CN113166256A

CN113166256A - 一种新型抗c-kit抗体

Info

Publication number: CN113166256A
Application number: CN201980079885.XA
Authority: CN
Inventors: 朴商奎; 金真玉
Original assignee: Novel Noble Co
Current assignee: Novel Noble Co
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2021-07-23
Also published as: KR102716514B1; AU2019358647A1; CA3116154A1; BR112021006924A2; EA202190983A1; KR20200040407A; JP2022508747A; EP3865512A4; EP3865512A1; WO2020076105A1; US20210355212A1

Abstract

本发明涉及一种新型抗C‑KIT抗体或其抗体片段。另外，本发明还涉及一种含有抗C‑KIT抗体或其抗体片段的用于预防或治疗血管生成相关疾病的组合物，或者用于诊断血管生成相关疾病的试剂盒。

Description

一种新型抗C-KIT抗体

技术领域

本发明涉及一种新型抗C-KIT抗体或其抗体片段。另外，本发明涉及一种含有抗C-KIT抗体或其抗体片段的用于预防或治疗血管生成相关疾病的组合物，或者用于诊断血管生成相关疾病的试剂盒。

背景技术

血管生成是由现有血管形成新血管的过程。异常或过度的血管生成可引发多种疾病。例如，血管生成是肿瘤生长以及肿瘤从良性向恶性发展和良性肿瘤中的恶性转化的原因之一，并且在多种疾病中已经报道了新血管的过度形成，例如与年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病、青光眼等眼部疾病、类风湿性关节炎、牛皮癣、慢性炎症(Cameliet andJain，Nature，407：249，2000)。为此，已经进行了许多使用血管生成抑制剂来治疗血管生成相关疾病的研究，并且发现了与血管生成过程(例如血管内皮细胞的生长、迁移、分化)相关的多种血管生成促进和抑制因子。

根据作用机制，血管生成抑制剂可分为几类，包括基质降解抑制剂、内皮细胞抑制剂、血管生成抑制剂。血管生成抑制剂包括靶向VEGFR2，VEGFR1，PDGFR，C-KIT，FLT3等和抑制其活性、信号传导、生产等的药物。C-KIT是血管生成抑制剂的靶点之一，属于III型受体酪氨酸激酶(RTK)，也被称为SCF(干细胞因子)的受体。SCF是一种与C-KIT受体结合的细胞因子，据报道，SCF在血细胞、精子和黑素细胞的分化和产生中起着重要作用。

SCF与C-KIT的配体结合域相结合并相互作用，因此C-KIT蛋白被磷酸化以具有活性。SCF通过信号传导过程(例如PI3K/AKT系统，RAS/MAP激酶)调节多种生物学功能，例如细胞生长、分化和增殖。特别地，已经报道了SCF/C-KIT刺激在血管生成中的作用(Angiogenesis in Health,Disease and Malignancy,pp 33-36)。

作为靶向C-KIT的市售药物，有格列卫(Gleevec，甲磺酸伊马替尼)和索坦(Sutent，苹果酸舒尼替尼)。然而，这些是抑制多种激酶的多靶点治疗，并且已经报道了其治疗局限性，例如可能产生许多副作用、低特异性和生物利用度、抗原性和不适当的药代动力学。因此，需要开发对C-KIT具有特异性并且对通过激活C-KIT而引起的血管生成相关疾病没有副作用的有效治疗剂。

作为发明人努力寻找血管生成相关疾病的治疗物质的结果，证实了特异性结合C-KIT的特定抗C-KIT抗体可以显着抑制血管生成，并由此对血管生成相关疾病具有优异的治疗能力，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供一种通过与C-KIT蛋白的结构域II特异性结合而具有优异的C-KIT抑制能力的抗C-KIT抗体或其抗体片段。本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗血管生成相关疾病的组合物和诊断试剂盒，其含有抗C-KIT抗体或其抗体片段。

技术方案

根据本发明的一方面，本发明提供了一种特异性结合C-KIT的抗C-KIT抗体或其抗体片段。

根据本发明的一方面，本发明的抗C-KIT抗体或其抗体片段特异性结合C-KIT的结构域II。

本文中所用的术语“抗体”是指与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，或用作特异性识别抗原受体的蛋白质分子。因此，在本发明中，“抗体”是广义的，并且被解释为包括多克隆抗体、单克隆抗体、完整抗体(由至少两个通过二硫键连接的重链和两个轻链组成的抗体)和抗体片段。完整抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG。另外，IgG可包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4作为亚型。

本文中所用的术语“抗体片段”是指抗体的抗原结合片段或类似物，其保留亲本抗体的一些结合特异性并且包含亲本抗体抗原结合区的一部分(例如一个或多个CDRs)或可变区。抗体片段是例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、sc-Fv、单抗体、双抗体、线性抗体、纳米抗体、结构域抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体片段。

本文中所用的术语“重链”是指含有重链可变区和重链恒定区及其片段的完整重链。重链中存在γ、μ、α、δ和ε型。

本文中所用的术语“轻链”是指含有轻链可变区和轻链恒定区及其片段的完整轻链。轻链中存在κ和λ型。

在本发明中，抗体是指完整抗体或具有抗原结合能力的抗体片段。重链可以是γ、μ、α、δ或ε型中的任意一种，轻链可以是κ或λ型。根据本发明的一方面，轻链是κ型。

本文中所用的术语“C-KIT”属于III型受体酪氨酸激酶(RTK)，并且也已知为SCF的受体。

C-KIT是血管生成抑制剂的靶点之一，属于III型受体酪氨酸激酶(RTK)，并且是SCF(干细胞因子)的受体，在造血中起重要作用。

本文中所用术语“抗C-KIT抗体”是指与C-KIT特异性结合的抗体。抗C-KIT抗体特异性结合C-KIT的结构域II，从而可以抑制或中和C-KIT的活性或活化。

根据本发明的另一方面，本发明所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段含有轻链可变区，该轻链可变区含有SEQ ID NO.1所示的轻链CDR1，SEQ ID NO.2所示的轻链CDR2和SEQID NO.3所示的轻链CDR3。

根据本发明的另一方面，本发明所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段含有重链可变区，该重链可变区含有SEQ ID NO.4所示的重链CDR1，SEQ ID NO.5所示的重链CDR2和SEQID NO.6所示的重链CDR3。

根据本发明的另一方面，本发明所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段的轻链可变区具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，本发明所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段的重链可变区具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，本发明所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段可以包含具有SEQ ID NO.25的氨基酸序列的轻链。

根据本发明的另一方面，本发明所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段可以包含具有SEQ ID NO.26的氨基酸序列的重链。

本文中所用的术语“CDR(互补决定区)”是指形成抗原结合位点高变区的氨基酸序列，该抗原结合位点是由B细胞和T细胞产生的抗体的可变区的一部分。重链氨基酸序列包括三个非连续的CDRs：重链CDR_H1、CDR_H2、CDR_H3，而轻链氨基酸序列包括三个非连续的CDRs：轻链CDR_L1、CDR_L2、CDR_L3。CDR是与抗原识别相关的区域，并且通过在抗体与抗原或表位的结合中提供主要的接触残基，在抗原特异性的多样性中起关键作用。

本发明的抗体或其抗体片段含有与序列表中描述的序列基本相同的序列。基本相同意味着将两个序列比对以尽可能多的对应，并使用本领域常用的算法进行分析，然后显示出80％、90％、95％或更高的序列之间的同源性。

另外，本发明的抗C-KIT抗体不仅包括本文所述的抗C-KIT抗体的序列，还包括特异性识别和结合C-KIT的范围内的生物学等价物，例如，它可以在序列中包括另外的突变以改善抗体结合亲和力和/或生物学特性，并且它可以在不改变分子总体活性的范围内包括另外的突变。

根据本发明的另一方面，抗C-KIT抗体或其抗体片段可以包括人IgG1来源的恒定区。根据本发明提供的一个方面，本发明提供了一种人抗C-KIT抗体，其包括轻链可变区、重链可变区和人IgG1来源的恒定区。

本文中所用的术语“人抗体”是指其中框架区和CDR区具有源自人免疫球蛋白序列可变区的抗体。本发明中的人抗体可以包括非人源性免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体可以是完整抗体的形式或包含抗体分子的功能片段的形式。由于人抗体的所有成分均来源于人，因此，施用于人时发生免疫应答的可能性低于人源化抗体或小鼠抗体。因此，它具有作为人类治疗用抗体的优势。

通过下述各种实例确认与血管生成抑制作用相关的效应，结果显示，本发明的抗C-KIT抗体或其抗体片段可以通过显著抑制血管生成来有效预防或治疗血管生成相关疾病。

根据本发明的另一方面，本发明提供了编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸。

本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸可以包括SEQ ID NO.9，SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11的核苷酸序列。SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的核苷酸序列编码分别由SEQ ID NO.1所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.2所示的轻链CDR2和SEQ IDNO.2所示的轻链CDR3。

SEQ ID NO.9-11的核苷酸序列可以分别对CHO细胞进行密码子优化，并且包括密码子优化的核苷酸序列的核酸应解释为包括在本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸的范围内。例如，本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸可以包括SEQ IDNO.17，SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。

可选地，本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸可以包括SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的核苷酸序列。SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的核苷酸序列分别编码SEQ ID NO.4所示的重链CDR1、SEQ ID NO.5所示的重链CDR2和SEQ ID NO 5所示的重链CDR3。SEQ ID NO.12-14的核苷酸序列可以分别对CHO细胞进行密码子优化，并且包括密码子优化的核苷酸序列的核酸应解释为包括在本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸的范围内。例如，本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸可以包括SEQ ID NO.20、21和22。

根据本发明的一方面，本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸可以包括轻链可变区编码核酸，该轻链可变区编码核酸包括SEQ ID NO.15或23。

根据本发明的另一方面，本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸可以包括重链可变区编码核酸，该重链可变区编码核酸包括SEQ ID NO.16或24。

根据本发明的另一方面，本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸可以包括轻链编码核酸，该轻链编码核酸含有SEQ ID NO.27或29。

根据本发明的另一方面，本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸可以包括重链编码核酸，该重链编码核酸含有SEQ ID NO.28或30。

本文中所用的术语“核酸”全面地包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA。组成核酸分子基本结构单元的核苷酸包括天然核苷酸以及带有修饰糖或碱基位点的类似核苷酸(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman and Peyman,ChemicalReview,90:543-584(1990))。

本发明的编码抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸分子含有与上述核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。基本相同意味着将两个序列比对以尽可能多的对应，并使用本领域常用的算法进行分析，然后显示出80％、90％、95％或更高的序列之间的同源性。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种含有核酸的载体和用该载体转化的细胞。

本文中所用的术语“载体”是指可以插入宿主细胞并能够进行基因复制的任何载体。载体包括质粒、线性核酸、粘粒、RNA载体、病毒载体等，并且病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒等。可以通过本领域已知的各种方法来构建本发明的重组载体系统。另外，可以将本发明的载体构建为用于克隆或表达的载体，并且可以使用原核或真核细胞作为宿主来构建。

此外，细胞可以是原核细胞、真核细胞或动物细胞。可以用载体转化选择合适的宿主细胞，并且它可以用于表达或分泌靶蛋白。宿主细胞可以是永生化的杂交瘤细胞、N/SO骨髓瘤细胞、293细胞，HuT 78细胞、CHO细胞、HELA细胞、COS细胞等类似细胞，优选为CHO细胞。然而，本发明不限于此，并且本领域中已知的任何宿主细胞都可以用作本发明的宿主细胞。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗血管新生相关疾病的药物组合物，该组合物含有抗C-KIT抗体或其抗体片段。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者中血管生成相关疾病的方法，该方法包括向受试者施用抗-C-KIT抗体或其抗体片段或含有其的组合物。

本文中所用的术语“治疗”包括通过施用本发明的组合物来改善、逆转或治愈血管生成相关疾病的症状。

本文中所用的术语“预防”包括通过施用本发明的组合物来减少、延迟或阻止血管生成相关疾病的发生或复发。

本文中所用的术语“血管生成相关疾病”包括由血管生成引发的疾病。这些疾病包括癌症、白血病、眼科血管疾病、类风湿性关节炎、牛皮癣、慢性伤口、慢性炎症、血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形、动脉硬化、血管粘连、血管炎、化脓性肉芽肿、水疱疾病、肺动脉高压、哮喘、鼻息肉、感染疾病、炎性肠病、牙周病、腹膜粘连、子宫内膜异位、子宫出血、卵巢囊肿、骨髓炎、骨炎、败血症和自身免疫性疾病等。优选地，该疾病可以是癌症和眼科血管疾病，但不限于此。

癌症可以是骨癌、肺癌、脑癌、颈部癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、皮内或眼内黑素瘤、直肠癌、肛门癌、结肠癌、子宫癌、卵巢癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、胶质母细胞瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤。

眼科血管疾病可以是糖尿病性视网膜病、黄斑变性、老年性黄斑变性、青光眼、青光眼相关的视网膜色素变性、脉络膜新生血管形成、早产儿视网膜病变、角膜营养不良或视网膜分裂症。

本发明的药物组合物可以是单独含有抗CKIT抗体或其片段，或者可以进一步含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

药学上可接受的载体可以进一步包括例如用于口服给药的载体或用于肠胃外给药的载体。口服给药的载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。另外，用于肠胃外给药的载体可以包括水、合适的油、盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇等，并且可以含有稳定剂和防腐剂。稳定剂的实例包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。防腐剂的实例可以是苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。可以使用本领域已知的那些作为其他药学上可接受的载体(Remington's PharmaceuticalSciences,19th ed,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995)。

本发明的药物组合物可以通过任何方法施用于包括人的哺乳动物。例如，它可以口服或肠胃外给药。作为肠胃外给药方法，可以使用静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下或直肠给药，但不限于此。例如，本发明的药物组合物可以以注射剂的形式制备并通过用30号细针头轻刺皮肤或直接将其施用于皮肤上的方法来给药。

本发明的药物组合物可以根据上述给药途径配制成口服或肠胃外给药的制剂。在用于口服给药的情况下，本发明的组合物可以使用本领域已知的方法配制为粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等。例如，作为口服制剂，可以通过将活性成分与固体赋形剂混合、粉碎、添加合适的助剂并加工成颗粒混合物来获得片剂或糖衣丸。赋形剂的实例包括：包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇和麦芽糖醇的糖，以及包含玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉的淀粉，以及包含纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素的纤维素，以及填充剂，例如明胶、聚乙烯吡咯烷酮等。另外，在某些情况下，可以加入交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠作为崩解剂。另外，本发明的药物组合物可以含有抗聚集剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂和防腐剂。在用于肠胃外给药的情况下，可以通过本领域已知的方法将其制成注射剂、乳剂、洗剂、外用药膏、油、保湿剂、凝胶、气雾剂和鼻吸入剂的形式。这些制剂在所有药物化学领域普遍已知的文件中均有描述(Remington's PharmaceuticalScience,15th Edition,1975Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042,Chapter 87:Blaug,Seymour)。

本发明的药物组合物的总有效量可以通过单剂量给予患者，并且可以通过分级治疗方案以多剂量长期给予患者。本发明的药物组合物可以根据疾病症状的程度来改变活性成分的含量。例如，本发明药物组合物的日剂量可以为0.0001-100mg/kg。但是，本发明的药物组合物的剂量可以考虑各种因素来确定，例如年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食、排泄率、给药途径、治疗频率，并且本领域普通技术人员能够确定合适的有效剂量。只要本发明的药物组合物能够显示出本发明的效果，就其制剂、给药途径和给药方法上没有特别限制。

另外，本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂组合给药。当与其他治疗剂组合施用时，本发明的组合物和其他治疗剂可以同时、单独或顺序地施用。其他治疗剂可以是已知具有治疗或改善血管生成相关疾病效果的物质，并且包括所有其他的抗癌疗法，包括非药物疗法，例如放射疗法。

当本发明的药物组合物与其他治疗剂组合施用时，本发明的组合物中含有的抗C-KIT抗体和其他治疗剂被分别配制到单独的容器中或一起配制在同一容器中。

根据本发明的另一方面，本发明提供了用于诊断血管生成相关疾病的试剂盒，该试剂盒含有抗C-KIT抗体或其抗体片段。

本文中所述的用语“生物样品”包括组织、细胞、血液、血清、血浆、组织尸检样品(脑、皮肤、淋巴结、脊髓)等，但不限于此。

通过使本发明的抗体与生物学样品反应，可以诊断血管生成相关疾病的发作或可能性。具体地，可以通过使抗C-KIT抗体或其功能片段与生物样品接触并确认抗原-抗体复合物的形成来诊断。由于本发明的诊断试剂盒含有抗体，因此可以使其适于各种免疫测定或免疫染色。免疫测定或免疫染色可以是酶促免疫测定(ELISA)、免疫荧光、蛋白质印迹、免疫组织化学染色、流式细胞术、免疫细胞化学、放射免疫测定(RIA)、蛋白质芯片等，但不限于此。

用于定性或定量确定抗原-抗体复合物形成的标记包括酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子和放射性同位素，但不限于此。

本发明的新型抗C-KIT抗体或其抗体片段特异性结合C-KIT的特定结构域II并具有强亲和力。因此，本发明的抗体或其抗体片段具有非常优异的效果，其显著地抑制异常或过度的新血管形成的产生，并且可以有效地预防或治疗血管生成相关疾病。另外，由于本发明的抗体或其抗体片段除与人以外，还具有与小鼠和大鼠的交叉反应性，因此可以有效地用于血管生成相关疾病的研究。

附图说明

图1表明了用SCF处理HUVEC细胞时，与未处理的对照组相比，总共十五种相对水平的抗C-KIT单克隆抗体的管形成抑制作用。

图2表明了用SCF处理HUVEC细胞时，与未处理的对照组相比，相对水平上的2G4浓度抗体对管形成的抑制作用。

图3表明了用SCF处理小鼠来源的内皮细胞MS-1时，2G4浓度抗体对管形成的抑制作用。

图4和图5分别显示出2G4抗体的轻链可变区和重链可变区的条带。

图6显示出2G4抗体轻链可变区的核苷酸序列、氨基酸序列和CDR区。

图7显示出2G4抗体重链可变区的核苷酸序列、氨基酸序列和CDR区。

图8显示出通过克隆、分离和纯化获得的2G4抗体的SDS-PAGE的分析结果。

图9显示出用于确认2G4抗体的C-KIT亲和力的SPR的分析结果。

图10显示出用于确认2G4抗体的C-KIT结合结构域的实验结果。

图11显示出使用小鼠氧诱导的视网膜病变模型比较2G4抗体和商购的Eylea抑制异常血管生成能力的结果。

图12显示出使用Brown Norwegian大鼠黄斑变性模型比较2G4抗体和商购的Eylea抑制异常血管生成能力的结果。

图13表明了2G4抗体对HUVEC细胞系中SCF引起的AKT磷酸化的抑制能力。

图14表明了2G4抗体对TF-1细胞系中AKT磷酸化、C-KIT磷酸化、ERK 1/2磷酸化和β-连环蛋白的抑制能力，从而显示出对白血病细胞增殖的抑制作用。

图15表明了2G4抗体对HUVEC和TF-1的细胞增殖抑制能力。

实施例

在下文中，使用参考示例进一步详细解释本发明构思。然而，以下实施例旨在举例说明本发明，并且本发明的范围不受以下实施例的限制。在本说明书中未具体定义的术语应理解为本发明所属的技术领域中常用的含义。

实施例1.C-KIT抗体生产细胞系的制备

1-1、免疫小鼠的制备

通过将50μg(以一只小鼠为基准)购自Elabscience的重组C-KIT(cat#PKSH030939)蛋白与相同体积的完全弗氏佐剂(sigma,USA)混合来制备乳剂。将制备的乳剂腹腔注射到6只7周龄雌性人CD34+细胞制备的人源化NSG小鼠体内。将50μg抗原以500μL的总体积注射到每只小鼠体内。1周或2周后，将不完全弗氏佐剂(sigma,USA)与抗原混合制备的乳剂分别注入小鼠的腹膜腔内。

1-2、抗体产生确认

从上述方法免疫的小鼠眼球中收集血液，将其置于1.5mL微量离心管中，并以13,000rpm离心10分钟。分离血清并将其储存在-20℃下直到进行实验确认抗体产生为止。使用抗原蛋白的酶免疫测定法确认抗体产生之后，在细胞融合前3天，将抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma,USA)混合的乳剂进一步注入小鼠的腹腔中。

1-3、杂交瘤的制备

确认抗体产生后，处死小鼠。分离脾细胞并与骨髓瘤细胞P3X63Ag 8.653(ATCCCRL-1580)融合以制备杂交瘤。

具体地，使用补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基在培养板上培养小鼠的P3X63Ag 8.653细胞。为了进行细胞融合，将P3X63Ag 8.653细胞用无血清RPMI1640(Hyclone，USA)培养基洗涤两次，并调节至1×10⁷的细胞浓度。通过颈脱位法处死小鼠，收集脾脏，然后置于网状容器(Sigma,USA)中以分离细胞。制备脾细胞的悬浮液后，离心洗涤悬浮液。将脾细胞溶液暴露于Tris-NH₄Cl(TRIS 20.6g/L,NH₄Cl 8.3g/L)以溶解红细胞。将完全分离的产生抗体的细胞以400×g离心5分钟。然后将其在无血清培养基中洗涤两次，并重悬于10mL培养基中。使用血细胞计数器对淋巴细胞进行计数，然后在无血清培养基中将1×10⁸淋巴细胞与1×10P3X63Ag 8.653细胞(10:1)混合。

在400×g下离心5分钟后，使用加热至37℃的50％(M/V)聚乙二醇1500(sigma，USA)逐滴添加1mL溶液中，并混合1分钟。用无血清的RPMI1640稀释由此制备的融合混合物溶液，并以400×g离心3分钟。将细胞悬浮在补充有20％胎牛血清和HAT(100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸苷)的35mL RPMI1640选择性培养基中。前一天将100μL悬浮液负载到涂有饲养细胞的96孔板上(使用RPMI1640从腹腔中分离出巨噬细胞)，并在37℃、5％CO₂下培养。培养5天后，每2-3天更换一次HAT培养基，并将细胞培养14天。14天后用补充了20％胎牛血清和HT的RPMI1640培养基代替进行二次培养(从HAT中去除了0.4μM氨基蝶呤的培养基)。

1-4、产生抗体的融合细胞的选择与分离

收集先前制备的融合细胞培养基的上清液，并进行酶免疫测定，以确定是否产生了针对制备抗原的特异性抗体。选择浓度为阴性对照组4倍或4倍以上的融合细胞培养基，并将其转移至24孔板中进行培养。另外，在96孔板中稀释培养至每孔含有1个细胞后(极限稀释)，回收培养液，并将用作抗原的C-KIT蛋白以每孔0.1μg涂覆在96孔板上。然后，进行酶免疫测定，最终选择产生15个单克隆抗体的融合细胞(1C6、1H2、1A6、AFA、2B3、2G4、4G5、4C4、4C7、4D7、1E1、2H6、1G3、1A3、1D3)。

实施例2.C-KIT抗体选择

2-1、使用HUVEC进行管形成分析

在将300μL Matriegel(Corning,USA)分配到24孔板中后，将HUVEC(人脐静脉内皮细胞)分配到含有SCF(50ng/mL)或SCF(50ng/mL)+抗C-KIT抗体的Matriegel中(1μg/mL)。然后，观察HUVEC的管形成，结果如图1所示。

如图1所示，根据使用HUVEC进行体外血管生成的结果，已确认在抑制SCF诱导的HUVEC管形成的15种抗体中，2G4最有效。这表明称为2G4的抗C-KIT抗体可以有效地用于预防或治疗血管生成相关疾病。

2-2、血管生成抑制作用取决于2G4抗体的浓度

在将300μL Matrigel(Corning,USA)分配到24孔板中后，将HUVEC分配到含有SCF(50ng/mL)、SCF(50ng/mL)+2G4抗体(0.1μg/mL)或SCF(50ng/mL)+2G4抗体(1μg/mL)的Matrigel中。然后，观察HUVEC的管形成，结果如图2所示。

如图2所示，根据使用HUVEC的管形成分析的结果，证实了2G4抗体以浓度依赖的方式抑制了HUVEC管的形成。特别地，即使在0.1μg/mL的浓度下，2G4抗体也具有优异的抑制血管生成的能力。

2-3、小鼠交叉反应测试

为了测试2G4抗体对小鼠的交叉反应性，使用小鼠来源的内皮细胞MS-1，与实施例2-2同样地进行。

结果如图3所示，证实了在小鼠来源的内皮细胞MS-1中2G4抗体显著抑制了小鼠内皮细胞的血管生成。

实施例3.抗C-KIT抗体IgG可变区的核苷酸序列分析

从实施例1和2获得的融合细胞2G4克隆5×10⁵中分离总RNA，使用随机引物(bioneer，Korea)和逆转录酶合成cDNA。使用PROGEN的人IgG文库引物组，从cDNA扩增出κ轻链结构域，扩增的核酸通过琼脂糖凝胶电泳确认，结果如图4所示。类似地，使用PROGEN的人IgG文库引物组扩增重链结构域，结果如图5所示。

如图4和5所示，在κ轻链结构域(414bp)和重链结构域(483bp)之间发现条带，证实产生了预期大小的PCR产物。

然后，将PCR产物铺展在琼脂糖凝胶上，切割条带，将琼脂糖凝胶在60℃下溶解，然后使用旋转柱(Qiagen)纯化核酸。将纯化的核酸克隆到TOPO-TA载体中，转化到大肠杆菌DH5α中以获得菌落，然后将获得的菌落培养以提取质粒。随后，再次进行PCR以获得四个质粒，然后分析2G4抗体的核苷酸序列。

图6显示了2G4抗体轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，它们分别对应本说明书所附序列表中的SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:15的核苷酸序列。此外，图6中轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3依次用红色表示，它们分别对应本说明书所附序列表中的SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列和SEQ ID NO:9-11的核苷酸序列。

图7显示了2G4抗体重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，它们分别对应本说明书所附序列表中的SEQ ID NO:8的氨基酸序列和SEQ ID NO:16的核苷酸序列。此外，图7中重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3依次用红色表示，它们分别对应本说明书附序列表中的SEQID NO:4-6的氨基酸序列和SEQ ID NO:12-14的核苷酸序列。

实施例4.抗C-KIT抗体的制备

4-1、完全人源化抗体克隆

将实施例3中获得的2G4抗体的可变区移植到人Fc氨基酸序列上，并克隆到pCHO载体中(lifetechnology)。

在人κ恒定区的框架中融合了轻链可变区，在人IgG1恒定区的框架中融合了重链可变区。将用于在培养基中分泌整个IgG1抗体的前导肽序列添加到两个基因中以合成该基因，然后再次通过测序进行验证。选择三个克隆用于在CHO细胞中的表达测试。准备了三个克隆的甘油储备液，并准备了不含内毒素的质粒用于CHO细胞中的表达测试。

4-2、抗体的分离与纯化

将以上获得的质粒DNA转染到CHO-S细胞中。转染前一周，在补充有血清的DMEM存在下，将CHO-S(Invitrogen，10743-029)细胞转移到单层培养物中。转染前1天分配细胞后，制备核酸-脂质转染胺复合物用于转染样品，并将细胞在5％CO₂和37℃的培养箱中孵育过夜。将培养基孵育一周，然后每2-3天添加一次。然后，回收培养液，与蛋白A/G琼脂糖(Invitrogen)结合，并用PBS洗涤。然后，用0.1M甘氨酸(pH 2.8)洗脱后，用1M的Tris-HCl(pH 8.0)中和。用PBS透析后，将其在-70℃下储存。

在非还原和还原条件下，将分离和纯化的2G4抗体在6％SDS-PAGE上电泳，以确认抗体的纯度和大小。结果如图8所示。图8中显示，通过SDS-PAGE观察到50kDa的重链和25kDa的轻链带，证实了抗体的精确产生。

实施例5.2G4抗体的亲和力

为了确认2G4抗体的C-KIT结合能力，进行了SPR(表面等离振子共振)。使用SR7500DC(Reichert，USA)、20μg的人C-KIT(elabscience,PKSH030939)用于抗体制备，将20μg的小鼠C-KIT(SB,Lot#LC05DE2304)和20μg的大鼠C-KIT(SB,Lot#LC06SE1787)固定在PEG(Reichert,USA)芯片上。之后，在浓缩流动2G4抗体后，使用Slacober 2程序分析对C-KIT的亲和力K_D值，K_D值是通过将kd除以ka获得的，值越低意味着与目标的结合能力越大。

结果如图9所示，2G4抗体对人C-KIT表现出很强的亲和力，K_D值约为2.8237(±0.9)×10^-12M。2G4抗体对对人类的亲和力最高，其次是小鼠和大鼠。

实施例6.结构域映射

在C末端用FLAG标记人C-KIT基因的缺失变体(人C-KIT基因(NM_000222)的Q26-P520,D113-P520△域I,A207-P520△域I-II,K310-P520△域I-III)，然后用HEK293转染。之后，分泌到培养基中，用FLAG抗体珠(西格玛-奥尔德里奇)将其纯化。然后，进行ELISA。

如图10所示，当结构域II被删除时，2G4抗体不识别C-KIT，由此证明2G4抗体的C-KIT的特异性结合位点是结构域II。

对比例1.使用小鼠模型进行体内功效比较

将广泛使用的小鼠氧诱导性视网膜病(OIR)模型作为用于增生性糖尿病性视网膜病和过早性视网膜病的动物模型。从出生后7天开始，C57BL/6小鼠暴露于75％的高氧环境中5天后，就会形成异常的血管。

C57BL/6小鼠在出生后0-7天暴露于21％的氧气环境中，而在出生后7-12天暴露于75％的高氧气环境中。出生后第12天，右眼玻璃体内分别注射2G4抗体(2μg/眼)和Eylea(2μg/眼)，左眼内注射PBS，作为对照组。然后，从出生后的第12日到第17日，它们再次暴露于21％的氧气环境中，并在出生后的第17天处死。

结果如图11所示，在右眼注射了2G4抗体和Eylea(2μg/眼)的小鼠中观察到异常的血管生成抑制作用，并确认该程度处于同等水平。

对比例2.使用大鼠模型进行体内功效比较

使用棕色挪威大鼠构建黄斑变性模型。

用激光诱发大鼠眼中的CNV(脉络膜新生血管)。同时，分别以4μL/眼的剂量向玻璃体内注射2G4抗体(6.28μg/眼)和Eylea(10μg/眼)。以4μL/眼的剂量注射IgG抗体(10μg/眼)的组用作对照。

如图12显示了使用BS-1凝集素14天后的分析结果。Eylea组和2G4抗体组均明显抑制了由黄斑变性引起的异常血管生成。特别地，即使剂量浓度低于Eylea的剂量浓度，2G4抗体也显示出同等水平的功效，这表明2G4抗体比Eylea更有效。

实施例7.2G4抗体对SCF/C-KIT信号转导的抑制能力

已知SCF/C-KIT信号转导基本上可诱导AKT磷酸化。如图13所示，证实了当用HUVEC处理SCF时，AKT磷酸化增加。另一方面，证实了2G4抗体降低了AKT磷酸化。另外，从图14可以看出，白血病细胞系TF-1中的2G4抗体抑制了SCF引起的AKT磷酸化。此外，由图14可知，SCF引起的ERK1/2的磷酸化和C-KIT的磷酸化也被抑制。

β-链蛋白是AKT下游信号，是细胞增殖的重要因素。由图14可知，2G4抗体以浓度依赖的方式抑制SCF引起的β-链蛋白的增加，这意味着2G4抗体显着抑制了白血病细胞TF-1的增殖。白血病具有许多C-KIT突变，因此经常发现对抗癌药具有耐药性或耐受性。然而，本发明的抗体可以显示出对白血病的预防或治疗作用，因此可以克服现有抗癌药的局限性。

实施例8.2G4抗体抑制HUVEC和TF-1细胞增殖的能力

2G4抗体以不同浓度(0、0.1、1、5、10μg/mL)对TF-1和HUVEC预处理30分钟。之后，处理50ng/mL的SCF，并且在36小时后，测量细胞数以比较细胞增殖率。

如图15所示，与阴性对照组相比，SCF处理组使TF-1细胞数量增加了约26％，并且使HUVEC细胞数量增加了约70％。另一方面，在用2G4抗体处理的组中，TF-1和HUVEC均以浓度依赖性的方式抑制了SCF引起的细胞增殖。这意味着2G4抗体具有非常好的抑制HUVEC和TF-1细胞增殖的能力。

序列表

<110> 新奇贵族公司

<120> 一种新型抗C-KIT抗体

<130> 20813KSR

<150> KR 10-2018-0120233

<151> 2018-10-10

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1 of 2G4 light chain

<400> 1

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2 of 2G4 light chain

<400> 2

Leu Gly Ser

1

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR3 of 2G4 light chain

<400> 3

Met Gln Ala Leu Gln Thr Ile Thr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1 of 2G4 heavy chain

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2 of 2G4 heavy chain

<400> 5

Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR3 of 2G4 heavy chain

<400> 6

Ala Arg Glu Asp Trp Ala Glu Ala Phe Asp Met

1 5 10

<210> 7

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> variable domain of 2G4 light chain

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> variable domain of 2G4 heavy chain

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Asp Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Trp Ala Glu Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1 of 2G4 light chain

<400> 9

cagagcctcc tgcatagtaa tggatacaac tat 33

<210> 10

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2 of 2G4 light chain

<400> 10

ttgggttct 9

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR3 of 2G4 light chain

<400> 11

atgcaagctc tacaaactat cacc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1 of 2G4 heavy chain

<400> 12

ggattcacct tcagtcgcta tggc 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2 of 2G4 heavy chain

<400> 13

atatggtatg atggaactaa taaa 24

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR3 of 2G4 heavy chain

<400> 14

gcgagagaag attgggctga ggcttttgat atg 33

<210> 15

<211> 333

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> variable domain of 2G4 light chain

<400> 15

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactatc 300

accttcggcc aagggacacg actggagatt aaa 333

<210> 16

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> variable domain of 2G4 heavy chain

<400> 16

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt cgctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaactaa taaagactat 180

acagactccg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagat 300

tgggctgagg cttttgatat gtggggccaa gggacaacgg tcaccgtctc ttca 354

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1 of 2G4 light chain_optimized codon for CHO

<400> 17

cagtccctgc tgcactccaa cggctacaac tac 33

<210> 18

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2 of 2G4 light chain_optimized codon for CHO

<400> 18

ctgggctcc 9

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR3 of 2G4 light chain_optimized codon for CHO

<400> 19

atgcaggccc tgcagaccat cacc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR1 of 2G4 heavy chain_optimized codon for CHO

<400> 20

ggcttcacct tctccagata cgga 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR2 of 2G4 heavy chain_optimized codon for CHO

<400> 21

atttggtacg acggcaccaa caag 24

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR3 of 2G4 heavy chain_optimized codon for CHO

<400> 22

gccagagagg attgggccga agccttcgat atg 33

<210> 23

<211> 333

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> variable domain of 2G4 light chain_optimized codon for CHO

<400> 23

gacatcgtga tgacccagtc tccactgagc ctgcctgtga cacctggcga gcctgcttcc 60

atctcctgca gatcctctca gtccctgctg cactccaacg gctacaacta cctggactgg 120

tatctgcaga agcccggcca gtctcctcag ctgctgatct acctgggctc caacagagct 180

tctggcgtgc ccgatagatt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgta tgcaggccct gcagaccatc 300

accttcggcc agggaaccag actggaaatc aag 333

<210> 24

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> variable domain of 2G4 heavy chain_optimized codon for CHO

<400> 24

caggtgcagc tggtggaatc tggtggcgga gttgtgcagc ctggcagatc cctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc agatacggaa tgcactgggt ccgacaggcc 120

cctggcaaag gattggaatg ggtcgccgtg atttggtacg acggcaccaa caaggactac 180

accgactctg tgcggggcag attcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagagaggat 300

tgggccgaag ccttcgatat gtggggccag ggcacaaccg tgaccgtgtc ctct 354

<210> 25

<211> 238

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2G4 light chain

<400> 25

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 26

<211> 468

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2G4 heavy chain

<400> 26

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

20 25 30

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Arg Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Asp Tyr

65 70 75 80

Thr Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Trp Ala Glu Ala Phe Asp Met Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 27

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2G4 light chain

<400> 27

atggaaacag acacactcct cctctgggtc ctcctcctct gggtcccagg cagcacagga 60

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 180

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 240

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactatc 360

accttcggcc aagggacacg actggagatt aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttga 717

<210> 28

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2G4 heavy chain

<400> 28

atggaaacag acacactcct cctctgggtc ctcctcctct gggtcccagg cagcacagga 60

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 120

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt cgctatggca tgcactgggt ccgccaggct 180

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaactaa taaagactat 240

acagactccg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 300

cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagat 360

tgggctgagg cttttgatat gtggggccaa gggacaacgg tcaccgtctc ttcagcctcc 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tcagcaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taaatga 1407

<210> 29

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2G4 light chain_optimized codon for CHO

<400> 29

atggaaaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctcttgt gggtgccagg atctaccggc 60

gacatcgtga tgacccagtc tccactgagc ctgcctgtga cacctggcga gcctgcttcc 120

atctcctgca gatcctctca gtccctgctg cactccaacg gctacaacta cctggactgg 180

tatctgcaga agcccggcca gtctcctcag ctgctgatct acctgggctc caacagagct 240

tctggcgtgc ccgatagatt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 300

tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgta tgcaggccct gcagaccatc 360

accttcggcc agggaaccag actggaaatc aagcggacag tggccgctcc ttccgtgttc 420

atcttcccac cttccgacga gcagctgaag tccggcacag cttctgtcgt gtgcctgctg 480

aacaacttct accctcggga agccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagtcc 540

ggcaactccc aagagtctgt gaccgagcag gactccaagg acagcaccta cagcctgtcc 600

tccacactga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 660

acccatcagg gcctgtctag ccctgtgacc aagtctttca accggggcga gtgctga 717

<210> 30

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2G4 heavy chain_optimized codon for CHO

<400> 30

atggaaaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctcttgt gggtgccagg atctacagga 60

caggtgcagc tggtggaatc tggtggcgga gttgtgcagc ctggcagatc cctgagactg 120

tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc agatacggaa tgcactgggt ccgacaggcc 180

cctggcaaag gattggaatg ggtcgccgtg atttggtacg acggcaccaa caaggactac 240

accgactctg tgcggggcag attcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgtac 300

ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagagaggat 360

tgggccgaag ccttcgatat gtggggccag ggcacaaccg tgaccgtgtc ctctgcttct 420

accaagggac ccagcgtgtt ccctctggct ccttccagca agtctacctc tggcggaaca 480

gctgctctgg gctgcctggt caaggattac ttccctgagc ctgtgacagt gtcctggaac 540

tctggcgctc tgacatccgg cgtgcacacc tttccagctg tgctgcaatc ctccggcctg 600

tactctctgt cctccgtcgt gacagtgcct tccagctctc tgggaaccca gacctacatc 660

tgcaatgtga accacaagcc ttccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 720

tgcgacaaga cccacacctg tccaccatgt cctgctccag aactgctcgg cggaccttcc 780

gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tctctcggac ccctgaagtg 840

acctgcgtgg tggtggatgt gtctcacgag gatcccgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 900

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 960

tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020

aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gctcctatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1080

aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac accttgcctc catctcggga cgagctgacc 1140

aagaaccagg tgtccctgac ctgtctcgtg aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 1200

gaatgggagt ctaatggcca gcctgagaac aactacaaga caacccctcc tgtgctggac 1260

tccgacggct cattcttcct gtactccaag ctgacagtgg acaagtccag atggcagcag 1320

ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 1380

tccctgtctc tgagccccgg caaatga 1407

Claims

1.一种抗C-KIT抗体或其抗体片段，该抗C-KIT抗体或其抗体片段特异性结合C-KIT的结构域II。

2.根据权利要求1所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段，其中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区包括SEQ ID NO.1所示的轻链CDR1，SEQ ID NO.2所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.3所示的轻链CDR3；所述重链可变区包括SEQ ID NO.4所示的重链CDR1，SEQ ID NO.5所示的重链CDR2和SEQ ID NO.6所示的重链CDR3。

3.根据权利要求1所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段，其中，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区；所述轻链可变区具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列；所述重链可变区具有SEQID NO.8的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段，其中，所述抗体包括人IgG1来源的恒定区。

5.一种编码权利要求1所述抗C-KIT抗体或其抗体片段的核酸。

6.根据权利要求5所述的核酸，所述核酸包括：(i)SEQ ID NO.9-14，(ii)SEQ ID NO.15和16，(iii)SEQ ID NO.17-22，或者(iv)SEQ ID NO.23和24。

7.一种包含权利要求5所述核酸的载体。

8.一种用权利要求7所述载体转化的细胞。

9.一种用于预防和治疗血管生成相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，所述血管生成相关疾病选自由癌症、白血病、眼科血管疾病、类风湿性关节炎、牛皮癣、慢性伤口、慢性炎症、血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形、动脉硬化、血管粘连、血管炎、化脓性肉芽肿、水疱病、肺动脉高压、哮喘、鼻息肉、传染病、炎性肠病、牙周病、腹膜粘连、子宫内膜异位、子宫出血、卵巢囊肿、骨髓炎、骨炎、败血症和自身免疫性疾病组成的组。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述癌症选自由骨癌、肺癌、脑癌、颈部癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、皮内或眼内黑色素瘤、直肠癌、肛门癌、结肠癌、子宫癌、卵巢癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、胶质母细胞瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤组成的组。

12.根据权利要求10所述的药物组合物，所述眼科血管疾病选自由糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、老年性黄斑变性、青光眼、青光眼相关的视网膜色素变性、脉络膜新生血管形成、早产儿视网膜病变、角膜营养不良和视网膜分裂症组成的组。

13.一种血管生成相关疾病诊断试剂盒，其中，所述试剂盒含有权利要求1所述的抗C-KIT抗体或其抗体片段。