JPWO2021060932A5 - - Google Patents

Description

ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメイン。

本明細書において、用語“キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）”は、少なくとも一つの細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び刺激分子に由来する細胞内信号伝達ドメインを含む組換えポリペプチドを意味する。

本発明の一具現例において、前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）を選択的にさらに含む。前記リーダー配列は、キメラ抗原受容体を構成する組換えポリペプチドのアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）に位置する。前記リーダー配列は、キメラ抗原受容体の細胞内プロセス及び細胞膜に局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）されながら抗原結合ドメインから任意に切断される。

本発明の具体的な具現例において、前記リーダー配列は、ＣＤ８アルファ（ＣＤ８ ａｌｐｈａ）のリーダー配列、ｈＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖（ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ）のリーダー配列、又は３Ｅ８抗体のリーダー配列であってよい。

本発明のより具体的な具現例において、前記リーダー配列は、配列番号２６、２８又は３０の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である。

本発明の一具現例において、前記キメラ抗原受容体のｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ヒンジ領域、スぺーサ領域、又はそれらの組合せによって連結される。

本発明の具体的な具現例において、前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ又はのゼータ鎖からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。

本発明のより具体的な具現例において、前記膜貫通ドメインは、配列番号４２、４６又は４７の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む。

本発明の他の具現例において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれるタンパク質の信号伝達ドメインを共同刺激ドメインとしてさらに含む。すなわち、本発明のキメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激分子に由来する細胞内信号伝達ドメイン及び共同刺激分子に由来する信号伝達ドメインを含む組換えポリペプチドであってよい。

本発明の一具現例において、前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるが、これに限定されるものではない。ここで、前記Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞毒性Ｔリンパ球、調節Ｔリンパ球又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選ばれる。

したがって、本発明の具体的な具現例によれば、本発明のエフェクター細胞、例えば、Ｔリンパ球、又はナチュラルキラー細胞に伝達され、抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲエンコーディング核酸分子は、ｍＲＮＡに転写され、該ｍＲＮＡから抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲポリペプチドが翻訳されてエフェクター細胞の表面に発現する。

実施例１－２．ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１遺伝子の準備
本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；ＶＨ）の５’部位には、ＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列及びＣＤ８アルファのリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＬＳ）を含み、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ；ＶＬ）の３’部位には、ｈＣＤ８アルファのヒンジとＴＭ、共同刺激ドメインである４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２）及びＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を含むように塩基配列を確保した。確保された塩基配列は、ＢａｍＨ Ｉ－ｈＣＤ８αＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８α ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ８αＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ－Ｘｈｏ Ｉの塩基配列（表２）を有し、これに基づいて配列番号６０のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１（図１）構造を合成した。合成されたｐＢＨＡ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）は、他のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ構造を確保するために使用した。

実施例３．ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３遺伝子の準備
実施例３－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
遺伝子合成を用いて確保されたｐＢＨＡ－ｃＭｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）を鋳型とし、プライマー配列番号７（表３）と配列番号８（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーが３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の１２個塩基配列を有し、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーがｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの塩基配列を有する（表５）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

実施例３－２．３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）遺伝子の準備
３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミド（図４）を鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１０（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーがＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の３’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖの塩基配列を有する（表５）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

実施例４．ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４遺伝子の準備
実施例４－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
遺伝子合成を用いて確保されたｐＢＨＡ－ｃＭｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）を鋳型とし、プライマー配列番号７（表３）と配列番号８（表３）を用いてＰＣＲ方法を増幅して使用した。このとき、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーが３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の１２個塩基配列を有し、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーがｈＩｇＤヒンジの１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＩｇＤヒンジの塩基配列を有する（表６）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

実施例４－２．３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）遺伝子の準備
３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００３プラスミド（図５）を鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１０（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーがＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の３’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖの塩基配列を有する（表６）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、それらの具体的な記述は単に好ましい具現例に過ぎず、それらに本発明の範囲が制限されないという点は明らかである。
本発明の態様は以下を含む。
＜１＞
次を含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子：ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメイン。
＜２＞
前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメインは、抗ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である、＜１＞に記載の核酸分子。
＜３＞
前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５～配列番号１７のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；及び、配列番号１８～配列番号２０のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜４＞
前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ
ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜５＞
前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）をさらに含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜６＞
前記リーダー配列は、ＣＤ８アルファのリーダー配列、ｈＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖（ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ）のリーダー配列、又は３Ｅ８抗体のリーダー配列である、＜５＞に記載の核酸分子。
＜７＞
前記リーダー配列は、配列番号２６、２８又は３０の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である、＜５＞に記載の核酸分子。
＜８＞
前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ヒンジ領域、スぺーサ領域、又は
それらの組合せによって連結されるものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜９＞
前記ヒンジ領域又はスぺーサ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ、ＩｇＧ４のヒンジ、ＩｇＤのヒンジ、ＣＤ８アルファのヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ３、ＣＤ２８の細胞外ドメイン又はそれらの組合せである、＜８＞に記載の核酸分子。
＜１＞０＞
前記ヒンジ領域又はスペース領域は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０又は４４の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である、＜８＞に記載の核酸分子。
＜１１＞
前記キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ又はゼータ鎖からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１２＞
前記膜貫通ドメインは、配列番号４２、４６又は４７の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、＜１１＞に記載の核酸分子。
＜１３＞
前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインを含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１４＞
前記ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインは、配列番号５５、５７又は５９の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、＜１３＞に記載の核酸分子。
＜１５＞
前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれるタンパク質の信号伝達ドメインを共同刺激ドメインとしてさらに含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１６＞
前記共同刺激ドメインは、配列番号４９、５１又は５３の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む共同刺激ドメインである、＜１５＞に記載の核酸分子。
＜１７＞
＜１＞～＜１６＞のいずれか一項の核酸分子を含むベクター。
＜１８＞
＜１＞～＜１６＞のいずれか一項の核酸分子によってエンコードされるポリペプチドを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子。
＜１９＞
＜１８＞の抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子を細胞表面に発現させるエフェクター細胞。
＜２０＞
前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるものである、＞９に記載のエフェクター細胞。
＜２１＞
＜１９＞のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ免疫治療用薬剤学的組成物。
＜２２＞
＜１９＞のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患の治療用薬剤学的組成物。
＜２３＞
前記ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患は、脳癌、神経膠腫、乳癌、膵癌、胸膜中皮腫、肝癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、及び大腸癌からなる群から選ばれる疾病である、＜２２＞に記載の薬剤学的組成物。

Claims (20)

1. ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメインを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子であって、
   前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメインは、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含む、前記核酸分子。
2. 前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）をさらに含むものである、請求項１に記載の核酸分子。
3. 前記リーダー配列は、ＣＤ８アルファのリーダー配列、ｈＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖（ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ）のリーダー配列、又は３Ｅ８抗体のリーダー配列である、請求項２に記載の核酸分子。
4. 前記リーダー配列は、配列番号２６、２８又は３０の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である、請求項２に記載の核酸分子。
5. 前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ヒンジ領域、スぺーサ領域、又はそれらの組合せによって連結されるものである、請求項１に記載の核酸分子。
6. 前記ヒンジ領域又はスぺーサ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ、ＩｇＧ４のヒンジ、ＩｇＤのヒンジ、ＣＤ８アルファのヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ３、ＣＤ２８の細胞外ドメイン又はそれらの組合せである、請求項５に記載の核酸分子。
7. 前記ヒンジ領域又はスペース領域は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０又は４４の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
8. 前記キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
9. 前記膜貫通ドメインは、配列番号４２、４６又は４７の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の核酸分子。
10. 前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインを含むものである、請求項１に記載の核酸分子。
11. 前記ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインは、配列番号５５、５７又は５９の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、請求項１０に記載の核酸分子。
12. 前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及びＣＤ１３７からなる群から選ばれるタンパク質の信号伝達ドメインを共同刺激ドメインとしてさらに含むものである、請求項１に記載の核酸分子。
13. 前記共同刺激ドメインは、配列番号４９、５１又は５３の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む共同刺激ドメインである、請求項１２に記載の核酸分子。
14. 請求項１～１３のいずれか一項の核酸分子を含むベクター。
15. 請求項１～１３のいずれか一項の核酸分子によってエンコードされるポリペプチドを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子。
16. 請求項１５の抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子を細胞表面に発現させるエフェクター細胞。
17. 前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるものである、請求項１６に記載のエフェクター細胞。
18. 請求項１６のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ免疫治療用薬剤学的組成物。
19. 請求項１６のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患の治療用薬剤学的組成物。
20. 前記ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患は、脳癌、神経膠腫、乳癌、膵癌、胸膜中皮腫、肝癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、及び大腸癌からなる群から選ばれる疾病である、請求項１９に記載の薬剤学的組成物。