CN102740877B - 对源自hsp65的肽-6有特异性的人源化抗体及其方法和用途 - Google Patents

对源自hsp65的肽-6有特异性的人源化抗体及其方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人源化抗体，所述人源化抗体特异性结合包含由SEQ ID NO:15所表示的肽-6的多肽，所述肽-6是源自HSP65的肽。更具体而言，本发明涉及用于治疗免疫相关病症的人源化抗肽-6抗体、组合物、方法及其用途，所述免疫相关病症具体为炎性病症，例如关节炎、IBD、银屑病、糖尿病和MS。本发明还提供组合了本发明的人源化抗体和至少一种抗炎剂的联合组合物和试剂盒，以及所述人源化抗体在诊断试剂盒和方法中的应用。

Description

对源自HSP65的肽-6有特异性的人源化抗体及其方法和用途
技术领域
本发明涉及人源化的对源自HSP65的肽(具体而言，肽-6)有抗性的抗体及其任何抗原结合片段。更具体而言，本发明涉及用于治疗免疫相关病症的人源化抗肽-6抗体、组合物、方法及其用途。
背景技术
将本申请中提及的所有出版物都通过援引完整地并入本文，包括其中所引用的所有参考文献。
结核分枝杆菌(MT)的65kDa热休克蛋白(HSP65)在自身免疫性关节炎的发病机理中起重要作用。其效果在佐剂性关节炎(AA)的实验模型中得到了良好的例证。通过皮内接种悬浮于弗氏佐剂中的热灭活分枝杆菌，可以在诸如Lewis或Wistar等大鼠的易感近交系中诱导AA。可以通过对HSP65的180～188位残基有反应性的T细胞克隆来被动转移AA[Holoshitz,J.等，Science 219:56-58(1983)]。
已报道的证据表明，抵御疾病的保护作用可能是由针对HSP65的细胞应答引起的[Lider,O.等，Proc.Natl.Acad.Sci.84:4577-4580(1987)；Moudgil,K.等，J.Exp.Med.185:1307-1316(1997)]，这表示该蛋白含有参与发病机理和抗性获得的不同表位。本发明人之前已指出，对AA的抗性还可以通过针对HSP65的抗体来赋予，并且可以通过向易患关节炎的大鼠静脉内输注来自具有关节炎抗性的品系的免疫球蛋白来被动转移[Ulmansky，R.,和Naparstek,Y.Eur.J.Immunol.25:952-957(1995)]。进一步的分析明确了抗HSP保护性抗体对31～46位氨基酸残基(命名为肽-6，且由SEQ ID NO:15表示)的表位特异性[Ulmansky，R.和Naparstek,Y.J.Eur.J.Immunol.168:6463-6469(2002)]。用此肽对Lewis大鼠进行的疫苗接种导致产生了针对全分子的抗体以及对疾病诱导的抗性。
本发明人之前已指出，针对肽-6的多克隆抗体刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生白细胞介素-10(IL-10)[Ulmansky(2002)，同上]。抗炎细胞因子IL-10在先天性免疫中起重要作用，主要是由于其使炎性应答受到抑制的抑制效果。据显示，本发明人制造的单克隆抗肽-6抗体通过与PBMC结合并刺激该细胞分泌IL-10而保留了这种保护性效果。
本发明人还指出针对肽-6的抗体不仅与肽-6相互作用，而且它们还直接与巨噬细胞的表面配体发生明显的交叉反应，这种相互作用是理解这些抗体的作用机制的关键。在抗肽-6抗体结合巨噬细胞后，会激活导致细胞因子(特别是IL-10)的产生和分泌增加的信号转导途径。作为抗炎细胞因子，IL-10削弱并抑制炎性过程，从而使炎性病症得到改善和治疗。这会使诸如肿瘤坏死因子α(THF-α)等促炎Th1细胞因子与诸如IL-10等抗炎Th2细胞因子间的平衡发生倾斜。因此，利用抗肽-6抗体将Th1/Th2平衡向Th2抗炎应答的方面调节，适用于治疗炎性病症。
然而，施用啮齿动物抗体或抗体片段具有限制其在人体中的适用性的缺点，该缺点部分上是由这些抗体或其片段的免疫原性造成的。为了克服啮齿动物抗体的这些不期望的性质，已通过用人抗体的区域对除抗原结合部位以外的框架区进行置换而开发了人源化抗体。制备此类人源化抗体的常用方法基于对编码人抗体的基因的选择，所述人抗体显示出与小鼠抗体最接近的序列相似性，并且使用CDR移植法仅将该人抗体的互补决定区(CDR)置换成小鼠抗体的互补决定区。人源化抗体的优势在于减少体内免疫应答。然而，当仅将CDR移植到人抗体上时，其选择性和反应性经常会受到损害。
此外，虽然人源化技术已提供了在施用给人时通常具有良好耐受性且免疫原性通常小于非人单克隆抗体的抗体。但已显示，用这些技术产生的若干种抗体在患者中引发了免疫原性，即使此类抗体的遗传起源是人。这种对免疫原性的诱导可能是因为在抗体可变区内存在小段的非自身氨基酸序列，所述小段的非自身氨基酸序列在某些情况下能够产生T细胞表位，这些T细胞表位诱导导致免疫原性的T细胞应答。
抗肽-6抗体作为免疫调节剂的潜在用途需要产生具有降低的抗原潜力的人源化抗体。因此有需要产生具有高比例的人源序列且避免形成可能诱导T细胞应答的序列的高特异性人源化抗肽-6抗体。
因此本发明的目的是提供用于调节患有免疫相关病症的受试对象中的Th1/Th2平衡的此类人源化抗肽-6抗体。
本发明的各种目标将随着描述的进行而变得明显。
发明内容
根据第一方面，本发明涉及特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽的人源化抗体或其任何抗原结合片段。应注意的是，多肽SEQ ID NO:15，也称为肽-6，源自HSP65。
根据一个实施方式，本发明的人源化抗体包含：
(a)重链可变区，所述重链可变区包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的Ile、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于H100位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于H101位的Asp和位于H102位的Tyr，且可选地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于H11位的Ile、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一个；和
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含位于L1位的Gln、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gln、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可选地包含位于L21位的Met、位于L10位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一个。应认识到的是，所有指出的位置都是根据Kabat编号系统来确定的。
本发明的另一方面涉及包含有效量的至少一种分离且纯化的本发明的人源化抗体作为活性成分的组合物。
本发明还提供用于预防、治疗、改善或抑制免疫相关病症的药物组合物。本发明的药物组合物包含治疗有效量的至少一种分离且纯化的本发明的人源化抗体作为活性成分。
在又一方面，本发明提供用于使有需要的受试对象(具体为患有免疫相关病症的受试对象)中的IL-10(白细胞介素-10)的表达和水平增加的组合物和方法。
本发明的另一方面提供用于预防、治疗、改善或抑制免疫相关病症的治疗或改善的方法。本发明的方法包括以下步骤：向有需要的受试对象施用治疗有效量的至少一种分离且纯化的本发明的人源化抗体或治疗有效量的包含所述抗体作为活性成分的组合物。
根据一个实施方式，本发明的方法可以特别适用于治疗和改善诸如自身免疫病或炎性病症等免疫相关病症。
此外，本发明提供包含至少一种分离且纯化的本发明的人源化抗体和至少一种抗炎剂的联合组合物。在某些实施方式中，此类抗炎剂可以选自由以下物质组成的组：甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮质类固醇衍生物和诱导任何信号传导途径的任何抗炎剂。更具体而言，附加的抗炎剂可以诱导与由抗肽-6抗体所诱导的途径(例如，参与IL-10诱导的任何途径)不同的途径。所述联合组合物还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
本发明的再一方面涉及用于在患有免疫相关病症的受试对象中获得疗效的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)至少一种分离且纯化的本发明的人源化抗体或其任何抗原结合片段或其药学上可接受的衍生物，和药学上可接受的载剂或稀释剂，上述物可选地为第一单位剂型；
(ii)至少一种抗炎剂，和药学上可接受的载剂或稀释剂，上述物可选地为第二单位剂型；和
(iii)用于容纳所述第一剂型和第二剂型的容器装置。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒中所包含的抗炎剂可以选自由以下物质组成的组：甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮质类固醇衍生物和诱导任何信号传导途径的任何其他抗炎剂。
本发明的另一方面涉及用编码本发明的人源化抗体的表达载体转化或转染的宿主细胞系。更具体而言，本发明的宿主细胞系表达具有重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，所述重链可变区包含由SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列。
在又一方面，本发明提供了嵌合单克隆抗体，所述嵌合单克隆抗体特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽或与包含SEQ ID NO:15的任何多肽结合，其中，所述抗体包含人免疫球蛋白恒定区和鼠类免疫球蛋白可变区。
借助于以下附图，本发明的其他方面将变得明显。
附图说明
图1A～1B：嵌合小鼠-人抗肽-6抗体的氨基酸序列和核酸序列
该图示出了嵌合小鼠-人抗体的可变结构域的氨基酸序列和核酸序列。
图1A示出了小鼠抗体重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和编码核酸序列(SEQ ID NO:3)。
图1B示出了小鼠抗体轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和编码核酸序列(SEQ ID NO:4)。
根据Kabat进行CDR的界定和蛋白序列编号。CDR核苷酸和蛋白序列用下划线标出。
缩写：M.Heav.Ch.Seq.(小鼠重链序列)；M.Ligh.Ch.Seq.(小鼠轻链序列)；SEQID NO:(序列识别号)。
图2：VK表达载体pANTVK和VH表达载体pANTVhG1/4的图解
该图显示了示出关键遗传元件和限制性酶切位点的VK和VH表达载体的图解。用于在细菌中进行增殖的元件(包括ColE1复制子和氨苄青霉素抗性基因)未示出。
缩写：Hin.(铰链)。
图3A～3B：嵌合抗肽-6抗体与肽-6的结合曲线
图3A～3B示出了小鼠IgM(3A)和嵌合小鼠-人IgG1(3B)与以10μg/ml包被的肽-6抗原的结合曲线。
缩写：OD(光密度)。
图4：复合抗体序列和比对的区段以及约束性氨基酸
该图示出了人源化的变体重链(VH1～VH4)和变体轻链(VK1～VK3)的氨基酸序列(第1行)、约束性残基谱图(第2行)和用于组装不同变体的复合人序列的序列区段(第3行)(图中的第3行由代表不同区段的第3、4、5行组成，这些区段由SEQ IDNO:12～14、16～19及34～59、96及97表示)。
缩写：VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)，SEQ ID NO:(序列识别号)。
图5：用于将合成的复合人抗体(Composite Human Antiboy)TM的VH和VK基因克隆到表达载体中的侧翼序列
该图示出了用于将合成的复合人抗体TM的VH和VK基因克隆到表达载体中的侧翼序列(SEQ ID NO:5、6、7和8)。
缩写：Flank.Seq.(侧翼序列)，SEQ ID NO:(序列识别号)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)。
图6A～6G：不同的人源化抗体变体的氨基酸序列和核酸序列
图6A～6D显示了氨基酸序列分别为SEQ ID NO:20、21、22和23且核酸序列分别为SEQ ID NO:27、28、29和30的变体VH1～VH4的重链可变区核苷酸序列和推定的氨基酸序列。
图6E～6G显示了氨基酸序列分别为SEQ ID NO:24、25和26且核酸序列分别为SEQ ID NO:31、32和33的变体VK1～VK3的轻链可变区核苷酸序列和推定的氨基酸序列。
根据Kabat进行CDR的界定和蛋白序列编号。CDR核苷酸和蛋白序列用下划线标出。由原始杂交瘤序列发生了变化的氨基酸以粗体突出显示。
缩写：Var.(变体)，CDR(互补决定区)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)，SEQ ID NO:(序列识别号)。
图7A～7C：复合人抗体与肽-6的结合
用ELISA测试了纯化的复合人抗体变体与肽-6的结合。将抗体变体从100μg/ml稀释到6.125μg/ml，并且使之与包被有肽-6的NuncMaxiSorp 96孔平板结合。通过抗人IgGκHRP和TMB底物来检测结合。在450nm处测量吸光度。
缩写：VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)，CH/CK嵌合小鼠抗体。OD(光密度)。
图8：嵌合抗肽-6抗体刺激人巨噬细胞分泌IL-10
该柱式图示出了与不同剂量的嵌合小鼠-人抗肽-6抗体温育了48小时的人PBMC的IL-10分泌。将未处理的细胞作为对照。收集上清液并用IL-10ELISA检测试剂盒(R&D systems)进行测定。
缩写：Chim.M-H a-pept.6(嵌合小鼠抗人肽-6)，α(抗)，U.T.(未处理的)。
图9：嵌合抗肽-6抗体抑制已建立的AA的严重程度
该图示出了用小鼠IgM抗体、嵌合小鼠-人IgG1抗肽-6抗体、对照嵌合抗体利妥昔单抗(Rituximab)和盐水处理过的不同实验组的的动物关节炎评分。关节炎评分是6～7只动物的平均值。*在第20天与用盐水处理过的大鼠相比，p<0.05。
缩写：D.A.Ind.AA.(诱导关节炎后的天数)；Sal.(盐水)；Chim.M-H(嵌合小鼠抗人)；AA Sc.(关节炎评分)。
图10A～10B：嵌合抗肽-6抗体抑制已建立的AA的严重程度
该图绘出并比较了用嵌合小鼠-人抗肽-6抗体处理过的大鼠(图10B)的关节用对照抗体利妥昔单抗处理过的大鼠(图10A)的关节的病理学发现。
缩写：Chim.M-H pept.6(嵌合小鼠抗人肽-6)。
图11：嵌合抗肽-6抗体、MPS和Enbrel对已建立的AA的影响
该图示出了用嵌合小鼠-人IgG1抗肽-6抗体、甲基强的松(MPS)或Enbrel及其与所述嵌合小鼠-人抗体的组合处理过的不同实验组的动物的关节炎评分。关节炎评分是6只动物的平均值。在第21天将嵌合抗肽-6抗体、Enbrel或MPS分别与PBS比较，p<0.05、p<0.02、p<0.05。在第19天将MPS与PBS比较，p<0.05。分别在第21天和第23天将嵌合抗肽-6抗体+Enbrel与PBS比较，p<0.02和p<0.05。分别在第18、19、21和23天将嵌合抗肽-6抗体+MPS与PBS比较，p<0.02、p<0.02、p<0.01和p<0.05。
缩写：D.A.Ind.AA.(诱导关节炎后的天数)；Chim.M-H(嵌合小鼠抗人)；Chim.(嵌合)；AA Sc.(关节炎评分)。
图12A～12C：人源化抗肽-6抗体与人巨噬细胞(CD14+细胞)结合
单独用抗CD14抗体(偶联有APC)对人PBMC进行染色，或用该抗CD14抗体与人源化VH2/VK3抗肽-6抗体(偶联有FITC；10μg)一起对人PBMC进行双染色。随后用FACS对细胞进行抗体结合分析。
图12A、12B绘出了被抗CD14染色了的细胞(A)和被抗CD14和人源化抗体染色了的细胞(B)的密度图。
图12C绘出了被染色的细胞的柱式图。
缩写：Hum.(人源化)；Cou.(计数)；α(抗)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)
图13：人源化抗肽-6抗体结合过表达的His-CAP1，但不结合His-CREBP
使用了商购的小鼠抗人CAP1、商购的小鼠抗His-tag和人源化的抗肽-6VH2/VK3变体来对过表达且纯化的His-CAP1(I)和His-CREB(II)进行蛋白质印迹分析。
缩写：αHum.CAP1(抗人CAP1抗体)；αHis(抗his-tag抗体)；Hum.α-pep.6.(人源化的抗肽-6抗体，VH2/VK3变体)。
图14：人源化抗肽-6抗体诱导人巨噬细胞分泌IL-10
该柱式图示出了与人源化抗肽-6抗体的两种变体VH2/VK1和VH2/VK3温育了48小时的人PBMC的IL-10分泌。将未处理的细胞作为对照。收集上清液并用IL-10ELISA检测试剂盒(R&D systems)进行测定。
缩写：U.T.(未处理的)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)。
图15A～15B：复合人抗体与肽-6的结合并不与IL-10诱导直接相关
图15A：33μg/ml或100μg/ml的不同的VH和VK人源化抗体变体的PBMC IL-10诱导能力。
图15B：肽6对VH3/VK2、VH2/VK3、VH2/VK1和VH2/VK2的亲和力。
缩写：Chim.(嵌合体)；OD(光密度)；Ab.Conc.(抗体浓度)，U.T.(未处理的)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)。
图16A～16C：人源化抗肽-6F(ab)2片段结合人巨噬细胞
单独用抗CD14抗体(偶联有PE)对人PBMC进行染色，或用该抗CD14抗体与人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的F(ab)2片段(偶联有FITC；10μg)一起对人PBMC进行双染色。
图16A、16B绘出了被抗CD14染色了的细胞(A)和被抗CD14和人源化抗体的F(ab)2片段染色了的细胞(B)的密度图。图16C绘出了被染色的细胞的柱式图。
缩写：Frag.(片段)；Cou.(计数)；α(抗)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)。
图17：人源化抗肽-6F(ab)2片段诱导人巨噬细胞分泌IL-10
该柱式图示出了与人源化抗肽-6VH2/VK3变体的F(ab)2片段温育了48小时的人PBMC的IL-10分泌。将未处理的细胞作为对照。收集上清液并用IL-10ELISA检测试剂盒(R&D systems)进行测定。
缩写：U.T.(未处理的)。
图18：人源化抗肽-6抗体抑制已建立的AA的严重程度
该图示出了用小鼠-人嵌合IgG1抗肽-6抗体、人源化抗肽-6变体VH2/VK3或作为对照的PBS处理过的动物的关节炎评分。关节炎评分是6～7只动物的平均值。*在第20和第22天将人源化抗肽-6抗体与PBS比较，p<0.02；在第24天比较，p<0.05。*在第20和第22天将嵌合抗肽-6抗体与PBS比较，p<0.01；在第24天比较，p<0.02；在第18天比较，p<0.05。
缩写：D.A.Ind.AA.(诱导关节炎后的天数)；Chim.M-Hαpept.6(嵌合小鼠抗人肽-6)；Hum.(人源化)；AA Sc.(关节炎评分)。
图19：人源化抗肽-6抗体对AA中各种细胞因子的影响
该柱式图示出了以下细胞因子在已建立了AA的大鼠的血清中的水平：IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17、IL-1和TNF-α。用人源化抗肽-6VH2/VK3变体或用PBS处理动物。将健康的、非关节炎的动物的血清用作对照。除IL-17、IL-1和TNF-α的结果表示每组1只大鼠以外，所有细胞因子的结果为每组2只大鼠的平均值±SE。
缩写：Health.(健康的)；Hum.(人源化)；IFN-γ(γ干扰素)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)。
图20：人源化抗肽-6抗体抑制已建立的胶原诱导型关节炎(CIA)的严重程度
该图示出用人源化VH2/VK3抗肽-6抗体处理过的动物相对于用TBS处理过的动物的关节炎评分。
通过测量爪直径来评估关节炎，其是每组8只小鼠的平均值。*与用TBS处理过的小鼠相比，p<0.05。
缩写：Hum.(人源化)；D.A.Diseas.Ons.(疾病发作后天数)；Aver.Fee.Diam.(平均爪直径)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)。
图21：人源化抗肽-6抗体诱导类风湿性关节炎患者的PBMC分泌IL-10
收集自两位RA患者的PBMC在与VH2/VK3抗肽-6人源化抗体一起温育或未与该抗体一起温育48小时后的培养物上清液中的IL-10水平。
缩写：U.T.(未处理的)；Pat.(患者)，hum.α-pep-6(VH2/VK3抗肽-6人源化抗体)。
图22：人源化抗肽-6抗体改善TNBS结肠炎，一种炎性肠病(IBD)模型
该柱式图示出并比较了在使用经人源化VH2/VK3抗体变体处理过的动物和对照动物(每组10只动物)的TBNS结肠炎模型中测得的体重(克)。*与对照小鼠相比，p<0.05。
缩写：Bod.Weigh.Gr.(体重(克))；Weigh.Los(体重损失)；Sens.(在敏化时)；Dis.Ind.(在疾病诱导时)；Sacrif.D.3(在处死时(第3天))；Hum.(人源化)；Cont.(对照)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)。
图23A～23C：人源化抗肽-6抗体改善TNBS结肠炎，一种IBD模型
图23A显示的柱式图指示并比较了用人源化VH2/VK3抗体变体处理过的TBNS结肠炎动物和对照(每组10只动物)的显微镜疾病评分。
图23B～23C显示了取自经处理的动物(C)和对照动物(B)的组织切片(放大率×100)。*与对照小鼠相比，p<0.05。
缩写：Micro.Dis.Sc.(显微镜疾病评分)；Hum.(人源化)；Cont.(对照)，VH(重链可变区)，VK(轻链可变区)。
图24：人源化抗肽-6抗体抑制TNBS结肠炎IBD模型中的体重损失
在第-7天(敏化)、第0天(疾病诱导)和第3天(处死)，对经直肠内施用TNBS进行激发用人源化抗肽-6抗体(VH2/VK3)、利妥昔单抗或PBS处理过的小鼠的体重进行的比较，每组使用了10只小鼠。*与对照小鼠相比，p<0.05。
缩写：Bod.Wei.(体重)；Sens.(敏化)；Dis.Ind.D.3(疾病诱导(第3天))；Sacrif.(处死)，Hum.α-pep.6.(人源化抗肽-6抗体，VH2/VK3变体)。
图25：人源化抗肽-6抗体的药代动力学特征
在腹膜内或皮下施用20mg/kg的小鼠血清人源化抗肽-6抗体(人源化抗肽-6抗体，VH2/VK3变体)后11天期间的所述人源化抗肽-6抗体的水平的图示。
缩写：S.C.(皮下)；I.P.(腹膜内)；D.Ant.Adm.(施用抗体后天数)。
图26：pPRO14双顺反子表达载体的图谱
显示了(未按比例)对表达人IgG和在真核细胞中进行选择而言需要的元件。VH区是PRO01重链变体2，VK区是PRO01轻链变体3。未示出用于原核细胞增殖和选择的元件细节。
缩写：Hin.(铰链)。
图27A～27B：细胞系PRO01-SF-14-524-AJ的生产力(productivity)和生长
在十代的时间内对细胞系PRO01-SF-14-524-AJ的生产力和生长特性进行的分析。间隔十代建立SPR(比生产率)培养物，即在250ml摇瓶中的70ml培养物，每天取样以获得细胞计数、细胞活力和Ig滴度。(图27A)SPR#1，(图27B)SPR#2。虚线表示用于计算峰值SPR的时间窗。
缩写：Cel.Dens.(细胞密度)；Cel.Cou.(细胞计数)；Tit.(滴度)；T.D.PI(接种后时间(天))。
图28A～28B：细胞系PRO01-SF-14-524-AO的生产力和生长
在十代的时间内对细胞系PRO01-SF-14-524-AO的生产力和生长特性进行的分析。间隔十代建立SPR培养物，即在250ml摇瓶中的70ml培养物，每天取样以获得细胞计数、细胞活力和Ig滴度。(图28A)SPR#1，(图28B)SPR#2。虚线表示用于计算峰值SPR的时间窗。
缩写：Cel.Dens.(细胞密度)；Cel.Cou.(细胞计数)；Tit.(滴度)；T.D.PI(接种后时间(天))。
图29A～29B：细胞系PRO01-SF-14-524-AZ的生产力和生长
在十代的时间内对细胞系PRO01-SF-14-524-AZ的生产力和生长特性进行的分析。间隔十代建立SPR培养物，即在250ml摇瓶中的70ml培养物，每天取样以获得细胞计数、细胞活力和Ig滴度。(图29A)SPR#1，(图29B)SPR#2。虚线表示用于计算峰值SPR的时间窗。
缩写：Cel.Dens.(细胞密度)；Cel.Cou.(细胞计数)；Tit.(滴度)；T.D.PI(接种后时间(天))。
图30A～30B：细胞系PRO01-SF-14-524-BE的生产力和生长
在十代的时间内对细胞系PRO01-SF-14-524-BE的生产力和生长特性进行的分析。间隔十代建立SPR培养物，即在250ml摇瓶中的70ml培养物，每天取样以获得细胞计数、细胞活力和Ig滴度。(图30A)SPR#1，(图30B)SPR#2。虚线表示用于计算峰值SPR的时间窗。
缩写：Cel.Dens.(细胞密度)；Cel.Cou.(细胞计数)；Tit.(滴度)；T.D.PI(接种后时间(天))。
图31：来自不同细胞系的抗体的结合
从细胞系PRO01-SF-14-524-AJ、PRO01-SF-14-524-AO、PRO01-SF-14-524-AZ和PRO01-SF-14-524-BE的上清液中纯化出的抗体的结合。在被10μg/ml肽-6预包被的微量滴定板中温育每种抗体的梯度稀释液。用经HRP标记的小鼠抗人κ轻链和TMB检测结合。
缩写：Chim.(嵌合)；Ab.Conc.(抗体浓度)，Abs(吸光度)。
具体实施方式
缩写：
BSA-牛血清白蛋白
CDR-抗体可变区的互补决定区(根据Kabat定义，对于每条重链和轻链编号为CDR1～3)。
Ec(0.1%)-1mg/ml的蛋白溶液的吸光度。
ED50-产生最大可观测效果的50%的测试物质的浓度。
ELISA-酶联免疫吸附测定
FR-框架区——支持CDR的可变结构域的支架(scaffold)区域
IgG-免疫球蛋白G
mAb-单克隆抗体
MHC-主要组织相容性复合物
OD280nm-280nm处测得的光密度
PBS-磷酸盐缓冲盐水
TMB 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺
PCR-聚合酶链式反应
V区-抗体链的可变区
本发明提供特异性地识别并结合包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的多肽的人源化抗体。应注意的是，多肽SEQ ID NO:15，即肽-6，源自HSP65。如下文所示，示例性的本发明的人源化抗体是通过将来自多种其他人抗体可变区的氨基酸序列的区段合并起来产生的。第一步，产生了不同可变区基因的文库，并将其克隆至表达载体中，随后进行筛选以回收具有所需特性(例如，与肽-6(SEQ ID NO:15)的结合)的文库成员。
将这些区段选择为包含参与表位识别的“约束性”氨基酸残基，这些残基也存在于本发明所用的参照小鼠抗体中。
更具体而言，通过从已知的人V区序列(例如在Kabat抗体数据库(www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)、NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中可获得的那些序列)和从蛋白数据库(例如UniProt(www.ebi.uniprot.org)和PRF/SBQDB(www.prf.or.ip))选择VH和VL序列的区段来设计VH和VL序列的文库。此外，通过从一个或多个单独区段扩增人源VH和VLmRNA而进行直接测序，而收集人VH和VL序列，来作为上述序列的补充。对于设计VH和VL基因，考虑了序列区段的各种组合。
本领域技术人员将理解，除了上述方法以外，还存在其他的用于创造和测试本发明的人源化抗体的方法和用于优化此类抗体的性质的方法。本发明的抗体是新颖的，并且由于V区是全人源的，本发明的抗体在人体中的免疫原性应当比包含非人序列的其他抗体的更小。本发明的人源化抗体的其他可选特征，即避免T细胞表位，也可以有助于低免疫原性。应理解的是，产生组合人抗体的抗体区段及其组合可以经选择而符合多种标准，包括可选地避免T细胞表位。例如，人蛋白序列的区段及其组合能够经选择而用于避免B细胞表位和其他表位(例如I类MHC限制型表位)、用于避免可能对人源化抗体的表达有害的氨基酸序列、用于避免可能对人源化抗体带来不适当修饰(例如N-糖基化)的序列、用于包含某些功能(例如辅助T细胞表位和/或B细胞表位)(例如，在疫苗应用中)、用于与其他部分的后续偶联和用于达到多种其他标准。应注意的是，本文所用的“T细胞表位”是由T细胞受体识别并结合的抗原决定簇。由T细胞受体识别的表位经常位于抗原的内部未暴露侧，并且在对该抗原进行蛋白水解加工后对T细胞受体变得可及。MHC限制型抗原识别，或MHC限制性，是指下述事实：指定的T细胞将仅在肽抗原与特定MHC分子结合时才识别肽抗原。通常，由于仅在自身MHC分子存在时才会刺激T细胞，抗原仅作为与自身MHC分子结合的肽被识别。
在一个实施方式中，抗肽-6人源化抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区完全源自一种或多种人抗体，如WO2006/08246中所描述的。在另一个实施方式中，可变区由来自一种或多种人抗体的氨基酸序列区段组成。在又一个实施方式中，人区段的长度为两个氨基酸以上。在一个实施方式中，人区段的长度为100个氨基酸以下。在其他实施方式中，人区段的长度为50个以下、40个以下、30个以下、20个以下、15个以下、10个以下、9个以下、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下或3个以下氨基酸。此类区段的实例由图4展示。
因此，根据第一方面，本发明涉及特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽的分离且纯化的人源化抗体或其任何抗原结合片段。
根据一个实施方式，本发明的人源化抗体包含：
(a)重链可变区，所述重链可变区包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的Ile、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于H100位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于H101位的Asp和位于H102位的Tyr，且可选地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于H11位的Ile、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一个；和
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含位于L1位的Gln、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gln、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可选地包含位于L21位的Met、位于L10位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一个。
应认识到的是，所有指出的位置都是根据Kabat编号系统来确定的。
应注意的是，根据某些实施方式，约束性氨基酸残基(具体为轻链可变区的位于L27位的残基Ser、位于L27A位的残基Ser、位于L28位的残基Val、位于L29位的残基Ser、位于L30位的残基Ser、位于L31位的残基Ser)，可以根据图1B所示的编号方式来对其进行如下编号：位于L27位的Ser、位于L28位的Ser、位于L29位的Val、位于L30位的Ser、位于L30A位的Ser。
还应当注意的是，上面指出的氨基酸残基被本发明鉴定为参与识别表位(即，肽-6(SEQ ID NO:15))的“约束性”氨基酸。这些残基也存在于对应的参照小鼠抗体中，所述参照小鼠抗体具有SEQ ID NO:1所表示的重链可变区和SEQ ID NO:2所表示的轻链可变区。因此，根据一个实施方式，本发明的人源化抗体的重链可变区与小鼠参照可变区的SEQ ID NO:1具有至少30%的同一性，轻链可变区与小鼠参照可变区的SEQ ID NO:2具有至少25%的同一性。
技术人员将认识到，重链和轻链的位置号是根据同样的编号方案(例如Kabat和Chothia编号方案)来指定的。Chothia编号方案与Kabat方案相同，但其在CDR-L1和CDR-H1中在具有结构差异的位置放置插入。除非另有说明，本文中述及序列位置时使用Kabat编号方案。特定VH或VL序列中的氨基酸残基位置并不是指特定序列中的氨基酸号，而是指参照编号方案指定的位置。
使用本领域中的标准定义来确定人重链和轻链的CDR位置并由此确定其框架区位置。例如，通常使用以下四种定义。Kabat定义基于序列变异性，并且是最常用的。Chothia定义基于结构环区域的位置。AbM定义是两者的折中，由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。最近，引入了接触定义，其基于对可获得的复杂晶体结构的分析。
例如，使用Kabat编号方法，本发明的轻链的框架通常包含残基1～23、残基35～49、残基57～88和残基98～109(或残基98至C端残基，例如残基98～108)。本领域技术人员将认识到，这些编号可以不指VH或VL序列中的氨基酸号，而是指使用Kabat编号系统(或其他编号系统)的残基位置。
术语“抗体”是指由免疫球蛋白基因编码的多肽或特异性地结合并识别抗原的其功能性片段(即，下文所定义的抗原结合片段)。已证实的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。将轻链分类为κ或λ。将重链分类为γ、μ、α、δ或ε，这些类别又分别定义了免疫球蛋白的类别，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单位由四聚体构成。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”(约25kDa)链和一条“重”(约50kDa～70kDa)链。每条链的N端界定了具有约100～110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别描述上述轻链和重链。更具体而言，将可变区再划分为超变区和(FR)框架区。对于指定的位置，相对于该位置最常见的氨基酸，超变区在该位置具有高比率的不同的氨基酸。在轻链和重链中，存在三个超变区。具有更稳定的氨基酸序列的四个FR区将超变区分隔开。超变区直接接触抗原表面的部分。因此，本文中的超变区称为“互补决定区”或“CDR”。FR区形成β叠片结构，该结构充当支架以将超变区保持在接触抗原的位置。
从N端到C端，轻链和重链均包含以下区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。CDR主要负责结合抗原的表位。每条链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，是从N端开始依次编号，并且还通常凭借特定CDR所在的链来识别CDR。因此，VH CDR3位于发现其的抗体的重链可变结构域，而VL CDR1是来自发现其的抗体的轻链可变结构域的CDR1。
除非另有说明，本文所述的对轻链和重链可变区的编号遵循Kabat[参见例如Johnson等，(2001)“Kabat Database and its applications:future directions”Nucleic AcidsResearch,29:205-206；以及the Kabat Database of Sequences of Proteins ofImmunological Interest,2002年2月22日数据集]。
VH或VL链的“框架”是指该链的框架区。该术语在应用到每条链时涵盖所有的框架区。
本文所用的“人源化抗体”是指具有参照抗体的结合特异性(即，与参照抗体的CDR区基本相同的CDR区，所述参照抗体通常为小鼠单克隆抗体)的抗体。更具体而言，根据本发明，参照抗体可以是重链可变区和轻链可变区分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的单克隆小鼠抗肽-6抗体。本文所用的“人源化抗体”结合与参照抗体的表位相同的表位，并且通常具有至少25%的结合亲和力。实施例2描述了示例性的结合亲和力测定(图7)。确定抗体是否结合相同表位的方法在本领域中是公知的，参见例如Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,1999，其公开了表位定位技术或替代性的竞争实验技术，用来确定抗体是否结合与参照抗体的表位相同的表位。
如上文指出的，根据某些实施方式，本发明提供人源化抗肽-6抗体及其任何抗原结合片段。术语“抗原结合片段”是指保留了与抗原的结合的任何抗体部分。抗体的功能性片段的实例包括但不限于：完整抗体分子，诸如Fv、单链Fv(scFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab、F(ab)2'及其任意组合等抗体片段，或免疫球蛋白肽的能够结合靶抗原的任何其他功能部分。本领域技术人员会认识到，各种抗体片段可以通过多种方法来获得，例如，用诸如胃蛋白酶等酶来消化完整抗体，或从新合成。经常使用化学手段或使用重组DNA方法来从新合成抗体片段。因此，本文所用的术语“抗体”包括通过修饰整个抗体而产生的抗体片段或使用重组DNA方法从新合成的那些片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库而鉴定出的那些片段。术语“抗体”还包括二价分子、微型双功能抗体(diabody)、微型三功能抗体(triabody)和微型四功能抗体(tetrabody)。
述及“VH”或“VH”时指的是免疫球蛋白的重链可变区，包括Fv、scFV、二硫键稳定化的Fv(dsFv)或Fab。述及“VL”或“VL”时指的是免疫球蛋白的轻链可变区，包括Fv、scFV、dsFv或Fab。
更具体而言，术语“单链Fv”或“scFv”是指其中传统双链抗体的重链和轻链的可变区域已结合起来形成了一条链的抗体。通常，将连接肽插到两条链之间以使可变结构域稳定，而不干扰活性结合部位的正确折叠和形成。本发明的单链人源化抗体，例如人源化抗肽-6抗体，可以作为单体来进行结合。其他示例性单链抗体可以形成微型双功能抗体、微型三功能抗体和微型四功能抗体。
另外，本发明的人源化抗体，例如人源化肽-6抗体，还可以形成“重构”抗体或抗体片段(例如，Fab、Fab'单体、F(ab)2二聚体或整个免疫球蛋白分子)的一种成分。应注意本发明的人源化抗体还可以包含人Fc区。
根据某些实施方式，本发明提供特异性地识别多肽SEQ ID NO:15(肽-6)或包含所述肽-6的任何序列(例如序列SEQ ID NO:98)的人源化抗体。在某些实施方式中，本发明的人源化抗体还可以识别含有SEQ IDNO:15的片段的序列。此类片段的非限制性实例由SEQ ID NO:101(命名为肽-7)表示。
因此应注意的是，当述及表位时，术语“结合特异性”、“特异性地与抗原结合”、“对……具有特异免疫反应性”、“特异性地针对”或“特异性地识别”是描述结合反应，该结合反应可用来确定在异源蛋白群体或其他生物分子中存在该表位。因此，在指定的免疫测定条件下，特异性的抗体与特定表位的结合至少为背景的两倍，且更常见为背景的10倍～100倍。可以使用多种免疫测定规程来选择对特定蛋白或碳水化合物有特异免疫反应性的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择对蛋白或碳水化合物有特异免疫反应性的抗体。术语“表位”意思是指任何分子的能够被抗体结合且还能够被该抗体识别的部分。表位或“抗原决定簇”通常由诸如氨基酸或糖侧链等具有化学活性的表面分子基团构成，并且具有特定的三维结构特性和特定的电荷特性。
如上文指出的，在某些实施方式中，本发明提供分离且纯化的人源化抗体。在述及抗体或编码抗体的核酸分子时，本文中所用的“分离的”或“基本纯化的”意为已将所述抗体或核酸从其天然环境中移出或已改变了其天然状态。因此“分离的”不必反映该抗体或核酸分子的纯化程度。然而应理解的是，已纯化至某种程度的抗体或核酸分子是“分离的”。如果该抗体或核酸分子在天然环境中并不存在，即它并不存在于自然界中，则不论该分子出现在何处它都是“分离的”。举例而言，并不天然存在于人体中的人源化抗体即使在其出现在人体中时也是“分离的”。
此外，术语“分离的”或“基本纯化的”在应用于核酸或蛋白时是表示该核酸或蛋白基本不含其在自然状态下所联结的其他细胞组分。其优选为同质态，但也可以在速干剂(dry solution)或水溶液中。通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术来确定纯度和同质性。作为存在于制备物中的最占优势物种(species)的蛋白是基本纯化的。
如图4和表3所示，本发明的人源化抗体的可变区是由源自不同的人抗体的不同区段构成的，这些区段经组合而产生了本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区。因此，在某些实施方式中，所述人源化抗体的重链可变区和轻链可变区是由至少两个或更多个人抗体的至少两个或更多个区段构成的，这些区段产生了完全由人源的区段组成的人源化抗体。应注意的是，这些区段既不是完整的CDR也不是框架区。
在本发明的背景下，术语“区段”是指见于抗体分子内的邻近氨基酸序列，此类区段的尺寸为2～125个氨基酸长、优选为2～31个氨基酸长，但此类区段既不是完整的CDR也不是完整的框架区。如图4所示，本发明的人源化抗体将通常在该人源化抗体的可变区内组合两个以上的来自不同的人抗体的氨基酸序列区段。特别而言，本发明涉及人源化抗体的重链可变区和轻链可变区(分别为VH和VL)，其中每个VH和VL都完全是由来自两个以上人抗体可变区的序列的区段组成，且其中每个组合得到的VH和VL通常都包含人可变区序列位置的区段，所述位置对应于这些区段在作为来源的人抗体的VH和VL中的位置，例如，组合得到的VH序列中的氨基酸1～10将会来自人抗体中的氨基酸1～10。作为另一选择，本发明的人源化抗体中的人VH或VL序列的区段可以位于任何序列位置，而不考虑在作为来源的人抗体的VH或VL中的序列位置。作为来源的人抗体的VH或VL将是任何已有的人抗体可变(V)区氨基酸序列，例如在人单克隆抗体V区序列数据库中提供的那些序列，并且可以包括来自非种系的带有V区体细胞突变和其他变异的亲和力成熟的抗体的序列、来自种系V区的序列、来自从该物种的抗体(例如具有一组固定的V区框架但具有可变的CDR的抗体)的序列区段产生的人工构建的抗体V区的序列、从人抗体文库(例如噬菌体展示文库)中选出的序列和来自源于表达编码人抗体或抗体片段的基因的转基因动物的人抗体的序列。
更具体地，如图4和表3所示，根据一个实施方式，本发明的人源化抗体的重链可变区可以包含：
a)框架区1(FR1)，所述框架区1包含：区段SEQ ID NO:12和区段SEQ ID NO:13或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:40和区段SEQ ID NO:13或其任意部分的氨基酸序列；
b)互补决定区1(CDR1)，所述互补决定区1包含：区段SEQ ID NO:13或其任意部分和区段SEQ ID NO:14或其任意部分的氨基酸序列；
c)FR2，所述FR2包含：区段SEQ ID NO:16、区段SEQ ID NO:14和区段SEQ IDNO:17或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:41、区段SEQ ID NO:14和区段SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:41、区段SEQ ID NO:14和区段SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
d)CDR2，所述CDR2包含：区段SEQ ID NO:18和区段SEQ ID NO:19或其任意部分的氨基酸序列；
c)FR3，所述FR3包含：区段SEQ ID NO:34、区段SEQ ID NO:19、区段SEQ IDNO:35和区段SEQ ID NO:36或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:43、区段SEQ ID NO:19和区段SEQ ID NO:36或其任意部分的氨基酸序列；
f)CDR3，所述CDR3包含：区段SEQ ID NO:36或其任意部分、区段SEQ ID NO:37和区段SEQ ID NO:38或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:36或其任意部分、区段SEQ ID NO:37和区段SEQ ID NO:42或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:36或其任意部分、区段SEQ ID NO:96和区段SEQ ID NO:42或其任意部分的氨基酸序列；和
g)FR4，所述FR4包含：区段SEQ ID NO:38或其任意部分和区段SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:42或其任意部分的氨基酸序列；
应注意的是，所述重链可变区在选自由H10、H11、H12、H13、H15、H19、H41、H49、H74、H75、H79、H81、H82、H82A、H82C、H84、H85和H108组成的组的至少一个位置上包含置换，其中，这些位置是根据Kabat编号系统确定的。
根据另一个实施方式，图4和表3所示的所述复合抗体的轻链可变区包含：
a)FR1，所述FR1包含：区段SEQ ID NO:45、区段SEQ ID NO:46和区段SEQ IDNO:47或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:45、区段SEQ ID NO:57和区段SEQ ID NO:47或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:45和区段SEQ IDNO:97或其任意部分的氨基酸序列；
b)CDR1，所述CDR1包含：区段SEQ ID NO:47或其任意部分、区段SEQ IDNO:48和区段SEQ ID NO:49或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:97或其任意部分、区段SEQ ID NO:48和区段SEQ ID NO:49或其任意部分的氨基酸序列；
c)FR2，所述FR2包含：区段SEQ ID NO:49或其任意部分、SEQ ID NO:50或其任意部分和区段SEQ ID NO:51或其任意部分的氨基酸序列；
d)CDR2，所述CDR2包含：区段SEQ ID NO:50或其任意部分、SEQ ID NO:51或其任意部分和区段SEQ ID NO:52或其任意部分的氨基酸序列；
e)FR3，所述FR3包含：区段SEQ ID NO:52或其任意部分、区段SEQ ID NO:53或其任意部分、区段SEQ ID NO:54或其任意部分和区段SEQ ID NO:55或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ ID NO:52或其任意部分、区段SEQ ID NO:58或其任意部分和区段SEQ ID NO:59或其任意部分的氨基酸序列；
f)CDR3，所述CDR3包含：区段SEQ ID NO:54或其任意部分、区段SEQ ID NO:55或其任意部分和区段SEQ ID NO:56或其任意部分的氨基酸序列，或区段SEQ IDNO:58或其任意部分、区段SEQ ID NO:59或其任意部分和区段SEQ ID NO:56或其任意部分的氨基酸序列；和
g)FR4，所述FR4包含：区段SEQ ID NO:56或其任意部分的氨基酸序列。根据另一个实施方式，所述轻链可变区在选自由L10、L11、L13、L15、L19、L21、L22、L42、L43、L60、L70、L72、L78、L79、L80、L83和L100组成的组的至少一个位置上可以包含置换，其中，这些位置是根据Kabat编号系统确定的。
应认识到的是，根据某些实施方式，本发明的人源化抗体是通过将表3所公开的多个人VH和VL序列区段以在最终的人源化抗体V区中限制或避免了人T细胞表位的组合方式组合而构建成的。T细胞表位的消除降低了组合人源化抗体的免疫原性。
此处所述的人T细胞表位是指能够结合人MHC II类分子并通过呈递至CD4T细胞来诱导辅助T细胞应答的氨基酸序列。能够选择在最终的人源化抗体中限制或避免T细胞表位的人VH和VL序列区段及区段组合。这能够通过以下方式来实现：使用不含T细胞表位的区段，例如来自人种系序列的区段，并且例如通过在两个区段的接合处产生非MHC结合序列、通过产生另一人种系序列或通过产生虽然是非种系序列但不诱导辅助T细胞应答的序列，来将相邻的区段接合起来以产生不含T细胞表位的新序列。
因此，根据一个实施方式，本发明的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区都不具有人T细胞表位。更具体而言，当将所有人区段组合起来以产生最终的本发明的人源化抗体时，除去了全部可能的T细胞表位中的约70%～99%、75%～99%、80%～99%、85%～99%、具体为90%～99%、更具体为91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
术语“免疫原性”是指抗体或抗原结合片段在施用到接收者时引发免疫应答(体液应答或细胞应答)的能力，包括例如HAMA(人抗小鼠抗体)应答。HAMA应答是在受试对象的T细胞对所施用的抗体产生免疫应答时启动的。该T细胞随后募集B细胞来产生特异性的“抗抗体”抗体。
如上文指出的，本发明的人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。重链可变区和轻链可变区都是由人源的组合区段构成的。根据一个具体实施方式，人源化轻链包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，这三个互补决定区具有的氨基酸序列基本上与参照小鼠抗肽-6抗体的对应互补决定区具有至少约60%～95%的同一性。根据一个具体实施方式，参照小鼠抗肽-6抗体的重链可变区和轻链可变区分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
在另一个具体实施方式中，本发明的人源化抗体的重链可变区包含参照小鼠可变区的SEQ ID NO:1中示出的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含参照小鼠可变区的SEQ ID NO:2中示出的CDR1、CDR2和CDR3。
因此，在具体实施方式中，本发明的人源化抗体可以包含：
(a)与参照小鼠抗体的SEQ ID NO:1具有至少约70%同一性的重链可变区；和(b)与参照小鼠抗体的SEQ ID NO:2具有至少约70%同一性的轻链可变区。更具体而言，本发明的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区分别与参照小鼠的重链可变区和轻链可变区SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2具有约70%～85%同一性。更特别的是，该氨基酸序列同一性可以是至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%或85%。
就两条或更多条核酸序列或多肽序列而言，术语“同一”、“基本同一性”、“基本同源性”或“百分比同一性”是指两条或更多条序列或子序列，在按下述缺省参数使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法后或者在通过手动比对和目视检查进行测量后，这些序列或子序列相同或具有规定百分比的相同氨基酸残基或相同核苷酸(即，当为获得最大对应而在比较窗口或指定区域上进行比较或比对时，在特定区域(例如，氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)上的同一性约为60%，优选为65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)。随后称这些序列为“基本同一”的。此定义还指或可以适用于测试序列的互补序列。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有置换的序列。如下文所述，优选的算法可以考虑空位等。优选的是，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选在长度为50～100个氨基酸或核苷酸的区域上。
对于序列比较，通常由一条序列充当参照序列，并将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机，如有必要则指定子序列配位，并指定序列算法程序参数。优选的是，可以使用缺省的程序参数，或者可以指定替代性的参数。随后，序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。
此外，本发明的人源化抗体可以包含的重链可变区与参照小鼠重链可变区SEQID NO:1具有至少约30%～70%同一性，更具体而言，与参照小鼠重链可变区SEQ IDNO:1具有至少约40%、50%、60%、65%或70%同一性。在一个具体实施方式中，本发明的人源化抗体可以包含的重链可变区与参照小鼠重链可变区SEQ ID NO:1具有至少约70%同一性，并且在选自由H10、H11、H12、H13、H15、H19、H41、H49、H74、H75、H79、H81、H82、H82A、H82C、H84、H85和H108组成的组的至少一个位置上具有置换。本发明的人源化抗体可以包含的轻链可变区与参照小鼠重链可变区SEQ ID NO:2具有至少约70%同一性，并且在选自由L10、L11、L13、L15、L19、L21、L22、L42、L43、L60、L70、L72、L78、L79、L80、L83和L100组成的组的至少一个位置上具有置换。如上文之前指出的，所有指出的位置都是根据Kabat编号系统来确定的。
在一个实施方式中，与结合肽-6(SEQ ID NO:15)或包含氨基酸序列SEQ IDNO:15的任何肽(例如，SEQ ID NO:98的肽)或含有SEQ ID NO:15的片段的肽(例如，SEQ ID NO:101所表示的序列)的小鼠参照抗体或亲本抗体相比，抗肽-6人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区具有18个以下·氨基酸置换。在另一个实施方式中，与参照小鼠抗肽-6抗体相比，抗肽-6人源化抗体的重链可变区和轻链可变区在所指定的位置上具有17个以下、16个以下、15个以下、14个以下、13个以下、12个以下、11个以下、10个以下、9个以下、8个以下或7个以下氨基酸置换。在一个实施方式中，与具有的重链可变区和轻链可变区分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的参照小鼠抗肽-6抗体相比，抗肽-6人源化抗体的重链可变区或轻链可变区具体在上文指出的位置上具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少13个氨基酸置换。
对于氨基酸序列而言，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的单个的置换、缺失或添加是“保守性修饰的变体”，其会在编码序列中改变、添加或删除单个氨基酸或一小部分氨基酸，其中改变的结果是将一个氨基酸用化学上相似的氨基酸进行置换。提供在功能上相似的氨基酸的保守性置换表在本领域中是公知的。此类经保守性修饰的变体是本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充且并不排除这些多态变体、种间同源物和等位基因。
例如，可以进行将脂肪族氨基酸(G、A、I、L或V)置换为该组另一成员的置换，或进行例如用一个极性残基置换另一个的置换，例如用精氨酸置换赖氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸或用谷氨酰胺置换天冬酰胺。以下8组中的每一组都含有彼此为保守性置换物的其他示例性氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8）半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)。
根据一个特定实施方式，本发明的人源化抗体包含：
(a)SEQ ID NO:1所示的重链可变区，不同之处在于：H10是Ala，H11是Ile或Leu，H12是Val，H13是Lys，H15是Thr，H19是Thr，H41是Ser或Ala，H49是Leu或Ala，H74是Tyr或Ser，H75是Lys，H79是Val，H81是Thr，H82是Met，H82A是Thr，H82C是Met，H84是Pro，H85是Val，且H108是Ser或Leu；和
(b)SEQ ID NO:2所示的轻链可变区，不同之处在于：L10是Ile或Thr，L11是Leu，L13是Leu，L15是Pro，L19是Ala，L21是Met或Leu，L22是Ser，L42是Lys，L43是Ala，L60是Ser，L70是Asp，L72是Thr，L78是Leu，L79是Gln，L80是Ala或Pro，L83是Phe，且L100是Gln。这些位置是根据Kabat编号系统来确定的。
更具体而言，本发明提供的人源化抗体包含：
(a)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20中的任何一个或者它们的任何变体的氨基酸序列。所述变体可以在选自由H10、H11、H12、H13、H15、H19、H41、H49、H74、H75、H79、H81、H82、H82A、H82C、H84、H85和H108组成的组的至少一个位置上包含置换；和
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25中的任何一个或者它们的任何变体的氨基酸序列。所述变体可以在选自由L10、L11、L13、L15、L19、L21、L22、L42、L43、L60、L70、L72、L78、L79、L80、L83和L100(根据Kabat编号系统)组成的组的至少一个位置上可以包含置换。
本发明的人源化抗体的变体与目的蛋白在氨基酸水平上可以具有至少80%，经常为至少85%、90%或至少95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性，例如本发明的人源化抗肽-6抗体的各种变体。
如上所述，术语“变体”能够应用于氨基酸序列和核酸序列。对于特定的核酸序列，优选保守性修饰的变体。这些变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸序列，或者如果核酸不编码氨基酸序列，则指基本相同的核酸序列。由于遗传密码具有简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定为丙氨酸的所有位置上，可以将该密码子变更为所描述的任何对应密码子而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，为保守性修饰变异中的一种。本文中编码多肽的所有核酸序列还描述该核酸的所有可能的沉默变异。技术人员将认识到，可以对核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子)进行修改来产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个所描述的序列中。
应意识到的是，基于氨基酸对CDR构象和/或与肽-6抗原的结合的可能影响，来选择用于进行置换的氨基酸。对这些可能的影响的研究是通过建模来检查特定位置的氨基酸的特性或对特定氨酸的置换或诱变的影响进行经验观察。
通常，人源化抗体中的CDR区与小鼠参照抗体中的对应CDR区基本相同，或更通常地，二者相同。虽然不经常需要，但有时可以对CDR残基进行一个或多个保守性氨基酸置换而不明显影响所得到的人源化免疫球蛋白的结合亲和力。偶尔，CDR区中的置换能够增强结合亲和力。
在一个特定实施方式中，本发明涉及具有选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:20组成的组的重链可变区的人源化抗体。根据另一个具体实施方式，所述人源化抗体的轻链可变区可以选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组。
在各种实施方式中，本文提出的人源化抗肽-6抗体包含的重链可变区具有：SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或与SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:20具有60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上序列同一性的氨基酸序列。在所述抗体包含的重链可变区具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:20具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上序列同一性的一些实施方式中，一个、多个或全部氨基酸差异为保守性置换。
在一些实施方式中，本文提出的抗肽-6抗体包含的轻链可变区具有：SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:25具有60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上序列同一性的氨基酸序列。在所述抗体包含的轻链可变区具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上序列同一性的一些实施方式中，一个、多个或全部氨基酸差异为保守性置换。当然，本文还涉及这些重链和轻链氨基酸序列的任何可能的组合。
因此，在一个实施方式中，本发明提供一种人源化抗体，所述人源化抗体具有重链可变区SEQ ID NO:21，可以选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组中的轻链可变区。
根据一个具体实施方式，本发明的人源化抗体具有重链可变区SEQ ID NO:21和轻链可变区SEQ ID NO:26。将该人源化抗体变体命名为VH2/VK3。
在另一个具体实施方式中，本发明的人源化抗体包含重链可变区SEQ ID NO:21和轻链可变区SEQ ID NO:25。将该人源化抗体命名为VH2/VK2。
在另一个具体实施方式中，本发明的人源化抗体包含重链可变区SEQ ID NO:21和轻链可变区SEQ ID NO:24。将该变体命名为VH2/VK1。
在又一个实施方式中，本发明提供一种人源化抗体，所述人源化抗体具有重链可变区SEQ ID NO:22和可以选自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的组中的轻链可变区。
根据一个具体实施方式，本发明的人源化抗体可以包含重链可变区SEQ IDNO:22和轻链可变区可以是SEQ ID NO:25。将该人源化抗体变体命名为VH3/VK2。
本发明的其他实施方式提供以下人源化抗体：重链可变区为SEQ ID NO:22且轻链可变区为SEQ ID NO:24人源化抗体(VH3/VK1)，重链可变区为SEQ ID NO:22且轻链可变区为SEQ ID NO:26人源化抗体(VH3/VK3)，重链可变区为SEQ ID NO:23且轻链可变区为SEQ ID NO:24人源化抗体(VH4/VK1)，重链可变区为SEQ ID NO:23且轻链可变区为SEQ ID NO:25人源化抗体(VH4/VK2)，重链可变区为SEQ ID NO:23且轻链可变区为SEQ ID NO:26人源化抗体(VH4/VK3)，重链可变区为SEQ ID NO:20且轻链可变区为SEQ ID NO:24人源化抗体(VH1/VK1)，重链可变区为SEQ ID NO:20且轻链可变区为SEQ ID NO:25人源化抗体(VH1/VK2)，和重链可变区为SEQ IDNO:20且轻链可变区为SEQ ID NO:26人源化抗体(VH1/VK3)。
如本文之前所公开的，根据具体实施方式，本发明的人源化抗体在包含下述重链可变区和轻链可变区时特别适合用于诱导IL-10，所述重链可变区是SEQ ID NO:1所示的重链可变区，不同之处在于：H10是Ala，H11是Ile或Leu，H12是Val，H13是Lys，H15是Thr，H19是Thr，H41是Ser或Ala，H49是Leu或Ala，H74是Tyr或Ser，H75是Lys，H79是Val，H81是Thr，H82是Met，H82A是Thr，H82C是Met，H84是Pro，H85是Val，且H108是Ser或Leu，即，由SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:20分别表示的重链变体H2、H3、H4和H1中的任一个所展示的重链可变区；所述轻链可变区是SEQ ID NO:2所示的轻链可变区，不同之处在于：L10是Ile或Thr，L11是Leu，L13是Leu，L15是Pro，L19是Ala，L21是Met或Leu，L22是Ser，L42是Lys，L43是Ala，L60是Ser，L70是Asp，L72是Thr，L78是Leu，L79是Gln，L80是Ala或Pro，L83是Phe，且L100是Gln，即，由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:24分别表示的轻链变体K3、K2和K1中的任一个所展示的轻链可变区。应注意的是，这些位置是根据Kabat编号系统来确定的。
如以下实施例、特别是比较性的图7、图14和图15所示，上述置换中的每一个都是重要的，并且可以有助于不同变体对肽-6的结合亲和力，或可以通过不同变体的诱导IL-10表达的能力反映。
更具体而言，如图7所示，由VH2重链构成的变体显示出最佳的肽-6结合亲和力，然而VH1变体显示出最低的结合亲和力。因此，根据某些实施方式，如变体VH2所示，残基H11的优选置换物可以是Leu。在另一个实施方式中，如变体VH1所示，残基H41的优选置换物是Ala，H74的优选置换物可以是Tyr，H108的优选置换物可以是Leu。图15B示出，变体VH2/VK3展现出最佳亲和力，而变体VH3/VK2则显示出明显下降的亲和力。与在H3中将残基H74置换为Ser相比，在H2中将残基H74置换为Tyr看上去很重要。带有不同轻链的各种组合还可以造成差异化的结合亲和力，例如，变体VH2/VK3显示出比VH2/VK2更佳的结合亲和力。两种变体的轻链之间的唯一区别在于：在含有VK2的变体中，将L21置换成了Met，而在优选的变体VK3中，将L21置换成了Leu。VH2/VK1组合显示出最低的亲和力，因此可以表明，轻链中的置换的优选组合可以是L10Thr、L21Leu和L80Pro。
如图15所示，不同的变体与肽-6的结合并不与IL-10诱导直接相关。因此，重链和轻链中的不同置换组合可以反映在变体的诱导IL-10表达的不同能力上。例如，如图15A和15B所示，VH2/VK3变体显示出最佳的IL-10诱导。在对不同的重链进行比较时，含有VH2的变体优于VH3变体。二者之间的唯一区别在于：在VH2变体中位于位置H74上的是Tyr残基，而在变体VH3中，H74上为Ser。应注意的是，在功能上，带有不同的VK变体的组合也反映在了IL-10诱导中。例如，与变体VH2/VK2相比，VH2/VK3变体显示出明显更高的对IL-10的诱导。两种变体之间的唯一区别在于：轻链有一个残基不同。在VK3变体中，位置L21上是Leu，而相比之下，在有效性较低的含VK2的变体中，此处为Met。这些结果表明，甚至一个置换都可能具有显著的功能影响。
因此，在某些实施方式中，应注意的是，可以将H11置换为Ile和Leu中的任何一个，对于结合肽-6而言，优选Leu，对于诱导IL-10表达而言，优选Leu；可以将H41置换为Ser和Ala中的任何一个，对于结合肽-6而言，优选Ala，对于诱导IL-10表达而言，优选Ala；可以将H49置换为Leu和Ala中的任何一个，对于结合肽-6而言，优选Leu，对于诱导IL-10表达而言，优选Leu；可以将H74置换为Tyr和Ser中的任何一个，对于结合肽-6而言，优选Tyr，对于诱导IL-10表达而言，优选Tyr；可以将H108置换为Leu和Ser中的任何一个，对于结合肽-6而言，优选Leu，对于诱导IL-10表达而言，优选Leu；可以将L10置换为Ile和Thr中的任何一个，对于结合肽-6而言，优选Thr，对于诱导IL-10表达而言，优选Thr；可以将L21置换为Met和Leu中的任何一个，对于结合肽-6而言，优选Leu，对于诱导IL-10表达而言，优选Leu；可以将L80置换为Pro和Ala中的任何一个，对于结合肽-6而言，优选Pro，对于诱导IL-10表达而言，优选Pro。
还考虑上述置换的所有组合，包括：含有H11Leu、H41Ala、H49Ala、H74Ser和H108Leu的经置换重链，和含有L10Thr、L21Leu和L80Pro的经置换轻链；含有H11Leu、H41Ala、H49Ala、H74Ser和H108Leu的经置换重链，和含有L10Thr、L21Met和L80Pro的经置换轻链；含有H11Leu、H41Ala、H49Ala、H74Ser和H108Leu的经置换重链，和含有L10Ile、L21Met和L80Ala的经置换轻链；含有H11Leu、H41Ala、H49Leu、H74Tyr和H108Leu的经置换的重链，和含有L10Thr、L21Leu和L80Pro的经置换轻链；含有H11Leu、H41Ala、H49Leu、H74Tyr和H108Leu的经置换重链，和含有L10Thr、L21Met和L80Pro的经置换轻链；含有H11Leu、H41Ala、H49Leu、H74Tyr和H108Leu的经置换重链，和含有经L10Ile、L21Met和L80Ala的置换轻链；含有H11Ile、H41Ser、H49Leu、H74Tyr和H108Ser的经置换重链，和含有L10Thr、L21Leu和L80Pro的经置换轻链；含有H11Ile、H41Ser、H49Leu、H74Tyr和H108Ser的经置换重链，和含有L10Thr、L21Met和L80Pro的经置换轻链；含有H11Ile、H41Ser、H49Leu、H74Tyr和H108Ser的经置换重链，和含有L10Ile、L21Met和L80Ala的经置换轻链；含有H11Leu、H41Ala、H49Leu、H74Ser和H108Leu的经置换重链，和含有L10Thr、L21Met和L80Pro的经置换轻链；含有H11Leu、H41Ala、H49Leu、H74Ser和H108Leu的经置换重链，和含有L10Ile、L21Met和L80Ala的经置换轻链；和最优选的，含有H11Leu、H41Ala、H49Leu、H74Ser和H108Leu的经置换重链，和含有L10Thr、L21Leu和L80Pro的经置换轻链。
不应忽视的是，还考虑其中一些上述置换出现而另一些不出现的部分置换。
应意识到的是，本发明的人源化抗体包括具有所有恒定区类型的抗体(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)以及任何同型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。该人源化抗体可以包含来自多于一个类别或同型的序列。根据一个具体实施方式，本发明的抗体属于IgG1同型。
根据某些实施方式，本发明的人源化抗体可以显示出的针对其各自抗原(肽-6或包含肽-6的任何氨基酸序列，例如SEQ ID NO:98的肽)的特异性结合亲和力可以是至少105、106、107、108、109或1010M-1。该人源化抗体的结合亲和力的上下限通常在其所源自的参照小鼠抗体的结合亲和力的1/3～3倍范围内、1/5～5倍范围内或1/10～10倍范围内。
本发明的重链区和轻链区通常是使用重组DNA技术获得的。经常用来执行此操作的重组DNA方法对本领域的技术人员而言是公知的。通常，编码包含在本发明的组合人源化抗体内的不同区段的核酸序列是用PCR产生的，例如，利用重叠延伸。在此技术中，通常通过将所需序列并入寡核苷酸中并用PCR产生包含所需区段序列的一系列产物来将区段序列接合起来。随后，通常使用额外的PCR反应，可以将这些产物沿正确的方向接合起来，从而产生VH链和VL链。使用本领域技术人员公知的技术，可以将VL和VH DNA序列直接连接到一起，或通过编码连接肽的DNA序列连接到一起。这些技术包括PCR和诸如体外连接等技术。可以沿任一方向将VL和VH序列连接起来。
技术人员将意识到，利用为可变区提供的序列信息，可以使用本领域技术人员所公知的任意数量的其他方法来获得编码这些序列的核酸。因此，通过任何适合的方法制备编码Fv区的DNA，所述方法包括例如其他扩增技术，例如，连接酶链式反应(LCR)，转录扩增和自主序列复制，或对合适的序列的克隆和限制性切割。通过与互补序列杂交，或者通过以单链为模板用DNA聚合酶进行聚合，可以将该DNA转变为双链DNA。虽然可以化学合成整个单链Fv区，但优选的是合成大量更短的序列(约100～150个碱基)，随后，通常使用例如重叠延伸PCR来将这些序列拼接起来。
核酸的大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些是从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、从已测序的核酸或从公开的DNA序列得到的估计值。蛋白的大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出。蛋白的大小是从凝胶电泳、从已测序的蛋白、从推导出的氨基酸序列或从公开的蛋白序列估计得到的。
可以将本发明的抗体的VH和VL结构域直接连接起来，或者可以用连接物将它们隔开，以例如分别使轻链和重链的可变抗体结构域稳定。适合的连接物是本领域技术人员公知的，包括公知的GlyGlyGlyGlySer连接肽或其变体。
为了获得克隆基因或核酸(例如编码本发明的人源化抗体(例如人源化抗肽-6抗体)或其Fab片段的那些cDNA)的高水平表达，通常将编码抗体的核酸亚克隆到含有合适的引导转录的启动子和转录/翻译终止子的表达载体中，如果针对编码蛋白的核酸，所述表达载体还含有用于启动翻译的核糖体结合位点。适合的细菌启动子在本领域是公知的，并且在例如Sambrook等和Ausubel等中有所描述。用于表达蛋白的细菌表达系统可在例如大肠杆菌、杆菌属物种和沙门氏菌属中获得。此类表达系统的试剂盒可商购获得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域是公知的，并且也是可商购获得的。
通常，为了在细胞中高水平地表达蛋白(例如，本发明的VH或VK变体)，在构建要表达的核酸序列时，考虑了针对表达系统的优选密码子。因此，来自一种有机体(例如人或小鼠)的核酸可以经改造而包含表达系统的优选密码子。
用来指导异源核酸的表达的启动子视特定的应用而定。可选的是，启动子的位置与异源转录起始位点的距离大约等于其在天然环境中与转录起始位点的距离。然而，本领域中已知的是，能够在不丧失启动子功能的情况下容忍该距离上一些变化。
除了启动子之外，表达载体通常还含有转录单元或表达盒，所述转录单元或表达盒包含在宿主细胞中表达编码蛋白的核酸所需的全部附加元件。因此常见的表达盒包含：与编码待表达的蛋白的核酸序列可操作地连接的启动子，以及使转录物有效多腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止序列。通常，可以将编码蛋白的核酸序列连接到可切割的信号肽序列上，以促进已转化的细胞分泌所编码的蛋白。此类信号肽特别包括：来自组织纤溶酶原激活子、胰岛素和神经元生长因子以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信号肽，等等。表达盒的其他元件可以包括增强子，如果将基因组DNA用作结构基因，则还包括带有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除了启动子序列外，表达盒还应当包含位于结构基因下游的转录终止区，以提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因中获得，或者可以从其他基因中获得。
适合在特定宿主细胞中使用的表达控制序列通常是通过克隆该细胞中所表达的基因来获得的。据本文中的定义，常用的原核控制序列，包含用于启动转录的启动子和核糖体结合位点序列，并可选地带有操纵基因(operator)。此类常用的启动子为例如图2的载体中所示的CMV启动子、β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、tac启动子和源自λ的PL启动子及N-基因核糖体结合位点。具体的启动子系统对本发明来说并非至关重要，可以使用在原核生物中发挥功能的任何可获得的启动子。
用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域是公知的，并且也是可商购获得的。在酵母中，载体包括酵母整合质粒(如YIp5)和酵母复制质粒(YRp系列质粒)以及pGPD-2。包含来自真核生物病毒的调控元件的表达载体通常在真核表达载体中使用，例如，SV40载体、乳头瘤病毒载体和源自爱泼斯坦－巴尔二氏(Epstein-Barr)病毒的载体。其他示例性的真核载体包括使蛋白在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子(polyhedrin promoter)或显示出对真核细胞中的表达有效的其他启动子的指导下可以表达的载体。
一些表达系统具有提供基因扩增的标志物，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。作为另一选择，不涉及基因扩增的高产率表达系统同样是合适的，例如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，其具有在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子引导下的GPCR编码序列。
表达载体中常包含的元件还包括：在大肠杆菌中起作用的复制子，允许筛选出携带重组质粒的细菌的抗生素抗性编码基因，和使得可以插入真核序列的在质粒的非必需区中的独特限制性位点。所选的具体抗生素抗性基因并非至关重要，本领域中已知的多种抗性基因中的任何一种都是适合的。可选的是，如有必要，选择不会干扰真核细胞中的DNA复制的原核序列。
使用标准的转染方法来产生表达大量蛋白(特别是本发明的不同的人源化抗肽-6抗体变体)的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，随后使用标准技术将这些蛋白纯化。
可以使用将外来核苷酸序列导入宿主细胞的任何公知方法。这些方法包括对磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体的使用，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外来遗传物质导入宿主细胞的任何其他公知方法。唯一必要的是，所使用的特定基因工程方法能够成功地将至少一种基因导入能够表达本发明的多肽的宿主细胞中。
在将表达载体导入细胞后，在有利于蛋白表达的条件下培养已转染的细胞，并使用下文指出的标准技术从培养物中回收该蛋白。
技术人员会认识到，可以对编码本发明的人源化抗体变体的核酸进行修饰而不减小其生物活性。可以进行一些修饰来促进克隆、表达或将靶向分子并入融合蛋白中。此类修饰是本领域的技术人员公知的，并且包括例如：终止密码子，添加到氨基末端以提供起始位点的甲硫氨酸，设置在任一末端以产生方便定位的限制性位点的额外氨基酸，或辅助纯化步骤的额外氨基酸(例如聚His)。
一旦被表达，本发明的人源化抗体能够根据本领域的标准方法(包括硫酸铵沉淀、亲和柱和柱色谱法等)来纯化。优选同质性至少为约90%～95%的基本纯的组分，对于药物用途，最优选98%～99%以上的同质性。一旦被纯化(无论是部分纯化或纯化至所需同质性)，如果要实施治疗性应用，所述多肽应当基本不含内毒素。
通常，将来自大肠杆菌或其他细菌的功能性异源蛋白从包涵体中分离出，并需要使用强变性剂对该蛋白进行增溶化并进行后续的重折叠。在增溶步骤中，如本领域所公知的，必须存在还原剂来切断二硫键。具有还原剂的示例性缓冲液是：0.1M Tris pH8，6M胍，2mM EDTA，0.3M DTE(二硫赤藓醇)。二硫键的重新氧化可以在还原态和氧化态的低分子量硫醇试剂存在时出现。
复性通常是通过将变性的还原蛋白稀释(例如，100倍)到重折叠缓冲液中来实现的。示例性的缓冲液是0.1M Tris，pH 8.0，0.5M L-精氨酸，8mM氧化谷胱甘肽(GSSG)和2mM EDTA。
作为对双链抗体纯化操作规程的修改，对重链和轻链区单独进行增溶化和还原，随后合并到重折叠溶液中。当将这两种蛋白以一种蛋白相对于另一种蛋白不超过5倍摩尔过量的摩尔比混合时，得到了优选的产率。理想的是，在氧化还原转换(redox-shuffling)完成后，向重折叠溶液中添加过量的氧化谷胱甘肽或其他氧化性低分子量化合物。
除了重组方法外，还可以使用标准肽合成法来构造完整的或部分的本发明的抗体。长度小于约50个氨基酸的本发明的多肽的固相合成可以通过以下方法来实现：将该序列的C端氨基酸连接到不溶性支持物上，随后依次添加该序列中的其余氨基酸。
此外，用来筛选抗体以鉴定出所需抗体的技术可以影响所得到抗体的性质。可以获得多种不同的技术来测试抗体/抗原的相互作用，从而鉴定出特别需要的抗体。此类技术包括ELISA、表面等离子体共振结合测定(例如，Biacore结合测定，Bia-coreAB，Uppsala，瑞典)、夹心法测定(例如，顺磁珠系统，IGEN International,Inc.,Gaithersburg,Maryland)、蛋白质印迹、斑点印迹、酶联免疫斑点法、免疫沉淀测定和免疫组化。
还应该理解的是，本申请还提供并因此涵盖编码本文所述的抗体的重链和轻链的框架区和CDR的多核苷酸序列以及用于在哺乳动物细胞中有效表达这些多核苷酸序列的表达载体。更具体而言，本发明涵盖编码由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25中任一个表示的本发明的重链可变区变体和轻链可变区变体(具体为，VH1～VH4和VK1～VK3)的核酸序列。在一个特定实施方式中，这些核酸序列可以分别包含由SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32中的任一个表示的序列。本发明还提供：包含至少一个所述核酸序列及其任意组合的核酸构建体和表达载体，和用所述构建体转化或转染的表达至少一种所述VH和VK变体的宿主细胞。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。该术语涵盖了包含已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的或非天然存在的，它们的结合性质与参照核酸相似，并且以与参照核苷酸相似的方式进行代谢。这些类似物的实例包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。本领域的技术人员会认识到，核酸序列的互补序列能够容易地从另一条链的序列确定。因此，本文所述的任何特定的核酸序列还公开了互补链。
“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一种或多种氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。
“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及在功能上与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来受到修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指基本化学结构与天然存在的氨基酸相同的化合物，即，与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有经修饰的R基或经修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指结构与氨基酸的常见化学结构不同、但功能与天然存在的氨基酸相似的化合物。在本文中，氨基酸可以用其公知的三字母符号来指代，或者可以用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。
应意识到的是，在某些方面中，本申请提供杂交瘤细胞系，以及由这些杂交瘤细胞系产生的单克隆人源化抗体。所公开的细胞系还具有产生单克隆抗体以外的用途。例如，这些细胞系能够与其他细胞(例如，适当带有药物标志物的人骨髓瘤细胞、小鼠骨髓瘤细胞、人-小鼠异质骨髓瘤细胞或人成淋巴细胞样细胞)融合，从而产生其他杂交瘤，并因此用于转移编码单克隆抗体的基因。此外，这些细胞系能够用作编码抗肽-6人源化抗体的核酸的来源，所述抗体可以被分离和表达。
另外，对于下文描述的诊断和治疗应用，本发明的抗体可以可选地以共价或非共价方式连接到可检测标记或额外的治疗剂上。适合于此类应用的可检测标记包括可以通过光谱学手段、光化学手段、生物化学手段、免疫化学手段、电子手段、光学手段或化学手段检测的任何组分。本发明中可用的标记包括磁珠(例如DYNABEADS)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明和绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和常用于ELISA和竞争性ELISA及本领域其他相似方法中的其他酶)和比色标记(例如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠)。
检测这些标记的手段是本领域的技术人员公知的。因此，例如，可以使用照相胶片或闪烁计数器来检测放射性标记，可以使用用来检测所发射的光照的光检测器来检测荧光标志物。通常通过向酶提供底物并检测因该酶对该底物的作用而产生的反应产物来检测酶标记；通过简单地目视观察有色标记来检测比色标记。
本发明的另一方面涉及包含有效量的至少一种分离且纯化的人源化抗体作为活性成分的组合物，所述人源化抗体特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽，所述人源化抗体包含：
(a)重链可变区，所述重链可变区包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的Ile、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于H100位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于H101位的Asp和位于H102位的Tyr，且可选地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于H11位的Ile、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一个；和
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含位于L1位的Gln、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gln、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可选地包含位于L21位的Met、位于L10位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一个；其中，这些位置是根据Kabat编号系统来确定的。根据某些实施方式，本发明的组合物还可以可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
根据一个实施方式，本发明的组合物可以包含本发明所描述的任何人源化抗体中的至少一种或者其任意组合或片段来作为活性成分。在一个特定实施方式中，本发明的组合物可以包含：具有重链可变区SEQ ID NO:21和轻链可变区SEQ ID NO:26的至少一种人源化抗体(VH2/VK3)。
在另一个具体实施方式中，本发明的组合物可以包含：具有重链可变区SEQ IDNO:21和轻链可变区SEQ ID NO:24的至少一种人源化抗体(VH2/VK1)。
在又一个具体实施方式中，本发明的组合物可以包含：具有重链可变区SEQ IDNO:21和轻链可变区SEQ ID NO:25的至少一种人源化抗体(VH2/VK2)。
根据另一个具体实施方式，本发明的组合物可以包含：具有重链可变区SEQ IDNO:22和轻链可变区SEQ ID NO:25的至少一种人源化抗体(VH3/VK2)。
本发明的其他具体实施方式提供包含至少一种下述抗体的组合物：具有重链可变区SEQ ID NO:22和轻链可变区SEQ ID NO:24的人源化抗体(VH3/VK1)，具有重链可变区SEQ ID NO:22和轻链可变区SEQ ID NO:26的人源化抗体(VH3/VK3)，具有重链可变区SEQ ID NO:23和轻链可变区为SEQ ID NO:24的人源化抗体(VH4/VK1)，具有重链可变区SEQ ID NO:23和轻链可变区SEQ ID NO:25的人源化抗体(VH4/VK2)，具有重链可变区SEQ ID NO:23和轻链可变区SEQ ID NO:26人源化抗体(VH4/VK3)，具有重链可变区SEQ ID NO:20和轻链可变区SEQ ID NO:24人源化抗体(VH1/VK1)，具有重链可变区SEQ ID NO:20和轻链可变区SEQ ID NO:25人源化抗体(VH1/VK2)，以及具有重链可变区SEQ ID NO:20和轻链可变区SEQ ID NO:26的人源化抗体(VH1/VK3)。
本发明还提供用于预防、治疗、改善或抑制免疫相关病症的药物组合物。本发明的药物组合物包含治疗有效量的特异性地结合含有SEQ ID NO:15的多肽或含有SEQID NO:15的任何氨基酸序列(例如SEQ ID NO:98)的至少一种分离且纯化的人源化抗体作为活性成分。根据一个实施方式，本发明的组合物包含人源化抗体，所述人源化抗体包含：
(a)重链可变区，所述重链可变区包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的Ile、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于H100位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于H101位的Asp和位于H102位的Tyr，且可选地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于H11位的Ile、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一个；和
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含位于L1位的Gln、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gln、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可选地包含位于L21位的Met、位于L10位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一个。所有位置都是根据Kabat编号系统来确定的。还应当注意的是，本发明的组合物还可以可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
根据一个具体实施方式，本发明的药物组合物可以包含本发明所描述的任何人源化抗体中的至少一种或其任意组合来作为活性成分。
在一个具体实施方式中，本发明的药物组合物包含：具有重链可变区SEQ IDNO:21和轻链可变区SEQ ID NO:26的至少一种人源化抗体(VH2/VK3)，或其任意组合或混合。
本发明所呈现的结果清楚地展示了本发明的抗体对免疫相关病症的治疗潜力。因此，根据另一个实施方式，本发明的药物组合物可以特别适合用于治疗免疫相关病症，例如，自身免疫性病症或炎性病症。
如上文指出的，下文的实施例10～13使用两种不同的动物模型清楚地证明了本发明的人源化抗体在治疗已建立的炎性关节炎中的适用性。更具体而言，经AA诱导处理并随后用已本发明的抗肽-6人源化抗体(尤其是VH2/VK3变体)处理的Lewis大鼠显示出关节炎的显著下降。类似地，用抗肽-6人源化抗体对已诱导产生胶原诱导性关节炎(CIA)的DBA/1小鼠进行治疗，减轻了关节炎的严重程度。本发明还展示了对收集自类风湿性关节炎(RA)患者的PBMC以及来自健康个体的PBMC中的IL-10的离体诱导。因此，在特定实施方式中，本发明的人源化抗体诱导罹患免疫相关病症(例如，关节炎、IBD、结肠炎、克罗恩氏病和糖尿病)患者的PBMC分泌IL-10。例如，如实施例13所示，本发明的人源化抗体诱导收集自类风湿性关节炎患者的PBMC分泌IL-10。因此，根据特定实施方式，与未经处理的PBMC相比，本发明的人源化抗体诱导PBMC IL-10分泌增加到至少1.1倍、增加到至少1.2倍、增加到至少1.3倍、增加到至少1.4倍、增加到至少1.5倍、增加到至少1.6倍、增加到至少1.7倍、增加到至少1.8倍、增加到至少1.9倍或优选增加到至少2倍。此外，如实施例所示，与未处理的对照中的疾病评分相比，用本发明的抗体对已建立的关节炎进行的治疗可以使疾病评分降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或者甚至降低至少55%或60%或更多。
此外，如Berent,J.等(Berent,J.等，Springer Semin.Immunopathol.25:7-63(2003))所指出的，佐剂性关节炎(AA)是类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎(JIA)和脓毒性关节炎的成熟确立的动物模型。此外，不同的出版物(分别为Myers等，LifeSciences 61(19):1861-1878(1997)和Brand等，Springer Semin Immunopathol(2003)25:3-18(2003))清楚地指出胶原诱导性关节炎(CIA)也是RA及其他自身免疫病、风湿病和炎症的确立模型。
应了解的是，存在不同形式的关节炎，通常可以将其分为两大类：炎性关节炎和退化性关节炎，每一类都具有不同的起因。因此，根据一个具体实施方式，可以将本发明的药物组合物特定地设计用于治疗和/或改善炎性病症，例如，炎性关节炎。
炎性关节炎的特征为滑膜炎、骨质侵蚀、骨质减少、软组织肿胀和均一的关节间隙变窄。更具体而言，关节炎症的特点是滑膜炎和骨质侵蚀。后者在初期表现为白色薄软骨下骨板的局灶性中断。通常，甚至在严重骨质减少的情况下也能够看到该软骨下骨板，但该骨板的中断表明存在侵蚀。虽然在真正的骨质侵蚀前确实可以出现关节周骨质减少和局灶性软骨下骨质减少，但表明确定的关节炎症的却是骨质侵蚀的存在。随着骨质侵蚀的扩大，骨破坏延伸到骨髓腔内的骨小梁中。炎性关节炎的一个重要特征是边界性骨质侵蚀的概念。该术语是指位于发炎的滑液关节边界的骨质侵蚀。该特定部位表示位于关节内但未被透明软骨覆盖的关节部分。因此，早期关节炎症将在关节表面下的软骨下骨板受到侵蚀之前产生边界性侵蚀。在寻找骨质侵蚀时，关节的多个视图对描述各个骨表面而言是必不可少的。炎性关节进程的第二个重要特征是均一的关节间隙变窄。其出现原因是，对关节软骨的破坏在整个关节内空间是均一的。有关炎性关节疾病的第三个发现是软组织肿胀。
应认识到的是，还可以将炎性关节炎划分为几个子组，因此，后文所述的本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒可以适用于治疗不同子组的每种炎性关节炎病况。
更具体而言，单个关节受累表示存在脓毒性关节炎。脓毒性关节炎的起因通常与葡萄球菌或链球菌微生物所引起的血源性播散(hematogenous seeding)有关。脓毒性关节的放射照相特征涵盖了任何炎性关节炎的特征，即，关节周骨质减少、均一的关节间隙变窄、软组织肿胀和骨质侵蚀。并不是所有的发现都会同时存在，而且确切地讲，骨质侵蚀可能不明显。因此，根据一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善炎脓毒性关节炎。
相比之下，系统性关节炎的特征是多关节受累，并且包括两大类：类风湿性关节炎和血清阴性脊柱关节病。
根据一个实施方式，可以将本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒用于治疗和/或改善类风湿性关节炎。类风湿性关节炎(RA)是慢性的系统性自身免疫病症，最常见的是，其引起关节(关节炎)和腱鞘内的炎症和组织损伤，并引起贫血。其还可以在肺、心包、胸膜和眼巩膜中产生弥漫性炎症，而且还会引起最常见于皮下组织中的小节损伤(nodular lesion)。其可以是能够导致机能和行动能力大幅度丧失的令人失去能力和令人疼痛的病况。诸如类风湿因子和针对环瓜氨酸肽抗体等血清标志物是类风湿性关节炎的重要指示因子。类风湿性关节炎的放射照相特征涵盖了关节炎症的特征，且包括特别的骨质减少、均一的关节间隙减小、骨质侵蚀和软组织肿胀。由于炎症的慢性特点，诸如关节不全脱位和软骨下囊肿等其他发现也可能是明显的。
血清阴性脊柱关节病类包括银屑病关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎，其特征是炎性体征、多关节受累和带有附加的骨增殖特征的手足远端受累。因此，根据一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善血清阴性脊柱关节病类的任何病况。
更具体而言，根据一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于预防、治疗、改善或抑制炎银屑病关节炎。银屑病关节炎是以皮肤炎症(银屑病)和关节炎症(关节炎)为特征的慢性疾病。在美国接近306,000人患有银屑病关节炎，而且在欧洲的前5大市场另有308,000人据信患有此疾病。银屑病和关节炎经常单独出现。事实上，在几乎80%的患者中该皮肤疾病要早于关节炎。在最多15%的患者中，关节炎可以早于银屑病。
银屑病是银屑病关节炎的特点之一，是一种普通的皮肤病况，其特征为斑驳的、凸起的带有剥落的皮肤炎症红色区域。银屑病经常影响肘和膝的末端、头皮、脐和生殖器或肛门周围的区域。约10%的银屑病患者还发展有其关节的伴随炎症。通常，皮肤症状越严重，人就越可能发展银屑病关节炎。银屑病关节炎的起因未知，其可能是遗传、环境和免疫起因的组合。
雄性和雌性患银屑病的可能性相等。对于银屑病关节炎，雄性更可能具有脊椎炎形式(其中脊柱受到了影响)，而雌性更可能具有类风湿病形式(其中可能累及到许多关节)。银屑病关节炎通常在35～55岁的人中发展。然而，其可以在几乎任何年龄的人中发展。银屑病关节炎与若干其他关节炎病况有许多共同特征，例如强直性脊柱炎、反应性关节炎、克罗恩氏病相关的关节炎和溃疡性结肠炎。所有这些病况都能够在脊柱和关节中、在眼、皮肤、口和多种器官中引起炎症。
根据另一个实施方式，可以将本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒用于预防、治疗、改善或抑制强直性脊柱炎。强直性脊柱炎(AS，旧称Bechterew氏病、Bechterew综合征、Marie Strümpell病，是脊椎关节炎的一种形式)通常是关节炎的慢性和进行性形式，是由位于脊柱基部的脊柱面小关节和骶髂关节为特征的多个关节的炎症引起的。当强直性脊柱炎趋于影响这些关节和脊柱周围的软组织时，其他关节以及关节周围的组织也可能受到影响(肌腱末端病，其中腱和韧带吸附到骨上)。强直性脊柱炎还可能累及关节以外的身体区域，例如眼、心脏和肺。
该病症经常导致骨性关节强硬(或融合)，因此术语强直性脊椎炎是指关节的僵硬，该术语源自希腊语ankylos。Spondylos意为椎骨(或脊柱)，描述一个或多个椎骨的炎症。
该疾病据估算可影响约0.1%～0.2%的一般群体。强直性脊柱炎主要影响年轻雄性。雄性患强直性脊柱炎的可能性是雌性的4～10倍高。大多数具有该疾病的人在15～35岁时发展该疾病，在平均26岁时发作。
虽然确切原因未知，但据信强直性脊柱炎是由遗传影响和触发性环境因子的组合引起的。与一般群体中的7%相比，强直性脊柱炎患者中有约90%～95%具有组织抗原人白细胞抗原B27(HLA-B27)。患有强直性脊柱炎的人经常具有该疾病的家族史。
在另一个实施方式中，可以将本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒用于预防、治疗、改善或抑制反应性关节炎(ReA)。反应性关节炎是血清阴性脊柱关节病的另一种类型，是在响应身体另一部分的感染时发展的自身免疫性病况。与细菌接触并形成感染可以触发反应性关节炎。其症状与统称为“关节炎”的各种其他病况(例如风湿病)类似。其由另一种感染因起，因此是“反应性”的，即，依赖于另一种病况。在慢性病例中，该“触发”性感染经常得到了治愈或缓解，因此难以确定最初起因。
反应性关节炎的症状常常包括三种表面上无关联的症状的组合，即大关节的炎性关节炎、眼部炎症(结膜炎和葡萄膜炎)和尿道炎。应指出的是，ReA还称作Reiter氏综合征(以德国医师Hans Reiter命名)，还称作尿道性关节炎、性病性关节炎和肠多动脉炎(polyarteritis enterica)。
应认识到的是，存在很多其他形式的炎性关节炎，包括幼年特发性关节炎、痛风和假性痛风以及与结肠炎或银屑病相关的关节炎。因此应认识到的是，本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒也适用于这些病况。
因此，根据另一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于预防、治疗、改善或抑制幼年特发性关节炎(JIA)。JIA是儿童中持续性未分化关节炎的最常见形式(在此背景下，幼年是指16岁前的发作，特发性是指无确定起因的病况，关节炎是指关节的滑膜的炎症)。JIA是见于儿童时期的关节炎的亚类，其可以是短暂且自限的或者是慢性的。其明显有别于成人中常见的关节炎(类风湿性关节炎)和可以存在于儿童时期的作为慢性病况的其他类型的关节炎(例如，银屑病关节炎和强直性脊柱炎)。
根据另一个实施方式，可以将本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒用于治疗和/或改善痛风。痛风(代谢性关节炎)是由尿酸的积累产生的疾病。在此病况中，尿酸单钠或尿酸的晶体沉积在关节的关节软骨、腱和周边组织上。这些晶体引起炎症和疼痛，二者都是严重的。如果不进行治疗，这些晶体会形成痛风石(tophi)，其可以引起明显的组织损伤。假性通风是由钙晶体引起的病况。当钙晶体在腱中引起炎症发作时，称其为“钙化性肌腱炎”。本发明还提供用于治疗此病症的组合物和方法。
通常，如上文同样公开的，存在多种类型的关节炎，应注意的是，本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒还可以适用于治疗所指出的关节炎的所有原发性形式和关节炎的所有继发性形式。这些病况可以包括红斑狼疮、Henoch-紫癜、银屑病关节炎、反应性关节炎、血色病、肝炎、韦格纳肉芽肿病(及很多其他血管炎综合征)、莱姆病、家族性地中海热、带有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关的周期性综合征和炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)。
实施例14和15使用TNBS-结肠炎动物模型清楚地展示了人源化抗肽-6抗体的显著改善效果。因此，在另一个具体实施方式中，本发明的药物组合物以及方法、联合组合物和试剂盒可以适用于预防、治疗、改善或抑制炎性肠病(IBD)，具体为溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
根据具体实施方式，对结肠炎或克罗恩失病的治疗、预防或改进可以反映在对体重损失的抑制和对与该疾病相关的炎症应答的抑制以及总体显微组织学疾病评分的提高上。例如，与未处理的对照中的显微疾病评分相比，用本发明的人源化抗体进行的治疗可以使显微疾病评分降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或者甚至降低至少55%或60%或更多。此外，在另一个实施方式中，与未处理的对照中的体重损失相比，用本发明的人源化抗体进行的治疗可以使体重损失降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%或者甚至降低75%或更多。
炎性肠病(IBD)是常见的胃肠病症，可以将其理解为免疫应答的Th1-促炎亚型和Th2-抗炎亚型之间失衡的结果。IBD是结肠和小肠的一组炎性病况。IBD的主要类型是克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。IBD的其他形式只占很小一部分。这些是胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏综合征和未定型结肠炎，未定型结肠炎不能作出将克罗恩氏病和溃疡性结肠炎区分开的明确诊断。
克罗恩氏病和UC的主要区别是炎性变化的位置和特性。克罗恩氏病能够影响从口到肛门的任何胃肠道部分(跳跃性病变)，但是大部分情况是起始于回肠末端。相比之下，溃疡性结肠炎则局限在结肠和直肠。显微观察下，溃疡性结肠炎局限在粘膜处(肠的上皮层)，而克罗恩氏病影响整个肠壁。最终，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎与不同比例的肠外表现(例如肝问题、关节炎、皮肤表现和眼问题)一起出现。克罗恩氏病和溃疡性结肠炎具有相同的症状，例如腹泻、呕吐、体重损失、发热和腹痛。
最近的假说推断，IBD的可能起因是：因缺乏常规靶标(例如寄生虫和蠕虫)，过度活跃的免疫系统攻击各种消化道组织。随着由诸如蛔虫、钩虫和人的鞭虫等寄生虫引起的感染数量的减少，诊断有IBD的人的数量在增加，并且在常出现寄生虫感染的国家，该病况仍然很稀少。
存在若干种伴随IBD的肠外表现，例如：自身免疫现象；免疫复合物在目标器官损伤(target organ damage)中起作用；并且使用免疫抑制剂(例如糖皮质激素、硫唑嘌呤、氨甲喋呤和环孢霉素)来减轻该疾病。IBD患者具有针对结肠细胞组分和若干种不同的细菌抗原的抗体。这些抗原因上皮损伤而得以接触免疫系统。在这些患者中还已描述了T细胞介导的免疫性的异常，包括皮试无反应(cutaneous anergy)和对T细胞刺激的反应性减小。此外，确定了粘膜细胞介导的免疫性的变化，包括粘膜IgG细胞的浓度升高和T细胞亚群的变化，这暗示了抗原剌激。在感染性损伤、免疫损伤或毒性损伤后靶抗原的暴露导致粘膜免疫细胞的激活，该激活产生了引发粘膜炎性应答的细胞因子。促炎细胞因子(例如IFNγ)的分泌有助于提高粘膜渗透性，并且已在IBD的动物模型中有所描述。
可以将CD4和CD8淋巴细胞分型为产生IL-2和IFNγ的Th1细胞或产生IL-4或Il-10的Th2细胞。免疫系统应答外来或自身的抗原的方式是这两种应答亚型之间的平衡的结果。Th1型应答参与若干种自身免疫病症和慢性炎症病症(例如IBD)的发病机制。因此，可以将人类中的实验性结肠炎和IBD理解为促炎的Th1型细胞因子和抗炎的Th2型细胞因子之间的失衡。最近显示，在动物和人中，抗炎细胞因子(例如IL-10)能够使Th1介导的细胞因子的促炎效果下调，从而减轻免疫介导的病症。
通常，通过施用具有强抗炎效果的药物(例如泼尼松)来开始进行对IBD的治疗。一旦成功地控制了炎症，通常会使患者改用更温和的药物来使疾病保持在消退状态。如果不成功，可以施用免疫抑制药的组合。治疗的目的是为了实现消退，此后通常会使患者改用潜在副作用更少的更弱的药物。常常会出现原始症状的急性再现；这称作“突发(flare-up)”。根据环境，其可能自行消散或需要药物治疗。突发的间隔时间可以是从数周到数年的任何长度，并且患者之间的差异很大，少数患者从未经历过突发。通常使用类固醇来控制疾病突发，而且类固醇作为维持药物曾经是可接受的。诸如TNF抑制剂等生物试剂已在克罗恩氏病患者中使用了若干年，近来用在了溃疡性结肠炎患者中。严重的情况可能需要外科手术，例如肠切除、狭窄成形术或者临时或永久的结肠造口术或回肠造口术。
克罗恩氏病是炎性肠病(IBD)的一种类型。其为慢性病况，目前对其没有治愈方法。其特征为，在症状突发时周期性的改善，然后偶发(episode)。其能够影响消化道(亦称为从口到肛门的胃肠(GI)道)的任何区域，但最常见的是影响小肠的下部(称之为回肠)。肿胀延伸到受影响器官的内壁深处。肿胀可以引起疼痛，并且可以使肠频繁地清空，导致腹泻。克罗恩氏病可以根据其所影响的区域来进行分类。回结肠克罗恩氏病影响回肠(小肠的最末部分，与大肠连接)和大肠，并占病例的50%。克罗恩氏回肠炎仅影响回肠，占病例的30%；克罗恩氏结肠炎影响大肠，占累及小肠最末部分和大肠的克罗恩氏病的病例的剩余20%，而且可能特别难与溃疡性结肠炎区分开。胃十二指肠克罗恩氏病在胃和小肠的最前部分(即十二指肠)中引起炎症。空肠回肠炎在小肠的上半部(即空肠)中引起炎症斑块。还可以将克罗恩氏病称为回肠炎或肠炎。
腹痛可以是克罗恩氏病的初期症状。其通常伴有腹泻，由肠狭窄引起的症状也常见于克罗恩氏病中。腹痛通常在狭窄的肠区域最严重。
克罗恩氏病与很多其他慢性炎症疾病一样，能够引起各种全身性症状。在儿童中，生长不足较为常见。基于不能保持生长，许多儿童最先被诊断患有克罗恩氏病。除了全身性受累和胃肠受累以外，克罗恩氏病能够影响许多其他器官系统。眼内部的炎症，即葡萄膜炎，能够引起眼痛，特别是在暴露于光时(畏光)。炎症还可能累及眼白部分(巩膜)，即一种被称为巩膜外层炎的病况。如不治疗，巩膜外层炎和葡萄膜炎均能够导致失明。
克罗恩氏病与被称为血清阴性脊柱关节病的一种类型的风湿病有关。该组疾病的特征是一个或多个关节的炎症(关节炎)或肌止点的炎症(起止点炎)。关节炎能够影响更大的关节，例如膝或肩，或者可以仅累及手和足的小关节。关节炎还可以累及脊柱，导致强直性脊柱炎(如果整个脊柱受累)或只是骶髂关节炎(如果仅下部脊柱受累)。关节炎的症状包括疼痛、温热、肿胀、僵硬的关节，以及关节运动性或功能的丧失。
结肠镜检查术是对克罗恩氏病做出诊断的最佳测试，因为其使得可以对结肠和回肠末端进行直接目视观察，从而确定疾病累及模式。发现疾病的块状分布，且累及结肠或回肠但并不累及直肠，表明有克罗恩氏病。
目前，对克罗恩氏病没有治愈方法，且消退可能不会实现，或者如果实现也不会长久。对克罗恩氏病的治疗仅仅是在症状活跃时进行，并且包括先治疗急性问题，随后维持消退。
急性治疗使用药物来减少炎症(通常为氨基水杨酸盐抗炎剂和皮质类固醇)。当症状在消退状态时，治疗进入维持阶段，目的是避免症状的复发。长期使用皮质类固醇具有明显的副作用；所以通常并不将其用于长期治疗中。替代形式包括仅使用氨基水杨酸盐，但是仅有少数能够维持治疗，而很多都需要免疫抑制药。
用于治疗克罗恩氏病的症状的药物包括5-氨基水杨酸(5-ASA)制剂、泼尼松、免疫调节剂(例如硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氨甲喋呤、英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab)和那他珠单抗)。氢化可的松用于克罗恩氏病的严重发作。从20世纪90年代末开始，可以得到生物药物(参见英夫利昔单抗)。克罗恩氏病不能通过外科手术治愈，但是在肠出现部分或全部堵塞时会使用外科手术。
克罗恩氏病的发病率已从在挪威和美国进行的群体研究中得到确定，且相似，为(6～7.1):100,100。克罗恩氏病在北部国家更常见，并且在同一国家的北部地区显示出更高的比重。认为克罗恩氏病发病率在欧洲是相似的，但在亚洲和非洲更低。作为年龄的函数，克罗恩氏病的发病率为双峰分布：该疾病倾向于侵袭10多岁到20多岁的人以及50多岁到70多岁的人。
应注意的是，本发明的人源化抗体还适用于治疗或预防上述的克罗恩氏病以及下述的溃疡性结肠炎。
溃疡性结肠炎(U.C.)是GI道内壁的另一种慢性(长期持续的)炎症。UC通常从直肠开始延伸，并累及几乎整个结肠，且该疾病局限于结肠(大肠)。内壁变得发炎，其特征是开口的疮或溃疡。在活动性疾病中，溃疡形成在炎症已将通常位于结肠内壁的细胞杀伤的地方，随后出现流血和化脓。结肠炎症还会引起结肠频繁地清空，从而引发缓起的混有血液的腹泻。溃疡性结肠炎是间歇病，具有周期性的恶化症状，以及相对无症状的时期。虽然溃疡性结肠炎的症状有时可以自行减弱，但是该疾病通常需要治疗来进入消退阶段。
在美国，每100,000人中有35～100人，或低于总人口的0.1%，患有溃疡性结肠炎。在世界上的北部国家以及单个国家或其他区域的北部地区，该疾病更为普遍。
在北美，溃疡性结肠炎的发病率为每100,000人中每年出现10～12个新病例，且溃疡性结肠炎的峰值发病率出现在15岁到25岁之间。患病率是1/1000。认为在发作年龄上存在双峰分布，第二个发病率峰出现在生命的第6个十年中。受该疾病影响的雌性多于雄性。
溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的地理分布在全世界范围内相似，最高发病率在美国、加拿大、英国和斯堪的纳维亚。在欧洲和美国，与南部地区相比，在北部地区见到的发病率更高。
与克罗恩氏病一样，溃疡性结肠炎的患病率在德系犹太人中更高，而且在犹太血统的其他人、非犹太高加索人、非洲人、西班牙人和亚洲人中逐步下降。
溃疡性结肠炎的临床表现取决于疾病的进展程度。患者通常表现出缓起的混有血液和粘液的腹泻。他们还可能具有如下体征：体重损失，和在直肠检查时发现血液。该疾病通常伴有从轻微不适到剧痛痉挛的不同程度的腹痛。
溃疡性结肠炎与影响身体多个部位的一般炎症过程相关。有时，这些相关的肠外症状是该疾病的早期体征，例如，十几岁的青少年中的疼痛的关节炎膝盖。然而，在肠部表现发作之前，不能确定该疾病的存在。
诊断患有溃疡性结肠炎的人有约一半具有轻微症状。其他的则遭受频繁的发热、血性腹泻、恶心和严重的腹部痉挛。溃疡性结肠炎还可以引起诸如关节炎(血清阴性关节炎、强直性脊柱炎、骶髂关节炎)、眼部炎症(虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎)、肝脏疾病和骨质疏松症。这些并发症可能是免疫系统所触发的炎症造成的结果，因为患有溃疡性结肠炎的人具有免疫系统异常。
溃疡性结肠炎通常从直肠向上沿结肠延伸。根据该疾病沿结肠向上延伸的距离，按受累程度来对该疾病进行分类。除了受累程度以外，UC患者还可以用其疾病的严重程度来表征。
溃疡性结肠炎的标准治疗视受累程度和疾病严重程度而定。目标是，最初用药物诱发消退，随后施用维持性药物来防止疾病复发。诱发消退和维持消退的概念非常重要。用来诱发和维持消退的药物在一定程度上有所重叠，但治疗是不同的。医师首先引导治疗来诱发消退，包括缓解症状并使结肠内壁粘膜愈合，随后进行更长时间的治疗来维持消退。
所用的药物包括氨基水杨酸盐(例如5-氨基水杨酸或5-ASA)、皮质类固醇(例如泼尼松)、免疫抑制药(例如氨甲喋呤)和生物治疗剂(例如英夫利昔单抗)。与克罗恩氏病不同，溃疡性结肠炎通常能够通过外科手术切除大肠来得到治愈。
溃疡性结肠炎并不是由情绪困扰(emotional distress)或对某些食物或食物产品的敏感性引起的，但是这些因素可能会在一些人中触发症状。因患溃疡性结肠炎而带来的生活压力也可能促使症状的恶化。虽然可以使用药物来诱发并维持疾病消退，但仅有部分是成功的，并且约25%～40%的溃疡性结肠炎患者最终会因大量出血、病情严重、结肠破裂或癌症风险而必须将其结肠切除。
诊断溃疡性结肠炎的最佳测试仍然是内窥镜检查术。可屈性乙状结肠镜检查通常足以支持诊断。取粘膜的组织活检来明确地诊断UC并将其与克罗恩氏病区分开，后者在临床上受到不同的处理。
应注意的是，本发明的人源化抗体还适合于治疗或预防IBD及其所有亚型，其中一些在上文中有更详细的描述。
与包括克罗恩氏病和UC在内的IBD一样，银屑病也是与促炎和抗炎细胞因子的产生相互影响的炎性病症。
虽然银屑病的确切起因和发病机理未知，但在银屑病中已表明存在促炎的1型(Th1)细胞因子的过表达，并认为其具有病理生理学重要性。重要的是，表明了皮肤IL-10mRNA的表达与其他炎性皮肤病相比相对缺乏。此外，早先的出版物表明，正在接受确立的抗银屑病疗法的患者显示出比治疗前的患者更高的外周血单个核细胞IL-10mRNA的表达。这表示IL-10可能具有抗银屑病能力。事实上，表皮施用IL-10在患者中产生了免疫抑制效果(降低的单核细胞HLA-DR表达、TNF-α和IL-12分泌能力、IL-12血浆水平和对回忆抗原的应答性)，并观察到了向2型(Th2)细胞因子模式的偏移(使产生IL4、Il5和IL10的T细胞的比例升高，IgE血清水平的选择性升高)。所以，Il-10对治疗银屑病的重要性很明显。因此，根据一个具体实施方式，可以将本发明的人源化抗体用于预防、治疗、改善或抑制银屑病或任何有关病况。
更具体而言，银屑病是一种常见的皮肤病况，其特征为斑驳的、凸起的带有剥落的皮肤炎症红色区域。银屑病经常影响肘和膝的末端、头皮、脐和生殖器或肛门周围的区域。其在免疫系统发出加速皮肤细胞生长周期的错误信号的时发生。银屑病通常引起的鳞状斑称作银屑病斑块，是炎症区域和皮肤过量生成的区域。皮肤在这些部位快速地积累，从而使皮肤具有银白色外表。斑块常出现在肘和膝的皮肤上，但可以影响包括头皮、手掌及足底和生殖器在内的任何区域。与湿疹不同，银屑病更可能出现在关节的外侧上。该病症是慢性的重现性病况，其严重程度从微小的局部斑块到完全覆盖身体不等。指甲和趾甲常常受到影响(银屑病甲营养不良)并且可以视作独立症状。如在关节炎中提到的，银屑病也可以引起关节的炎症，即银屑病关节炎。10%～15%的患有银屑病的人发展有银屑病关节炎。虽然有多种治疗可以使用，但由于其慢性重现性特性，银屑病难以治疗。银屑病的症状可以表现为多种形式。变化形式包括斑块状银屑病、脓疱性银屑病、滴状银屑病和屈侧银屑病。可以将银屑病分为非脓疱性类型和脓疱性类型。应注意的是，本发明的方法涵盖了对非脓疱性和脓疱性银屑病的治疗。
更具体而言，非脓疱性银屑病包括寻常性银屑病和红皮病性银屑病。寻常性银屑病(也称慢性静止性银屑病(Chronic stationary psoriasis)或斑块状银屑病)是最常见的银屑病类型。其影响80%～90%的患有银屑病的人。斑块状银屑病看上去通常为覆盖有银白色鳞状皮肤的凸起的发炎皮肤区域。这些区域称作斑块。
红皮病性银屑病(红皮性银屑病)涉及遍及大部分身体表面的大范围皮肤炎症和皮肤页状剥落。其可能伴有严重的搔痒、肿胀和疼痛。其通常是不稳定的斑块状银屑病发生恶化的结果，特别是在突然取消全身治疗之后。这种形式的银屑病可以是致命的，因为极度的炎症和页状剥落会破坏身体的温度调节能力和皮肤的屏障功能。
在又一个具体实施方式中，本发明的人源化抗体以及其组合物、方法和试剂盒可以用于治疗脓疱性银屑病。脓疱性银屑病看上去为充满非感染性脓的凸起肿块(脓疱)。脓包下面及周围的皮肤发红且变得一触即痛。脓疱性银屑病可以常常局限在手和足部(掌跖脓疱病)，或者可以泛发为随机出现在身体任何部分的大范围的斑块。脓疱性银屑病的亚型包括泛发性脓疱性银屑病(von Zumbusch脓疱性银屑病)、掌跖脓疱病(永久性掌跖脓疱病、Barber型脓疱性银屑病、四肢脓疱性银屑病)、脓疱性环状银屑病、连续性肢端皮炎和疱疹样脓疱病。
应了解的是，本发明的人源化抗体以及其组合物、方法和试剂盒还可以适用于治疗任何其他类型的银屑病，例如药物引起的银屑病、皮褶银屑病(或屈侧银屑病)。皮褶银屑病看上去为光滑的发炎的皮肤斑。其出现在皮肤褶皱中，特别是在生殖器周围(在大腿和腹股沟之间)、腋窝、过重的胃部下方(血管翳)和乳房下方(乳房下褶皱)。其因摩擦和出汗而加重，并且易受真菌感染。
此外，本发明的人源化抗体可以用于治疗滴状银屑病。这种类型的银屑病的特征是大量的小的鳞状的红色或粉色泪滴形损伤。这些大量的银屑病斑点出现在身体的较大区域上，主要是躯干，但也出现在四肢和头皮上。在滴状银屑病之前，经常是链球菌所致的感染，通常为链球菌所致的咽炎。
指(趾)甲银屑病也可以用本发明的方法来治疗，其造成指甲和趾甲外观上的多种变化。这些变化包括指(趾)甲板下脱色、指(趾)甲的孔蚀、跨甲纹、甲下皮肤增厚和甲的松弛(甲剥离)与块状崩落。
如前文提到的，本发明的人源化抗体以及其组合物、方法和试剂盒可以用于治疗银屑病关节炎。银屑病关节炎涉及关节和结缔组织的炎症。银屑病关节炎能够影响任何关节，但最常见于指和趾的关节中。这可以造成指和趾的香肠形肿胀，又称为指(趾)炎。银屑病关节炎还能够影响髋、膝和脊柱(脊柱炎)。患有银屑病的人中约有10%～15%还患有银屑病关节炎。
在一些实施方式中，对患有银屑病的受试对象的治疗可以改进该受试对象的生理学状态，例如，使因疾病而粗糙的皮肤变得光滑。在优选实施方式中，局部应用本发明的人源化抗体不会刺激皮肤且不会助长炎症。
应了解的是，其他慢性或急性的炎症相关的皮肤病理病况可以用本发明的人源化抗体以及其组合物、方法和试剂盒来治疗。所述其他病况包括皮炎、炎性皮肤损伤、皮肤色素沉着的炎症相关扰乱，例如，白癜风和湿疹。
更具体而言，本发明的某些实施方式涉及本发明的人源化抗体以及其组合物、方法和试剂盒的治疗皮炎的用途。术语“皮炎”通常是指皮肤的炎症。不同的种类通常对特定的过敏原具有相同的变态反应。该术语可以用来指湿疹，湿疹还称为皮炎湿疹或湿疹性皮炎。对湿疹的诊断通常意味着特应性皮炎(儿童湿疹)，但在没有适当背景的情况下，其意思仅仅是“疹(rash)”，即，短暂的皮肤炎症。在一些用语中，“皮炎”和“湿疹”是同义词，但是在另一些用语中，“皮炎”意味着急性病况而“湿疹”意味着慢性病况。经常将这两种病况归为一类。
根据另一个具体实施方式，可以将本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒用于治疗和/或改善自身免疫病症，例如糖尿病。因此，根据一个具体实施方式，可以将本发明的人源化抗体用于预防、治疗、改善或抑制I型糖尿病。
糖尿病是以紊乱的代谢和不适当高的血糖(高血糖症)为特征的综合征，其原因是低水平的激素胰岛素，或者是伴有待补偿的胰岛素分泌水平不足的对胰岛素效果的异常抵抗。特征性症状是过量的尿的产生(多尿)、过渡口渴和增加的液体摄取(烦渴)以及视觉模糊；如果血糖仅略微上升，这些症状就可能不存在。
存在三种主要形式的糖尿病：I型、II型和妊娠糖尿病(出现在怀孕过程中)。I型糖尿病的特征是胰腺中产生胰岛素的胰岛β细胞的丧失，导致胰岛素缺乏。β细胞丧失的主要原因是T细胞介导的自身免疫攻击。没有已知的预防措施可以用来抵抗I型糖尿病。另一方面，当发病出现时，多数患病的人是健康的且具有健康的体重。尤其在早期，对胰岛素的敏感性和应答性通常是正常的。I型糖尿病可以影响儿童或成人，而由于其代表了影响儿童的主要糖尿病情况，传统上将其命名为“幼年糖尿病”。
对I型糖尿病的主要治疗，甚至从极早期开始，是更换胰岛素，并组合有用血液测试监视仪小心监控血液葡萄糖水平。在无胰岛素的情况下，可以形成糖尿病酮酸中毒，其可以导致昏迷或死亡。还应注意对生活方式的调整(饮食和锻炼)，虽然这些并不会使损失逆转。除了常见的皮下注射外，还可以用泵来递送胰岛素，该方法使得可以一天24小时以预设的水平持续输注胰岛素，并且能够在用餐时间按需定制胰岛素的剂量(推注)。
I型治疗必须无限期地持续下去。如果在测试和药物治疗中采取足够的注意、适当的照料和纪律，治疗并不会破坏正常活动。
在美国，患病率是人口的0.12%，或接近340,000人。发病率是每年约30,000例，占人口的0.01%。
在另一个具体实施方式中，可以将本发明的人源化抗体用于预防、治疗、改善或抑制II型糖尿病。II型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)或成年发作型糖尿病是代谢紊乱，其特征是在胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏背景下的高血糖。随着该病况的进行，可能需要药物治疗。高血糖引起的长期并发症包括心脏病发作、中风、截肢和肾功能衰竭的风险升高。存在多种因素能够潜在地使II型糖尿病发生或加重。这些因素包括肥胖、高血压、升高的胆固醇(混合性高脂血症)和通常被称作代谢综合征的病况(还称作X综合征、Reavan氏综合征或CHAOS)。其他起因包括肢端肥大症、柯兴综合征、甲状腺毒症、嗜铬细胞瘤、慢性胰腺炎、癌症和药物。已发现可提高II型糖尿病风险的其他因素包括衰老、高脂肪饮食和活动较少的生活方式。
胰岛素抵抗是指在胰岛素存在时体细胞不发生适当的应答。与I型糖尿病不同，胰岛素抵抗通常是“受体后的”，意思是其为应答胰岛素的细胞的问题，而不是胰岛素产生方面的问题。不恰当处理的II型糖尿病能够引起严重的并发症，包括肾功能衰竭、勃起功能障碍、失明、缓慢愈合的伤口(包括外科手术切口)和动脉疾病(包括冠状动脉疾病)。II型的发作在中老年中最为常见，但是由于儿童肥胖和不活动性的增多，其出现在青少年和年轻成人中的频率越来越高。被称作MODY的一种糖尿病类型在青少年中越来越常见，但是将其类型划分为特定原因引起的糖尿病而不是II型糖尿病。
越来越多的证据表明，在炎症和II型糖尿病的发病机理之间可能存在关联。暗示胰岛素抵抗和II型糖尿病可能具有免疫因素的这一新兴概念为研究免疫治疗性方法开辟了新的通道，从而既可以理解II型糖尿病的发病机理又可以开发对该疾病的新的治疗方法。
在免疫相关病症的另一实例中，本发明还提供了本发明的人源化抗体以及其组合物和试剂盒在预防、治疗、改善或抑制多发性硬化的方法中的用途。更具体而言，多发性硬化(缩写为MS，旧称弥漫性硬化或弥漫性脑脊髓炎)是影响中枢神经系统(CNS)的慢性、炎性、脱髓鞘性疾病。疾病发作通常出现在年轻成年人中，且更常见于女性，根据国家或特定人群，患病率为2/100,000～150/100,000。
MS影响脑和脊髓的被称为白质的区域中的神经元。这些细胞在完成处理的灰质区之间以及在这些区和身体其他部分之间携带信号。更具体而言，MS破坏少突细胞，少突细胞是负责产生并维持脂层的细胞，所述脂层称作髓鞘，其辅助神经元携带电信号。MS导致髓磷脂的变薄或完全丧失，并且在不太常见的情况下，导致神经元的延长部分或轴突的切断(横切)。当髓磷脂丧失时，神经元不再有效地传导其电信号。名称多发性硬化是指白质中的疤痕(硬化，更多地称为斑块或损伤)。这些损伤中的髓磷脂丧失会引起一些症状，这些症状视何种信号受到阻断而大不相同。然而，如今更先进的成像形式显示很多伤害发生在这些区域外。该疾病可伴随有几乎任何神经学症状。
MS有若干种形式，其中新症状以不连续的偶发形式(复发形式)出现或随时间缓慢积累(进行性形式)。多数人首先被诊断患有复发性-消退性MS，但多年后发展了继发性-进行性MS(SPMS)。在偶发或发作之间，症状可能完全消失，但永久性的神经问题经常会持续，尤其是随着疾病的进展。
虽然对该疾病过程中所涉及的机制知之甚多，但起因仍然难以捉摸。具有最多支持者的理论是，该疾病是由自身免疫反应引起的。该疾病不能治愈，但已证明若干种疗法是有益的。治疗的目的是在偶发后恢复功能、防止新的发作和防止失能。如任何治疗一样，药物治疗具有若干种不良作用，而且很多疗法仍在研究中。
MS的临床特征通常为CNS中的损伤所引起的重现性或慢性进展性的神经学功能障碍。在病理学上，所述损伤包括影响大脑、视神经和脊髓的多个脱髓鞘区域。潜在的病原学尚不明确，但MS被广泛认为至少在部分上是自身免疫疾病或免疫介导的疾病。EAE是用于研究MS的新治疗方案的有用的实验模型。已发现多种免疫抑制剂在预防和治疗EAE中有效，包括皮质类固醇和共聚物1。然而，到目前为止患者要么接受对症治疗，要么用免疫抑制剂治疗，尚未确立对MS的满意疗法。
因此，本发明包括治疗、推迟或预防MS发作的组合物和方法，包括向有需要的受试对象施用本发明的抗体。
如下文实施例所示，本发明的抗肽-6人源化抗体清楚地展示了抗炎效果。更具体而言，图14和图15示出，使人PBMC暴露于本发明的抗肽-6人源化抗体(具体为VH2/VK3变体及其F(ab)2片段)引发了最终导致IL-10基因表达上调的后继事件。炎症部位中IL-10分泌的增加能够将局部细胞因子特征从炎性应答转变为抗炎应答，并因此可以说明针对由这些抗体引发的炎症的保护机制。
对IL-10分泌的诱导可以是抗体与巨噬细胞蛋白之间的相互作用的直接效应，并且不需要任何HSP抗原的存在。如图12所示，本发明的人源化抗体特异性地结合人巨噬细胞膜蛋白。因此，可以将本发明的抗体用作免疫调节剂，将Th1/Th2细胞平衡向抗炎的Th2应答方向调节。因此，本发明还提供用于增加IL-10(白细胞介素-10)的表达和水平的组合物和方法。根据此方面，本发明的组合物包含有效量的针对含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的肽的至少一种分离且纯化的抗肽-6人源化抗体作为活性成分。本发明的组合物还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
根据一个实施方式，在表示“增加”或“增强”抗炎细胞因子(例如，IL-10、IL-4和IL-6中的任何一种，尤其是IL-10)的表达或水平时，其意思是，此类增加或增强可以是此类细胞因子的表达增加或提高约10%～100%的。本文所用的术语“增加”、“增大”和“增强”涉及在尺寸、量、数目或强度上逐渐变大的过程。特别是指，与适当的对照相比，表达增加10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。还应当注意的是，上述增加或上升还可以是约2～100倍的增加。此外，应认识到的是，所述IL-10细胞因子的水平或表达的升高可以是在所述细胞因子的转录、翻译或稳定性上。对此，应理解的是，在被提到时，诸如10%、50%、120%、500%等百分比值可以分别与0.1、0.5、1.2、5等“倍数变化”值互换使用。
如上文指出的，增强的IL-10表达可以将Th1/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节。因此，本发明的抗体可用于需要将Th1/Th2平衡向抗炎应答方向调节的病况。因此，根据一个实施方式，可以将本发明的组合物用于增加有需要的受试对象的IL-10的表达和水平，从而将接受治疗的受试对象的Th1/Th2细胞平衡向抗炎Th2应答方向调节。根据一个具体实施方式，受试对象是患有免疫相关病症的受试对象。例如，诸如自身免疫疾病(例如关节炎、IBD、银屑病，I型和II型糖尿病、多发性硬化(MS)、狼疮、格雷夫斯病和甲状腺炎)、移植排斥病理学及移植物抗宿主病、超抗原诱导的病症(例如中毒性休克、败血病性休克和严重败血病)等免疫相关病症。
还应当认识到的是，通常，本发明的组合物以及方法、联合组合物和试剂盒可以用于预防、治疗、改善或抑制任何自身免疫疾病，例如但不限于肌无力综合征、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、肝炎、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)及NIDDM、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、重症肌无力、丛病症(例如，急性臂神经炎)、多腺性缺乏综合征、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、硬皮病、血小板减少、甲状腺炎(例如桥本病)、干燥综合征、过敏性紫癜、银屑病、混合性结缔组织病、多肌炎、皮肤肌炎、血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、韦格纳肉芽肿病、莱特尔氏综合征、Behget氏综合征、强直性脊柱炎、天疱疮、大疱性类天疱疮、疱疹样皮炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎及克罗恩氏病和脂肪肝病。
包含本发明的人源化抗体的药物组合物可用于胃肠外施用，即，腹膜内(i.p.)、皮下(s.c.)、肌肉内(i.m.)和静脉内(i.v.)施用以及口服和局部应用。用于胃肠外施用的组合物通常包含将溶解于可接受的载剂(优选水性载剂)中的抗体或其混合物的溶液。可以使用多种水性载剂，例如水、经缓冲的水、0.4%的盐水和0.3%的甘氨酸等。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。该组合物可以包含药学上可接受的、接近生理条件所需的辅助物质，例如pH调节与缓冲剂和毒性调节剂等，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠。人源化抗体在这些制剂中的浓度可以大幅度变化，即，从小于约0.01重量%、通常从小于约0.1重量%至几乎5重量%，且将主要根据所选的特定施用模式基于流体体积和粘度来选择该浓度。
更具体而言，可以将包含本发明的抗肽-6人源化抗体的可注射组合物制备到水、盐水、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水和柠檬酸盐缓冲盐水等中，并可以可选地与无毒的表面活性剂混合。在普通的储藏和使用条件下，这些制备物可以包含防腐剂，以防止微生物生长。适合于注射或输注的药物剂型包括含有活性成分的无菌水性溶液或分散液或者无菌粉末，所述粉末适合于即席制备可注射或可输注的无菌溶液或分散液。优选的是，最终剂型是无菌流体，并且在制造和储藏条件下稳定。该溶液、悬浮液或分散液的液体载剂或载质可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇或液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其适合的混合物。通过下述方式可以保持溶液、悬浮液或分散液的正常流动性，例如，通过形成脂质体，通过保持所需的粒径(对于分散体的情况)，或通过使用无毒的表面活性剂。使用各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基本甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸和硫汞撒等)可以实现预防微生物的作用。可以包含等渗试剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。通过在组合物中加入推迟吸收的药剂，例如一硬脂酸铝水凝胶和明胶，可以延长对可注射组合物的吸收。可以添加溶解度增强剂。
可以通过下述方式来制备无菌的可注射组合物：将抗肽-6人源化抗体按所需的量与各种其他成分(例如，上文所列举的)添加在适合的溶剂中，随后必要时通过例如过滤灭菌来进行灭菌。对于用来制备无菌可注射溶液的无菌粉末，制备方法包括真空干燥和冷冻-干燥技术，该方法可产生活性成分的粉末以及存在于之前无菌过滤过的溶液中的任何其他所需成分。可以采用任何适合的灭菌方法，例如过滤灭菌(如，0.22微米滤膜或纳米过滤)、γ射线或电子束灭菌。
在各种实施方式中，将最终溶液的pH调节至约4～约9、约5～约7、约5.5～约6.5或约6。可以用药理学上可接受的酸、碱或缓冲剂来调节组合物的pH。
此外，本发明的组合物可以以每剂量包含预定量的各活性成分的单位剂型存在。可以将这种单位调整为可提供0.1～100mg/kg体重的本发明的人源化抗体。具体而言，可以是0.1～10mg/Kg、5～15mg/Kg、10～30mg/Kg、25～50mg/Kg、40～80mg/Kg或60～100mg/Kg。更具体而言，所述有效剂量为约0.01～约100mg/Kg人源化抗体、约0.1～约90mg/Kg、约0.3～约8mg/Kg、约0.4～约70mg/Kg、约0.5～约60mg/Kg、约0.7～约50mg/Kg、约0.8～约40mg/Kg、约0.9～约30mg/Kg、约1～约20mg/Kg、特别是约1～约10mg/Kg。可以将这些剂量提供为单剂量形式或多个不连续剂量。当然，最终剂量将依赖于受治疗的病况、施用途径以及患者的年龄、重量和状况，并且将由医生决定。
如上文指出的，除了胃肠外途径外，本发明的组合物可以经改造而适用于任何其他适当途径的施用，例如口服(包括口腔和舌下)、直肠、鼻部、局部(包括口腔、舌下或经皮)或阴道途径。可以通过制药领域中的任何已知方法来制备此类制剂，例如通过使活性成分与一种或多种载剂或赋形剂结合。
经改造适合用于口服施用的药物制剂可以呈现为不连续的单位，例如：胶囊或片剂，粉末或颗粒，在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液，可食用的泡沫或搅打泡沫(whips)，或者水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。
经改造适合用于经皮施用的药物制剂可以呈现为不连续的贴片，该贴片意在使其与接受者的表皮保持长时间的紧密接触。
可以将经改造适合用于局部施用的药物制剂配制成软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油剂。
对于向眼或其他外部组织(例如口和皮肤)的敷用而言，制剂优选以局部软膏或乳膏敷用。当配制成软膏形式时，可以将活性成分与石蜡或水可混溶的软膏基底一起使用。另一选择为，可以将活性成分与水包油乳膏基底或油包水基底一起配制到乳膏中。
经改造适合于局部施用至眼部的药物制剂包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在适合的载剂尤其是水性溶剂中。
经改造适合于局部施用至口中的药物制剂包括锭剂、软锭剂和漱口剂。
具体的实施方式包括：通过向受影响的皮肤区域局部施用包含本发明的人源化抗体的软膏、乳膏、悬浮液、糊剂、洗剂、粉末、溶液、油剂、包封的凝胶、脂质体，包含所述抗体的任何纳米颗粒，或包含所述抗体的可喷雾气溶胶或蒸气，来治疗皮肤炎症病况(特别是银屑病)。常规的药物载剂，水性基底、粉末基底或油性基底，以及增稠剂等，可以是必要的或理想的。术语“局部敷用”或“局部施用”意思是将软膏、乳膏、软化剂、香脂、洗剂、溶液、油膏剂、软药(unguent)或任何其他药物形式敷用到患者皮肤的受到或已受到一种或多种银屑病症状影响的区域或者显示或已显示一种或多种银屑病症状的区域的一部分或全部上。
在优选实施方式中，用于治疗皮肤病症(特别是银屑病)的本发明的人源化抗体是通过局部敷裹物来施用的。术语“敷裹物”的意思是用于伤口或外科手术部位的覆盖物，通常是由布、织物、合成膜或纱布等构成。其通常是覆盖皮肤区域的含聚合物的基质。该敷裹物可以与或不与皮肤紧密接触。其可以是例如布或纱布，或可以是涂抹或喷在皮肤上的聚合物溶液，其中所述聚合物在溶剂变干后和/或在聚合物交联后在皮肤上发生固化。敷裹物还包括凝胶，通常是交联的水凝胶，其主要设计用来覆盖和保护伤口和外科手术部位等。
经改造适合用于直肠施用的药物制剂可以呈现为栓剂或灌肠剂。
经改造适合用于鼻部施用的、其中载剂为固体的药物制剂包括粒径为例如20～500微米的粗粉末，该粗粉末的施用是以吸入嗅剂的方式，即从举到鼻下近距离处的该粉末的容器中通过鼻道快速吸入的方式。作为鼻喷雾剂或滴鼻剂施用的、其中载剂为液体的适合制剂包括活性成分的水性溶液或油性溶液。
经改造适合用于通过吸入施用的药物制剂包括细粒粉尘或薄雾，可以通过使用各种类型的定量的加压气溶胶、雾化器或吹入器来产生所述细粒粉尘或薄雾。
经改造适合用于阴道施用的药物制剂可以呈现为阴道栓、塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
优选的单位剂量制剂是包含上文所述的每日、每周两次、每周、每几周或每月剂量或子剂量或者其适合的部分剂量的活性成分的那些制剂。应指明的是，尤其在IBD中，还存在以下情况：最初给予较大的推注剂量，随后减小该剂量用于后续治疗。
应理解的是，除了上文特别提到的成分以外，所述制剂还可以包含与所讨论的制剂类型有关的领域中常见的其他试剂，例如，适合于口服施用的那些制剂可以包含调味剂。
本发明的另一方面提供用于预防、治疗、改善或抑制免疫相关病症的方法。本发明的方法包括向有需要的受试对象施用治疗有效量的特异性地结合含有SEQ IDNO:15的多肽的至少一种分离且纯化的人源化抗体或含有所述抗体的组合物。根据一个实施方式，本发明的方法所用的人源化抗体包含：
(a)重链可变区，所述重链可变区包含位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的Ile、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于H100位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于H101位的Asp和位于H102位的Tyr，且可选地包含位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于H11位的Ile、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一个；和
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含位于L1位的Gln、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gln、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可选地包含位于L21位的Met、位于L10位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一个(位置是根据Kabat编号系统确定的)。
根据一个实施方式，如本发明所述，本发明的方法可以使用本发明的人源化抗体中的任何一种或包含所述抗体的任何组合物。一个特定实施方式涉及具有重链可变区SEQ ID NO:21和轻链可变区SEQ ID NO:26的至少一种人源化抗体(VH2/VK3)的应用。
根据一个实施方式，本发明的方法可以特别适用于预防、治疗、改善或抑制诸如自身免疫病或炎性病症等免疫相关病症。
根据一个具体实施方式，本发明的方法特别适用于治疗炎性关节炎。
根据另一个实施方式，可以将本发明的方法用于治疗炎性肠病(IBD)。
根据另一个实施方式，可以将本发明的方法用于治疗银屑病。
在又一个实施方式中，可以将本发明的方法用于治疗自身免疫病，例如糖尿病。
在又一个实施方式中，可以将本发明的方法用于治疗MS(多发性硬化)。
在本说明书和以下的实施例部分中，本文所用的术语“治疗”及其各种衍生形式涵盖：实质上抑制、延缓或逆转病况的进展，实质上改善病况的临床症状，或实质上预防病况的临床症状的出现。
本文所用的术语“疾病”、“病症”和“病况”等在它们涉及受试对象的健康时可以互换使用，并且其意义可指每个和全部这些术语。
本文所用的“受试对象”是指出于治疗或研究目的被施用了药剂(例如抗体)的哺乳动物。哺乳动物包括小鼠、大鼠、猫、豚鼠、仓鼠、狗、猴、黑猩猩和人。
本发明还涵盖了本发明的抗体在治疗与上述病况有关的任何病况中的应用。应理解的是，可互换使用的术语“相关的”和“有关的”在本文中描述病理时是指具有相同的起因和/或以高于巧合的频率共存的疾病、病症、病况或任何病理，或者指在至少一种疾病、病症、病况或病理引起第二疾病、病症、病况或病理的情况下的疾病、病症、病况或任何病理。
对于关节炎来说，此类相关的或有关的病况可以包括例如所有类型的原发性关节炎，例如类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病关节炎、反应性关节炎(ReA)、强直性脊柱炎(旧称别赫捷列夫氏病、别赫捷列夫综合征)、幼年特发性关节炎(JIA)和痛风(代谢性关节炎)。除了所述的所有原发性形式的关节炎外，本发明所治疗的病况可以包括所有继发性形式的关节炎，例如红斑狼疮、过敏性紫癜(Henoch-purpura)、血色病、肝炎、韦格纳肉芽肿病(及很多其他血管炎综合征)、莱姆病、家族性地中海热、带有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关的周期性综合征和炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)。
对于IBD来说，此类相关的或有关的病况可以包括例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏白塞氏综合征和未定型结肠炎。
对于银屑病来说，此类相关的或有关的病况可以包括例如银屑病关节炎、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、皮肌炎、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、狼疮、盘状狼疮和白癜风。
对于糖尿病来说，此类相关的或有关的病况可以包括例如与眼有关的并发症(白内障、青光眼、视网膜病变)、神经病、肾病变、心肌病、中风、高血压、外周动脉病和疮。
本发明的另一方面提供增加有需要的受试对象中的IL-10的表达和水平的方法，该方法包括以下步骤：向所述受试对象施用治疗有效量的特异性地结合含有SEQ IDNO:15的多肽的至少一种分离且纯化的人源化抗体或含有所述抗体的组合物。根据一个实施方式，可以将本发明的任何人源化抗体用于所述方法。
根据一个实施方式，增加IL-10的表达和水平会将受治疗的患有免疫相关病症的受试对象的Th1/Th2细胞平衡向抗炎的Th2应答方向调节。
还应注意的是，本发明提供本文所述的人源化抗体(尤其是VH2/VK3变体)在制备用于预防、治疗、改善或抑制免疫相关病症的组合物中的应用。
本发明展示了新型人源化抗肽-6抗体作为适用于治疗免疫相关病症的免疫调节剂的应用。还应该了解的是，所述抗体的有益免疫调节效果可以通过将其与其他已知的抗炎剂结合来增强。因此，本发明还提供本发明的抗体与任何治疗剂(尤其是抗炎剂)的任何组合或混合。因此，根据某些实施方式，本发明提供治疗有效量的由至少一种分离且纯化的人源化抗体或其任何抗原结合片段与至少一种抗炎剂组成的组合的应用，所述抗炎剂选自由以下物质组成的组：甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮质类固醇衍生物和用于治疗、预防、改善、减轻或推迟免疫相关病症的任何其他抗炎剂。应注意的是，此类附加抗炎剂可以是通过任何途径(除了抗肽-6抗体所包括的涉及诱导IL-10的途径的机制以外)来诱导抗炎应答的试剂。
因此，本发明特别涉及至少一种分离且纯化的人源化抗体或其任何抗原结合片段与至少一种抗炎剂的加成性组合和协同性组合，所述抗炎剂选自由以下物质组成的组：甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(certolizumab pegol)(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮质类固醇衍生物和诱导不同于抗肽-6途径的任何信号传导途径的任何抗炎剂，由此这些加成性组合和协同性组合可用于治疗患有免疫相关病症(例如，关节炎、IBD、银屑病或糖尿病)的受试对象。本发明的加成性和协同性组合还可以用于治疗呈现出此类病症的症状或体征的受试对象。
协同性组合的意思是，所述分离且纯化的人源化抗体或其任何抗原结合片段与至少一种选自由甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮质类固醇衍生物和任何其他抗炎剂组成的组的抗炎剂的组合效果大于将这些化合物中的任一种作为唯一疗法单独施用的治疗效果的总和。更具体而言，额外的抗炎剂可以诱导与抗肽-6抗体所诱导的途径(例如，参与IL-10诱导的任何途径)不同的途径。
本发明的联用化合物(combined compound)通常以包含本发明的上述两种化合物以及药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物形式来施用。然而，根据一些实施方式，这两种化合物可以单独施用。因此，本发明所用的化合物可以以试剂盒形式单独施用，或者以任何常规的口服或粘膜剂型一起施用。
更特别而言，由于本发明涉及用可以单独施用的活性成分的组合来治疗疾病和病况，因此本发明的另一方面还涉及将单独的药物组合物以试剂盒形式组合到一起。所述试剂盒包含至少两种单独的药物组合物：(i)分离且纯化的人源化抗体或其任何抗原结合片段，特别是任何一种本发明的人源化抗体，其可选地为第一剂型；和(ii)至少一种抗炎剂，所述抗炎剂选自由甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮质类固醇衍生物和诱导不同于抗肽-6途径的任何其他途径的任何抗炎剂组成的组，其可选地为第二剂型。
本发明的试剂盒还可以包含(iii)用于容纳所述第一剂型和第二剂型的容器。
更具体而言，所述试剂盒包含用于同时容纳两种单独的组合物的容器，例如分隔型瓶(divided bottle)或分隔型箔材包(foil packet)。然而，还可以将单独的组合物容纳在单一的未分隔的容器中。通常，所述试剂盒包含用于施用所述单独的组合物的说明书。在单独的成分优选以不同的剂型(例如，胃肠外)施用、以不同的剂量间隔施用时，或者在开处方的医师需要对组合中的单个成分进行滴定时，试剂盒形式具有特别的优势。
取得疗效是指，例如，在试剂盒是旨在用于治疗特定病症的情况下，疗效可以是例如延缓被治疗的病况的进展。
应了解的是，可以同时施用试剂盒的全部两种成分，即：分离且纯化的本发明的人源化抗体，其可选地为第一剂型；和至少一种抗炎剂，所述抗炎剂选自由以下物质组成的组甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮质类固醇衍生物和诱导不同于抗肽-6途径的任何其他途径的任何抗炎剂，其可选地为第二剂型。
作为另一选择，所述第一化合物或第一剂型和所述第二化合物或第二剂型以任意顺序依次施用。
可以施用包含该人源化抗体或其任何组合、混合物或混合剂的组合物以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，向已经患有免疫相关病症(例如，关节炎、IBD、银屑病、MS和糖尿病)的患者施用足以治愈或至少部分遏制该病况及其并发症的量的组合物。将足以实现此效果的量定义为“治疗有效剂量”。对此用途有效的量将取决于病况的严重程度和患者自身免疫系统的整体状况，但通常为每剂量约0.01mg/kg～约100mg/kg的人源化抗体，而0.1～50mg/kg体重和1～10mg/kg体重的剂量则更为常用。更具体而言，所述有效剂量为约0.01～约100mg/Kg人源化抗体、约0.1～约90mg/Kg、约0.3～约8mg/Kg、约0.4～约70mg/Kg、约0.5～约60mg/Kg、约0.7～约50mg/Kg、约0.8～约40mg/Kg、约0.9～约30mg/Kg、约1～约20mg/Kg、特别是约1～约10mg/Kg。用治疗医师所选定的剂量水平和模式，可以依计划在每日、每周两次、每周、每几周或每月进行单次或多次施用。
在预防性应用中，向有发展疾病状况风险的患者施用包含人源化抗体或其任何组合、混合物或混合剂的组合物以增强该患者的抵抗力。将这种量定义为“预防有效剂量”。在此应用中，精确的量同样取决于患者的健康状况和免疫力的整体水平，但通常为0.1～100mg/剂量，特别是1～10mg/kg体重。更具体而言，所述有效剂量为约0.01～约100mg/Kg人源化抗体、约0.1～约90mg/Kg、约0.3～约8mg/Kg、约0.4～约70mg/Kg、约0.5～约60mg/Kg、约0.7～约50mg/Kg、约0.8～约40mg/Kg、约0.9～约30mg/Kg、约1～约20mg/Kg、特别是约1～约10mg/Kg。
根据患者所需和所能耐受的剂量和频率来进行组合物的单次或多次施用。在任何情况下，组合物都应当提供充足量的本发明的人源化抗体，来有效地治疗患者。优选的是，期望单次施用，其中剂量仅施用一次。然而，在多数情况下，周期性地施用剂量，直到实现治疗并将维持疗效，或直到副作用有必要使治疗中止。通常，该剂量足以治疗或改善疾病的症状或体征且不对患者产生不可接受的毒性。
可以将本发明的免疫偶联物组合物的控释型胃肠外制剂制成植入物、油性注射物或微粒系统。
微粒系统包括微球体、微颗粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球体和纳米颗粒。微胶囊包含治疗蛋白来作为中心核。在微球体中，治疗物分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球体和微胶囊通常分别称作纳米颗粒、纳米球体和纳米胶囊。毛细血管的直径为约5μm，因此仅静脉内施用纳米颗粒。微颗粒的直径通常为约100μm，并且对其进行皮下施用或肌肉内施用。
可以将聚合物用于本发明的人源化抗肽-6抗体组合物的离子控释。用于控制型药物递送的各种可降解的和不可降解的聚合物基质在本领域中是已知的。
在另一个实施方式中，使用脂质体来实现脂质所包裹的药物的控释和药物靶向作用。
本发明的另一方面涉及用编码本发明的人源化抗体的表达载体转化或转染的宿主细胞系。在一个特定实施方式中，该表达载体编码了重链可变区链和轻链可变区链。
在某些实施方式中，所述细胞系表达具有包含SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列的轻链可变区的人源化抗体。
在一个特定实施方式中，本发明的细胞系在实施例23～26中有所描述，并且保藏号为CNCM I-4356。
本文所用的“宿主细胞”是指能够被用重组DNA技术构建的载体重组转化的细胞。药物抗性或其他可选择的标志物的部分目的是促进对转化体的选择。此外，选择性标志物(例如药物抗性标志物)的存在可以用于防止污染性微生物在培养基中倍增。通过在需要所诱导的表型才能存活的条件下培养细胞，将获得上述经转化的宿主细胞的纯培养物。
“细胞”、“宿主细胞”或“重组细胞”在本文中是可以互换使用的术语。应理解的是，这些术语不仅指特定的受试对象细胞，也指此类细胞的后代或潜在后代。由于在传代中因突变或环境影响可能出现一些修饰，因此，所述后代实际上可能与亲代细胞不完全一样，但是仍将其包含在本文所用的该术语的范围内。
本文所用的术语“转染”是指，通过由核酸介导的基因转移，将核酸(例如表达载体)导入受体细胞中。本文所用的“转化”是指下述过程：其中，由于细胞摄取了外源DNA或RNA，细胞的基因型发生了变化。
本发明还提供用于表达人源化抗体的表达载体，所述人源化抗体同时具有包含SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列的轻链可变区。
在具体实施方式中，本发明提供用于表达人源化重链可变区的表达载体，所述人源化重链可变区包含SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列。此类载体的实例是图2和实施例2所示的pANTVhG1/4载体。
在其他实施方式中，本发明提供用于表达人源化轻链可变区的表达载体，所述人源化轻链可变区包含SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列。此类载体的实例是图2和实施例2所示的pANTVK载体。
最优选的是，本发明提供用于表达人源化抗体的表达载体，所述人源化抗体同时具有包含SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列的轻链可变区。此类载体的实例是图26和实施例22所示的pPRO14载体。
一个特别优选的表达载体可以是图26所示的哺乳动物表达质粒pPRO14。其他优选的表达载体是图2所示的哺乳动物表达载体pANTVK和pANTVhG1/4。
表达载体通常是自我复制的DNA或RNA构建体，其包含所需的基因或其片段以及可操作性地连接的遗传控制元件，这些遗传控制元件在适合的宿主细胞中得到识别并实现所需基因的表达。这些控制元件能够在适合的宿主内实现表达。通常，遗传控制元件可以包含原核生物启动子系统或真核生物启动子表达控制系统。这通常包括：转录启动子，用来控制转录起始的可选的操纵基因，用来提高RNA表达水平的转录增强子，编码适合的核糖体结合位点的序列，RNA剪接点，以及使转录和翻译终止的序列，等等。表达载体通常包含复制起点，复制起点允许载体不依赖宿主细胞而进行复制。
载体还可以包含适当的限制性位点、抗生素抗性标志物或用于选择含载体细胞的其他标志物基因。质粒是最常用的载体形式，但是具有同等功能且在本领域中已知或正在被知晓的其他载体形式也适合在本发明中使用。参见例如Pouwels等，CloningVectors:a Laboratory Manual(1985及补充资料),Elsevier,N.Y.；和Rodriquez等(编)Vectors:a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses,Buttersworth,Boston,Mass(1988)，并通过引用将它们并入本文。
应注意的是，本发明还涵盖SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所编码的嵌合抗肽-6抗体。这些抗体具有重链可变区SEQ ID NO:1和轻链可变区SEQ IDNO:2。应注意的是，这些抗体携带小鼠可变区和人恒定区，并且还被称为参照抗体或亲本抗体。根据某些实施方式，本发明的小鼠抗肽-6抗体、嵌合抗体或人源化抗体包含本文所述的重链可变区和轻链可变区，条件是所述抗体与美国专利第7,488,476号中的名为MF9的鼠单克隆抗体不同即可。
可以使用本领域中已知的重组DNA技术来制造嵌合抗体。例如，用限制性酶消化编码鼠类(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，从而除去编码鼠Fc的区域，并且用编码人Fc恒定区的基因的等效部分进行置换。
因此，根据另一方面，本发明提供特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽的嵌合鼠类单克隆抗体，其中，所述抗体包含人免疫球蛋白恒定区和鼠免疫球蛋白可变区，所述可变区包含：具有SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列的轻链可变区，和具有SEQID NO:1所表示的氨基酸序列的重链可变区。
根据一些实施方式，本发明提供包含有效量的至少一种分离且纯化的本发明的嵌合单克隆抗体作为活性成分的组合物，所述嵌合单克隆抗体特异性地结合含有SEQID NO:15的多肽。
根据更具体的实施方式，本发明提供用于治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作的药物组合物，其中，所述组合物包含治疗有效量的至少一种分离且纯化的本发明的嵌合单克隆抗体作为活性成分，所述嵌合单克隆抗体特异性地结合含有SEQID NO:15的多肽。
本发明还涵盖用于治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作的方法，所述方法包括向有需要的受试对象施用治疗有效量的至少一种分离且纯化的本发明的嵌合单克隆抗体的步骤，所述嵌合单克隆抗体特异性地结合含有SEQ ID NO:15的多肽。
根据其他实施方式，本发明提供联合组合物，所述联合组合物包含：特异性地结合含有SEQ ID NO:15的多肽的至少一种分离且纯化的本发明的嵌合单克隆抗体；和至少一种抗炎剂，所述抗炎剂选自由以下物质组成的组：甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera;Rituxan)、氨甲喋呤、任何皮质类固醇衍生物和诱导任何信号传导途径(特别是不同于抗肽-6所诱导的途径(例如，参与IL-10诱导的任何途径)的途径)的任何抗炎剂。
根据特定实施方式，本发明涉及治疗有效量的至少一种分离且纯化的本发明的嵌合单克隆抗体在制备用于治疗、预防、推迟发作或改善免疫相关病症的组合物中的应用，所述嵌合单克隆抗体特异性地结合含有SEQ ID NO:15的多肽。
此外，本发明提供本文所述的嵌合抗体在试剂盒以及诊断应用中的用途。
本发明人之前证明了类风湿性关节炎患者的血清抗肽-6抗体滴度显著低于健康受试对象。因此，发明人设想了血清抗肽-6作为类风湿性关节炎(或实际上一般为炎性病症)标志物的应用。
因此，在另一方面，本发明提供用于检测和监视哺乳动物受试对象的免疫病症(尤其是免疫相关病症，包括涉及抗炎细胞因子表达特别是IL-10表达的下降的那些病症)的诊断试剂盒和方法。此类免疫相关病症包括关节炎、IBD(例如，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、银屑病、糖尿病和MS。更具体而言，本发明提供的诊断方法和试剂盒使用被测生物样品中的抗肽-6抗体水平来作为免疫相关病症的标志。被测样品中的抗肽-6抗体水平相对于健康对照中的水平的下降表明该样品属于患有免疫相关病症的受试对象。应了解的是，通过鉴定出患有特定炎性疾病且可能从人源化抗肽-6抗体治疗中获益的受试对象，本发明的诊断试剂盒和方法还提供了实现“定制”疗法或个人针对性疗法的工具。
应了解的是，本发明提供的诊断方法和试剂盒构成竞争性抗体结合测定，其中，包含在目的样品(具体为血清样品)中的抗肽-6抗体的量是通过以下方式确定的：将所述样品与已知量的分离且纯化的肽-6温育，随后将同一肽6与已知量的本发明的人源化抗肽-6抗体温育，其中所述人源化抗肽-6抗体可选地标记有可检测部分或标记。因此，所述目的样品中的抗肽-6抗体的量与结合有肽-6的带标记的抗肽-6抗体的减少成比例。
根据一个实施方式，本发明提供用于检测或监视哺乳动物受试对象的免疫病症的诊断方法，其中所述免疫病症可能对人源化抗肽-6抗体治疗有应答性，所述方法包括下述步骤：(a)使被测样品与预定量的分离的肽-6(SEQ ID NO:15)在使得所述肽可以与抗肽-6抗体结合的适合条件下接触；(b)向(a)中的样品-肽6混合物中添加预定量的本发明的人源化抗肽-6抗体，其中所述人源化抗肽-6抗体可选地标记有可检测标记。应了解的是，步骤(a)和步骤(b)可以依次执行或同时执行；(c)用适合的手段确定在所述样品中所述人源化抗肽-6抗体与肽-6的结合；由于所述样品中的抗肽-6抗体与本发明的人源化抗肽-6抗体竞争与肽-6的结合，所述样品中的抗肽-6抗体对所述人源化抗肽-6抗体的替换(displacement)由肽-6与人源化抗体的结合的减少反映；
(d)从标准曲线外推来估算出被测样品中的抗肽-6抗体的量，其中所述标准曲线是通过用抗肽-6抗体的梯度稀释液替换肽-6与带标记的本发明的人源化抗体的梯度稀释液而建立的。被测样品中的抗肽-6抗体的减少的量表明该样品属于患有免疫相关病症且可能从使用人源化抗肽-6抗体进行治疗中获益的受试对象。
根据一个具体实施方式，将样品与预定量的附着在固相载体上的分离的肽-6温育，随后添加预定量的标记有可检测标记的本发明的人源化抗肽-6抗体。
本说明书和权利要求书中的术语“样品”的含义包括生物样品。生物样品可以从哺乳动物(特别是人)受试对象获得，包括流体、固体(例如，粪便)或组织。术语“样品”还可以包括体液，例如血清、尿、血液、乳、脑脊髓液、从清洗体腔获得的清洗液、痰、脓。可以使一些事先不是液体的样品与缓冲液体接触，随后按本发明的诊断方法使用。
生物样品可以从所有的各种家畜科和未驯服动物或野生动物获得，包括但不限于：有蹄类动物，熊，鱼，兔形目动物，啮齿类动物，等等。优选的是，该样品是液体，特别是体液样品，最优选为源自哺乳动物特别是人的血清样品。
本发明还提供用于检测和监视哺乳动物受试对象的免疫病症的试剂盒。本发明的试剂盒还可以提供关于受检查患者对用本发明的抗肽-6抗体进行的治疗作出应答的潜在应答性的信息。本发明的试剂盒可以包含：(a)用于从被测受试对象获取生物样品的器件(means)；(b)标记有可检测部分的人源化抗肽-6抗体；(c)分离的肽-6，可选地附着在固相载体上；(d)用于检测带标记的人源化抗肽-6抗体与附着在固相载体上的肽-6之间形成的免疫复合物的量的器件；(e)通过用未标记的抗肽-6抗体的梯度稀释液替换肽-6与带标记的本发明的人源化抗体的梯度稀释液而建立的标准曲线；(f)用于实施以下内容的操作说明：检测所述样品中抗肽-6抗体的存在和量，并优选使用上文所述的本发明的方法。
应理解的是，可以适合用于本发明的试剂盒中的所述固相载体通常基本不溶于液相。本发明的固相载体不限于特定类型的载体。相反，对本领域的普通技术人员而言，存在大量的可以获得的已知载体。因此，可用的固相载体包括固体基质，例如气凝胶和水凝胶，树脂，珠，生物芯片(包括被覆薄膜的生物芯片)，微流体芯片，硅芯片，优选的是多孔平板(亦称为微孔平板或微孔板)。
应注意的是，为实施本文所述的诊断应用，本发明的人源化抗体可以与可检测标记偶联。能够使本发明的抗体带有可检测标记的一种方法是将所述抗体连接到酶上并在酶免疫测定(EIA)中使用。随即，该酶会在随后暴露于适合的底物时与该底物反应，其反应方式使得可以产生能够使用例如分光光度法、荧光测定法或目视装置而检测到的化学部分。能够用来使抗体带有可检测标记的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。检测可以通过比色方法来完成，所述方法采用针对酶的生色底物。检测还可以通过将底物与以类似方式制备的标准物的酶促反应程度进行目视比较来完成。
检测可以通过使用各种其他免疫测定中的任何一种来完成。例如，通过对本发明的抗体或抗体片段进行放射性标记，可以通过使用放射免疫测定(RIA)来检测样品中的抗肽-6抗体水平。通过例如使用γ计数器或闪烁记数器等手段或者通过自动射线照相术，可以检测到放射性同位素。
作为另一选择，还可以用荧光化合物、荧光发射金属、化学发光化合物或生物发光化合物来标记本发明的抗体。
应了解的是，本发明的诊断和方法都可选地使用适合的缓冲液和溶液，以用于本发明的抗体和被测样品中所含的抗体与肽6的相互作用，和用于这两种抗体的竞争性结合测定。所述缓冲液还可以用于在根据本发明的方法进行样品分析前溶解固体或半固体样品。
本发明的诊断试剂盒和方法中的本发明的抗体与存在于目的样品中的抗体的竞争性结合通常要求保持特定的pH和摩尔渗透压浓度条件。一些去垢剂和溶剂的存在与否同样会改变结合效率。该pH通常保持在相对中性的水平，例如约6～约9，而在一些实施方式中，约7。摩尔渗透压浓度通常是通过添加盐(例如氯化钠、氯化钾、氯化镁和其他盐)来调整的。可以用于调整结合条件的去垢剂和溶剂的一些非限制性实例包括Tween-20、Triton X100、PEG、DMSO和Nonidet P-40，等等。可以用来保持所需的pH和摩尔渗透压浓度的生物相容性缓冲液的一些非限制性实例包括硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、2-(N-吗啉)乙烷磺酸(“MES”)、三羟甲基氨基甲烷(“Tris”)、柠檬酸盐缓冲液，等等。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语都具有本领域中常用的意义。本文提供的定义是为了便于理解本文中常用的某些术语，并不意在限制本公开的范围。
现将基于以下实施例对本发明作更详细的描述，这些实施例仅是说明性的而不以任何方式限制本发明。基于本文的教导，可以对本发明做出很多修改和变形。因此应理解的是，在所附权利要求的范围内，可以以具体描述的方式以外的方式实施本发明。
对于所公开和描述的，应理解的是，本发明并不限于本文所公开的特定的实施例、方法步骤和组合物，因为这些方法步骤和组合物可以发生一些变化。还应理解的是，由于本发明的范围仅受所附权利要求及其等价概念的限制，所以本文所用的术语仅是用来实现描述特定实施方式的目的，并非试图进行限制。
必须注意的是，除非内容另有明确界定，本说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包含复数的所指代物。
在整个本说明和实施例及随后的权利要求中，除非上下文另有要求，词语“包含”及诸如“含有”和“包括”等变形应理解为包涵了所叙述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但并不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。
以下实施例代表了本发明人在实施本发明的各个方面时所采用的技术。应认识到的是，虽然这些技术是用于实行本发明的优选实施方式的典型，但本领域的技术人员基于本公开内容将认识到可以做出多种修改而不脱离本发明的主旨和所指示范围。
实施例
实验程序
在不另作详细描述的情况下，相信本领域的技术人员应该能够使用之前的说明最大限度地利用本发明。因此，应将下文的优选具体实施方式解读为仅是说明性的，而非以任何方式限制所要求保护的发明。
本领域已知的标准分子生物学操作规程并不在本文中作具体描述，其通常主要如以下书籍中所述：Sambrook等，《Molecular cloning:A laboratory manual》，Cold SpringsHarbor Laboratory，New-York(1989,1992)，和Ausubel等，《Current Protocols inMolecular Biology》，John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1988)。
本领域已知的标准有机合成操作规程并不在本文中作具体描述，其通常主要如以下书籍中所述：《Organic syntheses》第l-79卷,多个编者,J.Wiley，New York,(1941-2003)；Gewert等，《Organic synthesis workbook》,Wiley-VCH,Weinheim(2000)；Smith和March，《Advanced Organic Chemistry》,Wiley-Interscience，第5版，(2001)。
本领域已知的标准药物化学方法并不在本文中作具体描述，其通常主要如以下书籍中所述：《Comprehensive Medicinal Chemistry》系列，由多个作者和编者著，由Pergamon Press出版。
在不另作详细描述的情况下，相信本领域的技术人员使用之前的说明应该能够最大限度地利用本发明。因此，应将下文的优选具体实施方式解读为仅是说明性的，而非以任何方式限制所要求保护的发明。
本领域已知的标准分子生物学操作规程并不在本文中作具体描述，其通常主要如以下文献中所述：Vanderkerken K The 5T2MM murine model of multiple myeloma:maintenance and analysis，[Methods Mol.Med.113:191-205(2005)；Epstein J.TheSCID-hu myeloma model.Methods Mol.Med.113:183-90(2005)]。
抗体
*小鼠抗肽-6抗体是通过杂交瘤技术从肽-6免疫化的Balb/C小鼠开发出的小鼠单克隆抗体，并且属于IgM同型。
*嵌合抗肽-6IgG1小鼠抗体是由Antitope Ltd.使用实施例1所述的嵌合技术开发的。所得的嵌合抗体由小鼠抗体的小鼠可变区(如SEQ ID NO:1和2以及图1A和1B所示)和人IgG1同型的恒定区构成。
*基于小鼠参照抗体的人源化抗肽-6抗体是由Antitope Ltd.使用复合人抗体TM技术(在WO 2006/082406中有所描述)而制得的，如实施例2所述。
将带FITC标记的人源化抗体用于FACS分析。
在一些实施方式中，术语Proximab可以用来描述针对MT HSP65的肽-6表位的单克隆抗体。
*抗CD14-PE(Sigma)
*抗CD14-APC(Miltenyi Biotech)
*带HRP标记的小鼠抗人κ轻链(Sigma，目录号A7164)
*山羊抗小鼠IgM过氧化物酶(Sigma，目录号A8786)
*山羊抗人IgG过氧化物酶(Sigma，目录号A7164)
细胞系
*CHO dhfr-(ECACC，目录号94060607，批号05G020)
*THP-1(ATCC号TIB-202)单核细胞
*RAW鼠类巨噬细胞
*NSO细胞(ECACC 85 110503，Porton，英国)
限制性酶
*BssH II(New England Biolabs目录号R0199)
*BamH I(New England Biolabs目录号R0136)
*Mlu I(New England Biolabs目录号R0198)
*Hind III(New England Biolabs目录号R0140)
*SspI(New England Biolabs目录号R0132)
培养基和补充剂
*CD DG44(Invitrogen,目录号12610-010)
*Glutamax(Invitrogen,目录号35050)
*DMEM(Invitrogen,目录号41966)
*透析的FBS(Invitrogen,目录号26400)
*H/T(Invitrogen,目录号11067)
*CD-OptiCHO(Invitrogen,目录号12681-029)
*FBS(超低IgG，目录号16250-078Invitrogen,Paisley，英国)
*青霉素/链霉素(Invitrogen,Paisley，英国)
*DMSO(Sigma,目录号D2650)
*氨甲喋呤(Sigma,目录号A6770)
试剂和试剂盒
*Lipofectamine 2000(Invitrogen,目录号11668027)
*TMB底物(Invitrogen，目录号00-2023)或(Sigma，目录号T0440)
*Minerva BiolabsGeM支原体检测试剂盒(目录号11-1050)
*蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare，目录号110034-93)
*针对人IgG1/κ或IgG4/κ标准样(Sigma目录号I5154和I4631)的Fc捕捉/κ链检测ELISA(Sigma目录号I6260和A7164)
设备
*Binder CB150培育箱
*Dynex Technologies MRX TC II平板读取仪
*Vi-CELLTM XR计数器(Beckman Coulter)
*6孔组织培养板(Corning，目录号3516)
*MaxiSorp 96孔平底微孔板(Fisher，目录号DIS-971-030J)
*爱伦美氏烧瓶(Erlenmeyer flask)(Corning,目录号431407)
动物
*为获得佐剂诱导性关节炎模型，向6～8周龄雌性近交Lewis大鼠(HarlanLaboratories，以色列)的尾基部皮内注射含有1mg结核分枝杆菌(MT)H37Ra(Difco,Detroit,MI)的CFA(Difco)。
*为获得胶原诱导性关节炎模型，使用了9周龄的雄性DBA/1小鼠(HarlanLaboratories，以色列)。向小鼠尾基部皮下注射200μg乳化在CFA(Difco)中的II型胶原。三周后，用同样浓度的II型胶原对小鼠进行皮下注射加强。
*为获得TNBS结肠炎模型，用在50%乙醇中的160μl浓度为2.5%的半抗原化试剂TNBS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)通过皮肤涂抹来敏化Balb/C小鼠。
*用链脲霉素(70mg/kg)处理购自Harlan-Israel研究室的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，以用作I型糖尿病模型。
*向8周龄雌性C57BL/6小鼠的左侧腰区中皮下注射125μg髓磷脂少突细胞糖蛋白35～55肽(MOG35-55)(该肽乳化在含有5mg/ml热杀灭的结核分歧杆菌的完全弗氏佐剂(CFA)中)，以用作MS模型。
Cap1的克隆
用引物Cap1bamF(GCGTAGTC GGA TCC ATG GCT GAC ATG CAA AAT CTG G，SEQ ID NO:99)和cap1xhoyeshstopR(GCGTAGTC CTC GAG TTA TCC AGC AATTTC TGT CAC TGT GGT GAC C,SEQ ID NO:100)从THP-1 cDNA PCR扩增Cap1。将得到的约1400bp的PCR产物插入PGEMT载体(Promega)中，从而使Cap1在PGEMT中带有终止密码子(测序结果显示序列完整)。
接下来，用BamHI和XhoI将Cap1从pGEMT载体中切出。将1400bp条带连接到用同样的酶切开的经修改的Pet22b载体(Novagen)中，从而得到N端侧接有6×HIS且基因末端带有终止密码子的Cap1。
产生小鼠抗肽-6的杂交瘤的制备
用100μg悬浮在完全弗氏佐剂(CFA)中的肽-6(GPKGRNVVLEKKWGAP，如SEQ ID NO:15所示)对六周龄的雌性Balb/c小鼠或Lewis大鼠进行皮下注射。以三周为间隔，用含有该肽的不完全弗氏佐剂(IFA)再注射动物两次。收集血清，以用于通过ELISA来测量抗肽-6抗体的水平，向该水平最高的动物连续2次腹膜内注射含有50μg肽的PBS。次日，使脾细胞与BALB/c Ig-非分泌型骨髓瘤NSO细胞融合。通过特异性ELISA在上清液中检测到了特异性地识别肽-6(SEQ ID NO:15)的抗体的存在，并扩增阳性克隆。
从杂交瘤细胞的上清液中纯化出抗肽-6抗体。通过巯基吸附和随后的蛋白G色谱(Adar Biotech，以色列)来进行纯化。用SDS-PAGE来确定抗体的纯度。
人源化抗肽-6抗体的F(bb)2片段的制备
使用F(ab)2制备试剂盒基于胃蛋白酶消化(Pierce；按照制造商的操作说明)来产生人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的F(ab)2片段。使用DylightTM抗体标记试剂盒(Pierce；按照制造商的操作说明)用FITC标记F(ab)2片段。
人外周血单个核细胞(PBMC)的制备
从健康捐献者采集人静脉血，并在Ficol梯度上使之分层，从而分离并富集白细胞级分。离心(1800rpm，30分钟)后，收集单个核细胞的层，并将其转移到新管中，用20ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，并在1100rpm下离心10分钟。将细胞在24孔细胞培养板上铺平板，浓度为1.5×106个细胞/每孔，所述细胞在1ml RPMI中，该RPMI补充有2mM谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素(以上试剂来自Biological Industries，以色列)和10%人血清(Sigma)。
荧光激活细胞分选(FACS)分析
将106个PBMC细胞置于eppendorff管中(每100μl含有1%BSA和1%山羊血清(Sigma)的PBS中，有106个细胞)。随后，在4℃下，将细胞仅与抗CD14抗体温育1小时，或者与抗CD14抗体和人源化完整抗肽-6抗体或其F(ab)2一起温育1小时。随后用PBS清洗细胞，并通过LSRII流式细胞仪(BD)确定染色。使用FCS express 3程序(De novo)来分析数据。
ELISA——变体复合抗体与肽-6的结合
在黑暗中于室温用含5%戊二醛的PBS(每孔100μl)预处理Immulon MaxiSorp 96孔平底微孔板(Fisher，目录号DIS-971-030J)过夜，随后用含有10μg/ml肽-6(SEQ IDNO:15)的PBS于4℃进行过夜包被。用PBS/0.05%Tween 20清洗平板，随后用2%BSA/PBS封闭1小时。将抗体在2%BSA/PBS中稀释到100μg/ml的起始浓度。在平板上进行二倍稀释，随后将平板在室温下温育1小时。
每个ELISA平板都包括嵌合抗肽-6抗体作为阳性对照。清洗平板，向每个孔添加100μl PBS/0.05%Tween 20(其中以1:1000稀释有山羊抗人IgGκ过氧化物酶偶联物(Sigma，目录号A7164))。于室温温育1小时后，清洗平板，通过每孔添加100μl TMB底物(Simga，目录号T0440)显色而进行测定。每孔添加50μl 3M HCl来使反应停止。在450nm处读取吸光度(Dynex MRX TCII平板读取仪)，并用该吸光度对抗体浓度作图。
ELISA——对细胞因子水平的评估
使用来自R&D SYSTEMS,Minneapolis MN USA的特定试剂盒(按照制造商的操作说明)来对细胞培养物或动物血清中的细胞因子水平进行评估。
对佐剂诱导性关节炎的诱导和临床评价
向6～8周龄雌性近交Lewis大鼠(Harlan Laboratories，以色列)的尾基部皮内注射含有1mg结核分枝杆菌(MT)H37Ra(Difco,Detroit,MI)的CFA(Difco)。每隔一天由单盲观察者(blinded observer)对关节炎的严重程度(关节炎指数)作下述评价：0，无关节炎；1，关节发红；2，关节发红并肿胀。对每只爪的踝关节和跗骨-跖骨关节进行评分。可以获得最高16的评分。
佐剂诱导性关节炎中的组织病理学评价
将大鼠无痛处死，将后肢移除并在福尔马林中进行固定。用苏木紫和曙红(H&E)对关节进行染色，并由专业的兽医病理学家来作出评价。
对胶原诱导性关节炎的诱导和临床评价
向9周龄雄性DBA/1小鼠(Harlan Laboratories，以色列)的尾基部皮下注射200μg乳化在CFA(Difco)中的II型胶原。三周后，用同样浓度的II型胶原对小鼠进行皮下注射而加强。每天由单盲观察者用卡尺测量后足和前爪的直径，由此来评价关节炎的严重程度。作为对照，发明人测量了年龄大致相同的4只未注射胶原的小鼠。将健康小鼠的平均值作为“截断”度量。从加强注射后第5天开始，将评分值高于健康小鼠均值(一只或多只爪中的值)的每只小鼠都分配到某个治疗组中。
对半抗原介导性(TNBS)关节炎的诱导和临床评价
用160μl含有2.5%的半抗原化试剂TNBS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的50%乙醇通过皮肤涂抹来敏化Balb/C小鼠。一周后，经由3.5-French导管直肠内施用120μl含1%TNBS的50%乙醇。直肠内施用TNBS之后3天，处死小鼠。在敏化时、直肠内施用时和之后每天，都对动物进行称重，直至处死。通过评估体重损失和死后结肠组织的组织病理学来进行临床评价。
在TNBS关节炎中的组织病理学评价
在含4%福尔马林的磷酸盐缓冲盐水中固定组织，并将其包埋在石蜡中。用苏木紫和曙红对切片(5μm)进行染色。由单盲病理学家使用以下0～4的评分系统来评价炎症程度：0，无炎症迹象；1，低水平的白细胞浸润；2，中等水平的白细胞浸润；3，高水平的白细胞浸润、高血管密度、肠壁增厚；4，透壁浸润、杯状细胞损失、高血管密度、强烈的肠壁增厚、水肿。
在皮下和腹膜内施用后对血清人源化抗肽-6的药代动力学分析
将18只雄性DBA/1小鼠(7～8周龄)分为两组，每组9只小鼠。用500μgVH2/VK3以腹膜内途径处理第一组，用500μgVH2/VK3以皮下途径处理第二组，都在第0天进行。将每组分为3个子组，每个子组3只小鼠，对于每个子组的所有小鼠，在施用抗体后的同一天从眼部抽血。子组1在第0、第3和第8天抽血，子组2在第1、第4和第10天抽血，子组3在第2和第11天抽血。在实验结束时，将小鼠处死，抽血，收获器官(心、脾、肾、肺和肝)置于4%福尔马林中温育24小时，随后移至80%乙醇(其最适合用于免疫荧光载片制备)中。收集血清并保存在-20℃，以用于确定IL-10和VH2/VK3的含量。
MS的EAE模型——向8周龄雌性C57BL/6小鼠的左侧腰区中皮下注射125μg髓磷脂少突细胞糖蛋白35～55肽(MOG35-55)(该肽乳化在含有5mg/ml热杀灭的结核分歧杆菌的完全弗氏佐剂(CFA)中)，从而诱导EAE。之后立即向小鼠腹膜内接种0.5ml百日咳毒素(400ng)，并在48小时时再次向小鼠腹膜内接种0.5ml百日咳毒素(400ng)。7天后，通过向右侧腰区中额外注射含MOG35–55肽的CFA来进一步激发小鼠。用所示的本发明的人源化抗肽-6抗体、利妥昔单抗(Rituximab)或载质(PBS)来处理小鼠。
EAE临床评分按如下作出评估：
0-无临床疾病；
1-尾部虚弱；
2-后肢虚弱，足以损害翻正(righting)；
3-单肢瘫痪；
4-下身瘫痪，且前肢虚弱；
5-四肢瘫痪；
6-死亡。
实施例1
嵌合抗肽-6抗体的产生
作为产生抗肽-6人源化抗体的第一步，构建了其中重链可变区和轻链可变区(VH和VL)序列源自小鼠抗肽-6单克隆抗体的嵌合抗体。已确定了小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区(VH和VL)序列，并已产生了包含小鼠可变区和人IgG1或IgG4/κ恒定区的嵌合抗肽-6抗体。
简言之，从冷冻的小瓶中成功地使小鼠细胞复苏，并使用mRNA抽提试剂盒按制造商的操作说明(Promega，目录号Z5400)从杂交瘤细胞中抽提出mRNA。使用小鼠信号序列的简并引物池和单一恒定区引物来执行RT-PCR。使用含有6个简并引物池的组(5'引物：MuIgVH5’-A至F；3'引物：MuIgMVH3’-1和MuIgGVH3’-2，如表1所示)扩增了重链可变区mRNA，并使用含有8个简并引物池的组(5'引物：MuIGκVL5’-A至κG，和MuIGλVL5’-A；3'引物：MuIgκVL3’-1和MuIgλVL3’-1，如表1所示)扩增了轻链可变区mRNA。50μl反应混合物包含36.25μl PCR级水、5μl10×NovaTaq缓冲液、5.25μl dNTP(最终浓度为0.2mM)、2.5μl引物(10pmol/μl)和1μl(1.25U)NovaTaq DNA聚合酶(目录号7103-3)。反应条件为30～40个循环：94℃下变性1分钟，50℃下退火1分钟，72℃下延伸2分钟，72℃下最终延伸6分钟。扩增产物是用重链和κ轻链引物池而非从λ引物池获得的。因此，在每个情况中，轻链都来自κ簇。应注意的是，出于克隆目的，使用设计用来工程化引入5'MIuI和3'HindIII限制性酶切位点的引物来通过PCR扩增VH区基因。使用设计用来工程化引入BssHII和BamHI限制性内切酶位点的引物来扩增VL区。
表1：用于进行嵌合抗体克隆的引物
将扩增产物克隆至pSTBlue-1Perfectly Blunt克隆试剂盒(TB183，目录号70191-3)，或Single dA加尾试剂盒(TB059，目录号69282-3)和pSTBlue AccepTor载体克隆试剂盒(TB248，目录号70595-3)中中，并进行测序。所得到的小鼠VH氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和VL氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于图1A～1B中。对表2所示的序列的简单分析表明这些可变区序列都无异常。
表2：抗体序列分析
aCDR的界定和蛋白序列编号根据Kabat
b所示种系ID之后是%同源性
嵌合抗体的表达
随后将小鼠将可变区转移至用于IgG1和IgG4重链的表达载体系统中。更具体而言，分别在MluI/HindIII位点和BssHII/BamHI位点将VH和VL区PCR产物分别克隆到载体pANTVhG1/4和载体pANTVκ中(图2)。pANTVhG1/4和pANTVκ均为含有人Ig表达盒的pAT153类质粒。pANTVhG1/4中的重链盒由hCMV启动子所驱动的人基因组IgG1恒定区基因和下游的人IgG4聚A区组成。pANTVhG1/4还包含SV40启动子所驱动的仓鼠dhfr基因和下游的SV40聚A区。
pANTVκ的轻链盒由hCMV启动子所驱动的人基因组κ恒定区和下游的轻链聚A区组成。人Ig前导序列和恒定区之间的克隆位点允许插入可变区基因。
通过电穿孔用这两种质粒共转染NSO细胞(ECACC 85 110503,Porton,英国)，并且在DMEM(Invitrogen,Paisley，英国)+5%FBS(超低IgG，目录号16250-078，Invitrogen,Paisley，英国)+青霉素/链霉素(Invitrogen,Paisley，英国)+100nM氨甲喋呤(Sigma,Poole，英国)中进行选择。鉴定出了大量的具有氨甲喋呤抗性的集落，并扩增对IgG表达呈阳性的细胞系。此外，通过基于脂质的传递系统短暂转染了CHO-K1细胞。转染后72小时，收获细胞培养基，以用于抗体纯化。在蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare，目录号110034-93)上从细胞培养物上清液中纯化出嵌合小鼠抗体，并适当地使用针对人IgG1/κ或IgG4/κ标准样(Sigma目录号I5154和I4631)的Fc捕捉/κ链检测ELISA(Sigma目录号I6260和A7164)来进行定量。嵌合小鼠-人Vκ、VH IgG4和VH IgG1的完整载体核酸序列分别由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11表示。
嵌合抗体与肽-6的结合
相对于参照小鼠单克隆抗体，用ELISA评估了嵌合小鼠IgG1抗体与肽-6(SEQ IDNO:15)的结合。用2%BSA/PBS将抗体稀释到300μg/ml(30μg/孔)的起始浓度，随后在平板上对其进行二倍稀释。在预先包被有10μg/ml(100μl/孔)肽-6的Nunc ImmunoMaxiSorp 96孔平底微孔板(Fisher，目录号DIS-971-030J)上将这些抗体稀释液于室温温育1小时。每孔添加100μl适合的二抗：山羊抗小鼠IgM过氧化物酶，或山羊抗人IgG过氧化物酶。于室温再温育1小时后，通过每孔添加100μl TMB底物(Simga，目录号T0440)显色而进行测定。每孔添加50μl 3M HCl来使反应停止。
在450nm处读取吸光度(Dynex MRX TCII)，并用吸光度对抗体浓度作图。如图3所示，嵌合小鼠结合曲线并未在最高浓度处出现平台(plateau)，因此未确定准确的ED50值。然而，与小鼠单克隆参照抗体(图3A)的结合进行的比较表明，嵌合小鼠抗体(图3B)的结合效率比参照抗体的更高。此外，结合效率看似并未因从五聚体IgM转变为单体IgG而下降。
实施例2
小鼠抗肽-6抗体的复合人抗体变体的产生
接下来为小鼠单克隆抗体产生了抗肽-6复合人抗体。通常，人可变区(V区)序列的区段来源于不相关的人抗体序列数据库。对每个选出的序列区段(以及区段间的连接)测试与II类MHC结合的潜力，并且将所有最终的复合人抗体序列变体设计成避免T细胞表位。复合人抗体的V区基因是使用编码人序列区段的组合的合成寡核甘酸来产生的。随后将其克隆至含有人恒定区的载体中，制造出抗体，并通过竞争ELISA测试与靶抗原的结合。
复合人抗体可变区序列的设计
复合人VH和VL序列是通过以下方法来设计的：将小鼠序列与不同的天然存在的人VH和VL序列的片段进行比较，并选择出这些人片段来构造复合人序列。更具体而言，使用Swiss PDB产生了小鼠单克隆抗体V区的结构模型，并对其进行分析，从而鉴定出位于小鼠V区中的、可能参与抗体与抗原的结合的重要的“约束性”氨基酸。因此，对人VH和VL序列片段的选择会因参照小鼠抗体中对应位置上的某些氨基酸的存在而受到约束，这些氨基酸被认为会潜在地参与抗体结合。包含在CDR(使用Kabat和Chothia定义)中的残基以及多个FR(框架区)残基被认为与此有关。更具体而言，对于VH，约束性氨基酸为：位于H22位的Cys、位于H23位的Ser、位于H26位的Gly、位于H27位的Phe、位于H28位的Ser、位于H29位的Leu、位于H30位的Ser、位于H31位的Thr、位于H32位的Ser、位于H33位的Asn、位于H34位的Met、位于H35位的Gly、位于H35A位的Val、位于H35B位的Gly、位于H48位的Leu、位于H50位的His、位于H51位的Ile、位于H52位的Leu、位于H53位的Trp、位于H54位的Asn、位于H55位的Asp、位于H56位的Ser、位于H57位的Lys、位于H58位的Tyr、位于H59位的Tyr、位于H60位的Asn、位于H61位的Pro、位于H62位的Ala、位于H63位的Leu、位于H64位的Lys、位于H65位的Ser、位于H92位的Cys、位于H95位的Met、位于H96位的Gly、位于H97位的Gly、位于H98位的Tyr、位于H99位的Tyr、位于H100位的Gly、位于H100A位的Asn、位于H100B位的Tyr、位于H100C位的Gly、位于H100D位的Tyr、位于H100E位的Tyr、位于H100F位的Ala、位于H100G位的Met、位于H101位的Asp和位于H102位的Tyr，且可选地为位于H49位的Leu、位于H74位的Tyr、位于H11位的Ile、位于H41位的Ser和位于H108位的Ser中的至少一个。对于VK，约束性氨基酸为：位于L1位的Gln、位于L23位的Cys、位于L24位的Thr、位于L25位的Ala、位于L26位的Ser、位于L27位的Ser、位于L27A位的Ser、位于L28位的Val、位于L29位的Ser、位于L30位的Ser、位于L31位的Ser、位于L32位的Tyr、位于L33位的Leu、位于L34位的His、位于L47位的Trp、位于L50位的Ser、位于L51位的Thr、位于L52位的Ser、位于L53位的Asn、位于L54位的Leu、位于L55位的Ala、位于L56位的Ser、位于L71位的Tyr、位于L88位的Cys、位于L89位的His、位于L90位的Gln、位于L91位的Tyr、位于L92位的His、位于L93位的Arg、位于L94位的Ser、位于L95位的Pro、位于L96位的Pro和位于L97位的Thr，且可选地为位于L21位的Met、位于L10位的Ile和位于L80位的Ala中的至少一个(Kabat编号)。参照小鼠抗体的VH和VK序列都含有许多典型的邻近CDR的人FR残基基序，而据发现，两种链的CDR1和CDR2基序均与许多鼠类抗体相当。据以上分析，据认为，在产生用于人源化抗体的复合人序列时，在CDR外部可以使用大量的替代性残基，但在CDR序列内仅可使用很少的可行的替代性残基。初步分析表明，可以将来自若干种人抗体的对应序列区段组合以产生与小鼠序列中的CDR相似或相同的CDR。对于CDR的外部和侧翼鉴定出作为新型复合人抗体可变区的可行组成部分的人序列区段的大量选择。
表位避免和变体设计
基于以上分析，对可以用于产生基于小鼠的抗肽-6复合人抗体变体的大量初级序列区段进行选择，使用用于分析肽与人II类MHC等位基因的结合的iTopeTM技术(如PCT/GB2007/000736所述)并使用已知的抗体序列相关的T细胞表位的TCEDTM(T细胞表位数据库，Antitope Ltd.)数据库对这些区段进行分析。将经鉴定具有显著的结合非人II类MHC的肽的序列区段或针对TCEDTM具有显著的命中评分的序列区段弃去。这样减少了区段的数量，再对这些区段的组合进行上述分析，以确保区段间的连接部分不含潜在的T细胞表位。随后将表3所示的经选择的区段组合起来以产生用于合成的重链和轻链可变区序列，又如图4所示。
表3：用于组装复合人序列的序列区段
复合人抗体TM变体的构建
使用一系列重叠的寡核苷酸合成了初始变体1复合人抗体TM的VH和VK区基因，这些寡核苷酸经过退火、连接和PCR扩增而产生全长的合成V区。使用长的重叠的寡核苷酸和PCR，以初始变体1为模板，构造了后续的复合人抗体序列变体。为了包含用于克隆的限制性酶切位点，还将侧翼核苷酸序列添加到了基因两端。VH基因引入了分别含有MluI和HindIII限制性位点的额外的短5'序列和3'序列。MluI位点位于信号序列中，HindIII位点位于紧接VH基因剪接供体位点下游的第一个内含子中。VK基因引入了含有BssHII限制性位点的额外的短5'序列和包含BamHI限制性位点的延伸的3'序列。BssHII位点位于信号序列中，BamHI位点位于VK基因剪接供体位点下游32个核苷酸处的内含子中。侧翼序列示于图5中，载体示意图在图2中。构造了4种重链和3种轻链。图6呈现了这些变体的氨基酸序列和编码核酸序列[分别由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23(氨基酸序列)以及SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(核酸序列)表示的重链可变区VH1～VH4，分别由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26(氨基酸序列)以及SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33(核酸序列)表示的轻链可变区VK1～VK3]。
将所合成的基因克隆至T/A克隆载体中，以用于序列确认和扩增。用MluI和HindIII消化纯化的VH基因载体DNA，用BssHII和BamHI消化纯化的VK基因载体DNA，并在琼脂糖凝胶上分离所得到的片段。将变体基因的条带从凝胶上切下，纯化，并连接到以相似方式消化并纯化的表达载体DNA上。在转化到大肠杆菌XL1-blue中之后，就是否存在插入序列而对菌落进行PCR筛选。选出阳性集落并使之生长，纯化载体DNA并进行测序以确认插入序列的身份。按下述方法来制备确认了VH和VK的DNA制备物以用于转染NS0细胞：将总共30μgDNA按1:2的摩尔比混合，用限制性酶SspI进行消化使该DNA线性化。用乙醇沉淀经消化的DNA，并将该DNA重悬于50μl pH7.4的PBS中。
变体抗体的表达和纯化
通过电穿孔将复合重链(VH1～4)和轻链(VK1～3)的所有组合(即，共12种配对)稳定转染至NS0细胞中，并使用200nM氨甲喋呤(Sigma目录号M8407-500MG)对其进行选择。测试了每个构建体的氨甲喋呤抗性集落的IgG表达水平，并选出表达最佳的品系进行液氮冻存。
在蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare目录号110034-93)上从细胞培养物上清液中纯化出IgG1变体，并使用基于表4所示的所预期的氨基酸序列的消光系数Ec(0.1%)通过OD280nm来进行定量。纯化出了超过2mg的每种抗体，并用SDS PAGE进行了分析。观察到了与重链和轻链的预期大小对应的条带，且无证据表明有任何污染(未示出)。
表4：抗体变体的Ec(0.1%)值
  变体   Ec(0.1%)
  小鼠嵌合体   1.62
  人源化Ab变体：   1.62
  VH1-VK1
  VH1-VK2
  VH1-VK3
  VH2-VK1
  VH2-VK2
  VH2-VK3
  人源化Ab变体：   1.60
  VH3-VK1
  VH3-VK2
  VH3-VK3
  VH4-VK1
  VH4-VK2
  VH4-VK3
变体抗体与肽-6的结合
如实验程序部分所述，相对于嵌合小鼠-人抗体，用ELISA评估了每种人源化IgG1变体与肽-6的结合。如图7所示，所有抗体变体与肽-6的结合都至少与嵌合小鼠-人抗体的结合一样好，一些似乎结合得明显更好。如该图所示，不能通过计算ED50值来对嵌合抗体和人源化变体的结合进行定量，这是因为在多数情况下曲线都未达到平台期，并且对一些抗体来说未获得50%最大信号值。
但是，在表观结合上，变体之间存在差异。发明人已注意到，含有VH1的变体产生持续性的高背景结合，因此不会认为其是优选的变体。同时考虑结合情况(图7)和序列数据，认为VH2/VK1、VH2/VK2、VH2/VK3和VH3/VK2是最好的四个候选者。其中，VH2/VK2和VH2/VK3明显是最佳的结合者，而VH2/VK3在后续的实验中在同一平板上与VH2/VK2直接比较时产生了略微更佳的结合(数据未示出)。
综上所述，如本发明所示，已从完全源自不相关人抗体可变区的氨基酸序列区段构建了对肽-6有特异性的复合人抗体。复合人抗体变体中的所有CDR和框架区都包含超过一种的不相关人序列区段(源自人序列数据库)，并且所有的复合人抗体都被特定地设计成避免T细胞表位。选择了四种变体，其中一些展示出比嵌合参照抗体更好的结合。
实施例3
嵌合单克隆抗肽-6IgG抗体诱导人PBMC分泌IL-10
在展示了嵌合小鼠-人抗肽-6IgG抗体与肽-6(图3)结合并诱导PBMC中的IL-10分泌(图8)之后，发明人还分析了IL-10分泌的体外剂量依赖性。从健康捐献者收集人PBMC，并与不同剂量的嵌合小鼠-人抗肽-6抗体温育48小时。将未处理的细胞作为对照。收集上清液并用IL-10 ELISA检测试剂盒(R&D systems)进行测定。如图8所示，与未处理的细胞相比，用嵌合抗肽-6抗体处理过的细胞分泌出的IL-10显著增多，此外还示出了初始剂量响应效果(20μg/ml和50μg/ml)。
实施例4
嵌合单克隆抗肽-6IgG抗体抑制已确立的佐剂诱导性关节炎(AA)
接下来本发明人还在确立的关节炎实验模型中检查了嵌合小鼠-人抗肽-6IgG抗体的体内效果。在第0天用含MT的CFA对50只Lewis大鼠免疫来诱导关节炎，通过临床评分来测量关节炎的严重程度。在注射了MT的50只大鼠中，有43只发展了关节炎。在第16天，将关节炎评分最高的动物合并到5个组中(其中4组每组有6只大鼠，还有1组有7只大鼠)，其中平均疾病严重程度为6.16～6.7。
在疾病达到峰值时，用以下抗体来处理大鼠：a.小鼠抗肽-6抗体(IgM)；b.嵌合小鼠-人抗肽-6抗体(嵌合小鼠-人，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。用盐水和利妥昔单抗(以在大鼠中不存在的分子为靶标的一种嵌合抗体，F.Hoffmann-La Roche Ltd)来处理对照大鼠。在第17天(正好在疾病达到峰值之前)和第21天以5mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)施用抗体。
在实验结束时，处死大鼠，将经对照处理的大鼠和经嵌合小鼠-人抗肽-6处理的大鼠的后爪移除，以用于病理学分析。
如图9所示，小鼠IgM和嵌合小鼠-人IgG1抗肽-6抗体均使AA的严重程度显著下降。作为对照的嵌合利妥昔单抗对AA没有影响，因此可以排除通过这些抗体的人Fc片段而产生的影响。
此外，图10绘出并比较了来自用嵌合小鼠-人抗肽-6抗体处理过的大鼠和用对照抗体利妥昔单抗处理过的大鼠的关节的病理学发现。来自用嵌合抗肽-6抗体处理过的大鼠的关节具有正常结构(图10B)，而来自用利妥昔单抗处理过的大鼠的关节则显示出明显的纤维化和反应性骨膜骨的形成(图10A)。反应骨形成被纤维结缔组织包围的小叶，从而形成固体纤维-骨质团块。
实施例5
与Enbrel和甲基强的松(MPS)类似，嵌合抗肽-6抗体抑制已确立的佐剂诱导性关节炎，并表明与MPS具有协同效应
抗肽-6抗体的免疫调节效果是其治疗潜力的基础。因此应认识到的是，可以将这些抗肽-6抗体作为唯一治疗剂或与其他抗炎剂组合来进行使用。本发明人因此评估了带有/不带有抗炎剂(例如依那西普(Enbrel)或甲基强的松(MPS))的嵌合抗肽-6抗体对Lewis大鼠中的AA的效果。
在第0天用MT/CFA对Lewis大鼠免疫。在第16天，将大鼠分为6组，每组6只大鼠。在第17天，对大鼠进行如下处理：第1组，PBS(i.p.，腹膜内)；第2组，嵌合小鼠-人抗肽-6抗体(腹膜内5mg/kg)；第3组，Enbrel(皮下(s.c)(0.5mg/kg))；第4组，甲基强的松(MPS)(皮下5mg/kg)；第5组，嵌合小鼠-人抗肽-6抗体(腹膜内5mg/kg)和Enbrel(皮下0.5mg/kg)；第6组，嵌合小鼠-人抗肽-6抗体(腹膜内5mg/kg)和MPS(s.c.5mg/kg)。
在图11中可以看到，在抑制关节炎的严重程度方面，所有处理都有效。嵌合小鼠-人抗肽-6抗体在单独施用时，其有效性与MPS或Enbrel类似。此外，当嵌合抗肽-6抗体与高剂量的MPS一起施用时，取得了更高水平的疾病抑制，从而表示二者的组合具有潜在的协同效应。
实施例6
人源化抗肽-6抗体与人巨噬细胞(CD14+细胞)结合
在展示了实施例2所述的人源化抗肽-6抗体变体与肽-6(图7)显著地结合后，本发明人还分析了最有效的变体(VH2/VK3)在结合人巨噬细胞中的效果。从健康捐献者收集人PBMC(106个)，单独用抗CD14抗体(偶联有APC)对该人PBMC进行染色，或用该抗CD14抗体与人源化VH2/VK3抗肽-6抗体(偶联有FITC；10μg)一起对该人PBMC进行双染色。随后通过FACS对细胞进行分析与抗体的结合。CD14标志物存在于巨噬细胞上，因此呈CD14染色阳性的细胞可表明对人巨噬细胞的染色。
图12A和12B的密度图中所呈现的结果显示出人源化的VH2/VK3抗肽-6抗体与多数CD14阳性细胞(巨噬细胞占分离的细胞总数的约10%，图12A的右下象限)结合。这些结果与原始小鼠单克隆抗体(IgM)与人巨噬细胞的结合(数据未示出)相似。图12C的柱状图中的结果绘出了被FITC染色的细胞占CD14+总数的百分比(无抗肽-6抗体—黑色，有抗肽-6抗体—白色)，显示出人源化抗肽-6抗体结合了较大百分比的CD14+总数。
实施例7
人源化抗肽-6抗体结合腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1)
在之前的专利申请IL2010/000231(尚未公开)中，发明人已展示出，抗肽-6抗体识别巨噬细胞表面上的亲水性膜蛋白。质谱分析将该靶蛋白鉴定为腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1)。这些结果得到了下述现象的进一步支持：抗CAP1识别的蛋白保留在抗肽-6亲和柱上(而不是在对照利妥昔单抗柱上)。
为了验证人源化抗肽-6变体抗体像嵌合抗肽-6抗体那样识别CAP1，发明人使用人源化VH2/VK3变体进行了蛋白质印迹分析。克隆了N端融合有His标签的人CAP1，并在大肠杆菌BL21中进行表达。在Ni-琼脂糖凝胶柱上通过亲和色谱从细菌裂解物的上清液中富集该蛋白。将洗脱液用于SDS-PAGE，随后对其和对照(一种不相关的带His标签的蛋白，His CREB)一起进行蛋白质印迹分析。制备了3个相似的印迹并将其与以下抗体用于检测：商购的小鼠抗人CAP1，商购的小鼠抗His，和本发明的人源化抗肽-6抗体。在图13中可以看到，人源化VH2/VK3特异性地识别带His标签的CAP1蛋白，进一步表明该特定变体保留了结合CAP1并通过CAP1潜在地进行信号传导的能力。
实施例8
人源化VH2/VK3变体抗肽-6抗体显著地诱导人PBMC分泌IL-10
既然VH2/VK3变体(包含重链可变区SEQ ID NO:21和轻链可变区SEQ ID NO:26)在与肽-6结合时最有效(图7)并且还显示出与人巨噬细胞的显著结合(图12)，发明人接下来分析了该抗体在体外生物检测IL-10分泌时的活性。发明人还分析了有效与肽-6结合的其他人源化抗肽-6抗体变体(VH2/VK1)的IL-10分泌。从健康捐献者收集人PBMC，并与200μg的人源化抗肽-6变体VH2/VK1或VH2/VK3温育48小时。将未处理的细胞作为对照。收集上清液并用IL-10 ELISA检测试剂盒(R&D systems)进行测定。
如图14清楚显示，与用人源化VH2/VK1抗肽-6抗体变体处理的细胞或未处理的细胞相比，由用人源化VH2/VK3抗肽-6抗体处理过的细胞分泌出的IL-10显著增多。用VH2/VK3看到的这些结果与之前用嵌合抗肽-6抗体示出的发现(图8)类似。这些的结果表明，VH2/VK3变体，而非VH2/VK1变体，保留了抗肽-6抗体的这种生物活性。
实施例2(图7)展示了不同的VH和VK人源化抗体变体的肽-6结合动力学。在其下一个实验中，发明人试图评估抗体变体的肽-6结合亲和力与IL-10诱导之间的相关性。发明人使用了包被有肽-6的ELISA平板(如在实施例2中)来评估VH3/VK2、VH2/VK3、VH2/VK1和VH2/VK2的肽-6亲和力，并且从与33μg/ml或100μg/ml的每种抗体变体一起温育过的PBMC培养物中收集上清液来确定IL-10诱导。图15A显示，通常，100μg/ml的抗体比33μg/ml的抗体诱导更高的IL-10表达，且VH2/VK3变体比其他变体诱导更高的IL-10表达。图15B图示了不同变体的肽-6结合亲和力，表明最高的亲和力也由VH2/VK3显示。然而，令人惊奇的是，对于其他抗体，肽-6结合和IL-10诱导并不严格相关。
由于显示出了最佳的IL-10诱导，所以选择VH2/VK3来作为用于进一步的体内实验的最佳抗体。
实施例9
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的F(ab)2片段与人巨噬细胞(CD14+细胞)结合并诱导人PBMC分泌IL-10
为了确认使用VH2/VK3抗体所显示出的效果并非由该抗体的Fc部分介导，发明人制备了VH2/VK3抗肽-6抗体的F(ab)2片段，并评估了其对与人巨噬细胞结合和诱导IL-10分泌的效果。
从健康捐献者收集人PBMC(106个)，仅用抗CD14抗体(偶联有PE)对该人PBMC进行染色，或用该抗CD14抗体与人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的F(ab)2片段(偶联有FITC；10μg)一起对该人PBMC进行双染色。随后通过FACS对细胞分析抗体结合。在一个单独的实验中，从健康捐献者收集人PBMC，并与150μg的人源化抗肽-6VH2/VK3抗体的F(ab)2片段温育48小时。将未处理的细胞作为对照。收集上清液并用IL-10 ELISA检测试剂盒(R&D systems)进行测定。
图16A和16B的密度图中所呈现的结果显示出人源化的VH2/VK3抗肽-6抗体的F(ab)2片段与CD14阳性细胞(巨噬细胞占捐献者的分离的细胞总数的约11%，图16A的右下象限)结合。这些结果与完整的VH2/VK3抗肽-6抗体与人巨噬细胞的结合(图12B)相似。图16C的柱状图结果绘出了被FITC染色的细胞占CD14+总数的百分比(无抗肽-6抗体的F(ab)2片段—黑色，有抗肽-6抗体的F(ab)2片段—白色)，显示出人源化抗肽-6抗体的F(ab)2片段与较大百分比的CD14+总数结合。
如图17所示，与未处理的细胞相比，用人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的F(ab)2片段处理过的细胞分泌出的IL-10显著增多。这些结果与以上绘出的用完整VH2/VK3抗肽-6抗体使IL-10分泌增加的结果(图14)类似。这些发现清楚地表明并确认了VH2/VK3抗肽-6抗体的功能特性与该分子的F(ab)2部分的抗原结合区有关。
实施例10
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体抑制已确立的佐剂诱导性关节炎
接下来，本发明人在确立的关节炎实验模型中检查了人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的体内效果。在第0天用MT/CFA对Lewis大鼠免疫来诱导关节炎，通过临床评分来测量关节炎的严重程度。在第14天，将大鼠分为3组。在第15天，接近疾病峰值时，对大鼠进行如下处理：第1组，PBS(腹膜内)；第2组，人源化VH2/VK3(腹膜内2.5mg/kg)；第3组，嵌合小鼠-人抗肽-6抗体(腹膜内5mg/kg)。
在图18中可以看到，与经PBS处理的动物相比，人源化VH2/VK3抗肽-6抗体在显著抑制已确立的AA的严重程度方面是有效的，这与嵌合小鼠-人抗肽-6抗体相似。
实施例11
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体在具有确立的佐剂诱导性关节炎的大鼠的血清中诱导IL-10的分泌
此外发明人评估了在具有确立的关节炎的动物的血清中人源化抗肽-6抗体对诱导IL-10分泌的体内效果。在第0天用MT/CFA对Lewis大鼠免疫。在第11天和第15天，用人源化VH2/VK3(IP 1mg/kg)或用作为对照的PBS来处理大鼠。通过临床评分来评估关节炎的严重程度，在第19天处死动物，并用ELISA(R&D systems)测量各种细胞因子的血清水平。将健康的未处理的动物的血清用作对照。
在图19中可以看到，在用人源化VH2/VK3处理过的佐剂诱导性关节炎动物中，存在IL-10水平的明显诱导。这些发现与用人源化VH2/VK3处理时的关节炎严重程度减轻(图18)相关联。
此外，在施用VH2/VK3后，在关节炎动物中升高的其他细胞因子(例如IL-6和IFN-γ)的水平下降，而在所有组中其余细胞因子(例如IL-4、IL-17、IL-1和TNFα)的水平仍可忽略。
实施例12
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体抑制胶原诱导性关节炎
接下来，本发明人在其他关节炎实验模型(即小鼠中的胶原诱导性关节炎(CIA)模型)中检查了人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的体内效果。在第0天用乳化在CFA中的II型胶原对雄性DBA/1小鼠免疫来诱导关节炎，并在第21天给予加强剂量。在加强注射后2.5周内，85%的小鼠发展了CIA。在疾病的临床迹象出现时，用单剂量的人源化VH2/VK3抗肽-6抗体(腹膜内200μg)或Tris缓冲的盐水(TBS)处理小鼠。
在图20中可以看到，与TBS对照处理相比，人源化VH2/VK3抗肽-6抗体在显著抑制已确立的CIA的严重程度方面是有效的。
实施例13
人源化抗肽-6抗体诱导类风湿性关节炎患者的PBMC分泌IL-10
根据实施例8(其中人源化抗肽-6抗体显示诱导健康捐献者的PBMC的IL-10表达)和实施例11(其显示用人源化抗体进行的处理在AA大鼠血清中诱导了更高的IL-10水平)，发明人评估了VH2/VK3变体在收集自类风湿性关节炎(RA)患者的PBMC中诱导IL-10的功效。从两位RA患者收集PBMC，并与或不与200μg人源化抗肽-6抗体(VH2/VK3)温育48小时。随后，测定上清液中的分泌出的IL-10的含量。在图21中清楚可见，VH2/VK3变体诱导经处理的PBMC分泌强烈增加量的IL-10。
实施例14
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体改善TNBS结肠炎，一种炎性肠病(IBD)的动物模型
根据抗肽-6抗体的独特的抗炎机制，发明人评估了人源化VH2/VK3抗肽-6抗体在另一种自身免疫炎性疾病实验模型中的效果。此处所述的模型是TNBS结肠炎模型，为一种IBD动物模型。
通过TNBS皮肤涂抹来敏化20只Balb/C小鼠(指定为第-7天)，然后在一周以后直肠内施用TNBS(指定为第0天)。在三个时间点(-6、-2、+1)经由腹膜内注射施用人源化VH2/VK3抗体(200μg)来处理动物，并将其与未处理的对照动物比较。在敏化时、直肠内施用时和之后每天，都对所有动物进行称重。在对照组中出现明显体重损失(>5%)后，在直肠内施用后三天(指定为+3)处死动物，除去结肠组织并送去进行组织病理学分析。
在图22和图23中可以看到，人源化VH2/VK3抗体在显著抑制与所述疾病有关的体重损失和炎性应答方面是有效的。这可以从每组的总体显微镜疾病评分(与对照小鼠相比，*p<0.05)和代表性的组织学图片(放大率×100)中看出。在经VH2/VK3处理的小鼠的结肠中看到了最小的炎性应答，而在对照小鼠的结肠中看到了显著的炎症。
实施例15
与对照抗体相比，人源化VH2/VK3抗肽-6抗体改善TNBS结肠炎的严重程度
发明人已在实施例14中指出，VH2/VK3变体改善了在小鼠IBD模型中由半抗原化试剂TNBS所产生的有害效果。为了进一步支持这些结果，发明人进行了相似的实验，将人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的效果与利妥昔单抗阴性对照mAB和PBS(载质)进行了比较。
通过TNBS皮肤涂抹来敏化Balb/C小鼠(第-7天)，然后在一周以后直肠内施用TNBS(指定为第0天)。在敏化后，以及在直肠内诱导后第1天，施用VH2/VK3变体(8mg/kg)、利妥昔单抗(8mg/kg)或PBS。在敏化时、直肠内施用时和之后每天，都对小鼠进行称重。在对照组中出现明显体重损失后，在直肠内施用后三天(第3天)处死动物。
图24清楚地显示，人源化抗肽-6VH2/VK3变体在抑制体重损失方面是有效的，其将TNBS所诱导的体重损失最小化至3.5%，而相比之下经PBS处理的动物的体重损失为15%，经利妥昔单抗处理的动物的体重损失为14%。
实施例16
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体用于治疗糖尿病小鼠模型中的糖尿病
受本发明的抗体对关节炎和IBD模型中的炎性病况的有益效果的鼓舞，发明人接下来使用小鼠糖尿病模型检查了人源化抗肽-6抗体对另一免疫相关病症的潜在有益效果。因此，接下来用NOD小鼠作为糖尿病模型检查了VH2/VK3变体在预防和/或改善糖尿病中的可能用途。
发明人使用NOD小鼠，通过在第8周和第12周向NOD小鼠(n=8只/组)静脉内(i.v.)施用8mg/kg的人源化VH2/VK3抗肽-6抗体，检查了人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的效果。给予对照小鼠PBS。每隔一周监测小鼠的血糖水平和重量。
实施例17
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体用于治疗银屑病
在由20位17～71岁的患者(10男10女)组成的样本中进行试验。每种银屑病形式都有代表：斑块状银屑病、头皮银屑病、滴状银屑病、红皮性银屑病和反转型银屑病(reversed psoriasis)。
治疗由以下方案构成：每两周静脉内注射一次5mg/kg体重的VH2/VK3变体，并持续1个月(施用3次)。
在此研究中未使用银屑病的任何常规疗法，从而使所得到的结果仅能够归因于VH2/VK3变体。
还检查了局部应用人源化抗肽-6抗体的效果。因此，将500μl安慰剂(PBS)或500μl(10mg/ml)VH2/VK3变体置于防水闭塞绷带上。随后，将闭塞绷带置于银屑病患者的左肘(VH2/VK3变体)和右肘(PBS)上，在治疗开始时，该患者的双肘处均有较大的可见的银屑病斑块。
每天更换新的闭塞绷带。在更换新的闭塞绷带时，除去之前施用的物质的残留物并评估毒理学，随后放置带有新鲜抗肽-6VH2/VK3变体或PBS的新鲜闭塞绷带。通过数码照相来记录肘和膝的病况，其中所有照片上都带有自动的时间印记。
该治疗实施了4天，期间监视了受治疗的银屑病斑块的光滑化和带有正常外观皮肤的复原。
实施例18
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体用于治疗和预防小鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
为了进一步研究人源化VH2/VK3抗肽-6抗体对免疫相关病症的效果，接下来使用EAE来作为多发性硬化(MS)的模型。在实验的第1天和第7天向8周龄的雌性C57BL/6小鼠注射髓磷脂少突细胞糖蛋白35～55肽(MOG35–55)，从而诱导EAE。如实验程序部分所述，在实验的第1天和第2天对小鼠进一步步接种。如实验程序部分所详细描述的，对四组小鼠(每组有10只小鼠)进行临床评分评估。为检查人源化抗肽-6抗体的潜在预防性和保护性效果，使第1组(A)每周接受VH2/VK3变体(200μg)治疗，该治疗起始于注射MOG前3天并终止于第37天，随后在第37天至第52天用载质处理该组。第2组(B)小鼠每周用VH2/VK3变体(200μg)治疗，该治疗起始于注射MOG后第7天，并延续至第52天实验结束之时。第3组(C)每周接受VH2/VK3变体(200μg)治疗，该治疗起始于第1天，并延续至第52天实验结束之时。对照组(D)从第1天直至第52天实验结束之时都用载质(PBS)处理。
根据实验程序部分所说明的标准，对这些小鼠进行临床评分。
实施例19
剂量增加的人源化VH2/VK3抗肽-6抗体没有任何显著的病理学效果
发明人接下来评估了施用剂量递增的人源化VH2/VK3抗肽-6抗体在动物中的安全性。将10只雄性Balb/C小鼠(7周龄)分为5组，每组2只小鼠，并且用剂量递增的小鼠抗肽-6 IgM抗体或人源化VH2/VK3抗体(在两个单独的实验中)对小鼠进行一次如下腹膜内处理：
每隔一天观察小鼠的体重变化、行为以及其他异常体征。2周后，处死小鼠，移除心、肝、肺、脾和肾以用于病理学分析。
结果如下:
1.行为监督
每隔一天观察小鼠。其行为正常，其外表(包括其毛皮、皮肤和眼)无变化。在其食物消耗和其随时间而增加的体重方面未见到变化。
2.病理学发现
即使在最高剂量40mg/kg时也无显著的病理学发现，由此提供了关于施用抗肽-6抗体(特别是人源化VH2/VK3)的安全性的初始数据。
实施例20
人源化VH2/VK3抗肽-6抗体的药代动力学特征
本发明的一个重要应用是使用本发明的抗体治疗患者。为实现此目的，必须绘出抗体的体内半衰期。因此，发明人确定了残留在小鼠血液中的所注射的人源化Ab(VH2/VK3变体)的随时间推移的水平。在第0天用500μgVH2/VK3以腹膜内(i.p.)途径处理一组7～8周龄的DBA/1小鼠，并且在第0天用500μgVH2/VK3以皮下(s.c.)途径处理另一组。将这两组各自再分为3组，在注射后不同的天对每组进行后眼窝采血，即，子组1：第0、第3和第8天，子组2：第1、第4和第10天，子组3：第2和第11天。收集血清并保存在-20℃，以用于确定VH2/VK3。图25示出了11天期间的VH2/VK3的血清含量，其表明，对于腹膜内施用和皮下施用，血清半衰期均为约10天。
实施例21
PRO01 VH2/VK3表达载体的构建
为了使用人源化VH2/VK3抗肽-6抗体治疗患者，将需要大量的该抗体，因此，为了提高抗体产率，制造了同时引入轻链和重链的双顺反子表达质粒。
对重链载体pANTVhG1进行如下修饰：将短连接序列插入到重链表达盒的CMV启动子上游，该连接序列包含与轻链表达盒任一端的限制性酶切位点(Spe I和Pci I)相容的限制性酶切位点。随后从轻链表达载体pANTVK中切除轻链表达盒并将其转移至经修饰的重链表达载体中，从而产生双表达载体pANT18。该表达载体还包含用于在原核细胞中进行增殖的pMB1复制起点和用于原核生物筛选的β-内酰胺酶(ApR)基因。
用限制性酶BssH II和BamHI消化双表达载体pANT18(如上所述)和PRO01轻链变体VK3。对消化得到的片段进行凝胶纯化，并将其连接到一起。用限制性酶Mlu I和Hind III消化该新质粒以及PRO01重链变体VH2，对消化得到的片段进行凝胶纯化并将其连接到一起以形成图26所示的PRO01双表达载体pPRO14。
实施例22
PRO01 VH2/VK3表达载体的转染、初始细胞系的选择和对在确定化学成分的培养基(Chemically Defined Medium)中的悬浮培养的适应
使用限制性酶使质粒pPRO14成为线性化，该质粒具有位于β-内酰胺酶基因中的单一SspI识别位点。将线状的质粒DNA转染到取自Master Cell Bank的CHO dhfr-细胞中，该细胞事先已被测试并确认为不含细菌、真菌、支原体和偶然物质，并按适用的规章进行保存(由ECACC,Health Protection Agency，Porton Down,UK进行)。在8%CO2和37℃下，在100rpm的振荡培育箱(Kuhner Climo-shaker ISF1-X)装置中，将细胞培养物保持在带挡片的爱伦美氏烧瓶中的确定化学成分的培养基(CD DG44)中，所述培养基还补充有40ml/l的Glutamax。转染前48小时，将细胞平板接种至6孔组织培养平板中的DMEM培养基中，所述培养基还补充有1%的透析的FBS、Glutamax和H/T。使用Lipofectamine 2000，通过脂质介导的转染来导入质粒DNA。转染之后24小时，将细胞稀释在100ml的DMEM+1%FBS+以10ml/l添加的Glutamax(略去H/T补充)中，并以100μl/孔分配到96孔平底组织培养平板中。随后在8%CO2和37℃下的湿润气氛(Binder CB150)中温育细胞。再过24小时后，除去DMEM培养基，并代之以100μl/孔的CD-OptiCHO(补充有40ml/l Glutamax)。将平板放回培育箱中，并用Genetix,Clone Select Imager定期扫描平板，从而跟踪每个孔中的细胞生长。在温育期间，以固定的时间间隔添加新鲜的选择培养基，以确保营养水平保持恒定。
数周之后，经鉴定，大量孔都含有活跃生长的细胞集落。对这些孔的上清液取样，并使用人IgG1 Fc捕捉/κ轻链检测ELISA来对其进行人IgG滴度测定。基于来自该测定的结果，将共46个集落转移到每孔含有0.5ml CD OptiCHO培养基(补充有40ml/l Glutamax)的24孔平板中。当孔中的细胞几乎铺满时，对这46个孔中的每个孔的上清液取样并分析其IgG滴度。基于这些结果，选出了29个表达最佳的细胞系用于在T-25瓶中进行扩大培养。再次使这些细胞系生长至几乎长满，届时采集上清液样品并进行上述的IgG滴度测定。基于这些结果，将20个表达最佳的细胞系置于T-75瓶中进行扩增。对铺满的T-75瓶的细胞培养物的上清液取样并进行上述的IgG滴度定量。将所有这些测定的结果示于表5中。对这20个细胞系的表达水平进行比较，从而鉴定出12个表达最佳的细胞系(表5中的粗体/斜体)，并将其继续用于进一步的分析和开发。
表5:来自初始细胞系的人IgG1滴度
经选择用于第1轮基因扩增的集落以粗体/斜体着重显示。
对这12个细胞系中的每一个都进行比生产率(SPR)分析，并以pg/细胞/日表示比生产力。其结果示于表6中。
表6：比生产率分析
12个初始最佳细胞系的比生产率(SPR)。如下计算SPR：
(pg/细胞/天)=((Th-Ti)/((Vh+Vi)/2))/时间，其中：Th=收获滴度(μg)，Ti=起始滴度(μg)=0，Vh=收获时的活细胞计数(×106个细胞)，Vi=起始细胞计数(×106个细胞)，时间=Ti和Th之间经历的时间(天)。
表6中显示的所选择的12个细胞系进入第1轮基因扩增。基因扩增过程因在浓度递增的氨甲喋呤(MTX)下的选择压力而出现。对于第1轮基因扩增，将培养物从T75瓶接种到12孔平板中，每孔含有浓度递增的MTX。每周都更换每孔中的培养基，直至细胞铺满。2周后，对MTX水平递增(0.05μM～50.0μM)的每个培养基的上清液取样并进行IgG滴度测定。将这12个细胞系的每个的结果示于表7中。这些结果证明，在一些情况下，与未用MTX的孔(孔A1)相比，在某些MTX水平下观察到了抗体滴度增加。将每个细胞系的选定孔继续用于评估SPR。
进行了SPR分析，并以pg/细胞/日表示生产力。对所有细胞系的在不同MTX浓度下生长的培养物进行了比较，并将结果示于表7中。
表7：MTX基因扩增
将显示出最佳SPR的12个细胞系(见表6)接种在12孔板中并与指示范围内的MTX一起温育。每两周对上清液取样以用于进行抗体滴度测定。分析SPR，以检测在MTX选择压力下的基因扩增。
表7显示，在遭受递增的MTX浓度下的许多培养物的生产力得到了明显提高。具体而言，含有0.8μM MTX的细胞系PRO01-B-14-524-0.8显示出其比生产力几乎提高到了原来的4倍。选择表7中以粗体/斜体突出显示的培养物来进入第2轮基因扩增。
进行了在MTX存在情况下的第2轮基因扩增。每周对12孔平板的每个孔中的培养基进行更换，直至细胞铺满。2～4周后，对MTX水平递增的每个培养基的上清液取样并进行IgG滴度测定。将每个细胞系的结果示于表8中。从12孔平板得到的起始滴度数据表明，大部分孔中都未出现扩增；然而，对14个孔进行了SPR评估(表8)。该SPR分析的结果显示，在所使用的提高的MTX浓度下，未出现进一步的基因扩增。在此阶段，将来自第2轮扩增的细胞冷冻并保存在气相液氮中。
表8：重复的MTX基因扩增
第2轮扩增后的比生产率(SPR)。按照对表6的描述来计算SPR。
由于在第2轮基因扩增后hIgG的表达没有增加，因此选择来自第1轮的表达最佳的细胞系PRO01-B-14-524-0.8来继续进行无MTX情况下的有限稀释克隆。温育1天后，使用Genetix Clone Select Imager来检查平板。之后每周对每个平板拍照两次，并持续两周。对平板进行评分来鉴定单集落。这由两个研究员独立进行，并对被两位研究员都评定为单集落的集落进行扩增。结果是，认为有84个孔包含源自单个细胞的克隆细胞系。对全部84个孔取样并进行hIgG1滴度测定。基于这些结果，将57个最佳的克隆置于24孔平板中进行扩增。在无MTX的情况下，在6孔平板、T-25瓶和T-75瓶中继续进行扩增。在每个阶段，在进行扩增前，都对细胞上清液进行hIgG1滴度测定。由于IgG滴度低，在每个阶段都弃去了许多克隆，从而在将克隆扩增到T-75瓶中后，还剩下共38个克隆。随后，对这38个选定的克隆中的每一个进行SPR分析。该分析的结果可见于表9中。
根据这些结果，13个克隆细胞系经鉴定具有最高的生产力：PRO01-D-14-524-AG、PRO01-D-14-524-AJ、PRO01-D-14-524-AO、PRO01-D-14-524-AR、PRO01-D-14-524-AW、PRO01-D-14-524-AZ、PRO01-D-14-524-BE、PRO01-D-14-524-BH、PRO01-D-14-524-BI、PRO01-D-14-524-BJ、PRO01-D-14-524-BN、PRO01-D-14-524-CA和PRO01-D-14-524-CD。随后扩增这些克隆，将少量原液冷冻并保存在气相液氮中。使这些细胞系适应悬浮培养。
表9：有限稀释克隆和SPR分析
进行稀释克隆后的克隆细胞系的比生产率(SPR)。选择以粗体/斜体突出显示的细胞系来进行悬浮适应。按照对表6的描述来计算SPR。
使以上培养物适应在确定化学成分的培养基(补充有40ml/l Glutamax的CDOptiCHO)中的悬浮培养。通过轻轻敲击，使在T175组织培养瓶中生长的、作为半附着培养物的活跃分裂的细胞的培养物与塑料脱离。对悬浮液进行计数，并将2×107个细胞接种到含有65ml CD OptiCHO生长培养基的250ml带挡片的爱伦美氏烧瓶中。向该烧瓶中添加5ml保留在T瓶培养物中的条件培养基。将培养物置于8%CO2、37℃下的以100rpm振荡的潮湿振荡平台(Kuhner Climo-shaker ISF1-X)上。每2～3天，使用Vi-CELLTM XR计数器确定培养物的活细胞密度。在细胞密度翻倍后，以1:1将细胞分装到新鲜培养基中进行传代。第二次传代后，接种一个副本瓶(duplicate talsk)，将其用于冷冻2小瓶的少量细胞原液(1×107个细胞/小瓶)。使细胞进一步传代，当细胞密度每2～3天就翻倍且可以将细胞活力保持在约95%时，认为细胞适应了悬浮培养。在使每个细胞系适应了在确定化学成分的生长培养基中的悬浮培养后，将细胞原液冷冻保存(1×107个细胞/小瓶)在液氮中。
实施例23
对悬浮培养中的生长特性、比生产率和稳定性的确定
对于已适应了在确定化学成分的培养基中的悬浮培养的细胞系，确定了其SPR。简言之，将来自健康培养物的3×107个细胞接种到250ml带挡片的爱伦美氏烧瓶中的总体积为70ml的确定化学成分的培养基中。持续2周每天进行细胞计数并采集IgG滴度用样品，用ELISA来定量IgG滴度。用来自细胞计数和IgG ELISA的结果对时间作图，SPR和细胞倍增时间的计算方法如下：
细胞倍增时间=(时间×24)/(Log2(Vh/Vi))
SPR(pg/细胞/日)=((Th-Ti)/((Vh+Vi)/2))/时间
其中：
Th=收获滴度μg/ml
Ti=起始滴度μg/ml
Vh=收获时的活细胞计数(×106个细胞/ml)
Vi=起始活细胞计数(×106个细胞/ml)
时间=Ti和Th之间经历的时间(天)
以3天为间隔计算SPR。表10显示了从该评估中获得的峰值，以及为这12个悬浮适应的克隆中的每一个所估算的倍增时间、最大细胞密度和峰值IgG滴度。基于这些数值，将4个克隆选为最佳候选：PRO01-SF-14-524-AJ、PRO01-SF-14-524-AO、PRO01-SF-14-524-AZ和PRO01-SF-14-524-BE。将这四个细胞系保持在连续培养物中，并进一步取样测定以用于SPR，从而得到10代稳定性特征。将全部两个研究中的生产力曲线示于图27至图30中，并将结果总结于表11中。
表10：对悬浮培养物的SPR分析
悬浮适应细胞系的生长特性和生产力特性。
表11：两项SPR研究中的最佳悬浮适应细胞系的生长特性和生产力特性。
对于全部四个细胞系，在该研究停止前，培养总时间从9天降至8天。这反映在下述事实中：两项研究之间的细胞倍增时间下降，表明并不是所有的细胞系都完全适应了振荡瓶培养。对于细胞系PRO01-SF-14-524-AO，培养物的比生产率在两项研究之间下降，但仍保持在较高水平。对于其他三个细胞系PRO01-SF-14-524-AJ、PRO01-SF-14-524-AZ和PRO01-SF-14-524-BE，比生产力在两项研究之间仍非常相似，表明每个细胞的生产力在10代期间是稳定的。
扩增这四个最佳细胞系，并制备种子细胞库。简言之，将细胞扩增至300ml的总体积，并且当细胞密度超过0.85×106个细胞/ml且活力>90%细胞时收获细胞。通过离心收获细胞并重悬于适当体积的冷冻培养基中，从而产生1×107个细胞/ml的细胞悬浮液。将其以1ml的等分部分分配到2ml的无菌cryotube中。以1℃/分钟的控制速率将小瓶冷冻至-80℃。随后将细胞库转移至气相液氮中进行更长期的储存。表12中显示了最佳细胞系的冷冻储备清单。
表12：PRO01最佳细胞系的冷冻储备清单
  细胞系ID   冷冻的小瓶编号   冷冻日期
  PRO01-SF-14-524-AJ   36   2010年4月27日
  PRO01-SF-14-524-AO   21   2010年4月28日
  PRO01-SF-14-524-AZ   23   2010年5月7日
  PRO01-SF-14-524-BE   22   2010年5月11日
对每个适应了在确定化学成分的Opti-CHO培养基中的悬浮培养的细胞系进行解冻测试。将来自每个细胞库的一个小瓶从液氮储藏中取出，并将其解冻融解在70ml的确定化学成分的生长培养基中。解冻后，持续5天每天监视细胞密度和活力。数据概要示于表13中。该数据显示，种子储备细胞库具有活力，且生长性的培养物能够从液氮储藏中恢复。
表13：将冷冻细胞解冻后5天的培养物的细胞密度和活力
实施例24
细胞系产生了与靶抗原结合的抗体
通过ELISA确认了最佳细胞系(在适应了确定化学成分的培养基后)所分泌的抗体与肽-6的结合。简言之，使用蛋白A亲和柱从细胞培养物上清液中纯化出抗体。随后将纯化的抗体配制在10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中并储存在+4℃。用含10μg/ml肽-6的PBS溶液按100μl/孔于4℃包被经戊二醛处理过的Nunc MaxiSorp 96孔平底微孔板过夜。制备每种抗体的400μg/ml～6.25μg/ml的梯度稀释液，并按100μl/孔将其添加到经包被的平板中，并于室温温育1小时。通过以下方式来确定抗体的结合：在室温下，与100μl/孔的标记有HRP的小鼠抗人κ轻链的1/1000稀释液温育1小时，随后用100μl/孔的TMB底物进行检测。用50μl/孔的3M HCl停止反应后，随后测量450nm处的吸光度。图31显示出，来自最佳细胞系的上清液的每种抗体都以相似的结合曲线结合肽-6，且与NS0细胞所产生的嵌合的人源化的抗体相似。
实施例25
对产生抗体的细胞系进行的支原体和无菌性测试
使用Minerva BiolabsGeM支原体检测试剂盒对来自细胞库存材料的培养基上清液内部测试支原体。该试剂盒利用PCR来检测来自79个支原体物种的16SRNA，检测极限为3个支原体/样品。每份样品都包含191bp的阳性对照，其证明了反应是起作用的且呈支原体阳性的样品产生265～278bp的条带。用于细胞系PRO01-D-14-524-AJ、PRO01-D-14-524-AO、PRO01-D-14-524-AZ和PRO01-D-14-524-BE的PCR反应的琼脂糖凝胶未示出支原体特异性条带的证据。
根据布达佩斯条约保藏了细胞系PRO01-D-14-524-AJ，注册和保藏号为CNCMI-4356。细胞的保藏是根据布达佩斯条约的规定来进行的。

Claims (24)

1.一种特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽的人源化抗体或其F(ab)2片段，所述人源化抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20组成的组；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25组成的组。
2.如权利要求1所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:21，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组。
3.如权利要求2所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:21且所述轻链可变区为SEQ ID NO:26。
4.如权利要求2所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:21且所述轻链可变区为SEQ ID NO:25。
5.如权利要求2所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:21且所述轻链可变区为SEQ ID NO:24。
6.如权利要求1所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:22，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的组。
7.如权利要求6所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:22且所述轻链可变区为SEQ ID NO:25。
8.如权利要求6所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:22且所述轻链可变区为SEQ ID NO:24。
9.如权利要求6所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:22且所述轻链可变区为SEQ ID NO:26。
10.如权利要求1所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:23，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的组。
11.如权利要求1所述的人源化抗体，其中，所述重链可变区为SEQ ID NO:20，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的组。
12.一种组合物，所述组合物包含有效量的至少一种分离且纯化的人源化抗体或其F(ab)2片段作为活性成分，所述人源化抗体或其F(ab)2片段特异性地结合包含SEQID NO:15的多肽，所述人源化抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20组成的组；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25组成的组。
13.一种用于治疗或改善免疫相关病症的药物组合物，其中，所述病症是关节炎和炎性肠病IBD中任一种，所述组合物包含治疗有效量的至少一种分离且纯化的人源化抗体或其F(ab)2片段作为活性成分，所述人源化抗体或其F(ab)2片段特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽，所述人源化抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20组成的组；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25组成的组。
14.治疗有效量的至少一种分离且纯化的人源化抗体或其F(ab)2片段在制备用于治疗或改善有需要的受试对象中的免疫相关病症的药物中的应用，所述病症是关节炎和炎性肠病IBD中任一种，所述人源化抗体或其F(ab)2片段特异性地结合包含SEQ IDNO:15的多肽，其中，所述人源化抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20组成的组；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25组成的组。
15.如权利要求14所述的应用，其中，所述炎性病症是炎性关节炎。
16.如权利要求14所述的应用，其中，所述炎性病症是炎性肠病IBD。
17.治疗有效量的至少一种分离且纯化的人源化抗体或其F(ab)2片段在制备用于使患有免疫相关病症受试对象中的IL-10的表达和水平增加的药物中的应用，所述病症是关节炎和炎性肠病IBD中任一种，所述人源化抗体或其F(ab)2片段特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽，其中，所述人源化抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20组成的组；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25组成的组。
18.一种联合组合物，所述联合组合物包含至少一种分离且纯化的人源化抗体或其F(ab)2片段和至少一种抗炎剂，其中所述人源化抗体或其F(ab)2片段特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽，所述人源化抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20组成的组；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25组成的组。
19.如权利要求18所述的联合组合物，其中，所述抗炎剂选自由以下物质组成的组：甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera；Rituxan)和氨甲喋呤。
20.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
i.至少一种分离且纯化的人源化抗体或其F(ab)2片段，和药学上可接受的载剂或稀释剂，上述物为第一单位剂型；
ii.至少一种抗炎剂，和药学上可接受的载剂或稀释剂，上述物为第二单位剂型；和
iii.用于容纳所述第一剂型和第二剂型的容器装置；其中所述人源化抗体或其F(ab)2片段特异性地结合包含SEQ ID NO:15的多肽，所述人源化抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:20组成的组；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25组成的组。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中，所述抗炎剂选自由以下物质组成的组：甲基强的松(MPS)、抗TNF剂、依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)和赛妥珠单抗(Cimzia)、抗IL-6剂、托珠单抗(Actemra)、抗IL-1受体剂、kineret(阿那白滞素)、CTLA-4-Ig、阿巴西普(Orencia)、抗CD20剂、利妥昔单抗(MabThera；Rituxan)和氨甲喋呤。
22.如权利要求20或21所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于在患有免疫相关病症的受试对象中获得疗效，所述病症是关节炎和炎性肠病IBD中任一种。
23.一种表达权利要求1所述的人源化抗体的宿主细胞系。
24.如权利要求23所述的宿主细胞系，其中，所述细胞系表达人源化抗体，所述人源化抗体具有包含由SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列的重链可变区和包含由SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列的轻链可变区。
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