内的取代可發生在位置95 處。 親代免疫球蛋自巾位置％處之胺基酸祕在免疫球蛋白 變…體中可由不同胺基酸殘基替換。例如，位置％處之殘 150388.doc 201116626 基可被E或D取代。較佳地，位置％處之殘基被d取代。例 如，親代免疫球蛋白中位置95處之胺基酸殘基可為R且免 疫球蛋白變異體可包含含有R95E4R95D取代之VH結構 域。 VH之位置95易於聚集之區段内的取代可發生在位置96 處。 親代免疫球蛋白中位置96處之胺基酸殘基在免疫球蛋白 變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置96處之 殘基被A取代。例如，親代免疫球蛋白中位置外處之胺基 酸殘基可為G且免疫球蛋白變異體可包含含有6 a取代之 VH結構域。 VH之位置95易於聚集之區段内的取代可發生在位置1〇〇 處。 親代免疫球蛋白中位置100處之胺基酸殘基在免疫球蛋 白變異體中可由不同胺基酸殘基替換。位置1〇〇處之殘基 可被F、G、L、Μ或P取代。較佳地，位置i 〇〇處之殘基被F 取代。例如，親代免疫球蛋白中位置1 〇〇處之胺基酸殘基 可為V且免疫球蛋白變異體可包含含有vioof、V100G、 V100L、V100M或V100P取代之VH結構域。 取代可引入至親代免疫球蛋白之VH CDR3易於聚集之區 段中。 VH CDR3易於聚集之區段自位置i〇〇c(即距不變殘基 D101之N端兩個胺基酸或相對於Kabat殘基D101進行編號 之D101-2)延伸至位置102或位置1〇3。 150388.doc -22- 201116626 親代免疫球蛋白之VH結構域中位置DIO 1-2、D101-1(距 殘基D101之N端兩個或一個胺基酸）、101、1〇2及1〇3中之 一或多個位置處的胺基酸殘基在免疫球蛋白變異體中可由 不同胺基酸殘基替換。 VH CDR3易於聚集之區段内的取代可發生在位置di〇i_2 (距殘基D101之N端兩個胺基酸）處。 親代免疫球蛋白中位置D101-2處之胺基酸殘基在免疫球 蛋白變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置 D101-2處之殘基被D、E、F、G、P、S、T、W或Y取代。 例如’親代免疫球蛋白中位置D101_2處之胺基酸殘基可為 A且免疫球蛋白變異體可包含含有a(d101-2)D、ΑφΙΟΙ-Ζ^ 、 A(D101_2)F 、 A(D101-2)G 、 A(D101-2)P 、 A(D101-2)S、A(D101-2)T、或 A(D101-2)W、或 A(D101-2)Y 取代之 VH結構域。換言之，在距D1〇1iN端兩個胺基酸之位置 (例如 A100c)A被取代為D、E、F、G、P、S、T、W4Y。 VH CDR3易於聚集之區段内的取代可發生在位置di〇i_i (距D101之N端一個胺基酸）處。 親代免疫球蛋白中位置D101-1處之胺基酸殘基在免疫球 蛋白變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置 D101-1處之殘基被F、G、L、1>或^1取代。例如，親代免疫 球蛋白中位置D101-1處之胺基酸殘基可為S且免疫球蛋白 變異體可包含含有8(〇1〇1_1)卩、8(0101-1)〇、8(0101-1凡、8(〇101-1)?或8(〇101-1)厘取代之¥11結構域。在一些 實施例中，殘基s(Di〇i-i)對應於si〇〇d。 150388.doc -23- 201116626 VH CDR3易於聚集之區段内的取代可發生在位置i〇2 處。 親代免疫球蛋白中位置102處之胺基酸殘基在免疫球蛋 白變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置102 處之殘基被A、F、Η、I、L、V或Y取代。例如，親代免疫 球蛋白中位置102處之胺基酸殘基可為ρ且免疫球蛋白變異 體可包含含有 Ρ102Α、P102F、Ρ102Η、Ρ102Ι、P102L、 Ρ102Υ或P102V取代之VH結構域；或者親代免疫球蛋白中 位置102處之胺基酸殘基可為s且免疫球蛋白變異體可包含 含有 S102A、S102F、S102H、S102I、S102L、S102Y 或 S102V取代之VH結構域。 VH CDR3易於聚集之區段内的取代可發生在位置1〇3 處。 親代免疫球蛋白中位置103處之胺基酸殘基在免疫球蛋 白變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置1 〇3 處之殘基被I、L或V取代。例如，親代免疫球蛋白中位置 103處之胺基酸殘基可為W且免疫球蛋白變異體可包含含 有W103I、W103L或W103V取代之VH結構域。 CH1易於聚集之區段自位置150延伸至位置156。 CH1易於聚集之區段内的取代可發生在位置153處。

親代免疫球蛋白中位置153處之胺基酸殘基在免疫球蛋 白變異體中可由不同胺基酸殘基替換。較佳地，位置153 處之殘基被V取代。例如’親代免疫球蛋白中位置1 5 3處之 胺基酸殘基可為S且免疫球蛋白變異體可包含含有S153V 150388.doc -24- 201116626 取代之CH1結構域。 列可包含至 體可包含至 免疫球蛋白變異體相對於親代免疫球蛋白序 多1〇處本文所述取代。例如，免疫球蛋白變異 多 1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10處取代。 該等取代可位於相同的易於聚集之區段中心於不㈣ 易於聚集之區段中。例如，免疫球蛋白變異體可在1、之、 3、4個或更多個不同的本文所述易於聚集之區段中包含取

代。免疫球蛋白變異體可在VH結構域、¥[結構域及/或 CH1區中包含取代。 可使用本文所述取代之任何組合。適宜取代組合之實例 顯示於表3a及3b中。 在一些實施例中，免疫球蛋白變異體可在VL fri及/或 FR2結構域中包含2處取代；在vL CDR3結構域中包含3處 取代；在VL FR2結構域中包含2處取代且在VL CDR3結構 域中包含3處取代；在VL FR1結構域中包含2處取代、在 VL FR2結構域中包含2處取代且在VL CDR3結構域中包含3 處取代，在VH FR1結構域中包含2處取代；結構 域中包含1處取代且在VH CDR3結構域中包含丨處取代；在 VH CDR3結構域中包含2處取代；或在chi結構域中包含i 處取代且在VH FR1結構域中包含1處取代。 免疫球蛋白變異體可在位置20易於聚集之區段中包含兩 處取代。例如’免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位 置18及20處包含取代之vl結構域。例如，位置18及20處 之殘基可被R取代。VL結構域可例如包含丁18尺及12〇11取 150388.doc •25· 201116626 代。 免疫球蛋白變異體可在位置20易於聚集之區段中包含取 代且在位置74易於聚集之區段中包含取代。例如，免疫球 蛋白變異體可包含在如上文所述位置18及74處包含取代之 VL結構域。例如，位置18處之殘基可被R取代且位置74處 之殘基可被V取代。VL結構域可例如包含T18R及T74V取 代。 免疫球蛋白變異體可在位置45易於聚集之區段中包含兩 處取代。例如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位 置45及46處包含取代之VL結構域。例如，位置45處之殘 基可被K或R取代且位置46處之殘基可被L取代。VL結構域 可例如包含T45K(或T45R)及T46L取代。 免疫球蛋白變異體可在位置20易於聚集之區段中包含兩 處取代且在位置45易於聚集之區段中包含兩處取代。例 如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置18、20、 45及46處包含取代之VL結構域。例如’位置18及20處之 殘基可被R取代，位置45處之殘基可被K或R取代且位置46 處之殘基可被L取代。VL結構域可例如包含T18R、 T20R、T45K 及 T46L 取代或 T18R、T20R、T45R 及 T46L 取 代。 免疫球蛋白變異體可在VL CDR3 N端易於聚集之區段中 包含兩處取代。例如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文 所述位置91 (C8 8 + 3)、93 (C88 + 5)及96 (F98-2)處包含取代 之VL結構域。例如，位置91處之殘基可被W取代，位置93 150388.doc -26- 201116626 處之殘基可被Q取代且位置96處之殘基可被V取代。VL結 構域可例如包含 Y91W (C88+3)、P93Q (C88 + 5)及 R96V (F98-2)取代。 免疫球蛋白變異體可在位置45易於聚集之區段中包含兩 處取代且在VL CDR3 N端易於聚集之區段中包含兩處取 代。例如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置 45、46、91 (C88+3)、93 (C88 + 5)及 96 (F98-2)處包含取代 之VL結構域。例如，位置45處之殘基可被K或R取代，位 置46處之殘基可被L取代，位置91處之殘基可被W取代， 位置93處之殘基可被Q取代且位置96處之殘基可被V取 代。VL結構域可例如包含T45K、T46L、Y91W (C88+3)、 P93Q (C88+5)及 R96V (F98-2)取代或 T45R、T46L、Y91W (C88+3)、P93Q (C88 + 5)及 R96V (F98-2)取代。 免疫球蛋白變異體可在位置20易於聚集之區段中包含兩 處取代、在位置45易於聚集之區段中包含兩處取代、且在 VL CDR3 N端易於聚集之區段中包含兩處或三處取代。例 如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置1 8、20、 45、46、91 (C88 + 3)、93 (C88 + 5)及 96 (F98-2)處包含取代 之VL結構域。例如，位置18及20處之殘基可被R取代，位 置45處之殘基可被K或R取代，位置46處之殘基可被L取 代，位置91處之殘基可被W取代，位置93處之殘基可被Q 取代且位置96處之殘基可被V取代。VL結構域可例如包含 T18R、T20R、T45K、T46L、Y91W (C88+3)、P93Q (C88 + 5)及 R96V (F98-2)取代或 T18R、T20R、T45R、 150388.doc -27- 201116626 T46L、Y91W (C88+3)、P93Q (C88 + 5)及 R96V (F98-2)取 代。 免疫球蛋白變異體可包含在VL之位置37易於聚集之區 段及VL之位置45易於聚集之區段中包含取代之VL結構 域。例如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置37 及45處包含取代之VL結構域。例如，位置37處之殘基可 被Q或N取代且位置45處之殘基可被E、K或R取代。VL結 構域可例如包含L37Q及Q45R取代。 免疫球蛋白變異體可包含在VH FR1易於聚集之區段及 VH CDR3易於聚集之區段中包含取代之VH結構域。 例如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置1及 1 02處包含取代之VH結構域。例如，位置1處之殘基可被 Q、A、E或V取代且位置102處之殘基可被Y取代。VH結構 域可例如包含Q1A及P102Y取代、Q1E及P102Y取代、Q1V 及P102Y取代、E1A及P102Y取代、E1Q及P102Y取代、或 E1V及Ρ102Υ取代。 在其他實例中，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述 位置1及103處包含取代之VH結構域。例如’位置1處之殘 基可被Q、A、D、Ε或V取代且位置103處之殘基可被1取 代。VH結構域可例如包含Q1A及W103L取代、Q1E及 W103L取代、Q1D及W103L取代、Q1V及W103L取代、 Ε1Α及W103L取代、E1Q及W103L取代、E1D及W103L取代 或E1V及W103L取代。 免疫球蛋白變異體可在VH CDR3易於聚集之區段中包含 150388.doc •28- 201116626 兩處取代。 例如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置100c (0101-2)及10〇€1(0101-1)處包含取代之乂11結構域。例如， 位置100c處之殘基可被W取代且位置100d處之殘基可被F ' 取代。VH結構域可例如包含AlOOcW及SlOOdF取代。 ' 在其他實例中，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述 位置100d (D101-1)及102處包含取代之VH結構域。例如， 位置100d處之殘基可被F或Μ取代且位置102處之殘基可被 Ο ， V或Υ取代。VH結構域可例如包含SlOOdF及P102V取代、 SlOOdM 及 P102V 取代、SlOOdF 及 P102Y 取代或 SlOOdM 及 P102Y取代。 在其他實例中，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述 位置102及103處包含取代之VH結構域。例如，位置102處 之殘基可被V或Y取代且位置103處之殘基可被L、I或V取 代。VH結構域可例如包含P102Y及W103L取代、P102Y及 q W103I 取代、P102Y 及 W103V 取代、P102V 及 W103L 取代、 P102V 及 W103I 取代、或 P102V 及 W103V 取代。 免疫球蛋白變異體可包含在VH之位置95易於聚集之區 段及VH CDR3易於聚集之區段中包含取代之VH結構域。 ' 例如，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置95及 102處包含取代之VH結構域。例如，位置95處之殘基可被 E或D取代，且位置102處之殘基可被A F Η I L V或Y取 代。VH結構域可例如包含R95D及S102V取代。視情況， VH結構域可在如上文所述位置94及100處進一步包含取 150388.doc -29- 201116626 代。例如，位置94處之殘基可被R、K或T取代，且位置 100處之殘基可被F、G、L、Μ或Ρ取代。VH結構域可例如 包含 H94R、R95D、V100F 及 S102V 取代。 免疫球蛋白變異體可在CH1易於聚集之區段及VH之位置 19易於聚集之區段中包含取代。例如，免疫球蛋白變異體 可包含在位置153處包含取代之CH1結構域及在如上文所 述位置19處包含取代之VH結構域。例如，位置153處之殘 基可被V取代且位置19處之殘基可被Τ取代。免疫球蛋白 可例如在CH1結構域中包含S153 V取代且在VH結構域中包 含L19T取代。 在其他實例中，免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述 位置153處包含取代之CH1結構域及在如上文所述位置20 處包含取代之VH結構域。例如，位置1 53處之殘基可被V 取代且位置20處之殘基可被Α取代。免疫球蛋白變異體可 例如包含S153V及R20A取代。 免疫球蛋白變異體可包含在VL之位置20易於聚集之區 段中包含取代之VL結構域及在VH FR1易於聚集之區段中 包含取代之VH結構域。例如，免疫球蛋白變異體可包含 位置20處經取代之VH結構域及位置18處經取代之VL結構 域。例如，VH結構域中位置20處之殘基可被A取代且VL 結構域中位置1 8處之殘基可被V取代。例如，免疫球蛋白 可包含含有T1 8V取代之VL結構域及含有R20A或R20V取代 之VH結構域。 免疫球蛋白變異體可包含在VL之位置45易於聚集之區 150388.doc -30- 201116626 段中包含取代之VL結構域及在VH之位置75易於聚集之區 段中包含一或多處取代之VH結構域。例如，免疫球蛋白 變異體可包含位置61及85處經取代之VH結構域及位置46 處經取代之VL結構域。例如，VH結構域中位置61處之殘 基可被K、R、Q、E、D、N及A取代，較佳被R取代；VH 結構域中位置85處之殘基可被E、D或A取代，較佳被E取 代；且VL結構域中位置46處之殘基可被K、R、Η、F或S 取代，較佳被R取代。例如，免疫球蛋白可包含含有L46R Ο 取代之VL結構域及含有P61R及V85E取代之VH結構域。 免疫球蛋白變異體可包含在VL之位置45易於聚集之區 段中包含取代之VL結構域及在VH之位置95易於聚集之區 段中包含一或多處取代且在VH CDR3易於聚集之區段中包 含一或多處取代之VH結構域。例如，免疫球蛋白變異體 可包含位置95及102處經取代之VH結構域及位置37及45處 經取代之VL結構域。例如，VH結構域中位置95處之殘基 _ 可被Ε或D取代，較佳被D取代；VH結構域中位置102處之

G 殘基可被A、F、Η、I、L、V或Υ取代，較佳被Υ取代；VL 結構域中位置37處之殘基可被Q或Ν取代，較佳被Q取代； 且VL結構域中位置45處之殘基可被R、Κ或Ε取代，較佳被 R取代。例如，免疫球蛋白可包含含有L37Q及Q45R取代之 VL結構域及含有R95D及S102V取代之VH結構域。 免疫球蛋白變異體可包含在VL之位置45易於聚集之區 段中包含取代之VL結構域及在VH之位置95易於聚集之區 段中包含一或多處取代之VH結構域。例如，免疫球蛋白 150388.doc •31 201116626 變異體可包含位置94及95處經取代之VH結構域及位置46 處經取代之VL結構域。例如，VH結構域中位置94處之殘 基可被R、K或T取代，較佳被R取代；VH結構域中位置95 處之殘基可被E或D取代，較佳被D取代；且VL結構域中位 置46處之殘基可被K、R、Η、F或S取代，較佳被R取代。 例如，免疫球蛋白可包含含有L46R取代之VL結構域及含 有H94R及R95D取代之VH結構域。 在VH、VL及CH1結構域之易於聚集之區段的胺基酸序 列内實施取代所需要之技術在業内通常可以獲得。例如， 編碼包含一或多處取代之免疫球蛋白變異體的核酸可利用 標準DNA處理及誘變技術來製備；例如如Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel 等人編輯，John Wiley & Sons, 1992或Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 第二版，Sambrook等人，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press中所述。隨後可如下文所述表現該核酸以製備免疫球 蛋白變異體。 可針對結合及/或中和親代免疫球蛋白之靶抗原的能力 及/或改良之可製造性對各種不同序列進行測試。 引入上文所述一或多處取代可藉由相對於親代免疫球蛋 白提高免疫球蛋白變異體之表現後生產率及降低聚集傾向 而相對於親代免疫球蛋白提高免疫球蛋白變異體之可製造 性。 例如，免疫球蛋白變異體可呈現相對於親代免疫球蛋白 至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至 150388.doc -32- 201116626 少⑽％、至少200%或至少500%之生產率提高及相對於親 代免疫球蛋白至少10%、至少20%、至少3〇%、至少桃、 至少50%、至少嶋、至少90%或至少99%之聚集減少。免 疫球蛋白變異體相對於親代免疫球蛋白可呈現至多100% 之聚集減少（即聚集完全消除）。 製備本文所述之免疫球蛋白變異㈣方法可包含提供親 代免疫球蛋白，在VL結構域中在VL之位置37易於聚集之 區段及/或VL之位置45易於聚集之區段中引入取代及/或 在VH結構域中在VH !^丨易於聚集之區段；vh之位置％ 易於聚集之區段；及VH CDR3易於聚集之區段中引入取 代， 由此製備免疫球蛋白變異體，其中該免疫球蛋白變異體 相對於親代免疫球蛋白呈現提高之生產率及減少之聚集。 例如’製備免疫球蛋白變異體之方法可包含·· 提供親代免疫球蛋白； 在VH結構域中引入一或多處取代：位置1處八、〇、£、 Q或V取代；位置17處R取代；位置94處R取代；位置95處 D取代；位置96處A取代；位置1〇〇處ρ取代；位置1〇〇(1處 F、G、L、Μ或P取代，較佳為F或Μ取代；位置1〇2處a、 卩、11、1、1^、乂或¥取代，較佳為乂或丫取代；及/或 在VL結構域中引入取代：位置37處q取代；位置45處 E、K、R、Q或V取代，較佳為K或R取代；位置46處[或γ 取代，較佳為L取代； 由此製備免疫球蛋白變異體’其中該免疫球蛋白變異體 150388.doc -33- 201116626 相對於親代免疫球蛋白呈現提高之生產率及減少之聚集。 例如，適宜VH結構域可在如上文所述位置94及102處具 有取代，視情況在位置94及100處進一步經取代。例如， VH結構域中位置95處之殘基可被D取代，且位置102處之 殘基可被A、F、Η、I、L、V或Y取代，較佳被V或Y取 代；視情況，位置94處之殘基亦可被R取代且位置100處之 殘基被F取代。 適宜VL結構域可在如上文所述位置37及45處具有取 代。例如，位置37處之殘基可被Q取代且位置45處之殘基 可被Ε、Κ、R、Q或V取代，較佳被Κ或R取代。VL結構域 可例如包含L3 7Q及Q45R取代。 免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置94及95處經 取代之VH結構域及在位置46處經取代之VL結構域。例 如，VH結構域中位置94及95處之殘基可分別被R及D取代 且VL結構域中位置46處之殘基可被R取代。例如，免疫球 蛋白可包含含有L46R取代之VL結構域及含有H94R及R95D 取代之VH結構域。 其他免疫球蛋白變異體可包含在如上文所述位置95及 1 02處經取代之VH結構域及在位置37及45處經取代之VL結 構域。例如，VH結構域中位置95及102處之殘基可分別被 D及V取代且VL結構域中位置37及45處之殘基可分別被Q 及R取代。例如，免疫球蛋白可包含含有L73Q及Q45R取代 之VL結構域及含有R95D及S102V取代之VH結構域。 存在本文所述之易於聚集之區段可能有助於識別呈現降 150388.doc -34- 201116626 低或亞最佳之可製造性的免疫球蛋白。 評價免疫球蛋白可製造性之方法可包含： 識別選自由下列組成之群之一或多個位置處的胺基酸殘 基··免疫球蛋白VL結構域中之位置18、20、45、46、 74、91、93及96，及免疫球蛋白vh結構域中之位置1、 5、12、17、19、20、94、96、100c、100d、102、103， 及CH1結構域中之位置153， 其中在免疫球蛋白之VL結構域令在位置18處存在除R、 S或V(較佳R或V)之外的殘基、在位置2〇處存在除κ、R、S 或V(較佳R或V)之外的殘基、在位置45處存在除E、K、 R、Q或V(較佳K或R)之外的殘基、在位置46處存在除[或 Y(較佳L)之外的殘基、在位置74處存在除v之外的殘基、 在位置91處存在除A、F、L、R、S或W(較佳W)之外的殘 基、在位置93處存在除D、F、L、Q、S、T、W或Y(較佳 Q)之外的殘基及/或在位置96處存在除E、L、V或W(較佳 V)之外的殘基；及/或 在免疫球蛋白之VH結構域中在位置1處存在除a、d、 E、Q或V之外的殘基、在位置5或位置12處存在除v之外的 殘基、在位置17處存在除R之外的殘基、在位置19處存在 除T或V(較佳T)之外的殘基、在位置20處存在除a、K、S 或T(較佳A)之外的殘基、在位置94處存在除尺之外的殘 基、在位置96處存在除A之外的殘基、在位置⑺⑼處存在 除〇、£、1?、0、？、8、1、\^或丫(較佳\^)之外的殘基、 在位置100d處存在除F、G、L、Μ或P(較佳F或M)之外的 150388.doc 35- 201116626 殘基、在位置102處存在除A、F、Η、I、L、V或Y(較佳v 或Y)之外的殘基、在位置l〇3處存在除！、L或V之外的殘 基，及/或在免疫球蛋白之CH1結構域中在位置153處存在 除V之外的殘基表明免疫球蛋白具有亞最佳之可製造性。 在一些實施例中，可確定免疫球蛋白VH結構域中位置 100d及/或102處胺基酸殘基之身份。在位置1〇〇(1處存在除 F、G、L、Μ或P(較佳F或M)之外的殘基及/或在位置1()2處 存在除八、？、11、1、[、¥或丫（較佳乂或丫）之外的殘基表 明免疫球蛋白之可製造性亞最佳。 可製造性經鑒定相對於對照免疫球蛋白較低或亞最佳之 免疫球蛋白可為藉由上文所述方法進行修飾以製備呈現改 良之可製造性之免疫球蛋白變異體的候選者。 具體而言，可識別免疫球蛋白序列内對可製造性具有有 害影響之一或多個殘基。隨後可如本文所述對所識別之殘 基進行改變或修飾以改良可製造性。 本發明之另一態樣提供藉由上文所述方法製備之親代免 疫球蛋白的變異體。 本發明之另一態樣提供親代免疫球蛋白之變異體； 其中該免疫球蛋白變異體包含： VL結構域，相對於親代免疫球蛋白序列其在框架易於 聚集之區段及/或CDR3易於聚集之區段包含取代； VH結構域，相對於親代免疫球蛋白序列其在框架易於 聚集之區域及/或CDR3易於聚集之區段包含取代；及/或 CH1結構域，相對於親代免疫球蛋白序列其在CH1易於 150388.doc -36· 201116626 聚集之區域包含取代。 適宜的易於聚集之區段及取代在上文中已闡述。 VL、VH或CH1結構域中一位置處的取代涉及用不同的 殘基（較佳上文所述殘基）替換親代序列中該位置之殘基。 在親代免疫球蛋白於胺基酸序列中之合適位置上已含有上 文所述殘基的情況下，此並非本文所述之取代或經取代殘 基。因此，親代或種系免疫球蛋白不是本文所述之免疫球 蛋白變異體。 〇 如上文所述，免疫球蛋白變異體可與親代免疫球蛋白具 有類似或一致之生物活性，但呈現改良之可製造性，例如 降低之聚集傾向及/或異源表現系統中提高之生產率。 例如’免疫球蛋白變異體可呈現相對於親代免疫球蛋白 至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至 少100%、至少200%或至少500%之生產率提高及/或相對於 親代免疫球蛋白至少10%、至少20%、至少30%、至少 Q 40°/°、至少50〇/°、至少80。/。、至少90。/。或至少99%之聚集減 少（即在天然狀態總體中聚集分子之比例降低）。免疫球蛋 白變異體相對於親代免疫球蛋白可呈現至多1 〇〇%之聚集 減少（即聚集完全消除）。 如上文所述，免疫球蛋白變異體相對於親代免疫球蛋白 可呈現提高之生物利用度及/或降低之免疫原性。 本發明之另一態樣提供編碼如上文所述免疫球蛋白變異 體或其CHI、VH或VL結構域之分離核酸。 核酸可包含DNA或RNA，且可為完全或部分合成的。提 150388.doc -37- 201116626 及本文所述之核苷酸序列涵蓋具有指定序列2DNA分子， 且涵蓋具有指定序列之RNA分子，其中除非上下文另有要 求否則在該特定序列中U被T取代。 本文所述之免疫球蛋白變異體分子或其cm、VH結構域 及/或VL結構域可藉由包含以下步驟之方法來製備：在一 疋條件下表現該核酸以達成該免疫球蛋白變異體分子或其 CHI、VH及/或VL結構域之製備，及對其進行回收。 如下文更洋細闡述，核酸可編碼免疫球蛋白變異體或其 缺少一或多個CDR之VH或VL結構域。取自供體免疫球蛋 白之一或多個CDR可藉由將編碼該（等）CDR之適宜核酸插 入至編碼免疫球蛋白變異體或其V Η或V L結構域之核酸中 而納入免疫球蛋白變異體之框架中。 免疫球蛋白變異體及編碼核酸較佳係孤立的。當藉由重 組DNA技術在活體外或在活體内製備免疫球蛋白及核酸 時，免疫球蛋白及核酸不含或基本上不含在製備環境（例 如細胞培養）中可見之伴隨物質（例如其他多肽或核酸）。 本發明之其他態樣提供呈質粒、載體、轉錄或表現盒形 式之核酸構建體’其包含至少—種編碼本文所述免疫球蛋 白變異體或其CHI、VH及/或VL結構域之核酸。 構建體可用於表現系統中以表現如上文所述之免疫球蛋 白。 用於在各種不同宿主細胞中選殖及表現免疫球蛋白之系 統已為熟習此項技術者所熟知。適宜宿主細胞包括細菌、、 哺乳動物細胞、酵母及杆狀病毒系統。業内可獲得之用於 150388.doc -38- 201116626 表現異源多肽之哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、 HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞及諸多 其他細胞。大腸桿菌係常見的用於小免疫球蛋白分子之較 佳細菌宿主= 免疫球蛋白（例如抗體及抗體片段）於原核細胞（例如大腸 桿菌）中之表現在業内已非常確定。综述可參見例如 Pliickthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)。彼等熟 習此項技術者亦可將於培養物中之真核細胞中表現作為製 備免疫球蛋白之一種選擇方案，最近的綜述可參見例如 Ref，M.E. (1993) Curr· Opinion Biotech. 4: 573-576 ; Trill J.J.等 人，（1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560。免疫球蛋白（例 如抗體及抗體片段）亦可表現於無細胞系統中。 可選擇或構建含有合適調節序列之用於表現免疫球蛋白 的適宜載體，該等合適調節序列包括啟動子序列、終止子 序列、多聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因及視需 要其他序列。載體可為質粒、病毒（例如噬菌體）、或噬菌 粒，此視需要而定。更多細節可參見例如Molecular Cloning: a Laboratory Manual:第 2 版，Sambrook 等人， 1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。用於核酸處 理（例如在製備核酸構建體中）、誘變、測序、將DNA引入 細胞中及基因表現、及蛋白質分析之許多已知技術及方案 詳細闡述於 Current Protocols in Molecular Biology，第二 版，Ausubel 等人編輯，John Wiley & Sons，1992 中。 編碼免疫球蛋白變異體或其CHI、VH及/或VL結構域之 150388.doc -39- 201116626 核酸可包含於宿主細胞中。又一態樣提供包含將該核酸引 入宿主細胞中之方法。該引入可採用任何可用技術。對於 真核細胞，適宜技術可包括碟酸約轉染、DEAE-葡聚糖、 電穿孔、脂質體調介之轉知及使用反轉錄病毒或其他病毒 (例如牛痘或用於昆蟲細胞之杆狀病毒）之轉導。可使用病 毒系統或基於質粒之系統將核酸引入宿主細胞（尤其真核 細胞）中。質粒系統可以附加體形式保持，或者可納入宿 主細胞或人工染色體中。納入可藉由將一或多個拷貝隨機 或把向整合於單一或多個基因座來實施。對於細菌細胞， 適宜技術可包括氣化約轉化、電穿孔及使用嗟菌體之轉 染。 引入之後，可藉由例如在基因表現條件下培養宿主細胞 來促使或容許自核酸表現。 可將編碼免疫球蛋白變異體或其CH1、VH及/或VL結構 域之核酸整合至宿主細胞之基因組（例如染色體）中。可按 照標準技術藉由納入促進與基因組之重組的序列來促進整 合。 藉由表現進行製備後’可使用任何適宜技術來分離及/ 或純化免疫球蛋白變異體或其CHI、VH及/或VL結構域， 隨後視需要加以使用。例如，製備方法可進一步包含將產 物調配成包括至少一種其他組份（例如醫藥上可接受之賦 形劑）的組合物。 免疫球蛋白變異體可用於人類或動物體之治療或診斷方 法中，例如治療（其可包括預防性治療）人類患者疾病或病 150388.doc -40- 201116626 症之方法’該方法包含向該患者投予有效量之免疫球蛋白 變異體。 本發明之其他態樣提供包含本文所述免疫球蛋白變異體 之醫藥組合物；製造藥劑或醫藥組合物之方法，其包含將 免疫球蛋白變異體與醫藥上可接受之賦形劑一起調配；及 免疫球蛋白變異體於製造用於投予之藥劑的用途。

除免疫球蛋白變異體外，醫藥組合物還可包含醫藥上可 接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者 所熟知之其他物質。該等物質應無毒且不應干擾活性成份 之功效。載劑或其他物質之確切種類將端視投予途徑而 定，該投予途徑可為經口或藉由注射（例如靜脈内）。 靜脈内注射或在患病部餘射時，活性成份可呈非經腸 可接受之水溶液形式，其無熱原且具有適宜pH、等滲性及 穩定性。相關技術人員完全能夠使用例如等滲媒劑（例如 氣化鈉注射液、林格注射液（Rin㈣sInjeeti〇n)、乳酸林格 注射液（LaCtated Ringer，s Injecti〇n))來製備適宜溶液。可 視需要包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其 他添加劑。 組合物可單獨或與其他治療組合同時或依序(此端視擬 治療之病狀而定）進行投？。其他治療可包括投予適宜劑 量之疼痛減輕藥物’例如非類固醇消炎藥（例如阿司匹林 ㈣_、撲熱息痛（paracetam〇1) '衫芬伽㈣㈣或酮 洛芬（ket〇profen))或鴉月劑（例如嗎啡）；或止吐藥。 可使用免疫球蛋白變異體提供治療益處之臨床適應症包 150388.doc -41 - 201116626 括親代免疫球蛋白可能有效之任何病狀或病症。 按照本發明’可將所提供組合物投予至個體。投予較佳 係以足以顯示對患者之益處的「治療有效量」進行。該益 處可為至少一種症狀之最低限度的改善。投予之實際量、 及投予速率及時程將端視所治療疾病之種類及嚴重程度而 定。治療處方的開列（例如決定劑量等）在全科醫師及其他 醫師之職責範圍内。抗體之合適劑量已為熟習此項技術者 所熟知；參見Ledermann J.A.等人，（1991) Int J. Cancer 47: 659-664 ; Bagshawe K.D.等人，（1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922。 準確劑量應端視諸多因素而定，包括抗體係用於診斷抑 或用於治療、擬治療部位之大小及位置、抗體之確切種類 (例如全抗體、片段或雙鏈抗體）以及附接至抗體之任何可 檢測標記或其他分子之種類。典型抗體劑量通常介於〇5 mg至1 g範圍内（對於全身施用）及1〇叫至1 mg範圍内（對於 局部施用）。通常，抗體係全抗體’較佳為IgG4同種型。 此係成人患者之單一治療劑量，其可按比例進行調整以用 於兒童及嬰兒，而且亦可針對其他抗體配方物質進行調整 以與分子量成比例。可以每天一次、每週兩次、每週一次 或每月一次之時間間隔重複治療，此由醫師酌情決定。 本文所述之在易於聚集之區段内包括取代之免疫球蛋白 變異體及編碼核酸可用於抗體改造方法中以製備具有改良 之可製造性的免疫球蛋白。 可利用重組DNA技術來製備具有改良之可製造性的免疫 150388.doc •42· 201116626 球蛋白變異體。該等技術可涉及將編碼供體抗體之一或多 個CDR序列之DN A引入至本文所述免疫球蛋白變異體之可 變區中。參見例如 EP-A-184187、GB 2188638A 或 EP-A- 239400以及後來的大量文獻《或者，可對雜交瘤或其他產 免疫球蛋白細胞在編碼免疫球蛋白易於聚集之區段之序列 内實施基因突變，以改良所製備免疫球蛋白之可製造性。 此可用於设计或重新格式化具有適於重組製備之可製造性 的抗體。 在一些實施例中，免疫球蛋白變異體之VH及VL結構域 可缺少一或多個CDR序列（例如CDR3)。可使用重組DNA技 術將異源或合成的CDR引入至免疫球蛋白變異體之缺少對 應CDR(例如CDR3)之VH及/或VL結構域中。此可改變免疫 球蛋白變異體之結合特性而不影響可製造性。 例如，可使用來自供體免疫球蛋白之一或多個Cdr序列 (例如CDR3)來替換本文所述免疫球蛋白變異體中之對應 CDR序列。本文所述人類免疫球蛋白變異體之丨、2、3、 4、5個或全部6個CDR序列可由取自非人類供體免疫球蛋 白（例如鼠科動物免疫球蛋白）之CDR序列替換以製備人類 化免疫球蛋白。人類化免疫球蛋白可與非人類供體免疫球 蛋白具有相同之結合活性，但在人類中呈現降低之免疫原 性且因此可能具有治療效用。 製備結合乾抗原之雜合免疫球蛋白的方法可包含： 提供結合該靶抗原之供體免疫球蛋白； 提供如上文所述之免疫球蛋白變異體；及 150388.doc -43· 201116626 使用該供體免疫球蛋白之對應CDR序列替換該免疫球蛋 白變異體之1、2、3、4、5或6個CDR序列， 由此製備結合該靶抗原之雜合免疫球蛋白。 較佳地，使用供體免疫球蛋白之對應VH CDR3及/或VL CDR3替換免疫球蛋白變異體之VH CDR3及/或VL CDR3。 免疫球蛋白變異體可為人類免疫球蛋白，且供體免疫球 蛋白可為非人類免疫球蛋白。 適於藉由CDR移植來人類化免疫球蛋白之技術已為熟習 此項技術者所熟知（參見例如，Riechman等人，（1988) Nature 332 323-327 ; Queen等人，PNAS USA (1989) 86 10029-10033)。 雜合免疫球蛋白之VL CDR3可在如上文所述VL CDR3 N 端易於聚集之區段或VL CDR3 C端易於聚集之區段中包含 取代。 雜合免疫球蛋白之VH CDR3可在如上文所述VH CDR3易 於聚集之區段中包含取代。 適宜免疫球蛋白變異體可在如上文所述框架或恆定區中 包含一或多處取代。 在一些實施例中，取代可引入至供體VH及/或VL CDR3 序列中。取代可在插入至免疫球蛋白變異體中之前或之後 使用標準技術來實施。 本文所述之免疫球蛋白變異體亦可用於除CDR移植之外 的人類化方法中。本文所述之一或多處取代可在人類化抗 體製備期間引入至免疫球蛋白中以改良其可製造性。可使 150388.doc -44- 201116626 用之人類化技術已為熟習此項技術者所熟知（參見例如

Padlan等人，Mol Immunol. (1991) 28 489-498)。 本文所述之免疫球蛋白變異體可用於製備用以分離結八 特異性之文庫或集合。 13 製備免疫球蛋白變異體文庫之方法可包含： • 提供如上文所述之免疫球蛋白變異體群體； 使用CDR序列集合替換該免疫球蛋白變異體群體之工、 2、3、4、5或6個CDR序列， ^ 由此製備免疫球蛋白變異體文庫。 該免疫球蛋白變異體文庫將含有相同免疫球蛋白變異體 背景下之全部各種替換CDR序列。 可針對對靶抗原具有特異性之免疫球蛋白變異體對該文 庫進行篩選。 在一些較佳實施例中，免疫球蛋白變異體群體之VH CDR3可由VH CDR3序列集合替換。例如，製備結合乾抗 Q 原之免疫球蛋白變異體的方法可包含： (a)提供起始核酸群體，其編碼包括擬替換CDR3或缺 少CDR3編碼區之VH結構域；其中該VH結構域在如上文所 述之一或多個易於聚集之區段中包含一或多處取代； ' (b)將該VH結構域群體與編碼VH CDR3胺基酸序列集 合之供體核酸群體組合，由此將該供體核酸插入至VH結 構域群體中之CDR3區中，以提供編碼包含該等VH CDR3 序列之VH結構域集合的核酸產物群體； (c)表現該核酸產物群體； 150388.doc -45- 201116626 (d) 選擇對靶抗原具有特異性之免疫球蛋白；及 (e) 回收該免疫球蛋白或編碼其之核酸。 編碼VH結構域之核酸群體可進一步包含編碼CH1結構域 之核苷酸序列’該CH1結構域在如上文所述chi易於聚集 之區段中包含一或多處取代。 以相同方式，可將VL CDR3序列集合與編碼V]L結構域 之核酸群體組合，該VL結構域在如上文所述易於聚集之 區中包含一或多處取代，且包括擬替換^^ CDR3或缺少 V L C D R 3 編 區。 除CDR3外，亦可將CDRmCDR^列集合移植至叩及/ 或VL結構域群體中，該等結構域在本文所述之易於聚集 之區段中包含一或多處取代，隨後針對對靶抗原具有特異 性之免疫球蛋白變異體進行筛選。 CDR衍生序列集合可與本文所述缺少對應cDR序列之 VH或VL結構域群體重排，並將完成重排之或結構 域與關聯VL或VH結構域（其亦可包含一或多處本文所述取 代）組合以提供改造之免疫球蛋白變異體。隨後可將該集 合呈現於適宜宿主系統（例如貿〇92/〇1〇47之噬菌體呈現系 、洗）中自it匕可遥擇具有改良之可製造性的適宜免疫球蛋 白本σ可由1 0個以上個體成員（例如1 〇6至1 或丨〇 1 〇個成 員）組成。 CDR重排及抗體改造技術已為業内所熟知，且熟習此項 技術者能夠使用該等技術使用常規方法來提供具有改良之 可製造性的免疫球蛋白。 I50388.doc -46- 201116626 CDR序列集合可在CDR序列内之一或多個位置上包括各 種殘基。例如，CDR序列集合可在CDr序列内之1、2、 3、4、5個或更多個位置上包括各種殘基。 CDR序列集合可在CDR序列内包括一或多個可變位置。 例如，CDR序列集合可在CDR序列内包括丨、2、3、4、5 個或更多個可變位置。各可變位置上之殘基在不同集合成 員之間可有所不同。可變位置上之殘基可為隨機的（例如 ◎ 其可為任何天然存在之胺基酸且各胺基酸機率相等）或可 選自預定胺基酸群組或子集。例如，免疫球蛋白變異體之 VL CDR3可由供體VL CDR3序列集合替換，該等序列在位 置91上包含A、F、L、R、S及W，在位置93上包含D、F、 L、Q、S、T、W及Y，及/或在位置96上包含E、L、v及 W。免疫球蛋白變異體之VH CDR3可由供體VH CDR3序列 集合替換’該等序列在位置l00c上包含D、E、F、G、p、 s、τ、w及γ，在位置100d上包含F、G、L、p&M，在位 〇 置102上包含A、F、H、h L、V及Y，及/或在位置103上 包含I、L及V。 使CDR3集合在該等位置上傾向於具有該等殘基可有助 於改良可製造性。 除一或多個可變位置外’ CDR序列集合亦可包括一或多 個非可變位置。各非可變位置上之殘基在各集合成貢間可 相同》 可利用將CDR序列集合納入受體免疫球蛋白變異體中來 製備具有各種結合特性之免疫球蛋白變異體文庫，其中各 150388.doc •47· 201116626 文庫成員在本文所述之一或多個易於聚集之區段中包含一 或多處取代。 免疫球蛋白變異體文庫可包含： VL結構域，其在如上文所述框架易於聚集之區段及/或 CDR3易於聚集之區域包含取代； VH結構域，其在如上文所述框架易於聚集之區域及/或 CDR3易於聚集之區段包含取代；及/或 CH1結構域，其在如上文所述CH1易於聚集之區域包含 取代； 其中該文庫之各成員之一或多個CDR序列有所不同。 免疫球蛋白變異體文庫可用於識別具有改良之可製造性 且能夠結合靶抗原之免疫球蛋白。獲得結合靶抗原之一或 多種免疫球蛋白之方法可包含： 使如上文所述之免疫球蛋白文庫與該抗原接觸，及 選擇文庫中能夠結合該抗原之一或多種免疫球蛋白。 該文庫可例如呈現於噬菌體顆粒表面上，各顆粒含有編 碼呈現於其表面上之抗體VH可變結構域以及視情況所呈 現VL結構域（若存在）的核酸。 在選擇能夠結合抗原且呈現於噬菌體顆粒上之免疫球蛋 白後，可自呈現該免疫球蛋白之噬菌體顆粒獲取核酸。該 核酸隨後可用於製備免疫球蛋白或其抗體VH可變結構域 及/或VL結構域，此藉由自具有自呈現該免疫球蛋白之噬 菌體顆粒獲取之核酸序列的核酸表現來實施。 可針對結合抗原之能力、與其他免疫球蛋白競爭結合抗 150388.doc -48· 201116626 原之能力及/或中和抗原之能力對免疫球蛋白進行測試。 可在適^條件下比較不同免疫球蛋白之結合親和性及中和 效力。亦可測試免疫球蛋白之可製造性。 彼等熟習此項技術者根據本揭示内容可明瞭本發明之各 個其他態樣及實施例。本說明書中所提及之所有文件的全 文均以引用方式併入本文中。 本文所用之「及/或」欲理解為兩種指定特徵或組份中 之每一者的具體揭示内容，包括或不包括另一者。例如， Ο Γ A及/或B」欲理解為⑴a，（ii) B及（iii) A及B中每一者的 具體揭示内容’正如每一者均在本文中單獨列出一樣。 除非上下文另有說明，否則上文所列特徵之描述及定義 並不限於本發明之任一特定態樣或實施例且同等地適用於 所有所闡述態樣及實施例。 現將藉由實例及參照下文所述表格來闡釋本發明之某些 態樣及實施例。 〇 表1&及11)顯示免疫球蛋白VH及VL結構域之Kabat與 H〇negger編號方案間之對應。 表2a及2b顯示可改良可製造性之在易於聚集之區段内的 胺基酸取代實例。亦指出較佳之取代。使用胺基酸之標準 IUPACMUB JCBN單字母命名。 表3a及3b顯示可改良可製造性之在易於聚集之區段内的 取代組合實例。 表4顯不免疫球蛋白變異體實例之可製造性。 實驗 150388.doc -49- 201116626 基因合成 由商業供應商優化及合成序列，並亞選殖至pEE6.4及 ρΕΕ12·4中。藉由轉化至ToplO細胞中來製備DNA原液，在 LB培養液中培養過夜（O/N)，並使用QIAGEN Endofree質 粒純化套組實施純化。將DNA再懸浮於TE緩衝液中，並使 用Nanodrop分光光度計測定濃度。 常規細胞培養 在補加有15 mM L-麩醯胺酸之CD-CHO培養基中每3-4天 對CHOK1SV細胞進行一次傳代培養，並在振盪C02培育箱 (140 rpm、36.5°C、10% C02、85%濕度）中進行培育。 瞬時轉染 使用 Lipofectamine 2000 轉染 CHOK1SV細胞。轉染後72 h， 收穫上清液，離心並儲存於4°C下，隨後進行分析。 穩定轉染 使用穩定轉染之CHOK1SV細胞在MSX選擇下實施大規 模表現。收穫後，將上清液儲存於4°C下，隨後進行純 化。 純化 使用HiTrap管柱（GE)對上清液實施蛋白質A純化，並儲 存於4°C下，隨後進行濃縮及緩衝液更換。 抗體濃縮及緩衝液更換 藉由在2000 g下離心15-20 min來濃縮試樣。使用調配緩 衝液（5 0 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，pH 7·4)對物質進行緩 衝液更換，實施4-5次。緩衝液更換後，將試樣在調配緩 150388.doc 50- 201116626 衝液中稀釋至合適工作濃度。

GP-HPLC 藉由GP-HPLC在Agilent 1200系列HPLC系統上對兩份相 同試樣進行分析。注射80 μΐ之1 mg/ml試樣分液（在4°C下 保存），並以1 ml/min運行15 min。使用化學工作站 (chemstation)軟體來分析結果。

IgG滴度 利用夾心ELISA來測定抗體表現產量。將滴度規範化成 輕鏈特異性對照。 硫代黃素T結合 可使用硫代黃素T來檢測聚集。將純化抗體以1 mg/ml在 60°C下培育1 h，隨後與最終濃度為30 μΜ之硫代黃素T混 合，並在 Ex=305 nm(Hawe, Α.，Sutter, Μ 及

Jiskoot 5 W. Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99) 下量測螢光。 ANS結合 可使用8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS)來檢測聚集。將純化抗 體以1 mg/ml在60°C下培育1 h，隨後與最終濃度為30 μΜ 之 ANS 混合，並在 Ex=360 Em/508 nm(Hawe, A., Sutter, Μ 及 Jiskoot，W. Pharmaceutical Research 2008 25 (7) 1487-99)下量測螢光。 結論 藉由電腦及活體外方法來分析免疫球蛋白序列以識別易 於聚集之區段。所識別之易於聚集之區段顯示於表2中。 150388.doc -51 - 201116626 在顯示於SEQ ID NO: 1及2中之VH及VL結構域之所識別 易於聚集之區段内設計及合成可降低聚集傾向之取代（表 2)。測試取代對免疫球蛋白之表現、穩定性及聚集的影響 (表3及4)。 已發現，所識別易於聚集之區段内的殘基取代使得可製 造性改良，且尤其達成降低之聚集傾向及/或提高之生產 量0 本發明之額外編號陳述項 1. 一種免疫球蛋白變異體，其包含： 輕鏈可變（VL)結構域，其在框架（FR)易於聚集之區段及/ 或互補決定區3 (CDR3)易於聚集之區段包含取代； 重鏈可變（VH)結構域，其在框架區易於聚集之區段及/ 或CDR3易於聚集之區段包含取代；及/或 重鏈恆定區1 (CH1)結構域，其在CH1易於聚集之區段包 含取代。 2. —種改良免疫球蛋白可製造性之方法，其包含： 識別親代免疫球蛋白； 向該親代免疫球蛋白VL結構域中之框架易於聚集之區 段及/或CDR3易於聚集之區段中引入取代；及/或 向該親代免疫球蛋白VH結構域中之框架區易於聚集之 區段及/或CDR3易於聚集之區段中引入取代；及/或 向該親代免疫球蛋白CH1結構域中之恆定區易於聚集之 區段中引入取代， 由此製備相對於該親代免疫球蛋白具有改良之可製造性 150388.doc -52· 201116626 的免疫球蛋白變異體。 3·如Μ述P東述項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， ”中該免疫球蛋自變異體在表現後相對於該親代免疫球蛋 白具有降低之聚集傾向及/或提高之生產率。 4.如則述陳述項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VL結構域框架易於聚集之區段選自由下列組成之 群.位置20易於聚集之區段、位置45易於聚集之區段及位 置74易於聚集之區段。 5·如陳述項4之免疫球蛋白變異體或方法，其中該位置2〇 易於聚集之區段自該VL結構域之位置〗5延伸至位置23。 6. 如陳述項5之免疫球蛋白變異體或方法，其中該¥1^結構 域在該VL結構域之位置18處包含取代。 7. 如陳述項6之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置“處 之殘基被R、S或V取代。 8. 如陳述項7之免疫球蛋白變異體或方法，其中該^^結構 域包含T18R、T18S或 T18V。 9. 如陳述項5至8中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VL結構域在該VL結構域之位置20處包含取代。 10. 如陳述項9之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置2〇處 之殘基被Κ、R、S或V取代。 11. 如陳述項10之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VL& 含 T20K、T20R、T20S或 T20V取代。 12. 如陳述項4至11中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該位置45易於聚集之區段自該VL結構域之位置“延 150388.doc •53· 201116626 伸至位置49。 13. 如陳述項12之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VL結 構域在位置45處包含取代。 14. 如陳述項13之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置45 處之殘基被E、K、R、Q或V取代。 15. 如陳述項14之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vl結 構域包含 T45E、T45K、T45R、T45Q 或 T45V 取代。 16. 如陳述項12至15中任一項之免疫球蛋白變異體或方 法，其中該VL結構域在位置46處包含取代。 17. 如陳述項16之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置46 處之殘基被L或Y取代。 18. 如陳述項17之免疫球蛋白變異體或方法，其中該結 構域包含T46L或T46Y取代。 19. 如陳述項4至18中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該位置74易於聚集之區段自該vl結構域序列之位置 71延伸至位置77。 20. 如陳述項19之免疫球蛋白變異體或方法，其中該V]L結 構域在位置74處包含取代。 21. 如陳述項20之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置74 處之殘基被V取代。 22. 如陳述項21之免疫球蛋白變異體或方法，其中該¥1^结 構域包含T74V取代。 23. 如前述陳述項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VL結構域CDR3易於聚集之區段選自由下列組成之 150388.doc •54· 201116626 群：VL CDR3 N端易於聚集之區段及VL CDR3 C端易於聚 集之區段。 24. 如陳述項23之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VL CDR3 N端易於聚集之區段在該VL結構域序列中自殘基 C88延伸至距殘基C88之C端8個胺基酸之位置。 25. 如陳述項24之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vl結 構域在位置 88、89、90、91、92、93、94、95 或 95a 中之 一或多個位置處包含取代。 26. 如陳述項25之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vl結 構域在位置91處包含取代。 27. 如陳述項26之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置91 處之殘基被A、F、L、R、S或W取代。 2 8 ·如陳述項27之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vl結 構域包含 Y91A、Y91F、Y91L、Y91R、Y91S 或 Y91W 取 代。 29. 如陳述項24至29中任一項之免疫球蛋白變異體或方 法，其中該VL結構域在位置93處包含取代。 30. 如陳述項29之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置93 處之殘基被D、F、L、Q、S、T、W或Y取代。 31. 如陳述項30之免疫球蛋白變異體或方法，其中該Vl結 構域包含 P93D、P93F、P93L、P93Q、P93S、P93T、 P93W或P93Y取代。 32. 如陳述項23之免疫球蛋白變異體或方法，其中該Vl € 端CDR3易於聚集之區段在該VL結構域序列中自距殘基 150388.doc -55- 201116626 F98之N端3個胺基酸之位置延伸至位置99。 33. 如陳述項32之免疫球蛋白變異體或方法，其中該¥[結 構域在位置95、96、97、98或99中之一或多個位置處包含 取代。 34. 如陳述項33之免疫球蛋白變異體或方法，其中該¥[結 構域在位置96處包含取代。 35. 如陳述項34之免疫球蛋白變異體或方法’其中位置％ 處之殘基被E、L、V或W取代。 3 6.如陳述項35之免疫球蛋白變異體或方法，其中該Vl結 構域包含R96E、R96L、R96V或R96W取代。 37.如前述陳述項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域之框架易於聚集之區段選自由下列組成 之群· FR1易於聚集之區段；位置95易於聚集之區段；及 位置102易於聚集之區段。 3 8.如陳述項37之免疫球蛋白變異體或方法，其中該卩… 易於聚集之區段位於該VH結構域序列之框架區丨中。 39. 如陳述項38之免疫球蛋白變異體或方法，其中該fri 易於聚集之區段係選自由下列組成之群的易於聚集之區 段.位置1至3、位置4至6、位置11至13及位置16至21。 40. 如陳述項39之免疫球蛋白變異體或方法，其中FR1易 於聚集之區段自位置1延伸至位置3。 41·如陳述項40之免疫球蛋白變異體或方法 ，其中該VH結 構域在該VH結構域之位置丨處包含取代。 42.如陳述項41之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置1處 150388.doc •56· 201116626 之殘基被E、Q、D、A或V取代。

43·如陳述項42之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結 構域包含 Q1E、Q1D、Q1A 或 Q1V取代或 E1Q、E1D、E1A 或E1V取代。 44_如陳述項39之免疫球蛋白變異體或方法，其中該FR1 易於聚集之區段自該VH結構域之位置4延伸至位置6。 45. 如陳述項44之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結 構域在該VH結構域之位置5處包含取代。 〇 46. 如陳述項45之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置5處 之殘基被V取代。 47·如陳述項46之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結 構域包含L5V。 48. 如陳述項39之免疫球蛋白變異體或方法，其中該FR1 易於聚集之區段自該VH結構域之位置u延伸至位置13。 49. 如陳述項48之免疫球蛋白變異體或方法，其中該¥凡结 Q 構域在該VH結構域之位置12處包含取代。 50. 如陳述項49之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置12 處之殘基被V取代。 51•如陳述項50之免疫球蛋白變異體或方法，其中該服结 構域包含L12V。 52.如陳述項39之免疫球蛋白變異體或方法，其中該剛 易於聚集之區段自該VH結構域之位置i6延伸至位置Η。 53_如陳述項52之免疫球蛋白變異體或方法，其中該观 構域在位置1 7處包含取代。 150388.doc .57· 201116626 54.如陳述項53之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置Η 處之殘基被R取代。 法，其中該VH結 55.如陳述項54之免疫球蛋白變異體或方 構域包含G17R取代。 56.如陳述項52至55中任一項之备疤沐疋 項<免疫球蛋白變異體或方 法，其中該VH結構域在位置19處包含取代。 57·如陳述項56之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置19 處之殘基被T或V取代。 58. 如陳述項57之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結 構域包含L19T或及L19V取代。 59. 如陳述項52至58中任一項之免疫球蛋白變異體或方 法，其中該VH結構域在位置20處包含取代。 60. 如陳述項59之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置2〇 處之殘基被A、K、S或T取代。 61. 如陳述項60之免疫球蛋白變異體或方法，其中該結 構域包含R20A、R20K或R20S或R20T取代。 62. 如陳述項37至61中任一項之免疫球蛋白變異體或方 法，其中該位置95易於聚集之區段自位置91延伸至位置 99。 63. 如陳述項62之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結 構域在位置 91、92、93、94、95、96、97、98及 / 或 99 中 之一或多個位置處包含取代。 64. 如陳述項63之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結 構域在位置94處包含取代。 150388.doc •58_ 201116626 65. 如陳述項64之免疫球蛋白變異俨 ;㈡甓共骽或方法，其中位置94 處之殘基被R取代。 66. 如陳述項65之免疫球蛋白變異體或方法，其中該結 構域包含K94R取代。 ° 67. 如陳述項63至66中任一須夕备被1+、泣 丁仕項之免疫球蛋白變異體或方 法，其中該VH結構域在96處包含取代。 68. 如陳述項67之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置％ 處之殘基被Α取代。 69. 如陳述項68之免疫球蛋白變異體或方法，其中該乂^^结 構域包含G96A取代。 70. 如陳述項1至69中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH CDR3易於聚集之區段自位置1〇以延伸至位置 103。 71. 如陳述項70之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結 構域在位置100c、l〇〇d、1〇1、1〇2及1〇3中之一或多個位 置處包含取代。 72. 如陳述項71之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結 構域在位置100c處包含取代。 73·如陳述項72之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置 100c處之殘基被D、E、F、G、P、S、T、W或Y取代。 74_如陳述項73之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結 構域包含AlOOcD ' AlOOcE、AlOOcF、AlOOcG、AlOOcP、 AlOOcS、AlOOcT、或 AlOOcW或 AlOOcY。 75.如陳述項70至74中任一項之免疫球蛋白變異體或方 150388.doc •59· 201116626 法，其中該VH結構域在位置100d處包含取代。 76. 如陳述項75之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置 100d處之殘基被F、G、L、P或Μ取代。 77. 如陳述項76之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結 構域包含 SlOOdF、SlOOdG、SlOOdL、SlOOdP或 SlOOdM取 代。 78. 如陳述項70至77中任一項之免疫球蛋白變異體或方 法，其中該VH結構域在位置102處包含取代。 79. 如陳述項78之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置102 處之殘基被A、F、H、I、L、V或Y取代。 80_如陳述項79之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結 構域包含 P102A、P102F、P102H、P102I、P102L、P102Y 或P102V取代。 81_如陳述項70至80中任一項之免疫球蛋白變異體或方 法，其中該VH結構域在位置1 03處包含取代。 82. 如陳述項8 1之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置1 〇3 處之殘基被I、L或V取代。 83. 如陳述項82之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結 構域包含W103I、W103L或W103V取代。 84. 如陳述項1至83中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該CH1易於聚集之區段自位置150延伸至位置156。 85. 如陳述項84之免疫球蛋白變異體或方法，其中該chi 結構域在位置153處包含取代。 86. 如陳述項85之免疫球蛋白變異體或方法，其中該cm 150388.doc -60- 201116626 結構域在位置153處包含取代。 87. 如陳述項86之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置ι53 處之殘基被V取代。 88. 如陳述項87之免疫球蛋白變異體或方法，其中該結 構域包含S153V取代。 89. 如前述陳述項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該免疫球蛋白變異體序列相對於該親代免疫球蛋白序 列具有至多10處胺基酸取代。 Ο ΟΛ _ 90. 如前述陳述項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該免疫球蛋白變異體序列在VL FR1及/或FR2結構域中 包含2處取代；在VL CDR3結構域中包含3處取代；在Vl FR2結構域中包含2處取代且在Vl CDR3結構域中包含3處 取代；在VL FR1結構域中包含2處取代、在VL FR2結構域 中包含2處取代且在Vl CDR3結構域中包含3處取代；在 VH FR1結構域中包含2處取代；在VH FR1結構域中包含1 Q 處取代且在VH CDR3結構域中包含1處取代；在VH CDR3 結構域中包含2處取代；或在CH1結構域中包含i處取代且 在VH FR1結構域中包含1處取代。 91·如陳述項90之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結 構域序列包含l〇〇d (D101-1)及102取代。 92. 如陳述項91之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置1〇2 處之殘基被A、F、Η、I、L、V或Y取代，且其中位置100d 處之殘基被F、G、L、P或Μ取代。 93. 如陳述項92之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結 150388.doc •61- 201116626 構域包含 P102A、P102F、P102H、P102I、P102L、P102Y 或 P102V取代及 siOOdF、SlOOdG、SlOOdL、SlOOdP 或 SlOOdM 取代。 94. 如陳述項93之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結 構域包含SlOOdF及P102V取代、SlOOdM及P102V取代、 SiOOdF 及 P102Y 取代或 SlOOdM 及 P102Y 取代。 95. 如前述陳述項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該免疫球蛋白變異體經人類化。 96. —種評價免疫球蛋白可製造性之方法，其包含： 識別選自由下列組成之群之一或多個位置處的胺基酸殘 基.該免疫球蛋白VL結構域中之位置1 8、20、45、46、 74、91、93及96 ’及該免疫球蛋白VH結構域中之位置1、 5、12、17、19、20、94、96、100c、100d、102及 103， 及該免疫球蛋白CH1結構域中之位置153， 其中在該免疫球蛋白之VL結構域中在位置1 8處存在除 R、S或V(較佳R或V)之外的殘基、在位置2〇處存在除κ、 R、S或V(較佳R或V)之外的殘基、在位置45處存在除E、 K、R、Q或V(較佳K或R)之外的殘基、在位置46處存在除 L或Y(較佳L)之外的殘基、在位置74處存在除V之外的殘 基、在位置91處存在除a、F、L、R、S或W(較佳W)之外 的殘基、在位置93處存在除〇、F、L、Q、S、T、W或 Υ(較佳Q)之外的殘基及/或在位置96處存在除E、l、V或 W(較佳V)之外的殘基；及/或 在該免疫球蛋白之VH結構域中在位置1處存在除a、d、 150388.doc -62- 201116626 E、Q或V之外的殘基、在位置5或位置12處存在除V之外的 殘基、在位置17處存在除R之外的殘基、在位置19處存在 除T或V(較佳T)之外的殘基、在位置20處存在除a、K、S 或T(較佳A)之外的殘基、在位置94處存在除R之外的殘 基、在位置96處存在除A之外的殘基、在位置i〇〇c處存在 除0、£、卩、0、卩、8、丁、贾或丫（較佳\^)之外的殘基、 在位置100d處存在除F、G、L、Μ或P(較佳F或M)之外的 殘基、在位置102處存在除A、F、Η、I、L、V或Υ(較佳V 或Υ)之外的殘基、在位置103處存在除I、L或V之外的殘基 及/或 在該免疫球蛋白之CH1結構域中在位置！ 53處存在除ν之 外的殘基， 表明該免疫球蛋白之可製造性亞最佳。 9 7 · —種評價免疫球蛋白可製造性之方法，其包含： 識別該免疫球蛋白VH結構域中位置⑺⑽及/或1〇2處之胺 基酸殘基， 其中位置100d處存在S及/或位置1〇2處存在p表明該免疫 球蛋白具有亞最佳之可製造性。 98. —種分離核酸，其編碼包含一或多處該等取代之如陳 述項1至95中任一項之免疫球蛋白變異體或其¥11結構域、 VL結構域或CH1結構域。 99_ 一種表現載體，其包含如陳述項98之分離核酸。 100. —種宿主細胞，其包含如陳述項99之表現載體。 101. —種製備免疫球蛋白變異體之方法，其包含： 150388.doc •63· 201116626 在一足條件下表現如陳述項98之核酸以達成該免疫球蛋 白變異體或其VH結構域、VL結構域或CH1結構域之製 備’及對其進行回收。 102. 如陳述項101之方法，其包含將該免疫球蛋白變異體 調配成包括醫藥上可接受之賦形劑之組合物。 103. —種醫藥組合物，其包含如陳述項1至95中任一項之 免疫球蛋白變異體及醫藥上可接受之賦形劑。 104. 如陳述項1至95中任一項之免疫球蛋白變異體，其用 作藥劑。 105—種製備結合靶抗原之雜合免疫球蛋白的方法，其包 含： 提供結合該靶抗原之供體免疫球蛋白， 提供如陳述項1至89中任一項之免疫球蛋白變異體， 使用該供體免疫球蛋白之對應CDR序列替換該免疫球蛋 白變異體之1個或多個CDR序列， 由此製備結合該靶抗原之雜合免疫球蛋白。

106.如陳述項105之方法，其中該雜合免疫球蛋白之VL CDR3在VL CDR3 N端易於聚集之區段或vl CDR3 C端易 於聚集之區段中包含取代。 107如陳述項1〇5或106之方法，其中該雜合免疫球蛋白之 VH CDR3在VH CDR3易於聚集之區段中包含取代。 108· —種製備免疫球蛋白變異體文庫之方法，其包含： 提供如陳述項1至95中任一項之免疫球蛋白變異體， 使用在一或多個位置上包含隨機殘基之CDR序列替換該 150388.doc -64- 201116626 免疫球蛋白變異體之1個或多個CDR序列， 由此製備免疫球蛋白變異體之多樣文庫。 109. 如陳述項108之方法，其中該免疫球蛋白變異體之VL CDR3由在位置91處包含A、F、L、R、S或W、在位置93 處包含D、F、L、Q、S、T、W或Y、及/或在位置96處包 含E、L、V或W之隨機CDR3序列替換。 110. 如陳述項108或109之方法，其中該免疫球蛋白變異體 之VH CDR3由在位置100c處包含d、E、F、G、P、S、T、 ❹ W或Y、在位置i〇〇d處包含F、G、L、P或M、在位置102處 包含A、F、H、I、L、V或Y、及/或在位置103處包含工、[ 或V之隨機CDR3序列替換。 111· 一種免疫球蛋白變異體文庫，其中該文庫之各成員包 含： VL結構域，其在框架易於聚集之區段及/或cdR3易於聚 集之區段包含取代； Ο VH結構域 ’其在框架區易於聚集之區段及/或CDR3易於 聚集之區段包含取代；及/或 CH1結構域，其在CH1易於聚集之區段包含取代， 其中β玄文庫之各成員之一或多個cdr序列有所不同。 112. —種核酸群體，其編碼如陳述項丨丨丨之免疫球蛋白變 異體文庫。 Η3· —種獲得一或多種結合靶抗原且具有改良之可製造性 之免疫球蛋白的方法，其包含： 使如陳述項Hi之免疫球蛋白變異體文庫與該抗原接 150388.doc •65· 201116626 觸，及 選擇該文庫中能夠結合該抗原之一或多種免疫球蛋白。 序列：

VL

NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRP GSSPTTVIYEDNQRPSGYPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKT EDEADYYCQSYDPEMRVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 1) VH

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQ

APGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKTYEGPTYFASDPWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 2) 序列B Kabat Honegger 序列B Kabat Honegger N 1 1 V 33 41 F 2 2 0 34 42 M 3 3 W 35 43 L 4 4 Y 36 44 T 5 5 0 37 45 0 6 6 Q 38 46 P 7 7 R 39 47 8 8 P 40 48 H 9 9 G 41 49 S 10 10 S 42 50 V 11 11 s 43 51 s 12 12 P 44 52 E 13 13 T 45 53 s 14 14 T 46 54 P 15 15 V 47 55 G 16 16 I 48 56 K 17 17 Y 49 57 T 18 18 E 50 58 V 19 19 59 T 20 20 60 I 21 21 61 s 22 22 62 c 23 23 63 150388.doc -66- 201116626 τ 24 24 64 R 25 25 65 S 26 26 66 s 27 27 D 51 67 G 27a 28 N 52 68 S 27b 29 0 53 69 27c 30 R 54 70 27d 31 P 55 71 27e 32 s 56 72 27f 33 G 57 73 34 V 58 74 35 P 59 75 I 28 36 D 60 76 A 29 37 R 61 77 S 30 38 F 62 78 N 31 39 S 63 79 Y 32 40 G 64 80 s 65 81 121 I 66 82 122 D 67 83 123 s 68 84 124 s 68a 85 125 s 68b 86 126 N 69 87 127 s 70 88 128 A 71 89 129 S 72 90 130 L 73 91 131 T 74 92 132 I 75 93 133 s 76 94 134 G 77 95 135 L 78 96 136 K 79 97 R 96 137 T 80 98 V 97 138 E 81 99 F 98 139 D 82 100 G 99 140 E 83 101 G 100 141 A 84 102 G 101 142 D 85 103 T 102 143 Y 86 104 K 103 144 Y 87 105 L 104 145 C 88 106 T 105 146 0 89 107 V 106 147 s 90 108 L 107 148 Y 91 109 D 92 110 P 93 111 E 94 112 M 95 113 150388.doc -67- 201116626 95a 114 95b 115 95c 116 95d 117 95e 118 95f 119 120 表1A VL結構域編號 序列B Kabat Honegger 序列B Kabat Honegger 0 1 1 41 V 2 2 42 0 3 3 W 36 43 L 4 4 V 37 44 V 5 5 R 38 45 E 6 6 0 39 46 S 7 7 A 40 47 8 8 P 41 48 G 9 9 G 42 49 G 10 10 K 43 50 G 11 11 G 44 51 V 12 12 L 45 52 V 13 13 E 46 53 0 14 14 W 47 54 P 15 15 V 48 55 G 16 16 A 49 56 R 17 17 V 50 57 S 18 18 I 51 58 L 19 19 s 52 59 R 20 20 Y 52a 60 L 21 21 52b 61 S 22 22 52c 62 c 23 23 63 A 24 24 D 53 64 A 25 25 G 54 65 S 26 26 S 55 66 G 27 27 N 56 67 F 28 28 K 57 68 T 29 29 Y 58 69 F 30 30 Y 59 70 S 31 31 A 60 71 s 32 32 D 61 72 Y 33 33 S 62 73 G 34 34 V 63 74 M 35 35 K 64 75 H 35a 36 G 65 76 35b 37 R 66 77 38 F 67 78 150388.doc •68- 201116626

39 T 68 79 40 I 69 80 s 70 81 lOOg 121 R 71 82 lOOh 122 D 72 83 lOOi 123 N 73 84 124 S 74 85 125 K 75 86 126 N 76 87 127 T 77 88 128 L 78 89 129 Y 79 90 130 L 80 91 131 0 81 92 132 M 82 93 133 N 82a 94 134 S 82b 95 135 L 82c 96 136 R 83 97 D 101 137 A 84 98 P 102 138 E 85 99 W 103 139 D 86 100 G 104 140 T 87 101 0 105 141 A 88 102 G 106 142 V 89 103 T 107 143 Y 90 104 L 108 144 Y 91 105 V 109 145 c 92 106 T 110 146 A 93 107 V 111 147 K 94 108 s 112 148 T 95 109 s 113 149 Y 96 110 E 97 111 G 98 112 P 99 113 T 100 114 Y 100a 115 F 100b 116 A 100c 117 S lOOd 118 lOOe 119 lOOf 120 表IB VH結構域編號 150388.doc 69- 201116626 取代位置 區段 A.輕鏈 A-輕鏈 B-輕鏈 Β- ▲里鏈 C-輕鏈 D-輕鍵 D-輕鏈 E-輕鏈 1¾ 一 >—~-I-~?_ - ~->*- - bpv -?*-| -?~^ -I"· -βε :''c d3 de -βε -c£ -c£ de -Εε -αε JOQ -e£ 金金&^""^"^^^^"^ ,IB11 _gll -Ifh-l ·1ΒΙΙ >g-l *gJ •ittlll ·1Β1Ι ·1Β·=-•"•ll ·1Β1Ι ·1?1 ·1Β·1 ·1ΒΜ JeJ JeJ w-ej A-A-B-C-D-D-D-E-E-F-F-F-F-G-

卜聚集而言重要的殘基 較佳變異體 測試變異體 LC T18 RS V R V T20 KRSV RV T45 EKRQV KR T46 LY L T74 V V Y91 (C88+3)* AFLRSW W P93 (C88+5)* DFLQSTWY Q R96 {F98-2)* ELVW V HC E1 ADQ V Q Q1 AD E V ADEV L5 V V L12 V V G17 R R L19 TV T R20 AKST A K94 R R G96 A A A100c (Ο101-2Γ DEFGPSTWY W S100d (D101-1)** FGLMP FM P102 AFHILVY VY W103 ILV ILV S153 V V *VL CDR3位置：分別地，Y91、P93亦藉由與Kabat C88 之接近度進行編號，且R96亦藉由與Kabat F98之接近度 進行編號 **VHCDR3位置：由於CDR3(重鏈)之異質性，亦根據與 D101 (在Kabat中不變)之接近度來命名位置 表2 a 150388.doc •70- 201116626 Ο 取代位置 區段 對於聚集而言重要的殘基 較佳變異體 測試變異體 LC Β-輕鍵 L37 QN Q Β-輕鏈 L46 KRHFS R Β-輕鏈 Q45 RKE R HC D-重鏈 Ρ61 KRQEDNA R D-重鏈 V85 EDA E Ε-重鏈 Η94 RKT R Ε-重鏈 R95 ED D Ε-重鏈 V100 FGLMP F Ε-重鍵 S102 AFHILVY V 表2b 150388.doc •71 · 201116626

變異體組合 測試組合 LC T18T20 T18RT20R T18T74 T18RT74V T45 T46 T45K T46L Y91 (C88+3)* P93 (C88+5)* R96 (F98-2)* T45R T46L T18RT20R T45RT46L T18RT20R T45KT46L Y91W (C88+3)* P93Q (C88+5)* R96V (F98-2)* T45K T46L Y91W (C88+3)* P93Q (C88+5)* R96V(F98-2)* T45R T46L Y91W (C88+3)* P93Q (C88+5)* R96V (F98-2)* T18R T20R T45R T46L Y91W (C88+3)* P93Q (C88+5)* R96V (F98-2)* HC Q1 P102 Q1A P102Y Q1EP102Y Q1VP102Y Q1 W103 Q1AW103L Q1DW103L Q1EW103L Q1VW103L A100c (D101-2)** S100d (D101-1)** S100d (D101-1)** P102 A100cW (D101-2)** S100dF (D101-1)** S100dF (D101-irP102V S100dF (D101-ir*P102Y S100dM (D101-irP102V S100dM (D101-1)**P102Y P102W103 P102VW103L P102Y, W103L P102Y W103I P102YW103V ：S153L19 S153 R20 S153VL19T S153VR20A LC&HC T18 R20 T18V R20A T18V R20V *VL CDR3位置：分別地，Y91、P93亦藉由與Kabat C88之接近度 進行編號，且R96亦藉由輿Kabat F98之接近度進行編號 **VH CDR3位置：由於CDR3 (重鏈）之異質性，亦根據與D101 (在Kabat中不#)之接近廑來命名位置 表3a 150388.doc -72- 201116626

變異體組合 測試組合 HC R95 S102 R95D S102V H94R95 V100S102 H94R R95D V100F S102V HC/LC P61 V85/L46 P61RV85E/L46R R95 S102/L37Q45 R95DS102V/L37Q Q45R H94 R95/L46 H94R R95D/L46R LC L37 Q45 L37Q Q45R 表3b 150388.doc -73- 201116626 實施的取代 (Kabat 編號） LC 或 HC 相對聚集 相對生產率 相對硫代 黃素T結合 相對ANS 結合 1 1 1 1 T18V LC 0.28 0.43 0.49 0.35 T74V LC 0.23 0.05 0.88 0.81 T18VT74V LC 0.21 0.23 0.45 0.48 L37Q Q45R LC 0.31 1.84 L46R LC 0.4 1.4 E1Q HC 0.51 6.73 L5V HC 0.63 0.51 L12V HC 0.92 0.92 G17R HC 0.52 1.76 L19T HC 0.52 0.53 0.87 1.16 R95D HC 0.05 2.69 R20A HC 0.61 0.57 1.22 1.33 S153V HC 0.73 S153V R20A HC 0.31 0.78 0.95 1.22 S153VL19T HC 0.41 0.43 0.7 0.87 T18V/ R20A LC/HC 0.59 0.04 0.52 T18V/ R20V LC/HC 0.86 L46R / H94R R95D LC/HC 0.14 2.33 L46R/P61RV85E LC/HC 0.52 0.77 L37QQ45R/ R95DS102V LC/HC 0.01 18.77 G96A HC 0.69 4.38 S102V HC 0.10 6.61 P102Y HC 0.60 1.57 0 0.12 Q1E HC 1.03 1.96 Q1V HC 1.12 2.21 Q1A HC 1.17 1.84 Q1D HC 1.58 SlOOdF (D101-1)** HC 1.26 2.64 SlOOdM (D101-1)** HC 0.54 3.44 P102Y HC 0.55 1.71 PI 02 V HC 0.39 1.37 W103L HC 0.74 W103V HC 1.37 W103I HC 0.81 Q1AP102Y HC 0.58 1.69 Q1EP102Y HC 0.58 1.23 Q1VP102Y HC 0.59 0.78 Q1AW103L HC 0.76 Q1D W103L HC 1.08 Q1EW103L HC 0.99 Q1VW103L HC 0.85 R95DS102V HC 0.01 11.92 H94RR95D V100FS102V HC 0.64 3.44 150388.doc 74- 201116626 實施的取代 (Kabat 編號） LC 或 HC 相對聚集 相對生產率 相對硫代 黃素T結合 相對ANS 結合 S100dF(D101-l)**Pl〇2V HC 0.15 8.61 S100dF(D101-l)**P102Y HC 0.18 6.78 S100dM(D101-l)**P102V HC 0.00 8.69 SlOOdM (D101-1)**P102Y HC 0.13 6.40 P102VW103L HC 0.58 P102Y，W103L HC 0.44 P102YW103I HC 0.39 P102YW103V HC 0.50 VLCDR3位置：分別地，Y9b P93亦藉由與KabatC88之接近度進行編號，且.R96亦 藉由與Kabat F98之接近度進行編號 **VH CDR3位置：由於CDR3(重鍵)之異質性，亦根據與D101(在Kabat中不變)之接 近度來命名位置 顯示的所有數據均相對於野生型而言。 表4

-75- 150388.doc 201116626 序列表 <11〇>英商龍沙生物學公司 <120>具改良之可製造性之免疫球蛋白變異體 <130> NRSFP6713770 <140> 099128051 <141> 2010-08-20 <150> 0914691.1 ; 61/241,717 <151> 2009-08-21 ; 2009-09-11 <160> 2 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 110 <212> PRT <213>智人 <400> 1

Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Set Pro Gly Lys 15 10 15

Thr Val Thr He Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser lie Ala Ser Asn 20 25 30

Tyr Val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 lie Tyr Glu Asp Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser He Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly 65 70 75 80

Leu 'Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Pro 85 90 95

Glu Met Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 2 <211> 121 <212〉 PRT <213>智人 <400> 2

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 150388.doc 201116626

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Thr Tyr Glu Gly Pro Thr Tyr Phe Ala Ser Asp Pro Trp Gly loo 105 no

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 2- 150388.doc

Claims (1)

1. 201116626 七、申請專利範圍： 1. 一種改良免疫球蛋白可製造性之方法，其包含： 識別具有VL結構域及VH結構域之親代免疫球蛋白； 向該親代免疫球蛋白VL結構域中之框架易於聚集之區 段及/或CDR3易於聚集之區段中引入取代；及/或 向該親代免疫球蛋白VH結構域中之框架區易於聚集之 區段及/或CDR3易於聚集之區段中引入取代；及/或 向該親代免疫球蛋白CH1結構域中之悝定區易於聚集 〇 之區段中引入取代， 由此製備具有VL結構域及VH結構域且相對於該親代 免疫球蛋白呈現改良之可製造性的免疫球蛋白變異體。 2. —種免疫球蛋白變異體，其包含： 輕鏈可變（VL)結構域，其在框架（FR)易於聚集之區段 及/或互補決疋區3 (CDR3)易於聚集之區段包含取代； 重鏈可變（VH)結構域，其在框架區易於聚集之區段及 /或CDR3易於聚集之區段包含取代；及/或 重鏈恆定區1 (CH1)結構域’其在CH1易於聚集之區段 包含取代。 3. 如請求項1之方法或如請求項2之免疫球蛋白變異體，其 中§亥免疫球蛋白變異體在表現後相對於該親代免疫球蛋 白呈現降低之聚集傾向及提高之生產率。 4. 如請求項3之免疫球蛋白變異體或方法，其中該免疫球 蛋白變異體相對於該親代免疫球蛋白呈現至少2〇%之生 產率提高及至少30%之聚集傾向降低。 150388.doc 201116626 5. 如請求項3或4之免疫球蛋白變異體或方法，其中在該親 代免疫球蛋白之VL結構域中在該VL之位置37易於聚集 之區段及/或該VL之位置45易於聚集之區段引入取代； 及/或 在該親代免疫球蛋白之VH結構域中在該VH之FR1易於 聚集之區段、該VH之位置95易於聚集之區段、及該VH 之CDR3易於聚集之區段引入取代。 6. 如請求項5之免疫球蛋白變異體或方法，其中在該vh結 構域序列之選自由1、17、94、95、96、100、l〇〇d及 1 02組成之群的位置及/或在該vl結構域序列之選自由 37、45及46組成之群的位置引入該取代。 7·如請求項6之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vl結構 域序列中位置3 7處之殘基被Q或N取代。 8. 如請求項7之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vl結構 域包含L37Q取代。 9. 如請求項6至8中任一項之免疫球蛋白變異體或方法，其 中該VL結構域序列中位置45處之殘基被E、K、R、Q或 V取代。 1〇_如請求項9之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VL結構 域包含 T45E、T45K、T45R、T45Q 或 T45V 取代。 11.如請求項6至10中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VL結構域序列中位置46處之殘基被L或Y取代。 12·如請求項11之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vl結構 域包含T46L或T46Y取代。 I50388.doc 201116626 13.如請求項6至12中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域序列中位置i處之殘基被E、Q、D、a 或V取代。 14_如請求項13之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 域包含 Q1E、Q1D、Qia 或 Q1V取代或 E1Q、E1D、E1A ， 或E1V取代。 15.如請求項6至14中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 〇 其中該VH結構域序列中位置17處之殘基被R取代。 1 6·如請求項1 5之免疫球蛋白變異體或方法，其中該結構 域包含G17R取代。 17. 如請求項6至16中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域序列中位置94處之殘基被r取代。 18. 如請求項17之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結構 域包含H94R取代。 19. 如請求項6至18中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， Q 其中該VH結構域序列中位置95處之殘基被D取代。 20. 如請求項19之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結構 域包含R95D取代。 21_如請求項6至20中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域序列中位置96處之殘基被A取代。 22. 如請求項21之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 域包含G96A取代。 23. 如請求項6至22中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域序列中位置l〇〇d處之殘基被F、G、L、 150388.doc 201116626 P或Μ取代。 24. 如請求項23之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結構 域包含 SlOOdF、SlOOdG、SlOOdL、SlOOdP 或 SlOOdM 取 代。 25. 如請求項6至24中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域序列中位置102處之殘基被a、F、η、 I、L、V或Υ取代。 26. 如請求項25之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結構 域包含 P102A、P102F、P102H、P102I、P102L、 P102Y、P102V或 S102V取代。 27. 如請求項3至26中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該免疫球蛋白變異體序列相對於該親代免疫球蛋白 序列具有至多10處胺基酸取代。 28·如請求項3至27中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域序列在該Vh之FR1易於聚集之區段及該 VH之CDR3易於聚集之區段中包含取代。 29·如請求項28之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結構 域序列在位置1及位置1 〇2處包含取代。 30. 如請求項29之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置1〇2 處之殘基被八、卩、11、1、[、¥或丫取代，且其中位置1 處之殘基被E、Q、D、A或V取代。 31. 如請求項30之免疫球蛋白變異體或方法，其中該vh結構 域包含P102Y取代及q1a或q1E取代。 32. 如請求項3至3 1中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 150388.doc 201116626 其中該VH結構域序列在該VH之位置95易於聚集之區段 及該VH之CDR3易於聚集之區段中包含取代。 33. 如請求項32之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 域序列在位置95及位置1〇2處包含取代。 34. 如請求項33之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置1〇2 •處之殘基被入、卩、11、1、1^、¥或丫取代，且其中位置95 處之殘基被E或D取代。 35·如請求項34之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 C) 域包含S102V取代及R95D取代。 36·如請求項33至35中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域在位置94及1〇〇處進一步包含取代。 3 7.如請求項36之免疫球蛋白變異體或方法，其中位置94處 之殘基被R取代且位置1 〇〇處之殘基被F取代。 38·如叫求項37之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 域包含H94R取代及V100F取代。 Ο 39_如請求項3至38中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該免疫球蛋白變異體之VL結構域序列在該位置37易 於聚集之區段及該位置45易於聚集之區段中包含取代。 40·如請求項39之免疫球蛋白變異體或方法，其中該免疫球 蛋白變異體之V L結構域序列在該位置3 7及位置* 5處包含 取代。 札如請求項40之免疫球蛋白變異體或方法，其中該位置η 處之殘基被取代，且其中該位置45處之殘基被r、 K或E取代。 150388.doc 201116626 42. 如請求項41之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VL結構 域包含L37Q取代及Q45R取代。 43. 如請求項3至42中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VL結構域包含S102V取代及R95D取代且該VL結 構域包含L37Q取代及Q45R取代。 44. 如請求項3至43中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該VH結構域在該VH之位置95易於聚集之區段中包 含一或多處取代且該VL結構域在該位置45易於聚集之區 段中包含一或多處取代。 45. 如請求項44之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 域在位置94及95處包含取代且該VL結構域在位置46處包 含取代。 46. 如請求項45之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 域中位置94處之殘基被R、K或T取代，且該VH結構域中 位置95處之殘基被E或D取代，且該VL結構域中位置46 處之殘基被K、R、Η、F或S取代。 47. 如請求項46之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 域包含H94R及R95D取代且該VL結構域包含L46R取代。 48. 如請求項3至47中任一項之免疫球蛋白變異體或方法， 其中該免疫球蛋白變異體之VH結構域在該VH之CDR3易 於聚集之區段中包含兩處或更多處取代。 49. 如請求項48之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 域在位置100d及102處包含取代。 50. 如請求項49之免疫球蛋白變異體或方法，其中該VH結構 150388.doc 201116626 域包含 SlOOdF 及 Pl〇2V 取代；S10〇dM&pi〇2v 取代； SlOOdF 及 P102Y 取代或 siOOdM 及 Ρ1〇2γ 取代。 51. 如前述、青求項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法，其 中該免疫球蛋白變異體經人類化。 52. 如前述請求項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法，其 中該免疫球蛋白變異體表現於重組系統中。 53. 如前述請求項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法其 中在表現後分離及/或純化該免疫球蛋白變異體。 54. 如前述請求項中任一項之免疫球蛋白變異體或方法，其 中將該免疫球蛋白變異體與醫藥上可接受之賦形劑一起 調配。 55. —種評價免疫球蛋白可製造性之方法，其包含： 識別選自由下列組成之群之一或多個位置處的胺基酸 殘基：該免疫球蛋白VL結構域中之位置37、45及46,該 VH結構域中之位置1、17、94、95、96、100、1 〇〇d及 102， 其中在該免疫球蛋白之VL結構域中在位置37處存在除Q 之外的殘基；在位置45處存在除E、K、R、Q或V、較佳 K或R之外的殘基；在位置46處存在除L或Y、較佳L之外 的殘基；及/或 在該免疫球蛋白之VH結構域中在位置丨處存在除a、 D、E、Q或V之外的殘基；在位置17處存在除尺之外的殘 基；在位置94處存在除R之外的殘基；在位置96處存在 除A之外的殘基；在位置i〇〇d處存在除f、g、L、Μ或 150388.doc 201116626 P、較佳F或Μ之外的殘基丨在位置1〇2處存在除A、F、 Η' 1' L、V或γ'較佳乂或丫之外的殘基， 表明該免疫球蛋白之可製造性亞最佳。 56. 57. 58. 如哨求項55之方法’其包含該免疫球蛋白之可製造性亞 最佳且藉由如請求項⑴以中任一項之方法來改良該 免疫球蛋白之可製造性。 -種製備具有改良之可製造性之免疫球蛋白的方法豆 包含： 〃 提供編碼藉由如請求項⑴越中任―項之方 之免疫球蛋白變異體的核酸， 在一定條件下表現該核酸以達成該 之製備，及對其進行回收。 “蛋白變異體 θ长項57之方法，其包含將該免疫球蛋白妈 成包:te μ μ , < 受異體調配 邊樂上可接受之賦形劑之組合物。 150388.doc 201116626 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 150388.doc -2-