ES2264425T3

ES2264425T3 - Procedimientos y composiciones para la reconstruccion de estructuras de tejido multicapa.

Info

Publication number: ES2264425T3
Application number: ES00984327T
Authority: ES
Inventors: Anthony Atala
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1999-12-29
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2007-01-01
Anticipated expiration: 2020-12-14
Also published as: JP2003527170A; ATE329010T1; CA2395674A1; US6428802B1; DE60028616T2; EP1261692B1; AU778222B2; AU2096301A; WO2001049827A1; CA2395674C; EP1261692A1; DE60028616D1

Abstract

Constructo de órgano artificial, que comprende: un sustrato biocompatible; una primera policapa cultivada de células derivadas de una población aislada de células musculares lisas; y una segunda policapa cultivada de células derivadas de una segunda población celular que es diferente de la población de células musculares lisas, en el que la segunda policapa se cultiva sobre la primera policapa y está acoplada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica en la que se produce biomaterial intersticial, de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una estructura biológica natural tras la implantación.

Description

Procedimientos y composiciones para la reconstrucción de estructuras de tejido multicapa.

Antecedentes de la invención

El campo técnico de la presente invención se refiere a la creación de órganos artificiales in vitro con implantación posterior del órgano artificial in vivo, y en particular a la creación de órganos celulares multicapa con un interfaz natural entre las capas de tejido.

La comunidad médica ha dedicado una cantidad considerable de esfuerzo a la sustitución de órganos defectuosos por órganos completos o por parte de un órgano. En muchos casos estos órganos son completamente sintéticos, tales como los corazones artificiales, o completamente naturales, tales como los órganos procedentes de donantes mamíferos. Sin embargo, existen limitaciones en ambos enfoques. En los trasplantes de órganos naturales existe un riesgo potencial de transmisión de enfermedades, tales como el SIDA y la hepatitis, o el rechazo del órgano trasplantado. Además, la disponibilidad de un órgano donante con frecuencia es un factor limitante. En el caso de los órganos sintéticos existen complicaciones asociadas a fallos mecánicos y a la formación de cálculos.

Se han explorado varios enfoques para la reconstrucción de órganos y tejidos defectuosos. Inicialmente se demostró la viabilidad de la supervivencia celular mediante la inyección de suspensiones de células disociadas en otros tejidos, tales como el tejido adiposo, el hígado, o proporcionando el estroma del tejido huésped la matriz para la unión y reorganización celulares. Sin embargo, no se observó un crecimiento sostenido de la masa celular, subrayando de esta manera las limitaciones de los intentos por conseguir el crecimiento y estructuración de tejido nuevo en tejido preexistente (ver Cima et al., J. Biomech. Engr. 113:143-151, (1991).

Alternativamente, se han preparado órganos sobre diversas matrices. La morfología celular y la actividad metabólica de las células cultivadas resultan afectadas por la composición de la matriz sobre la que se cultivan. Presumiblemente las células cultivadas funcionan mejor (es decir, proliferan y llevan a cabo sus funciones naturales in vivo) cuando se cultivan sobre matrices que imitan estrechamente su ambiente natural. En la actualidad, los estudios in vitro sobre la función celular se encuentran limitados por la disponibilidad de matrices de cultivo celular que presentan el ambiente fisiológico apropiado para la proliferación y el desarrollo de las células cultivadas. Por ejemplo, Naughton et al. utilizaron un sistema de cultivo basado en células estromales fibroblásticas para cultivar una diversidad de células diferentes (ver el documento WO 96/40175).

Una limitación adicional en la reconstrucción de órganos ha sido imitar la organización celular de un órgano multicapa. Muchos órganos están constituidos por múltiples capas de diferentes tejidos, proporcionando diferentes propiedades al órgano. Por ejemplo, la vejiga presenta tres capas principales de tejidos: la mucosa, la submucosa y el detrusor. La mucosa, que comprende células uroteliales, es la capa más interna y está compuesta de epitelio celular de transición. La submucosa se encuentra inmediatamente por debajo de la mucosa y su membrana basal. Se trata de una capa de proteína intersticial que da soporte a vasos sanguíneos que suministran a la mucosa los nutrientes y a los nódulos linfáticos, que ayudan en la eliminación de los productos de desecho. La submucosa presenta una función importante y se produce como interfaz entre la mucosa y el detrusor. El detrusor es una capa de células de músculo liso que se expanden para almacenar orina y se contraen para expulsarla. Los interfaces naturales producidos in vivo entre las diferentes poblaciones de células resultan en la formación de varias características biológicas que presentan importantes propiedades estructurales y funcionales, por ejemplo la producción de la submucosa que suministra nutrientes a la mucosa.

La reconstrucción de órganos multicapa ha implicado típicamente recubrir ambos lados de una matriz sintética con diferentes poblaciones de células. En estos casos, la matriz funciona como una barrera artificial entre las diferentes poblaciones celulares (ver Atala et al., US nº de serie 60/063.790 presentada el 31 de octubre de 1997, titulada "Bladder Reconstruction"; Atala, documento WO 99/22781; Oberpenning et al., Nature Biotech. 17:149-155, (1999). Otra matriz es la submucosa de la vejiga, que también se ha recubierto en caras separadas con dos poblaciones celulares diferentes (ver Atala, documento WO 98/06445) o una matriz extracelular descelularizada (ver Hu, US nº 5.916.265). Aunque se producen algunas interacciones entre las dos poblaciones celulares diferentes a través de los poros de la matriz, estas interacciones son, en el mejor de los casos, mínimas y carecen de las interacciones célula-célula características del tejido completo in vivo. Ello impide las interacciones funcionales y morfológicas normales que resultan en la formación de material biológico, tal como células epiteliales, por ejemplo la submucosa de la vejiga, la mucosa oral y el epitelio nasal. La presencia de la submucosa proporciona factores de crecimiento y otras proteínas que promueven la división y diferenciación normales.

Por lo tanto, existe una necesidad de crear órganos artificiales que presenten interfaces naturales entre diferentes poblaciones celulares, con el fin de producir órganos artificiales que se asemejen más estrechamente a la interfaz de los órganos nativos in vivo.

Sumario de la invención

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar órganos artificiales con una interfaz quimérica entre dos poblaciones celulares diferentes que se asemeje más estrechamente a la interfaz de un órgano nativo in vivo.

El objetivo de la invención consiste en proporcionar procedimientos para la producción de órganos artificiales con una interfaz quimérica entre dos poblaciones celulares diferentes que se asemeje más estrechamente a la interfaz de un órgano nativo in vivo.

El objetivo de la invención consiste en proporcionar órganos artificiales en los que las células conserven su morfología y función celular normales.

La invención en parte se basa en el descubrimiento de que el crecimiento de una población celular diferente sobre sustrato biocompatible con una interfaz quimérica entre las diferentes poblaciones celulares produce nuevo biomaterial intersticial que se asemeja al biomaterial equivalente en un órgano nativo in vivo. Ello puede conseguirse manteniendo la proliferación activa de policapas heterogéneas que comprenden diferentes poblaciones de células en cultivo, de manera que cada policapa se asemeje al tejido de parénquima equivalente de un órgano in vivo. Ello puede deberse en parte al procedimiento utilizado para producir las policapas. Las policapas se producen cultivando una primera población celular homogénea capa a capa sobre el sustrato biocompatible hasta que las células de cada capa se encuentren en proliferación activa. Las policapas se incuban hasta que las células se desarrollan y proliferan para asemejarse a la estructura y morfología del tejido de parénquima equivalente de un órgano in vivo.

Por lo tanto, las policapas desarrolladas mediante el procedimiento de la invención producen proteínas, factores de crecimiento y factores reguladores necesarios para dar soporte a la proliferación a largo plazo de la población celular homogénea. Tras el establecimiento de la primera policapa, ésta proporciona la superficie para producir la segunda policapa. La segunda policapa comprende una segunda población celular homogénea que es diferente de la primera población celular homogénea. La segunda policapa se desarrolla cultivando la segunda población celular homogénea capa a capa hasta que las células de cada capa se encuentren en proliferación activa con el fin de producir una policapa de células.

Se produce una interfaz quimérica donde las células de las dos policapas se encuentran en contacto. Ello crea un microambiente celular análogo al de un órgano multicelular in vivo. Mediante la creación de este microambiente, las células en la interfaz proliferan, se diferencian y se segregan de la manera que lo harían in vivo, no impedidas por ninguna limitación estructural. Ello también permite que las células en la interfaz adquieran una morfología, estructura y distribución espacial más naturales, que se aproximan más a las condiciones in vivo. El crecimiento de las células en la interfaz quimérica puede potenciarse adicionalmente añadiendo proteínas, glucoproteínas, glucosaminoglicanos, una matriz celular y otros materiales entre las diferentes policapas.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un aspecto la invención proporciona un constructo de órgano artificial que comprende:

una primera policapa cultivada de células derivada de una primera población celular; y

una segunda policapa cultivada de células derivadas de una segunda población celular que es diferente de la primera población celular, en el que la segunda policapa se encuentra asociada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una estructura biológica natural tras la implantación.

En una forma de realización, el órgano artificial comprende además una tercera policapa cultivada de células derivada de una tercera población celular que es diferente de la primera población celular y de la segunda población celular, en el que la tercera policapa se encuentra asociada a la segunda policapa mediante una interfaz quimérica.

En una forma de realización preferida, la interfaz quimérica comprende además un biomaterial intersticial producido como mínimo por una de las policapas. El biomaterial intersticial comprende células con una morfología normal.

En otra forma de realización, el órgano artificial comprende además factores en capas entre la primera y segunda policapas, en el que los factores se seleccionan de entre el grupo constituido por nutrientes, factores de crecimiento, citoquinas, componentes de la matriz extracelular, inductores de diferenciación, productos de secreción, inmunomoduladores, compuestos biológicamente activos que potencian o permiten el crecimiento de la red celular o de las fibras nerviosas.

En una forma de realización, el órgano artificial se selecciona de entre el grupo constituido por corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. En otra forma de realización, el órgano artificial es parte de un órgano seleccionado de entre el grupo constituido por corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra.

En otro aspecto, la invención proporciona un constructo de vejiga artificial que comprende:

una primera policapa cultivada de células derivadas de una población de células de músculo liso; y

una segunda policapa de células derivadas de una población de células uroteliales, en la que la segunda policapa se encuentra asociada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica, de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una vejiga natural tras la implantación.

En una forma de realización preferida, la interfaz quimérica comprende además una submucosa intersticial producida como mínimo por una de las policapas.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de un constructo de órgano artificial, que comprende:

proporcionar un sustrato biocompatible en la forma de un órgano;

crear una primera policapa cultivada de células derivadas de una primera población celular sobre un área del sustrato biocompatible, en la que la primera policapa se encuentra unida al sustrato biocompatible;

crear una segunda policapa cultivada de células derivadas de una segunda población celular que es diferente de la primera población celular, en la que la segunda policapa se encuentra asociada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica, de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una estructura biológica natural tras la implantación, produciendo de esta manera un constructo de órgano artificial.

En una forma de realización, el sustrato biocompatible es un polímero. En otra forma de realización, el sustrato biocompatible es un órgano descelularizado. En una forma de realización, el órgano descelularizado se selecciona de entre el grupo constituido por corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. En otra forma de realización, el órgano descelularizado es una parte de un órgano descelularizado seleccionado de entre el grupo constituido por corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de un constructo de vejiga artificial, que comprende:

proporcionar un sustrato biocompatible en la forma de una vejiga;

crear una primera policapa cultivada que comprende una población de células de músculo liso sobre un área del sustrato biocompatible, en la que la primera policapa se encuentra unida al sustrato biocompatible;

crear una segunda policapa cultivada que comprende una población celular urotelial, en la que la segunda policapa se encuentra asociada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica, de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una vejiga natural tras la implantación, produciendo de esta manera un constructo de vejiga artificial.

Descripción detallada

Con el fin de que la invención se entienda con una mayor claridad, en primer lugar se definen determinados términos.

El término "policapa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una disposición que comprende múltiples capas de poblaciones homogéneas de células cultivadas en capas superpuestas. El procedimiento para la producción de una "policapa" implica depositar una capa de una población celular sobre una superficie, por ejemplo sobre un sustrato biocompatible. Las células depositadas se cultivan en un medio de crecimiento hasta que se desarrollan y proliferan, produciendo una primera monocapa que comprende células con un fenotipo y una morfología deseados. Tras alcanzar la primera monocapa una densidad celular deseada, se deposita una segunda capa de la misma población celular sobre la primera monocapa. La segunda capa de células depositadas se cultiva en medio de cultivo que suministra nutrientes a tanto la segunda capa celular como a la primera monocapa, hasta que las células de la segunda capa se desarrollan y proliferan hasta una densidad celular deseada, produciendo una bicapa que presenta células con un fenotipo y morfología deseados. Se deposita una tercera capa de la misma población celular sobre la bicapa, y las células se cultivan en medio de cultivo que suministra los nutrientes a la bicapa y a las células de la tercera capa hasta que las células de la tercera capa se desarrollan y proliferan hasta una densidad deseada, produciendo una tricapa con un fenotipo y morfología deseados. El procedimiento se repite hasta producir una policapa que comprende muchas capas de una población celular homogénea. Las características de la policapa son tales que se asemeja muy estrechamente a la morfología y características funcionales del tejido de parénquima equivalente de un órgano in vivo. Por ejemplo, una policapa que comprende una población de células de músculo liso puede presentar características funcionales del tejido de músculo liso de una vejiga, es decir, del
detrusor.

El término "asociado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a las interacciones íntimas mutuas entre dos poblaciones celulares diferentes que se encuentran en contacto. Esta interacción mutua implica interacciones célula-célula, crecimiento, desarrollo y proliferación. El comportamiento celular responsable del desarrollo, reparación y mantenimiento de los tejidos se encuentra regulado en gran parte por las interacciones entre células y entre componentes de su microambiente. Estas interacciones están mediadas por moléculas de superficie celular que se unen a factores de crecimiento, enzimas y a otras moléculas que inducen respuestas que resultan en cambios del fenotipo celular. Estas interacciones resultan además en la generación de nuevas células, que pueden ser capaces de generar material celular con propiedades funcionales únicas, diferentes de las propiedades funcionales de cada una de las diferentes poblaciones celulares.

El término "interfaz quimérica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la región limítrofe formada entre dos poblaciones celulares diferentes.

El término "equivalente funcional" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una estructura, por ejemplo a un órgano artificial producido mediante el procedimiento de la invención, que se comporta de una manera igual o similar a la del órgano natural, por ejemplo la vejiga artificial presenta las mismas características funcionales que una vejiga in vivo.

El término "biomaterial intersticial" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la formación de material celular en la interfaz quimérica en la que dos poblaciones celulares diferentes se encuentran en contacto mutuo. El término "biomaterial intersticial" en su concepto más amplio pretende incluir la formación de cualquier material celular nuevo formado cuando dos o más poblaciones celulares diferentes se encuentran en contacto. El nuevo material celular se asemeja al material celular equivalente producido durante el desarrollo celular normal in vivo del órgano. Por ejemplo, durante la reconstrucción de una vejiga artificial, las dos poblaciones celulares diferentes en contacto mutuo son la población de células de músculo liso y la población de células uroteliales. Por lo tanto, el "biomaterial intersticial" producido en la interfaz de estas dos poblaciones se asemejaría al de la submucosa.

La expresión "trastorno genitourinario" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una enfermedad o infección que afecta a la función normal de la vejiga, uréter y uretra.

El término "sujeto" tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir los organismos vivos en los que se produce una respuesta inmunológica. Los sujetos preferentes son mamíferos. Entre los ejemplos de sujetos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, seres humanos, primates, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cerdos, cabras y ovejas.

La expresión "sustrato biocompatible" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un material adecuado para la implantación en un sujeto, sobre el que puede depositarse una población de células. Un sustrato biocompatible no provoca efectos tóxicos o perjudiciales tras la implantación en el sujeto. En una forma de realización, el sustrato biocompatible es un polímero con una superficie que puede conformarse en el órgano deseado que necesita sustituirse. El polímero puede además conformarse en una parte de un órgano que necesita sustituirse.

En otra forma de realización, el sustrato biocompatible es una estructura descelularizada. El término "estructura descelularizada" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una disposición biológica tridimensional (por ejemplo un órgano) producido mediante un procedimiento en el que se elimina la totalidad del contenido celular y de tejido, dejando una infraestructura compleja. Los órganos tales como la vejiga o el riñón están compuestos por diversos tejidos especializados. Las estructuras especializadas de tejido de un órgano es el parénquima que proporciona la función específica asociada con el órgano. La red fibrosa de soporte del órgano es el estroma. La mayoría de órganos presentan una estructura estromal compuesta de tejido conectivo no especializado que da soporte al tejido especializado. El procedimiento de descelularización elimina el tejido especializado, dejando la red tridimensional compleja de tejido conectivo. La infraestructura de tejido conectivo está compuesta principalmente de colágeno. El término "estructura descelularizada" se pretende que incluya órganos completos de los que se ha eliminado el material celular y de los tejidos. La expresión "estructura descelularizada" también se pretende que incluya partes de la estructura de un órgano, por ejemplo la arteria renal de un riñón, del que se ha eliminado el material celular y de tejido. La estructura descelularizada proporciona un sustrato biocompatible sobre el que pueden infusionarse diferentes poblaciones celulares. Las estructuras descelularizadas pueden ser rígidas o semirrígidas, presentando la capacidad de alterar su forma. Por ejemplo, una vejiga descelularizada es capaz de dilatarse cuando se llena de líquido, pero volver a su forma original tras la expulsión del líquido. Entre los ejemplos de órganos descelularizados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra.

La presente invención describe composiciones y procedimientos para la reconstrucción in vitro de órganos. Generalmente la invención proporciona órganos multicelulares que comprenden por lo menos dos poblaciones celulares diferentes. Los constructos de órgano comprenden una primera policapa cultivada de células derivadas de una primera población celular, y una segunda policapa cultivada de células derivadas de una segunda población celular que es diferente de la primera población celular, en los que la segunda policapa se encuentra asociada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica con el fin de producir un constructo que es el equivalente funcional de una estructura biológica natural.

La invención proporciona además procedimientos para la producción de órganos artificiales mediante la utilización de un sustrato biocompatible con la forma de un órgano, creando una primera policapa cultivada de células derivadas de una primera población celular en un área del sustrato biocompatible, estando unida la primera policapa al sustrato biocompatible;

crear una segunda policapa cultivada de células derivadas de una segunda población celular que es diferente de la primera población celular, estando asociada la segunda policapa a la primera policapa mediante una interfaz quimérica de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una estructura biológica natural tras la implantación, produciendo de esta manera un constructo de órgano artificial.

Se describen con mayor detalle diversos aspectos de la invención en las subsecciones siguientes.

I. Cultivo de células para la reconstrucción de órganos

Un aspecto de la invención se refiere a constructos de órganos artificiales que comprenden por lo menos dos poblaciones celulares diferentes. Los constructos artificiales pueden ser constructos artificiales alogénicos, en los que diferentes poblaciones celulares se derivan del propio tejido del sujeto. Por ejemplo, las células pueden derivar de un órgano humano, tal como la vejiga, la uretra, el uréter y otros tejidos urogenitales. El constructo de órgano artificial puede también ser xenogénico, cuando las diferentes poblaciones celulares se derivan de una especie de mamífero que es diferente de la del sujeto. Por ejemplo, las células pueden derivar de órganos de mamíferos, tales como seres humanos, primates, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cerdos, cabras y ovejas.

Las células pueden aislarse a partir de varias fuentes, por ejemplo a partir de biopsias o de autopsias. Las células aisladas preferentemente son células autólogas obtenidas mediante biopsia del sujeto. Por ejemplo, una biopsia de músculo esquelético del brazo, antebrazo o extremidades inferiores, o músculo liso procedente del área tratada con anestésico local con una cantidad reducida de lidocaína inyectada subcutáneamente y expandida en cultivo. La biopsia puede obtenerse utilizando una aguja de biopsia, una aguja de acción rápida que permite que el procedimiento sea rápido y simple. El pequeño núcleo de biopsia de músculo esquelético o liso puede a continuación expandirse y cultivarse, tal como describen Atala et al., J. Urol. 148:658-62, (1992); Atala et al., J. Urol. 150:608-12, (1993), y en el Ejemplo 1. También pueden utilizarse células procedentes de familiares u otros donantes de la misma especie bajo inmunosupresión apropiada.

Los procedimientos para el aislamiento y cultivo de células se comentan en Fauza et al., J. Ped. Surg. 33:7-12, (1998), que se incorpora a la presente memoria como referencia. Las células pueden aislarse utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el tejido u órgano puede desagregarse mecánicamente y/o tratarse con enzimas digestivos y/o agentes quelantes que debilitan las conexiones entre células vecinas, haciendo posible la dispersión del tejido en una suspensión de células individuales sin roturas celulares apreciables. La disociación enzimática puede conseguirse triturando el tejido y tratando el tejido triturado con cualquiera de entre varios enzimas digestivos, sea solos o en combinación. Entre éstos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, tripsina, quimotripsina, colagenasa, elastasa y/o hialuronidasa, ADNasa, pronasa y dispasa. La rotura mecánica puede también conseguirse mediante varios procedimientos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, raspar la superficie del órgano, la utilización de trituradores, mezcladores, tamices, homogeneizadores, celdas de presión o sonicadores. Para una revisión de las técnicas de desagregación de tejidos, ver Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, segunda edición, A. R. Liss, Inc., New York, capítulo 9, páginas 107-126, (1987).

Entre los tipos celulares preferidos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, las células uroteliales, las células mesenquimales, especialmente las células musculares lisas o esqueléticas, los miocitos (células madre musculares), fibroblastos, condrocitos, adipocitos, fibromioblastos y células ectodérmicas, incluyendo las células dúctiles y de la piel, hepatocitos, células de los islotes, células presentes en el intestino y otras células parenquimales, osteoblastos y otras células que forman el hueso o el cartílago. En algunos casos puede también resultar deseable incluir células nerviosas. En una forma de realización, se aislan células uroteliales y células de músculo liso. Pueden utilizarse células uroteliales y células musculares lisas de todas las etapas de desarrollo, tales como las etapas fetal, neonatal y juvenil a adulta.

Tras reducir el tejido a una suspensión de células individuales, la suspensión puede fraccionarse en subpoblaciones de las que pueden obtenerse los elementos celulares. Ello también puede conseguirse mediante técnicas estándar para la separación celular, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, la clonación y la selección de tipos celulares específicos, la destrucción selectiva de células no deseadas (selección negativa), la separación basada en la aglutinabilidad diferencial de las células en una población mixta, procedimientos de congelación-descongelación, propiedades diferenciales de adherencia de las células en una población mixta, filtración, centrifugación convencional y zonal, elutriación centrífuga (centrifugación en contracorriente), separación por gravedad unitaria, distribución en contracorriente, electroforesis y separación celular activada por fluorescencia. Para una revisión de las técnicas de selección clonal y de separación celular, ver Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques, segunda edición, A. R. Liss, Inc., New York, capítulos 11 y 12, páginas 137-168, (1987). Por ejemplo, puede enriquecerse en células uroteliales mediante separación celular activada por fluorescencia, y puede reducirse el número de células de músculo liso y de células fibroblásticas para la recolección de células uroteliales. De manera similar, puede enriquecerse en células musculares lisas y reducirse el número de células uroteliales y células fibroblásticas para la recolección de células musculares lisas.

El fraccionamiento celular puede también resultar deseable, por ejemplo cuando el donante presenta enfermedades tales como cáncer o metástasis de vejiga u otros tumores de la vejiga. Puede separarse una población de células de vejiga con el fin de separar las células de vejiga malignas u otras células tumorales de las células de vejiga normales no cancerosas. Las células de vejiga normales no cancerosas, aisladas mediante una o más técnicas de separación, seguidamente pueden utilizarse para la reconstrucción de vejiga.

Las células aisladas pueden cultivarse in vivo para incrementar el número de células disponible para recubrir el sustrato biocompatible. La utilización de células alogénicas, y más preferentemente las células autólogas, resultan preferidas para evitar el rechazo de tejidos. Sin embargo, si se produce una respuesta inmunológica en el sujeto tras la implantación del órgano artificial, el sujeto puede tratarse con agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina o FK506, con el fin de reducir la probabilidad de rechazo. En determinadas formas de realización, las células quiméricas o células procedentes de un animal transgénico pueden recubrirse sobre el sustrato biocompatible.

Las células aisladas pueden transfectarse con material genético previamente al recubrimiento. El material genético útil puede ser, por ejemplo, secuencias genéticas capaces de reducir o eliminar una respuesta inmunológica en el huésped. Por ejemplo, puede suprimirse la expresión de antígenos de superficie celular, tales como los antígenos de histocompatibilidad de clase I y de clase II. Ello puede permitir que las células trasplantadas presenten una probabilidad reducida de rechazo por el huésped. Además, la transfección también podría utilizarse para la transferencia de genes. Las células uroteliales y musculares podrían transfectarse con genes específicos previamente al recubrimiento del sustrato biocompatible. El constructo de célula-sustrato podría portar información genética requerida para la supervivencia a largo plazo del huésped o del órgano artificial.

Las células aisladas pueden ser normales o modificarse genéticamente para proporcionar un función adicional o normal. Pueden utilizarse procedimientos para la modificación genética de células con vectores retrovirales, polietilenglicol, u otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Entre éstos se incluyen los vectores de expresión que transportan y expresan moléculas de ácido nucleico en las células (ver Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, (1990)).

El vector de ADN se introduce en procariotas o en células mediante técnicas convencionales de transformación o de transfección. Pueden encontrarse procedimientos adecuados para transformar o transfectar las células huésped en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) y en otros manuales de laboratorio.

II. Reconstrucción de órganos

Otro aspecto de la invención se refiere a procedimientos para la producción de órganos artificiales multicapa. En una forma de realización preferida, el órgano artificial se produce sobre una superficie del sustrato biocompatible. La construcción de constructos artificiales tridimensionales in vitro previamente a la implantación facilita la diferenciación terminal final de las células tras la implantación in vivo, y minimiza el riesgo de una respuesta inflamatoria en el sustrato biocompatible-matriz celular, evitando de esta manera la contractura y encogimiento del injerto. Las secciones siguientes describen ejemplos de sustratos biocompatibles adecuados.

(i) Estructuras descelularizadas

Las bioestructuras, por ejemplo los órganos completos, o partes de órganos, pueden descelularizarse mediante la eliminación de la totalidad del contenido celular y de tejidos del órgano. El procedimiento de descelularización comprende una serie secuencial de extracciones. Una característica clave de este procedimiento de extracción es que se evita una extracción fuerte, que podría perturbar o destruir la compleja infraestructura de la bioestructura. Seguidamente se solubilizan los componentes citoplasmáticos nucleares y los componentes nucleares.

Preferentemente la bioestructura, por ejemplo el órgano, se descelulariza eliminando la membrana celular y los residuos celulares que rodean el órgano mediante procedimientos de rotura mecánica suave. Los procedimientos de rotura mecánica suave deben ser suficientes para romper la membrana celular. Sin embargo, el procedimiento de descelularización debe evitar dañar o alterar la compleja infraestructura de la bioestructura. Entre los procedimientos de rotura mecánica suave se incluyen el raspado de la superficie del órgano, la agitación del órgano, o la agitación del órgano en un volumen adecuado de líquido, por ejemplo de agua destilada. En una forma de realización preferida, el procedimiento de rotura mecánica suave incluye la agitación del órgano en un volumen adecuado de agua destilada hasta que se rompan las membranas celulares y se hayan eliminado los residuos celulares del
órgano.

Tras eliminar las membranas celulares, se eliminan los componentes nucleares y citoplasmáticos de la bioestructura. Ello puede llevarse a cabo solubilizando los componentes celulares y nucleares sin romper la infraestructura. Con el fin de solubilizar los componentes nucleares, pueden utilizarse detergentes o surfactantes no iónicos. Entre los ejemplos de detergentes o surfactantes no iónicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la serie Triton, disponible de Rohm y Hass de Philadelphia, Pa., que incluye Triton X-100, Triton N-101, Triton X-114, Triton X-405, Triton X-705 y Triton DF-16, disponibles comercialmente de muchos proveedores; la serie Tween, tal como monolaurato (Tween 20), monopalmitato (Tween 40), monooleato (Tween 80) y polioxetilén-23-lauril éter (Brij. 35), polioxietilén éter W-1 (Polyox) y similares, colato sódico, desoxicolatos, CHAPS, saponina, n-decil-\beta-D-glucopuranósido, n-heptil-\beta-D-glucopiranósido, n-octil-\alpha-D-glucopiranósido y nonidet P-40.

Un experto en la materia apreciará que puede encontrarse una descripción de compuestos pertenecientes a las clasificaciones indicadas anteriormente, y pueden obtenerse comercialmente los proveedores, en "Chemical Classification, Emulsifiers and Detergents", McCutcheon's, Emulsifiers and Detergents, North American and International Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co., Glen, Rock, N.J., U.S.A., 1986, y en Judith Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem R., Hoechst Celanese Corp., 1987. En una forma de realización preferida, el surfactante no iónico es de la serie Triton, preferentemente Triton X-100.

Puede alterarse la concentración del detergente no iónico dependiendo del tipo de bioestructura que se descelulariza. Por ejemplo, para tejidos delicados, por ejemplo vasos sanguíneos, debe reducirse la concentración del detergente. Los intervalos de concentración preferidos para el detergente no iónico pueden encontrarse comprendidos entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 2,0% (p/v). Más preferentemente entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 1,0% (p/v). Todavía más preferentemente, entre aproximadamente 0,1% (p/v) y aproximadamente 0,8% (p/v). Las concentraciones preferidas de estos se encuentran comprendidas en los intervalos entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 0,2% (p/v), siendo particularmente preferentes entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 0,1% (p/v).

El componente citoesquelético, constituido por redes de filamentos citoplasmáticos densos, complejos intercelulares y estructuras microcelulares apicales, puede solubilizarse utilizando solución alcalina, tal como hidróxido amónico. También puede utilizarse otra solución alcalina constituida por sales amónicas o sus derivados para solubilizar los componentes citoesqueléticos. Entre los ejemplos de otras soluciones amónicas adecuadas se incluyen sulfato amónico, acetato amónico o hidróxido amónico. En una forma de realización preferida se utiliza hidróxido
amónico.

La concentración de las soluciones alcalinas, por ejemplo de hidróxido amónico, puede alterarse dependiendo del tipo de bioestructura que se descelulariza. Por ejemplo, para tejidos delicados, por ejemplo vasos sanguíneos, debe reducirse la concentración del detergente. Los intervalos de concentración preferidos pueden ser de entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 2,0% (p/v). Más preferentemente de entre aproximadamente 0,005% y aproximadamente 0,1% (p/v). Todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,01% (p/v) y aproximadamente 0,08%(p/v).

La estructura descelularizada liofilizada puede almacenarse a una temperatura adecuada hasta que se requiera su utilización. Previamente a la utilización, la estructura descelularizada puede equilibrarse en tampón isotónico adecuado o medio de cultivo celular. Entre los tampones adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina, MOPS, HEPES, solución salina equilibrada de Hank, y similares. Entre los medios de cultivo celular adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, RPMI 1640, de Fisher, de Iscove, de McCoy, medio de Dulbecco, y similares.

(ii) Polímeros

Los polímeros, tales como el ácido poliglicólico, también son estructuras biocompatibles adecuadas para la reconstrucción de órganos. El polímero biocompatible puede conformarse utilizando procedimientos tales como, el moldeo por evaporación de disolvente, el moldeo por compresión, el estirado de filamentos, el mallado, el lixiviado, el entramado y el recubrimiento.

En el moldeo por evaporación de disolvente, una solución de uno o más polímeros en un disolvente apropiado, tal como cloruro de metileno, se moldea como una estructura con relieve con un patrón ramificado. Tras la evaporación del disolvente, se obtiene una película delgada.

En el moldeo por compresión, se comprime un polímero a presiones de hasta 30.000 libras por pulgada cuadrada con un patrón apropiado. El estirado de filamentos implica el estirado del polímero fundido y el mallado implica formar una malla mediante compresión de las fibras para formar un material similar al fieltro.

En el lixiviado, una solución que contiene dos materiales se extiende dando lugar a una forma similar a la forma final del órgano. A continuación, se utiliza un disolvente para disolver y separar uno de los componentes, resultando en la formación de poros (ver Mikos, US nº 5.514.378, incorporada a la presente memoria como referencia).

En la nucleación, se exponen películas delgadas con la forma del órgano a productos de fisión radioactiva que crean pistas de material dañado por la radiación. A continuación, las láminas de policarbonato se atacan con ácido o base, convirtiendo las pistas del material dañado por radiación en poros. Finalmente, puede utilizarse un láser para conformar y quemar orificios individuales a través de muchos materiales, formando una estructura de órgano con tamaños de poro uniformes.

El sustrato polimérico puede fabricarse para que presente una estructura de poros controlada que permita que los nutrientes del medio de cultivo alcancen la población celular depositada, pero que evite que las células cultivadas migren a través de los poros. La unión y viabilidad celulares in vitro puede evaluarse mediante microscopía electrónica de barrido, histología y evaluación cuantitativa con radioisótopos.

Los sustratos poliméricos pueden conformarse en cualquiera de varias configuraciones deseables con el fin de satisfacer cualquier número de restricciones del sistema global, geométricas o de espacio. Por ejemplo, al utilizar un sustrato polimérico para la reconstrucción de vejiga, el sustrato puede conformarse para que se adapte a las dimensiones y formas de la totalidad o parte de una vejiga. Los sustratos poliméricos pueden conformarse en diferentes tamaños para adaptarse a las vejigas de pacientes de diferente tamaño. El sustrato polimérico también puede conformarse para facilitar las necesidades especiales del paciente, por ejemplo un paciente discapacitado que presente un espacio de cavidad abdominal diferente puede requerir una vejiga reconstruida que se adapte a dicho espacio.

En otras formas de realización, el sustrato polimérico se utiliza para el tratamiento de estructuras laminares en el cuerpo, tales como la uretra, un vaso deferente, los tubos de Falopio, los conductos lacrimales. En estas aplicaciones, el sustrato polimérico puede conformarse en forma de tubo hueco.

Puede permearse un sustrato biocompatible (un órgano descelularizado o un polímero) con un material, por ejemplo con copolímeros licuados (poli-DL-láctido coglicólido 50:50, 80 mg/ml de cloruro de metileno) con el fin de alterar sus propiedades mecánicas. Ello se puede llevar a cabo mediante recubrimiento de una capa o de múltiples capas hasta conseguir las propiedades mecánicas deseadas.

III. Generación de una policapa de una población celular

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para la preparación de órganos artificiales utilizando poblaciones celulares cultivadas que se utilizan para crear policapas del constructo multicelular de órgano artificial. Las células pueden expandirse tal como se describe en la Sección I y utilizarse para crear policapas en una cara de un sustrato biocompatible.

a) Producción de policapas sobre una estructura descelularizada

En una forma de realización, pueden utilizarse diferentes poblaciones celulares cultivadas para producir diferentes policapas sobre una estructura descelularizada, por ejemplo un órgano descelularizado, o una parte de un órgano. Puede perfundirse una primera suspensión celular homogénea en la estructura descelularizada utilizando agujas insertadas dentro de posiciones localizadas de la infraestructura tridimensional del órgano descelularizado. Las células perfundidas se distribuyen entre los intersticios tridimensionales de la infraestructura y crecen para producir una capa de células que rodea la infraestructura. Tras la perfusión de la primera suspensión celular homogénea, el órgano descelularizado se incuba en medio de cultivo a 37ºC hasta que las células se desarrollan y proliferan, produciendo una monocapa de una primera población de células cultivadas que se une a la infraestructura del órgano descelularizado. Tras el establecimiento de la monocapa, se perfunde nuevamente la primera suspensión celular homogénea en la estructura descelularizada sobre la monocapa. El órgano descelularizado se incuba hasta que se desarrollan y proliferan las células, produciendo una segunda monocapa de células sobre la primera monocapa, produciendo de esta manera una bicapa. El procedimiento se repite hasta producir una policapa de una primera población celular homogénea.

La primera policapa presenta características funcionales y morfología similares al tejido de parénquima equivalente de un órgano in vivo. Por ejemplo, con una vejiga descelularizada la primera población celular es una población de células musculares lisas. La suspensión de células musculares lisas se perfunde en la vejiga hasta formar una policapa de tejido de músculo liso, que presenta características funcionales similares a las del tejido muscular liso (es decir, el detrusor) de una vejiga.

Tras crear la primera policapa, se crea una segunda policapa utilizando una segunda población celular cultivada que es diferente de la primera población celular. Se perfunde una suspensión celular de la segunda población celular homogénea sobre la primera policapa en el órgano descelularizado. Las células perfundidas se distribuyen sobre la primera policapa, y el órgano descelularizado se incuba hasta que las células de la segunda población celular se desarrollan y proliferan formando una primera monocapa. Tras el establecimiento de la primera monocapa, se perfunde nuevamente la segunda población celular homogénea en la estructura descelularizada sobre la primera monocapa. El órgano descelularizado se incuba hasta que las células se desarrollan y proliferan, produciendo una segunda monocapa sobre la primera monocapa, produciendo de esta manera una bicapa. El procedimiento se repite hasta producir una segunda policapa de una segunda población celular homogénea.

La segunda policapa presenta características funcionales y morfológicas similares a las del tejido de parénquima equivalente de un órgano in vivo. Por ejemplo, la segunda policapa para el constructo de vejiga es una policapa urotelial que presenta características morfológicas y funcionales similares a las del tejido urotelial (es decir, la mucosa) de la vejiga.

El experto en la materia apreciará que pueden producirse varias policapas heterogéneas con el fin de crear constructos de órganos artificiales multicelulares. Cada policapa comprende capas múltiples de una población celular homogénea, aunque las poblaciones celulares de las policapas son diferentes. En una forma de realización, el órgano artificial comprende por lo menos aproximadamente cinco policapas. En otra forma de realización, el órgano artificial comprende por lo menos aproximadamente cuatro policapas. En todavía otra forma de realización, el órgano artificial comprende por lo menos aproximadamente tres policapas. En una forma de realización preferida, el órgano artificial comprende por lo menos aproximadamente dos policapas.

Se produjo una interfaz quimérica en la que dos o más policapas heterogéneas se encontraban en contacto mutuo. Ello permite que se produzca una interacción libre entre las células de las policapas. Las interacciones extensivas entre las diferentes poblaciones celulares resulta en la producción de un biomaterial intersticial que es diferente de cada una de las policapas. Debido a que la interacción entre las dos poblaciones celulares diferentes no se ve impedida por barreras estructurales, tales como sustratos biocompatibles (por ejemplo polímeros), las células en la interfaz quimérica adoptan una forma y configuración más naturales. Mediante la provisión de un microambiente en la interfaz quimérica que es más similar al microambiente de un órgano in vivo, las células en la interfaz quimérica se desarrollan más naturalmente y producen factores de crecimiento y otras proteínas que promueven la división y diferenciación normales. Ello puede resultar en la producción de biomaterial intersticial que proporciona propiedades biológicas y funcionales únicas con el fin de crear órganos artificiales que se asemejan más estrechamente a las encontradas en el órgano in vivo. Por ejemplo, la interacción de la policapa de músculo liso y la policapa urotelial de un constructo de vejiga artificial produce una interfaz quimérica que resulta en la producción de una capa de células similar a la submucosa de una vejiga in vivo. La submucosa proporciona características funcionales diferentes de las de las células de músculo liso y de las células uroteliales, en el aspecto de que la submucosa, cuando se encuentra completamente desarrollada, proporciona un suministro sanguíneo a las células de músculo liso.

El experto en la materia apreciará que cualquier biomaterial intersticial producido cuando interaccionan dos o más policapas heterogéneas que comprenden poblaciones celulares diferentes, se encuentra dentro del alcance de la invención. El biomaterial intersticial diferente producido dependerá del tipo de células en la policapa heterogénea.

En una forma de realización, pueden añadirse capas colágenas adicionales a las superficies internas de la estructura descelularizada con el fin de crear una superficie lisa, tal como se describe en la publicación de patente internacional PCT nº WO-95/22301. Esta capa colágena lisa estimula la unión celular, que facilita el crecimiento y el desarrollo. Tal como se describe en la publicación de patente internacional PCT nº WO-95/22301, esta capa colágena lisa puede realizarse en colágeno fibrilar o no fibrilar extraído con ácido, que predominantemente es colágeno de tipo I, pero también puede incluir colágeno de tipo II, colágeno de tipo IV, o ambos. El colágeno utilizado puede derivarse de cualquiera de entre varias fuentes de mamífero, típicamente piel y tendones de cerdo y de vaca. El colágeno preferentemente se ha procesado mediante extracción con ácido, resultando en una dispersión de fibrillas o en un gel de elevada pureza. El colágeno puede extraerse con ácido a partir de la fuente de colágeno utilizando un ácido débil, tal como ácido acético, cítrico o fórmico. Tras extraerse en la solución, el colágeno puede someterse a precipitación salina utilizando NaCl, y recuperarse utilizando técnicas estándar, tales como centrifugación o filtración. Se proporcionan los detalles del colágeno extraído con ácido por ejemplo en la patente US nº 5.106.949, concedida a Kemp et al.

En otra forma de realización, pueden añadirse capas colágenas adicionales entre las policapas heterogéneas, con el fin de promover el crecimiento y desarrollo entre las células de las policapas heterogéneas. En todavía otra forma de realización, pueden añadirse entre las policapas heterogéneas, factores tales como nutrientes, factores de crecimiento, citoquinas, componentes de la matriz extracelular, inductores de diferenciación o productos de secreción, inmunomoduladores, compuestos biológicamente activos que potencian o permiten el crecimiento de la red celular o de las fibras nerviosas (ver la Sección IV).

b) Producción de policapas sobre un polímero

En otra forma de realización, pueden utilizarse diferentes poblaciones celulares cultivadas para producir policapas heterogéneas sobre un área de un polímero. Entre los ejemplos de polímeros adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, colágeno, poli(alfa-ésteres), tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poliortoésteres y polianhídridos y los copolímeros de los mismos, éter de celulosa, celulosa, éster celulósico, polietileno fluorado, fenólico, poli-4-metilpenteno, poliacrilonitrilo, poliamida, poliamideimida, poliacrilato, polibenzoxazol, policarbonato, policianoariléter, poliéster, poliestercarbonato, poliéter, polieteretercetona, polieterimida, polietercetona, polietersulfona, polietileno, polifluoroolefina, poliimida, poliolefina, polioxadiazol, óxido de polifenileno, polifenileno, sulfuro, polipropileno, poliestireno, polisulfuro, polisulfona, politetrafluoroetileno, politioéter, politriazol, poliuretano, fluoruro de polivinilideno, celulosa regenerada, urea-formaldehído o copolímeros o mezclas físicas de estos materiales.

En una forma de realización preferida, una cara del sustrato biocompatible se utiliza para crear una policapa de una primera población celular homogénea. Ello se lleva a cabo recubriendo una cara del sustrato biocompatible con una suspensión de una primera población celular homogénea, por ejemplo de células de músculo liso. La primera suspensión celular homogénea se incuba en medio de cultivo hasta que las células se desarrollan y proliferan, produciendo una monocapa, y las células de la monocapa se unen al sustrato biocompatible. Tras el establecimiento de la monocapa, se deposita la primera suspensión celular homogénea sobre la primera monocapa, y las células se cultivan hasta que se desarrollan y proliferan, produciendo una segunda monocapa de células sobre la primera monocapa, produciendo de esta manera una bicapa. El procedimiento se repite hasta que se genera una policapa que comprende múltiples capas de la primera población celular homogénea. La primera policapa presenta características morfológicas y funcionales similares a las del tejido de parénquima de un órgano in vivo, por ejemplo del detrusor.

Tras el establecimiento de la primera policapa, se crea una segunda policapa que comprende una segunda población celular homogénea (por ejemplo una población de células uroteliales) sobre la primera policapa. Ello produce una interfaz quimérica entre las dos poblaciones celulares diferentes. La segunda policapa se crea depositando una suspensión celular de una segunda población celular homogénea sobre la primera policapa. Se cultivan las células de la segunda población celular homogénea hasta que se desarrollan y proliferan, produciendo una primera monocapa. Tras el establecimiento de la primera monocapa, se deposita la segunda suspensión celular homogénea sobre la primera monocapa, y las células se cultivan hasta que se desarrollan y proliferan, produciendo una segunda monocapa de células sobre la primera monocapa, produciendo de esta manera una bicapa. El procedimiento se repite hasta que se genera una segunda policapa que comprende múltiples capas de una segunda población celular homogénea. La segunda policapa presenta características morfológicas y funcionales similares a las del tejido de parénquima de un órgano in vivo, por ejemplo de la mucosa. Se produce un biomaterial intersticial en la interfaz quimérica entre las dos poblaciones celulares diferentes, tal como se ha indicado anteriormente.

Por lo tanto, la invención proporciona composiciones y procedimientos para la producción de órganos artificiales con una organización multicelular que se asemeja más estrechamente a la de un órgano nativo in vivo. La organización celular incluye policapas heterogéneas. Cada policapa del órgano artificial comprende múltiples capas de una población celular homogénea, generando una estructura organizada con una morfología celular y características funcionales que se asemejan a las de las capas de tejido nativo equivalente in vivo de un órgano natural.

La interfaz quimérica entre las diferentes policapas proporciona un microambiente que imita el microambiente nativo entre las diferentes poblaciones celulares. El experto en la materia apreciará que la forma celular desempeña un papel importante en la división y diferenciación celulares (ver, por ejemplo, Darnell et al., Molecular Cell Biology, publicado por Scientific American Books, (1986)). El microambiente más natural creado mediante el procedimiento de la invención permite interacciones mutuas dinámicas libres célula-célula entre las células de las policapas heterogéneas. Estas interacciones libres permiten que las células en la interfaz adopten una configuración celular y morfológica más natural. El desarrollo celular más natural en la interfaz quimérica permite que las células produzcan proteínas que promueven la división y diferenciación normales.

El constructo de órgano artificial de la invención, que funciona como una parte corporal sustitutiva, puede ser plano, tubular o de geometría compleja. La forma del órgano se decide según el uso pretendido. El órgano artificial puede implantarse para reparar, aumentar o sustituir órganos enfermos o dañados, tales como defectos de la pared abdominal, el pericardio, hernias, y diversos otros órganos y estructuras, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, hueso, periostio, pericondrio, disco intervertebral, cartílago articular, dermis, epidermis, intestino, ligamentos y tendones. Además, el tejido de reparación de tejido puede utilizarse como parche vascular o intracardíaco, o como válvula cardíaca de sustitución.

Por ejemplo, pueden utilizarse láminas planas para soportar órganos prolapsados o hipermóviles mediante la utilización de la lámina como cabestrillo para los órganos. Este cabestrillo puede soportar órganos tales como la vejiga o el útero.

Pueden utilizarse injertos tubulares por ejemplo para sustituir secciones transversales de órganos tubulares, tales como el esófago, la tráquea, el intestino y los tubos de Falopio. Estos órganos presentan una forma tubular básica con una superficie externa y una superficie luminal.

IV. Adhesión celular

En algunas formas de realización, se potencia la unión de las células al sustrato biocompatible recubriéndolo con compuestos, tales como componentes de la membrana basal, ágar, agarosa, gelatina, goma arábiga, colágenos de tipos I, II, III, IV y V, fibronectina, laminina, glicosaminoglicanos, mezclas de los mismos, y otros materiales de unión hidrofílica y peptídica conocidos por los expertos en la materia del cultivo celular. Un material preferido para el recubrimiento del sustrato biocompatible es el colágeno.

En otras formas de realización, los sustratos biocompatibles pueden tratarse con factores o fármacos previamente a la implantación, antes o después del recubrimiento del sustrato biocompatible con células cultivadas, por ejemplo para promover la formación de tejido nuevo tras la implantación. Pueden incorporarse factores, entre ellos fármacos, en el sustrato biocompatible, o proporcionarse conjuntamente con el sustrato biocompatible. Estos factores en general se seleccionarán según el tejido u órgano que se reconstruye o aumenta, con el fin de garantizar que se forma tejido nuevo apropiado en el órgano o tejido injertado (para ejemplos de estos aditivos para la utilización en la estimulación de la cicatrización ósea ver, por ejemplo, Kirker-Head, Vet. Surg. 24:408-19, (1995)). Por ejemplo, cuando se utilizan sustratos biocompatibles para aumentar el tejido vascular, puede utilizarse factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) para estimular la formación de tejido vascular nuevo (ver, por ejemplo, la patente US nº 5.654.273, concedida a Gallo et al.). Entre otros aditivos útiles se incluyen agentes antibacterianos, tales como antibióticos.

La injertación de órganos artificiales puede llevarse a cabo según los procedimientos conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Fauza et al., J. Ped. Surg. 33:7-12, (1998)).

Un experto en la materia apreciará características y ventajas adicionales de la invención a partir de las formas de realización descritas anteriormente. De acuerdo con esto, la invención no se encuentra limitada por lo mostrado y descrito particularmente, excepto según se indica en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Recolección y cultivo de células

Las células recolectadas se cultivaron según los protocolos publicados anteriormente de Atala et al., J. Urol. 150:608, (1993), Cilento et al., J. Urol. 152:655, (1994), Fauza et al., J. Ped. Surg. 33:7-12, (1998).

a) Cultivo de poblaciones de células uroteliales

Se obtuvo y preparó para el cultivo un espécimen de vejiga. Con el fin de minimizar el daño celular, el espécimen se extirpó con bisturí y no mediante electrocauterización. La superficie serosa se marcó con sutura con el fin de eliminar ambigüedades sobre cuál era la superficie urotelial.

El espécimen se procesó en una campana de flujo laminar para cultivo celular utilizando instrumentos estériles. Se preparó medio de cultivo con Keratinocyte-SFM (GIBCO BRL, nº de cat. 17005), con extracto de pituitaria bovina (nº de cat. 13028, 25 mg/500 ml de medio) y factor recombinante de crecimiento epidérmico, (nº de cat. 13029, 2,5 \mug/500 ml de medio) como suplemento. Se introdujeron 10 ml de medio de cultivo a 4ºC en dos placas de cultivo celular de 10 cm y 3,5 ml en una tercera placa. Se extrajo la sangre del espécimen colocándolo en la primera placa y agitando suavemente. El procedimiento se repitió en la segunda placa y finalmente el espécimen se transfirió a la tercera placa. Se raspó suavemente la superficie urotelial con una cuchilla de escalpelo del nº 10 sin cortar el espécimen. Las células uroteliales resultaban visibles como material opaco diminuto que se dispersaba en el medio. Se aspiró la suspensión de células uroteliales/medio y se sembró en seis pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos con aproximadamente 0,5 a 1 ml de medio en cada pocillo, proporcionando un total de 1 a 1,5 ml por pocillos. Las células se incubaron a 37ºC con 5% de CO_{2}.

Al día siguiente (día 1 tras la recolección), el medio se aspiró de los seis pocillos y se añadió medio fresco. Las células se centrifugaron a 1.000 rpm durante 4 minutos y se separó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 3 a 4,5 ml de medio fresco calentado a 37ºC en una placa de 24 pocillos.

Se retiró el medio de cultivo y se añadió PBS/EDTA (37ºC, pH 7,2, EDTA 0,53 mM (0,53 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,0, en 500 ml de PBS)) a cada pocillo de la placa de 24 pocillos, o 10 ml a cada placa de 10 cm. A continuación las células se cultivaron en dos placas de 10 cm. A continuación las células se pasaron a placas diferentes siempre que alcanzasen entre 80% y 90% de confluencia, sin permitir que las células alcanzasen 100% de confluencia.

Las células se observaron bajo un microscopio de contraste de fases. Cuando las uniones célula-célula se encontraban separadas para la mayoría de las células (tras aproximadamente 5 a 15 minutos), se retiró el PBS/EDTA y se añadieron 300 \mul de tripsina/EDTA (37ºC, GIBCO BRL, nº de cat. 25300-054) a cada pocillo de la placa de 24 pocillos, o 7 ml a cada placa de 10 cm. La placa de pocillos/placa se agitó periódicamente. Cuando se habían separado de la placa entre el 80% y el 90% de las células y empezaban a flotar (tras aproximadamente 3 a 10 minutos), se inhibió la acción de la tripsina añadiendo 30 \mul de inhibidor de tripsina de soja (GIBCO BRL, nº de cat. 17075-029, 294 mg de inhibidor en 20 ml de PBS) en cada pocillos de la placa de 24 pocillos o 700 \mul a cada placa de 10 cm con el fin de detener la acción del EDTA. Se añadieron 0,5 ml de medio de cultivo a cada pocillo de la placa de 24 pocillos o 3 ml de medio de cultivo a cada placa de 10 cm. Las incubaciones PBS/EDTA y tripsina/EDTA se llevaron a cabo a temperatura ambiente aunque resultaban más efectivas si se incubaban a 37ºC.

Las células se recogieron mediante centrifugación a 1.000 rpm durante 4 minutos y se separó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 5 ml de medio de cultivo y se determinó el número de células con un hemocitómetro. Se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo estándar de tinción con azul tripán. La densidad óptima de sembrado para una placa de cultivo de 100 mm era de aproximadamente 1 x 10^{6} células/placa. Se añadieron alícuotas del número deseado de células a cada placa y se añadió el volumen de un medio para un total de aproximadamente 10 ml/placa.

b) Cultivo de células musculares lisas de vejiga

Tras separar la capa de células uroteliales del espécimen de vejiga tal como se describe en el Ejemplo I, sección (a), el músculo restante se diseccionó en segmentos de músculo de 2 a 3 mm. Cada segmento de músculo se espació uniformemente sobre una placa de cultivo celular de 100 mm. Los segmentos de músculo se secaron y se dejó que se adhiriesen a la placa (tras aproximadamente 10 minutos). Se añadieron 20 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco con FCS al 10% a los segmentos secos de músculo. Los segmentos de músculo se incubaron durante 5 días sin perturbaciones a 37ºC con 5% de CO_{2}. Se cambiaron los medios de cultivo al 6º día y se eliminó cualquier segmento no adherido. Los segmentos restantes se cultivaron durante un total de 10 días, tras los cuales se retiraron todos los segmentos de músculo. Las células de los segmentos de músculo que se habían adherido a la placa se incubaron hasta la aparición de pequeños islotes de células. Estas células se tripsinizaron, se contaron y se sembraron en un matraz de cultivo T75.

Las células se alimentaron cada 3 días, dependiendo de la densidad celular, y las células se pasaron a matraces nuevos cada vez que alcanzaban una confluencia de entre el 80% y el 90%.

Ejemplo 2

Aumento de vejiga con tejido fetal

El Ejemplo siguiente demuestra la viabilidad de producir órganos artificiales multicelulares funcionales utilizando células uroteliales y musculares lisas de vejiga procedentes de vejiga fetal, tal como describen Fauza et al., J. Ped. Surg. 33:7-12, (1998).

Manipulación quirúrgica materna y fetal

Se anestesiaron ovejas gestantes de tiempo de gestación conocido a los 90-95 días de gestación con 2% a 4% de halotano (Halocarbon Laboratories, River Edge, NJ) tras la inducción con 15 mg/kg de cetamina (Parke-Davis Co., Morris Plains, NJ) intramuscularmente. Recibieron 1 g de cefazolina (BMH Ltd., Philadelphia, PA) intravenosamente. Diez terneros fetales se sometieron a creación quirúrgica abierta de un defecto de extrofia de la vejiga mediante la marsupialización de la parte anterior de la vejiga con la pared abdominal. Al final del procedimiento, se reinfusionó el líquido amniótico, que se había retirado anteriormente y mantenido a 37ºC, en la cavidad amniótica, junto con 500 mg de cefazolina. Se cerraron las membranas gestacionales y la pared uterina en una capa con una grapadora quirúrgica de titanio de 90 mm TA (United States Surgical Corp. (USSC), Norwalk, CT). A continuación se dividieron los fetos en dos grupos.

En el grupo 1, se estableció el acceso videofetoscópico a la cavidad amniótica tal como describen Fauza et al., J. Ped. Surg. 33:7-12, (1998). Se introdujeron cánulas semiflexibles de punta de balón (Marlow Surgical Technologies, Inc., Willoughby, OH) en el útero a través de tres entradas (una de 10 mm y las otras dos de 5 mm de tamaño).

Se llevó a cabo la manipulación videofetoscópica bajo amnioinfusión continua de solución salina caliente o con aire médico como medios de trabajo. Se recolectó un espécimen de grosor completo de tamaño no superior a 1,5 x 1,0 cm de la vejiga extrófica. Se utilizó un telescopio de 5 mm de 30º (Karl Storz Endoscopy-America, Inc., Los Angeles, CA) junto con pinzas endoscópicas de 2 mm y de 5 mm, tijeras endoscópicas de 2 mm y de 5 mm y clips endoscópicos de titanio de 10 mm, estas últimas par el cierre del área recolectada (todos de USSC). Las entradas uterinas se cerraron con Glycomer 631 (Biosyn, USSC) 4-0 sintético absorbible en sutura doble continua. En el grupo II, no se llevaron a cabo procedimientos fetales adicionales.

Se cerró el abdomen de la madre en capas. En el primer día postoperatorio, las ovejas recibieron 1,2 millones de unidades de benzatin penicilina intramuscularmente (Wyeth Laboratories, Inc., Philadelphia, PA). Se permitió el parto normal.

Manipulación de las células

Las capas urotelial y muscular recolectadas de los especímenes de vejiga fetal se separaron quirúrgicamente y se procesaron separadamente.

Cultivo celular

Las células de vejiga se cultivaron mediante procedimientos descritos anteriormente (Cilento et al., J. Urol. 52:665-670, (1994)) y tal como se describe en el Ejemplo 1. En resumen, se aislaron células de músculo detrusor cortando los especímenes de músculo liso en fragmentos de aproximadamente 0,5 mm de diámetro. Se sembraron los explantes en placas de cultivo de 10 cm y se mantuvieron y expandieron con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suplementado con suero de feto bovino al 10% (Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD) en una cámara humidificada al 95% con 5,0% de CO_{2} a 37ºC, tal como se describe en detalle en el Ejemplo 1.

Las células uroteliales se separaron del espécimen quirúrgico mediante curetaje de su superficie epitelial y se sembraron en una placa de 24 pocillos. Se mantuvieron y se expandieron con medio de cultivo de queratinocitos libre de suero que contenía 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico y 50 \mug/ml de extracto de pituitaria bovina (Keratinocyte SFM, Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) en la misma cámara indicada anteriormente.

Se expandieron separadamente in vitro tanto las células de músculo detrusor como las células uroteliales durante 50 a 55 días, hasta alcanzar una densidad de aproximadamente 1,3 x 10^{7} células/cm^{2}.

Transferencia de células

El vehículo de transferencia de las células consistía en láminas no tejidas de polímero ácido poliglicólido con una densidad de 58 mg/ml y un diámetro de fibra de 15 \mum. La malla presentaba una porosidad superior al 95% antes del sembrado y se esterilizó con óxido de etileno. El andamiaje se diseñó para que se degradase por hidrólisis dentro de las 6 a 8 semanas posteriores a la implantación.

Siete a 10 días antes de la implantación in vivo, se sembraron las células de músculo detrusor en un andamiaje de polímero ácido poliglicólico de 3 mm de grueso de 16 a 20 cm^{2}. 3 días después, se sembraron células uroteliales sobre el mismo polímero, sobre las células detrusoras. El número medio de células por polímero era de 200 millones. La bicapa de células uroteliales/de detrusor se dejó en cultivo en DMEM durante aproximadamente 1 semana hasta la implantación en los animales recién nacidos.

Manipulación neonatal

Se administró sulfametoxazol/trimetoprim (Barre-National, Inc., Baltimore, MD) (6 mg/kg de sulfametoxazol) a todos los recién nacidos por vía oral una vez al día de manera profiláctica.

Cirugía

Uno a 4 días después del nacimiento, los recién nacidos se anestesiaron con 1,5% a 3,5% de isoflurano (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) tras la inducción con 15 mg/kg de cetamina intramuscularmente. Se administró una dosis de 100 mg/kg de cefazolina por vía intravenosa. La vejiga extrófica se separó quirúrgicamente de la pared abdominal. Se llevó a cabo la reconstrucción de vejiga en cada grupo de la manera siguiente.

En el grupo I, se utilizó el tejido autólogo de vejiga fetal manipulada para el aumento quirúrgico de la vejiga. Se suturaron los márgenes del tejido manipulado a los márgenes de la vejiga nativa con lactómero 9-1 sintético 3-0 absorbible (Polysorb, USSC) en sutura continua única de manera que la capa de células uroteliales se encontraba en la parte luminal de la vejiga y la capa muscular se encontraba en su parte externa. Se aplicó cola de fibrina (Melville Biologics, Inc., New York, NY) en la superficie externa del tejido manipulado tras su implantación. Se utilizó omento para cubrir el tejido manipulado, se unió libremente a la vejiga, por los márgenes del implante, con cuatro puntos simples cardinales de sutura continua de lactómero 9-1 absorbible 3-0 sintético. En el grupo II, el defecto de la vejiga se cerró inicialmente, con lactómero 9-1 sintético 3-0 adsorbible de forma continua.

En ambos grupos, durante cualquiera de las técnicas de reconstrucción indicadas anteriormente, se dejó dentro de la vejiga un catéter 5F de plástico multiperforado de 15 pulgadas de largo (Davol Inc., Cranston, RI), se exteriorizó a través de una herida punzante separada y se dejó que drenase continuamente hacia un depósito externo abierto. En el primer día postoperatorio todos los recién nacidos recibieron una dosis de 0,6 mU de benzatín penicilina por vía intramuscular.

Seguimiento

Tres semanas después de la operación se llevó a cabo un cistograma de contraste en ambos grupos con yotalamato de meglumina diluida (Mallinck-rodt Medical, Inc., St. Louis, MO) instilado a 15 mm Hg a través del catéter de la vejiga. A continuación se retiró el catéter. Se interrumpió la administración de sulfametoxazol/trimetoprim tras la inserción directa del catéter (Medex Inc., Hilliard, OH) en la vejiga y se conectó a un monitor ditigal/terminal 78534C (Hewlett Packard, Andover, MA). Después se vació por completo la vejiga. La solución salina normal fue infusionada a una tasa de 8 ml/min.Tras cada infusión de 5 ml se registró la presión de la vejiga tras la estabilización. Después se realizó un cistograma radiográfico. Los animales se sacrificaron mediante inyección intravenosa de Somlethal (J. A. Webster, Inc., Sterling, MA). Se extirpó la vejiga para su análisis histológico.

Análisis histológico

Se sumergieron los especímenes de vejiga principalmente cerrada y manipulada en solución al 10% de formalina tamponada (Stephens Scientific, Riversdale, NJ) tras la extirpación y se sometieron a procesamiento habitual con hematoxilina-eosina 24 a 48 horas después de la recolección. Se llevó a cabo análisis microscópico a magnificación 25X y 100X con un microscopio óptico Zeiss de laboratorio (Zeiss, Alemania).

Análisis estadístico

Se llevó a cabo el análisis estadístico mediante análisis de la varianza (ANOVA) y prueba de Scheffe-f con límites de confianza al 95%. Los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

Resultados

Los cistogramas de contraste eran evidentemente diferentes en ambos grupos. Las vejigas manipuladas produjeron imágenes similares a las normales, en contraste con las más pequeñas y distorsionadas observadas en el grupo sometido a cierre primario de vejiga.

A los 2 meses de edad, las vejigas manipuladas funcionaban mejor (P<0,05) y presentaban una capacidad mayor a presiones más altas de 30 mm Hg (P<0,05) que las cerradas inicialmente.

El análisis histológico del tejido manipulado mostraba un revestimiento urotelial pseudoestratificado multicapa (epitelio de transición) en la cara luminal y capas superpuestas de células musculares lisas rodeadas por tejido conectivo. La arquitectura microscópica de la mucosa manipulada era diferente aunque similar a la de la vejiga nativa. Se observó hipertrofia muscular en las vejigas extróficas cerradas inicialmente, tal como se esperaba, pero no en las manipuladas.

El procedimiento de la invención produce tejido autólogo de vejiga y supera también determinadas limitaciones del trasplante autólogo. Tras la recolección fetal, el intervalo necesario para manipular un injerto autólogo es paralelo al resto de la gestación, por lo tanto el tiempo no es un factor limitante. Además, con frecuencia existe una relación inversa entre la edad del donante y la tasa de crecimiento celular en el cultivo (Langer et al., Science 260:920-926, (1993)). El hecho de que se utilizaron las células fetales en el presente experimento maximizó este principio, tal como demuestra la elevada tasa de expansión observada con las células detrusoras fetales.

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Además, el aumento de vejiga mediante el procedimiento de la invención presentado en la presente memoria podría demostrar su utilidad en el tratamiento de determinadas anomalías congénitas humanas, tales como las extrofias de vejiga y cloacales, en las que podría no haber suficiente vejiga residual para el cierre apropiado durante el periodo neonatal.

Claims

1. Constructo de órgano artificial, que comprende:

un sustrato biocompatible;

una primera policapa cultivada de células derivadas de una población aislada de células musculares lisas; y

una segunda policapa cultivada de células derivadas de una segunda población celular que es diferente de la población de células musculares lisas, en el que la segunda policapa se cultiva sobre la primera policapa y está acoplada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica en la que se produce biomaterial intersticial, de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una estructura biológica natural tras la implantación.

2. Órgano artificial según la reivindicación 1, que comprende además una tercera policapa cultivada de células derivadas de una tercera población celular que es diferente de la primera población celular y de la segunda población celular, en el que la tercera policapa está acoplada a la segunda policapa mediante una interfaz quimérica.

3. Procedimiento para la producción de un constructo de órgano artificial, que comprende:

proporcionar un sustrato biocompatible en la forma de un órgano;

crear una primera policapa cultivada de células derivadas de una población aislada de células musculares lisas sobre un área del sustrato biocompatible, en el que la primera policapa se une al sustrato biocompatible; y

crear una segunda policapa cultivada de células derivadas de una segunda población celular que es diferente de la población de células musculares lisas, en el que la segunda policapa se cultiva sobre la primera policapa y está acoplada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica en la que se produce biomaterial intersticial, de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una estructura biológica natural tras la implantación, produciendo de esta manera un constructo de órgano artificial.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, que comprende además crear una tercera policapa cultivada de células derivadas de una tercera población celular que es diferente de la primera población celular y de la segunda población celular, en el que la tercera policapa se encuentra asociada a la segunda policapa mediante una interfaz
quimérica.

5. Constructo de órgano artificial según las reivindicaciones 1 y 2 o procedimiento para la producción de un constructo de órgano artificial según las reivindicaciones 3 y 4, en el que la interfaz quimérica comprende además un biomaterial intersticial producido por por lo menos una de las policapas, preferentemente células con una morfología normal.

6. Constructo de órgano artificial según las reivindicaciones 1 y 2 o procedimiento para la producción de un constructo de órgano artificial según las reivindicaciones 3 y 4, que comprende además factores de formación de capas entre la primera y segunda policapas, en el que los factores se seleccionan de entre el grupo constituido por nutrientes, factores de crecimiento, citoquinas, componentes de matriz extracelular, inductores de diferenciación, productos de secreción, inmunomoduladores, y compuestos biológicamente activos que potencian o permiten el crecimiento de la red celular o las fibras nerviosas.

7. Constructo de órgano artificial según las reivindicaciones 1 y 2 o procedimiento para la producción de un constructo de órgano artificial según las reivindicaciones 3 y 4, en el que el órgano artificial se selecciona de entre el grupo constituido por corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra o es una parte de cualquiera de dichos órganos.

8. Constructo de vejiga artificial, que comprende:

un sustrato biocompatible;

una segunda policapa cultivada de células derivadas de una población de células uroteliales, en la que la segunda policapa se cultiva sobre la primera policapa y está acoplada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica en la que se produce biomaterial intersticial, de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una vejiga natural tras la implantación.

9. Procedimiento para la producción de un constructo de vejiga artificial, que comprende:

proporcionar un sustrato biocompatible en la forma de una vejiga;

crear una primera policapa cultivada que comprende una población aislada de células musculares lisas sobre un área del sustrato biocompatible, en el que la primera policapa se une al sustrato biocompatible; y

crear una segunda policapa cultivada que comprende una población de células uroteliales, en el que la segunda policapa se cultiva sobre la primera policapa y está acoplada a la primera policapa mediante una interfaz quimérica, de manera que el constructo proporciona el equivalente funcional de una vejiga natural tras la implantación, produciendo de esta manera un constructo de vejiga artificial.

10. Constructo de vejiga artificial según la reivindicación 8 o procedimiento para la producción de un constructo de vejiga artificial según la reivindicación 9, en el que la interfaz quimérica comprende además una submucosa intersticial producida por por lo menos una de las policapas.

11. Procedimiento para la producción de un constructo de órgano artificial según las reivindicaciones 3 ó 9, en el que el sustrato biocompatible es un polímero, una vejiga descelularizada, o una parte de una vejiga descelularizada.