KR102057601B1 - 신경 전구 세포 분화 - Google Patents

Abstract

신경 줄기 세포들의 분화 및 안정성은 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 조성물들, 예를 들면 콜라겐 I, IV, 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸으로 인 비트로 또는 인 비보 배양함으로써 증가될 수 있다. 본 발명의 일 태양에서, 성체 포유류 장 뉴런 전구 세포들은 신경 ECM 조성물들의 성분 또는 조합들로부터 유래된 다양한 기판 상에서 분화되도록 유도될 수 있다. 콜라겐 I 및 IV 는 신경 분화 및 광범위한 신경교 분화를 개별적 그리고 조합하여 지지하였다. 라미닌 또는 헤파란 설페이트의 콜라겐 기판으로의 첨가는 뉴런 분화, 뉴런 수 증가, 뉴런 과정의 분지, 및 뉴런 네트워크 형성을 예상외로 증진시켰다. 다른 태양으로, 뉴런 아형 분화는 내장 평활근 시트를 덮은 하이드로겔 내 ECM 조성물들이 변함으로써 영향을 받았다. 본 발명의 기판 조성물은 신경절 없는 장애(aganglionic disorder)를 치료하기 위한 조직 조작된 이식가능한 신경분포된 GI 평활근 구조체에 사용될 수 있다.

Description

신경 전구 세포 분화{NEURAL PROGENITOR CELL DIFFERENTIATION}

정부 권리

본 발명은 미국 국립 보건원 과제 번호 RO1DK071614 및 RO1DK042876에 의한 US 정부 지원으로 이루어졌다. US 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

관련 출원

본 출원은 "Neuroglial Differentiation"이라는 제목의 2013년 3월 15일자 출원된 미국 가출원 출원번호 61/788,285에 기초하고, 우선권을 주장한다.

기술 분야

본 발명의 분야는 조직 공학이고, 특히 기관 및 신체 조직의 신경재분포(re-innervation)이다.

근육층 신경절(myenteric ganglia)의 보존과 함께 연속된(uninterrupted) 장 신경계(enteric nervous system)가 장의 운동(motility) 및 기능을 위해 요구된다. 근육층 신경절의 운동 뉴런(motor neuron)은 아세틸콜린/타키키닌(흥분성(excitatory)) 또는 산화질소/억제 펩티드/퓨린(억제성)을 주로 발현하여, 평활근 수축 및 이완을 중재한다. 기관 및 다른 신체 구조 내 신경 세포 집단(population)의 손실 및/또는 신경 기능의 부분, 선택적 또는 총 손실은 많은 질환 및 장애의 특징이다. 예를 들면, 다양한 길이의 원위 소화관(distal gut)의 무신경절증(aganglionosis)은 히르쉬스프롱병(hirschsprung's disease)에서의 중앙 병리(central pathology)이다. 장관 신경병증(enteric neuropathy)은 또한 위장 장애(gastrointestinal dysfunction)를 가져오는 몇몇 다른 장애(예를 들면, 당뇨병, 파킨슨병 및 염증)에 뒤따르는 것이다. 위장 운동 기능은 벽내(intramural) 장 신경계에 의해 조절된다. 이는 외근육층(muscularis externa)의 평활근 및 2개의 장근 신경총(enteric neuronal plexi) 사이의 복잡한 상호작용이다.

신경 줄기 세포 요법은 장근 신경총을 살려(repopulating), 신 신경세포 기능 및 이에 따른 위장 운동 기능을 회복시키기 위한 최근 생겨난 요법이다. 연구는 2가지 중요한 연구 결과에 의해 유도된다: i) 신경 줄기 세포는 히르쉬스프롱 환자의 신경절이 있는(ganglionated) 콜론을 포함하는 성인 포유류 장으로부터 분리될 수 있고; ii) 신경 줄기 세포는, 동물 모델에서 원위 결직장(colo-rectum)으로 인비보 또는 조직절편배양(explant culture)으로 이식시 장 신경계(ENS)의 몇몇 신경 세포 아형(subtype) 및 교질(glia) 특성으로 분화하여 도입될 수 있다.

신경능(neural-crest) 유도된 장 신경 줄기 세포가, 히르쉬스프롱 질환을 가진 환자의 신경절 창자(ganglionic bowel)를 포함하는, 성인 포유류의 장으로부터 분리되는 동안, 마이크로 환경 유도 분화의 정보 또는 이해가 거의 없고, 인 비트로 이들 분화된 뉴런의 부차적인 작용 거동을 기술하는 오직 제한된 연구들만 있다. 또한, 신경 손실 관련 장애를 위한 치료로서 신경 줄기 세포 이식에 의한 신경 기능의 복구는 아직 임상적으로 입증되지 않았고, 신경교세포(neuroglial cell)를 지지하고, 이식된 또는 심어진(implanted) 신경 줄기 세포의 장기간 생존 및 표현형 안정성(phenotypic stability)을 보장하기 위한 방법 및 물질에 대한 요구가 있다.

요약

세포외 기질(ECM) 조성물들이 신경 줄기 세포 운명 및 직접적인 분화를 조절한다는 것을 발견하였다. 용어 "세포외 기질" 또는 "ECM"은 여기서 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 조성물을 나타내기 위해 사용된다: 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌(laminin), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 또는 상기 단백질들의 하나 또는 그 이상의 단편들(fragments).

본 발명의 일 태양은, 평활근 세포의 집단(population)을 수득하는 단계, 단축으로 배열된 (uniaxially-aligned) 평활근 시트(sheet)를 형성하도록 평활근 세포를 배양하는 단계, 신경 줄기세포의 집단을 수득하는 단계, 단축으로 배열된 평활근 시트에 적용된 하이드로겔 내 신경 줄기 세포를 배양하는 단계, 및 적어도 하나의 세포외 기질(ECM) 성분에 상기 신경 줄기 세포를 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 ECM 성분은 뉴런 아형(neuronal subtype)이 풍부한(enriched) 분화된 신경 줄기 세포로 신경 줄기 세포들의 분화를 편향(biasing)시키는, 신경 줄기세포 분화의 편향 방법을 포함한다. 예를 들면, 상기 뉴런 아형은 콜린작동성 뉴런이고, 상기 하이드로겔은 콜라겐 I, 또는 적어도 적어도 약 800 ㎍/ml 콜라겐 I, 또는 약 800 ㎍/ml 내지 약 1600 ㎍/ml의 콜라겐 I을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 뉴런 아형은 질소활성(nitrergic) 뉴런이고, 상기 하이드로겔은 콜라겐 IV를 포함하고 라미닌이 실질적으로 없거나, 또는 적어도 약 200 ㎍/ml 콜라겐 IV를 포함하고 라미닌이 실질적으로 없을 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 뉴런 아형은 펩티드성 뉴런이고, 상기 하이드로겔은 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌을 포함하거나, 또는 적어도 약 800㎍/ml 콜라겐 I, 적어도 약 200 ㎍/ml 콜라겐 IV, 및 적어도 약 5㎍/ml 라미닌을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 태양은 상기 분화된 신경 줄기 세포를 분리하는 단계 및 상기 분화된 신경 줄기 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 환자에게 하이드로겔 내 분화된 줄기 세포들을 주입하는(injecting) 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 분화된 신경 줄기 세포는 단축으로 배열된 평활근 시트를 신경분포(innervate)하여 신경 분포된 평활근 시트가 형성되도록 하고, 상기 신경분포된 평활근 시트를 환자에게 이식하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 태양은 신경 줄기세포의 집단을 수득하는 단계, 평활근 세포의 집단을 수득하는 단계, 상기 평활근 세포 존재 하에 상기 신경 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 신경 줄기 세포는 적어도 하나의 세포외 기질(ECM) 성분을 포함하는 기판(substrate) 코팅이 있는 기판 상에 부착하고, 상기 ECM 성분은 뉴런이 풍부한 분화된 신경 줄기세포로 신경 줄기 세포의 분화를 편향시키는 방법을 포함한다. 예를 들면, 상기 기판 코팅은 적어도 하나의 라미닌, 콜라겐 I, 및 콜라겐 IV을 포함하거나, 상기 기판 코팅은 라미닌, 그리고 콜라겐 I 및 콜라겐 IV 중 적어도 하나, 또는 상기 기판 코팅은 콜라겐 I 및 콜라겐 IV, 그리고 라미닌 및 헤파란 설페이트 중 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 다른 태양은 상기 분화된 신경 줄기 세포를 분리하는 단계 및 상기 분화된 신경 줄기 세포를 환자에게 투여하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 환자에게 분화된 줄기 세포들을 주입하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 태양은 신경 줄기 세포의 집단을 수득하는 단계, 평활근 세포의 집단을 수득하는 단계, 평활근 세포 존재 하에 상기 신경 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 신경 줄기세포는 적어도 하나의 세포외 기질 성분을 포함하는 기판 코팅이 있는 기판 상에 부착되고, 상기 ECM 성분은 신경교 세포(glial cell)가 풍부한 분화된 신경 줄기 세포로의 상기 신경 줄기 세포의 분화를 편향시키는 방법을 포함한다. 예를 들면, 상기 기판 코팅은 적어도 콜라겐 I 및 콜라겐 IV를 포함하고, 라미닌 및 헤파란 설페이트 중 적어도 하나가 실질적으로 없을 수 있고, 또는 상기 기판 코팅은 적어도 5 ㎍/cm² 콜라겐 I, 그리고 적어도 5㎍/cm² 콜라겐 IV를 포함하고, 라미닌 및 헤파란 설페이트 중 적어도 하나가 실질적으로 없는 것일 수 있다. 다른 태양은 상기 분화된 신경 줄기 세포를 분리하는 단계 및 상기 분화된 신경 줄기 세포를 환자에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 환자에게 상기 분화된 줄기 세포들을 주입하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 태양에서, 성체 포유류 장(enteric) 신경 전구 세포들은 ECM 조성물들의 성분 또는 조합들로부터 유래된 다양한 기판 상에서 분화가 유도될 수 있다. 뉴런의 그리고 신경교 세포 분화는 ECM 조성물의 기능으로써 연구되었다. 콜라겐 I 및 콜라겐 IV 기판들은 뉴런(neuronal) 분화 및 광범위한 신경교 분화를 개별적으로 그리고 조합하여 지지하였다. 라미닌 또는 헤파란 설페이트를 콜라겐 기판에 첨가함은 뉴런 분화를 향상시키고, 뉴런의 수와 뉴런 과정의 분지(branching) 및 뉴런 네트워크 형성의 개시를 증가시킨다. 다양한 신경 ECM 성분들이 성체 장 신경 전구 세포들의 신경교 분화의 효과 연구를 위해 개별적으로 그리고 조합하여 평가되었다.

본 발명의 다른 태양에서, 조직 조작된(tissue-engineered) 내장(intestinal) 세로(longitudinal) 평활근 시트들은 다양한 ECM 조성물들의 하이드로겔에 봉입된(embedded) 장 뉴런 전구 세포들을 이용하여 신경분포될 수 있다.

분화된 뉴런 조성물(콜린작동성(cholinergic), 질소활성(nitrergic), 펩티드성(peptidergic)), 뿐만 아니라 기능적인 뉴런 생리 매개 평활근 수축/이완들이 평가되었다. 몇몇 기능적인 분화된 뉴런 아형은 조직 조작된 내장 시트에 존재하고, 평활근 수축/이완을 매개할 수 있다. 뉴런 집단들은 매우 콜린작동성(콜라겐 I), 매우 질소활성(복합물 콜라겐 I 및 콜라겐 IV), 둘 사이에 균형된 것 (복합물 콜라겐 I 및 콜라겐 IV, 및 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트)으로 다양할 수 있다. 추가로, 펩티드성 뉴런에서의 증가는 라미닌 및 헤파란 설페이트로 검출되었다.

비신경 소화관(aneural gut)의 외식(explant) 배양에서 다양한 타입의 뉴런 전구 세포들(CNS-유래된, 신경 튜브-유래된, 배아 및 성체 ENS-유래된)의 이식의 실행가능성은 잘 확립되어 있다. 그러나, 허용된(permissive) 환경에 초점을 두어 성공적인 이식 및 장기간 생존을 위해 필요한 조건들은 지금까지는 확인되지 않았다. ECM의 역할에 초점을 둔 성체 장 신경 전구 세포의 인 비트로 분화와 관련된 연구들은 신경 및 신경교 표현형 모두의 생존가능성 및 유지를 최적화하는데 도움이 될 수 있다. 또한, 우리 연구는 뉴런 분화가 ECM 미세환경(microenvironment)의 조성물의 변화에 의해 조절될 수 있다는 것을 나타낸다. 분화된 뉴런 아형의 풍부한 집단은 ECM 미세환경을 이용하여 이식가능한 조직 조작된 시트내에서 유래될 수 있다. ECM 미세환경들은 충분한 영양(trophic) 지지와 분화된 뉴런의 표현형 유지를 또한 가능하게할 수 있다.

임의의 구현예에서, 신경 분화는 유효한 양의 라미닌 또는 라미닌, 그것의 단편들, 그것의 유도체, 또는 유사체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 유도된다.구체적인 예로, 라미닌은 완전한 라미닌 단백질일 수 있다. 추가의 예로, 라미닌은 라미닌-1, 라미닌-2, 라미닌-4, 및 그것의 단편들 또는 조합들로부터 선택된다. 추가의 예로, 라미닌 또는 라미닌 조성물은 적어도 실질적으로 라미닌-1, 라미닌-2, 또는 라미닌-4와 상동인(homologous) 물질을 포함한다. 더 추가적인 예시로, 라미닌 또는 라미닌 조성물은 적어도 실질적으로 라미닌 α1 사슬과 상동인, 예를 들면 신경교 분화를 유도하는 능력을 보유하고 있는 적어도 라미닌 α1 사슬의 단편과 적어도 80%, 또는 85%, 또는 90% 또는 95% 서열 일치하는 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시의 다양한 치료적 치료를 위해 유효한 양은, 물론, 질환의 중증도, 환자의 체중 및 일반적인 상태, 뿐만 아니라 치료적으로 활성인 화합물 또는 성분의 흡수, 불활성 및 배설율, 복용량 스케쥴, 및 투여량, 뿐만 아니라 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있는 다른 인자들에 의존될 수 있다. 정확한 복용량(dosage) 및 투여 빈도는 특정한 라미닌, 라미닌 조성물 또는 다른 투여될 수 있는 치료적 물질, 치료되는 특정 증상, 치료되는 증상의 중증도, 나이, 체중, 일반적인 특정 환자의 신체적 조건, 및 환자가 받는 다른 치료가 고려될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 통상적으로, 인 비트로 사용되는 복용량은 약학적 조성물의 인 비보 투여를 위해 유용한 양에 유용한 가이드를 제공할 수 있고 동물 모델은 특정 장애의 치료를 위한 유효한 복용량을 결정하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 신경 장애의 동물 모델은 유효한 복용량을 결정하는데 사용될 수 있고, 그리고나서, 본 기술분야에 알려진 바와 같이, 인간을 비롯한 다른 환자의 복용량으로 전환될 수 있다. 복용량 결정에 관한 다양한 고려는, 예컨대, Gilman et al, eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press (1990); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990)에 기술되어 있으며, 참조를 위해 여기에 포함된다.

다른 실시예에서, 라미닌 또는 라미닌 조성물은 약 10 fmol/g 내지 약 500 nmol/g, 예를 들면 약 2 nmol/g 내지 약 20 nmol/g 또는 약 2 nmol/g 내지 약 10 nmol/g의 라미닌 도즈(dose)를 제공하기에 충분한 양으로 신경 줄기 세포들의 인 비트로 배양물(또는 환자에게 신경 줄기 세포를 공동투여하는)에 도입될 수 있다. 추가의 예로, 라미닌 또는 라미닌 조성물은 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1000 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg의 라미닌 도즈를 제공하기에 충분한 양으로 환자에게 투여되거나 인 비트로 공급될 수 있고, 특정 예에서, 이 양은 1일 당 또는 1주 당 제공된다. 다른 예에서, 라미닌 또는 라미닌 조성물은 약 0.2 mg/kg 내지 약 2 mg/kg의 라미닌 도즈를 제공하는데 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 추가의 예로, 라미닌 또는 라미닌 조성물은 약 5 nM 내지 약 500 nM, 예를 들면 약 50 nM 내지 약 200 nm, 또는 약 100 nM의 투여되는 물질 내 라미닌의 농도를 제공하기에 충분한 양으로 환자에게 투여된다.

복합물 콜라겐 혼합물에 헤파란 설페이트의 첨가는 또한 뉴런 분화를 향상시킬 수 있다. 뉴런 네트워킹과 뉴런 클러스터링은 나중(later) 시점에서 볼 수 있었다. 헤파란 설페이트 및 GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor)와의 상호작용 그리고 다른 신경영양인자들은 안정화하고, 이 인자들을 국소적으로 이용가능하도록, 신경돌기 진전(outgrowth) 및 뉴런 분화를 조절 가능하도록 만든다. 헤파란 설페이트는 콜라겐 IV 및 라미닌과 모두 상호작용하고, 뉴런 분화를 양성(positive) 조절하며, 뉴런 네트워킹의 개시 및 축삭돌기(axonal) 길이, 향상된 신경돌기 진전에 의해 입증될 수 있다(도 4의 A-H). 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트와 함께 복합물 콜라겐 기판은 낮은 수준의 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 양성 신경교 세포들을 유지하고, 그와 함께 성상세포 네트워킹의 개시는 나중 시점에 좀 더 명확해질 것이다. 일반적으로, 뉴런 분화를 지지하는 기판들은 뉴런 세포 표현형 또는 생존을 지지 가능하게 하는데 필요로 하는 거의 최소한의 신경교 세포들을 증명하였다.

함께 고려하면, 본 결과들은 뉴런 전구 세포들의 캡슐화(encapsulate)를 위해 최적의 3D 매트릭스 조성물을 동정하는데 도움이 된다. 특정 구현예에서, 3차원 하이드로겔 환경은 신경 분화를 위한 기계적인 신호를 또한 제공할 수 있다.

예를 들면, 몇몇 구현예에서, 3차원 ECM 하이드로겔은: 콜라겐 I (약 800 ㎍/ml 내지 약 1600 ㎍/ml); 콜라겐 I(약 800 ㎍/ml) 및 콜라겐 IV(약 200 ㎍/ml); 라미닌과 함께 콜라겐 I 및 콜라겐 IV(약 5 ㎍/ml 내지 약 10 ㎍/ml); 라미닌 및 헤파란 설페이트와 함께 콜라겐 I 및 콜라겐 IV(약 10 ㎍/ml 내지 약 20 ㎍/ml)를 포함할 수 있다. 겔의 다른 성분들은 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 내에 적어도 1% 신생우아혈청 및 적어도 0.1X 항생제를 포함할 수 있다. 수산화나트륨(0.1N)은 겔화를 위해 약 7.4로 pH를 조정하는데 사용될 수 있다.

따라서, 신경퇴행성 증상의 치료를 위한 방법 및 시스템들은 개시되고, 이에 의해 신경 줄기 세포(NSCs)는 필요한 환자에게 이식될 수 있고, 그리하여 세포들은 분화되고 신경퇴행성 증상을 경감시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 이식시 신경줄기세포들은 질환 상태 또는 증상을 경감하기 위한 신경 인프라구조(infrastructure) 내에 통합되기에 충분한 뉴런 또는 신경교 세포들의 양을 생성한다. 일 구현예에서, 개시된 방법들은, 포유류의 중추 신경계로부터 분리되고, 인 비트로 증식되고, 세포외 기질 물질(ECM)의 적어도 하나의 성분에 노출함으로써 분화를 유도하는, 다능 신경 전구세포 또는 신경 줄기 세포들을 이식함으로써 신경퇴행성 질환 또는 증상을 치료하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 태양 이식된 세포들이 충분한 수의 뉴런 및/또는 신경교 세포들로 분화하여 결함이 있는 신경 회로를 회복시키도록, 치료가 손상된 신경 부위에 이식을 통해 적절한 수의 NSCs를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 개시된 방법들은 운동 뉴런 질환에서, 운동 기능을 복구하는 것을 포함한다. 운동 뉴런으로 분화가능한, 치료적으로 유효한 양 또는 적절한 수의 NSCs 또는 신경 전구세포는 신경 퇴행의 적어도 하나의 영역에 공급될 수 있다. NSCs는 퇴행된 신경근 접합부를 대체함으로써 치료적 효과를 발휘할 수 있다.

특정 구현예에서, 개시된 방법들 및 시스템들은 호스트(host) 조직에 통합되고 하나 또는 그 이상의 인자들을 호스트 뉴런에게 제공하고 그리하여 조직 내에 존재하는 퇴행성 영향들로부터 그들을 보호하는 신경 줄기 세포 또는 신경 전구세포를 제공하는 것을 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 개시된 방법들은 하나 또는 그 이상의 세포외 기질 물질(ECMs)에 줄기세포의 노출에 의해, 이식된 NSCs의 뉴런 또는 신경교 세포들로의 분화 효율성을 증가시키는 것을 포함한다. 본 방법은 매우 풍부한 NSCs 또는 신경 전구 세포(progenitors)가 이들의 미분화된 상태에서 증식하고, 그리고 나서 이식시 충분한 수의 세포들이 원하는 표현형으로 적응될 수 있도록 분화를 유도하는 것을 포함한다.

개시된 방법의 세포들은 포유류의 태아, 신생아, 청소년, 또는 성인 또는 사후의 조직으로부터 분리되거나 수득될 수 있다. 개신된 방법의 세포들은 중추 신경계, 혈액, 또는 뉴런으로 분화하는 줄기 세포들의 임의의 다른 적절한 소스로부터 분리되거나 수득될 수 있다. 세포들은 또한 배아 줄기 세포들로부터 수득될 수 있다. 특정 바람직한 구현예로, 세포들은 신경 장애의 경감을 위하여 환자로부터 수득되고 환자에게 다시 돌려줄 자가 신경 줄기 세포들이다. 특정 구현예에서, 신경 줄기 세포들은 배양으로 증식될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 신경 전구체 (precursor) 세포들은 배양에서 증식할 수 있는 다능 NSCs 그리고 분화시 뉴런 및 신경교를 생성할 수 있다.

세포들은 이식 시점에 인비트로 미분화되거나, 전분화되거나(pre-differentiated) 또는 완전히 분화될 수 있다. 일 구현예에서, 세포들은 신경 계통으로 분화하도록 유도될 수 있다. 개시된 방법들의 세포들은 손상된 조직 내 존재하는 다른 환경적인 인자 그리고 전염증성 사이토카인 및/또는 EMCs의 존재에서 인 시추(in situ) 뉴런 분화를 거칠 수 있다.

본 방법을 이용하여, 신경 회로는 질환, 장애, 또는 증상의 경감을 위하여 적절한 부위에 세포들을 이식 또는 도입함으로써 처리(treat)될 수 있다. 일반적으로, 이식은 이식된 세포들의 생존을 지지하는 비신경 조직 또는 신경 조직으로 일어난다. 개시된 방법으로 수행된 NSC 이식(graft)은 NSC는 신경퇴행성 증상 또는 질환의 개시 및 전파를 지연하는 형태로 강력한 임상 효과를 발휘할 수 있는 신경퇴행성 환경에서 잘 생존한다.

본 발명은, 공유이고(commonly owned), 현재 함께 계류중인 출원 PCT/US2013/024080호 제목 "Innervation of Engineered Structures" 2013년 1월 31일 출원 그리고 PCT/US2013/024024호 제목 "Tubular Bioengineered Muscle Structures" 2013년 1월 31일 또한 출원, (각각은 그 전체가 본원에 참조로써 개재된다.)에 개시된 내용을 포함하는 다양한 다른 조직 조작된 방법들과 조성물들과 조합하여 사용될 수 있다.

도 1의 A-D는 토끼 장 신경구의 현미경 사진이다 - 도 1의 A는 배양에서 토끼 장 신경구의 위상차 현미경 사진이다. 일차(primary) 분리 및 배양시, 전구 세포가 증식되고 응집되어 신경구와 같은 형 본체(body)를 형성한다(장 신경구). 초기 표현형에 대한 면역조직화학(도 1의 B-D): 토끼 장 신경구는 p75NTR(도 1의 B), Sox2(도 1의 C) 및 네스틴(도 1의 D) 양성이다-이들은 신경능 유도 뉴런 및 신경교 전구 세포를 포함한다. 스케일 바 100 ㎛임.
도 2는 세포외 매트릭스(ECM) 조성물의 작용으로서 장 신경구 분화의 개략도이다: 22 x 11 mm 커버슬립이 폴리-L-라이신(PLL), 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 또는 헤파란 설페이트 각각으로 또는 조합하여 코팅되었다. 장 신경구를 6시간 동안 상기 코팅된 커버슬립에 부착하도록 하였다. 별개로 코팅되지 않은 유리 커버슬립을 결장(colonic) 평활근 세포로 시드하고, 밀집(confluence)까지 배양하였다. 장 신경구의 분화를 자극하기 위해, 밀집된(confluent) 평활근을 함유하는 커버슬립을, 2개의 커버슬립이 용해성 인자를 공유하도록 동일한 디쉬 내에 놓았다.
도 3은 개별 코팅된 커버슬립 상의 뉴런의 분화를 보여준다 - βIII 튜블린 항체(백색)가, PLL(도 3의 A,E), 라미닌(도 3의 B,F), 타입 I 콜라겐(도 3의 C,G) 및 타입 IV 콜라겐(도 3의 D,H)으로 코팅된, 5일(도 3의 A-D) 및 15일(도 3의 E-H) 커버슬립 상에서의 뉴런을 시각화하기 위해 사용되었다. PLL 상의 장 신경구는 15일에서 거의 뉴런 분화 초기였다. 라미닌, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV 상의 신경구는 인 비트로 초기(early) 및 늦은(late) 시점에서 모두 분지 및 몇몇 뉴런의 진행을 보여주었다.
도 4는 콜라겐-라미닌 기판 상에서의 뉴런 분화를 보여준다 - 뉴런을 타입 I 콜라겐 및 5㎍/cm² 라미닌(도 4의 A,E) 또는 10㎍/cm² 라미닌(도 4의 B,F) 또는 5(도 4의 C,G) 또는 10(도 4의 D,H) ㎍/cm² 의 라미닌을 가진 타입 IV 콜라겐으로 코팅된, 5일(도 4의 A-D) 및 15일(도 4의 E-H) 커버슬립 상에서 βIII 튜블린(백색)으로 염색하였다. 콜라겐 기판으로의 라미닌의 첨가는 초기 및 늦은 뉴런 분화를 향상시켰지만, 유의미한 차이는 5 및 10 ㎍/cm² 의 라미닌 사이에서 관찰되지 않았다. 타입 IV 콜라겐 기판(도 4의 C,D,G,H)은 타입 I 콜라겐(도 4의 A,B,E,F) 기판에 비해 향상된 뉴런 분지 및 분화를 증명하였다.
도 5는 복합 콜라겐-라미닌-헤파란 설페이트(HS) 기판 상의 뉴런 분화를 보여준다 - 뉴런을 5㎍/cm² 라미닌(도 5의 B,F), 0.1㎍/cm² 헤파란 설페이트(HS)(도 5의 C,G), 둘 모두(도 5의 D,H) 또는 없음(도 5의 A,E) 중 어느 하나를 가진 타입 I 및 IV 콜라겐으로 코팅된 5일(도 5의 A-D) 및 15일(도 5의 E-H) 커버슬립 상에서 βIII 튜블린(백색)으로 염색하였다. 콜라겐 기판으로의 라미닌 또는 HS의 첨가는 15일까지의 시각적인 네트워킹과 함께, 초기 및 늦은 뉴런 분화를 향상시켰다. 라미닌 또는 HS가 없는 기판들은 최소한의 뉴런 분화임을 증명하였다(도 5의 A,E).
도 6은 일차 코팅된 기판 상의 신경교(glial) 분화를 보여준다 - 신경교를 폴리-L-라이신(PLL)(도 6의 A,E), 라미닌(도 6의 B,F), 타입 I 콜라겐(도 6의 C,G) 및 타입 IV 콜라겐(도 6의 D,H)으로 코팅된, 5일(도 6의 A-D) 및 15일(도 6의 E-H) 커버슬립 상에서 GFAP(백색)로 염색하였다. PLL 상의 장 신경구는 5일에서 시작하여 15일까지 최대의 신경교 분화임을 입증하였다. 콜라겐 기판 상의 신경구는 우수한 초기 및 늦은 신경교 분화를 입증한 반면, 라미닌 코팅된 기판은 5일(B)까지 초기 신경교 분화를 나타내지 않았지만, 연속해서 15일(F)까지 분화하였다.
도 7은 콜라겐-라미닌 기판 상의 신경교 분화를 보여준다 - 신경교를 타입 I 콜라겐 및 5㎍/cm² 라미닌(도 7의 A,E) 또는 10㎍/cm² 라미닌(도 7의 B,F), 또는 5(도 7의 C,G) 또는 10(도 7의 D,H) ㎍/cm² 의 라미닌을 가진 타입 IV 콜라겐으로 코팅된, 5일(도 7의 A-D) 및 15일(도 7의 E-H) 커버슬립 상에서 신경교섬유질산성단백질(GFAP)(백색)로 염색하였다. 콜라겐 기판으로의 라미닌의 첨가는 5일 및 15일 모두에서 신경교 분화를 촉진하였다. 5 및 10㎍/cm² 의 라미닌 사이에 GFAP+신경교 분화에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다.
도 8은 복합 콜라겐-라미닌-헤파란 설페이트(HS) 기판 상의 신경교 분화를 보여준다 - 신경교를 5㎍/cm² 라미닌(도 8의 B,F), 0.1㎍/cm² 헤파란 설페이트(HS)(도 8의 C,G), 둘 모두(도 8의 D,H) 또는 없음(도 8의 A,E) 중 어느 하나를 가진 타입 I 및 IV 콜라겐으로 코팅된 5일(도 8의 A-D) 및 15일(도 8의 E-H) 커버슬립 상에서 GFAP(백색)로 염색하였다. 복합 콜라겐 기판에 대한 라미닌 또는 HS의 첨가는 5일(도 8의 B-D)에서 피크이고 이후의 시점(도 8의 E-H)에서 유지되는 신경교 분화를 증명하였다.
도 9는 신경돌기 길이가 코팅된 배양 기판 상에서 측정되고 일원 배치 분산분석(one way ANOVA)를 사용하여 비교하는 것을 보여준다. 각 기판의 2개의 바는 5일 및 15일에서 평균 신경돌기 길이를 나타낸다. 도 9의 A는 PLL 상에서의 신경돌기 길이가 임의의 일차 코팅 기판보다 현저히(^***P<0.001) 짧다는 것을 보여준다. 라미닌 기판은 보다 긴 신경돌기를 가진다(^*P<0.05). 도 9의 B는 5 또는 10㎍/cm² 라미닌의 첨가와 함께 신경돌기 길이에서의 유의미한 차이가 발견되지 않음을 보여준다. 도 9의 C는 라미닌 또는 헤파란 설페이트의 첨가는 복합 콜라겐 기판에 대해 신경돌기 길이를 현저히 증가시키는 것을 보여준다(^*P<0.05). 도 9의 D는 평균 GFAP 면역형광이 정량화되었음을 보여준다: PLL 기판(^***P<0.001) 및 복합 콜라겐 기판(^*P<0.05)은 광범위한 신경교 분화를 지지한다.
도 10은 탈수된(dehydrated) ECM 겔의 주사 전자 현미경 사진을 보여준다. 이미지는 일정한 배율 및 일정한 작업 거리(working distance)에서 얻었다. (A) 콜라겐 I 섬유는 무작위로 배열되었고, 밀집한 섬유 구조를 나타내었다; (B) 복합 콜라겐 I/IV 시트는 네트워크와 같은 구조 형성의 증거를 증명하였다; (C) 라미닌 첨가와 함께 미세구조 상에서 차이가 없었다; (D) 케이블화(cabling) 및 가교의 증거가 헤파란 설페이트의 첨가와 함께 관찰되었다. 평균 다공도(porosity)가 측정되었고, 수반되는 표에 요약되었다. 점탄성 계수(modulus)가 이들의 수화(hydrated) 상태에서 ECM 겔의 진동 레오메트리(oscillatory rheometry)를 사용하여 계산되었고, 표로 만들어졌다. 스케일 바 10 ㎛임.
도 11은 조직 조작된 시트 내 뉴런 분화를 보여준다. 위상차 현미경 사진이 상기 조직 조작된 시트의 가장자리(edge)에서 얻어졌다. 뉴런 분화 및 네트워크 형성의 시작의 증거는 모든 ECM 조성물에서 10일에서 관찰되었다. 화살표는 예비적인 뉴런 네트워킹의 예들을 나타낸다. 스케일 바 200 ㎛임.
도 12는 조직 조작된 길이방향 시트의 면역블롯(immunoblot) 분석을 보여준다. 시트들은 뉴런 분화, 구성 평활근 표현형, 및 흥분성 및 억제성 신경 마커의 발현에 대해 평가되었다. 덴시토메트리(densitometry)가 밴드 강도를 정량화하고, 발현을 비교 정량화하기 위해 사용되었다. (A) 뉴런 βIII 튜블린 발현은 4개의 매트릭스 모두 사이에서 유사하고, 이는 모든 ECM 조성물이 뉴런 분화를 지지함을 암시한다; (B) 조직 조작된 시트 내 구성 평활근은 수축성 표현형을 유지했고, 이는 유사한 스무셀린 발현에 의해 증명되었다; (C) 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT) 발현은 Col I 및 Col I/IV/라미닌 시트에서 Col I/IV 및 Col I/IV/Lam/HS 시트에 비해 현저히(^*P<0.05) 상승했다; (D) 뉴런 산화질소 신타제(Neuronal nitric oxide synthase, nNOS) 발현은, 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트를 가지거나 가지지 않는 Col4를 함유하는 모든 조직 조작된 시트에서의 상승된 수준에 비해 Col I 시트에서 현저히 낮았다(^**P<0.001). (E) 대표적인 면역블롯이 β 액틴(actin)에 따라 제공되고 동등한 로딩(loading)을 증명한다.
도 13은 조직 조작된 시트 내 분화된 뉴런에 대한 면역형광을 보여준다. 조직 조작된 시트 내 분화된 뉴런은 혈관활성 장내 펩티드(vasoactive intestinal peptide, VIP), 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT) 또는 뉴런 산화질소 신타제(nNOS)에 대한 마커와 함께 염색되었다. (A-D) 다수의 분화된 VIP활성 뉴런이 조직 조작된 시트 내 존재하였다. (E-H) ChAT를 발현하는 분화된 흥분성 콜린작동성 뉴런이 조직 조작된 시트 내 존재하였다; (I-L) nNOS를 발현하는 분화된 억제성 질산성 뉴런이 조직 조작된 시트 내에 존재하였다. 스케일 바 100 ㎛임.
도 14는 조직 조작된 시트의 염화칼륨 유발 수축을 보여준다. 60mM 염화칼륨(KCl)이 조직 조작된 시트 내 구성 평활근 세포의 전기기계 커플링 무결성을 시험하기 위해 사용되었다. 검정색 선은 KCl의 첨가에 대한 반응으로의 수축을 나타낸다. 회색 선은 뉴런 차단제(blocker), TTX의 존재 하에 KCl의 첨가를 나타낸다. TTX로의 전처리는 KCl 유발 수축을 억제하지 못했다. 조직 조작된 시트의 ECM 조성물은 평활근 수축에 영향을 주지 못했고, KCl 자극에 대한 응답으로 유사한 수축성 패턴에 의해 증명된다. 강건하고 즉각적인 수축은, 원래의(native) 토끼 내장 조직(E)과 유사한, 모든 조직 조작된 시트에서(A-D) KCl의 첨가시(화살표에 의해 나타내어짐) 관찰되었다. KCl에 대한 응답으로의 피크 수축은 279.5 μΝ 내지 296.5 μΝ의 범위이고, 원래의 조직(F)에서는 373.3 ± 10.63에서 평균이다. KCl 유발 수축의 곡선 아래의 면적은, 원래의 조직에서 다소 상승된(^*P<0.05) 정도(magnitude)와 함께, 조직 조작된 시트 내 수축에서 유의미한(ns) 차이가 없음을 증명하기 위해 정량화되었다.
도 15는 아세틸콜린 유발 수축을 보여준다. 1μM 아세틸콜린(Ach; 화살표)의 첨가는 원래의 조직 뿐만 아니라, 조직 조작된 시트의 수축을 가져왔다. 회색선은 뉴런 차단제, TTX의 존재 하에서의 Ach 처리를 증명한다. (A-E) 조직 조작된 시트 및 원래의 조직에서 Ach-유발 수축의 대표적인 추적. Ach-유발 수축의 정도는 조직 조작된 시트들 사이에서 다양하다. 수축 곡선 아래의 면적의 비교는 조직 조작된 시트가 원래의 조직에서 관찰된 수축의 31.5%(Col4) - 67.6%(라미닌)에 근접하였다. TTX의 존재 하에, Ach-유발 수축의 정도는 약화되었다. 억제의 정량화(F)는 TTX와의 억제도(degree of inhibition)가 다른 ECM 조성물을 가진 조직 조작된 시트들 사이에 다양하다는 것을 나타내었다. 가장 높은 억제는 Col I(72.77±2.5%) 및 COl I/IV/라미닌(60.58±1.7%) 시트에서 관찰되었고, 이는 Ach-유발 수축에 기여하는 콜린작동성 뉴런의 상승된 존재를 나타낸다. 현저히 낮은 억제(^*P<0.05; 48.36±4.3 - 50.31±4.2%)가 Col I/IV 및 Col I/IV/Lam/헤파란 설페이트 시트에서 보여졌다. TTX 전처리는 Ach-유발 수축을 원래의 조직에서의 72.73±3.7%까지 약화시켰다.
도 16은 조직 조작된 시트에서 전기장 자극 유발 이완(relaxation)을 보여준다. 전기장 자극(EFS; 음영 회색 영역)은 조직 조작된 시트(A-D) 및 원래의 조직(E)에서 이완을 자극하기 위해 사용되었다. 회색 선은 TTX 전처리를 나타낸다. EFS 유발 이완은 TTX 전처리에 의해 현저히 약화되었고(90.9±2.41 - 94.41±0.93%), 이는 조직 조작된 시트 내 분화된 뉴런이 평활근 이완을 일으킬 수 있음을 나타낸다. 이완의 정도는 조직 조작된 시트 사이에 다양하였다(표 3에 요약됨). (F) 이완 곡선 아래 영역의 정량화는 Col I 시트가 현저히 낮은(^***P<0.001; 23142±4921AU) 이완 정도를 가지는 것을 나타낸다. Col I/IV 시트에서의 이완(109693±8465AU)은, 전기장에 응답한 원래의 조직에서 관찰된 것(101550±11279AU)과 유사하였고, 이는 이완을 매개할 수 있는 억제성 운동 뉴런의 상승된 수준의 존재를 나타낸다. 이완은, Col I에 비교할 때, Col I/IV/라미닌(69025±7154AU) 및 Col I/IV/Lam/헤파란 설페이트(68395±8228AU) 시트에서 보다 높았고, 이는 또한 억제성 운동 뉴런의 존재 하에서의 유사한 증가를 나타낸다.
도 17은 L-NAME와의 이완의 억제를 보여준다. 질산성 뉴런의 작용은 L-NAME, nNOS를 위한 비물질대사가능(non-metabolizable) 기판과의 EFS-유발 이완을 억제함에 의해 연구되었다. 회색 선은 L-NAME의 존재 하에 EFS를 나타낸다. L-NAME로의 전처리는 모든 조직 조작된 시트(A-D) 및 원래의 조직(E)에서 EFS-유발 이완을 약화시켰다. (F) 이완 곡선 아래의 면적의 정량화는 L-NAME 억제의 크기가 조직 조작된 시트 사이에서 다양함을 나타낸다. Col I 시트는, nNOS의 가장 낮은 면역블롯 발현에 대응하는, L-NAME와 함께 현저히 낮은 %억제(^*P<0.05; 33.4±8.4%)를 가진다. L-NAME 억제의 정도는 Col I/IV 및/또는 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트를 함유하는 조직 조작된 시트에서 보다 높고(57.16%-62.28%), 이는 nNOS의 보다 높은 면역블롯 발현에 대응한다. L-NAME의 존재 하에 이완의 약화는 원래의 조직에서의 78±2.9%였다.
도 18은 VIP-Ra와의 이완의 억제를 보여준다. VIP활성 뉴런의 작용은 VIP-Ra, VIP-수용체 안타고니스트와의 EFS 유발 이완을 억제함에 의해 연구되었다. 회색선은 VIP-Ra 존재 하에서 EFS를 나타낸다. VIP-Ra의 존재 하에, EFS-유발 이완은 조직 조작된 시트(A-D) 및 원래의 조직(E)에서 약화되었고 이것은 전기장 자극시 평활근 이완을 매개할 수 있는 기능성 VIP활성 뉴런의 존재를 나타낸다. 이완 곡선 아래의 영역은 VIP-Ra(F)의 존재 하에 이완의 %억제를 계산하기 위해, 정량화되었다. VIP-Ra 유발 이완의 억제의 크기는 조직 조작된 시트 내에서 56.55±3.12 - 63.11±3.2%로 다양하였고, 원래의 조직에서 73.32±3.23%에서 평균이었다.

정의

본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥을 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "상기(the) 방법"에 대한 참조는 하나 이상의 방법, 및/또는 본 명세서 내에 기재된 형태의 단계들을 포함하고, 이는 본 개시 등을 읽을 때 당업계의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 임의의 방법의 단계들은 실현 가능한 순서로 실행될 수 있고 청구항 내에서 다시 인용되기 때문에 단순히 순차적인 순서로 제한된다.

달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서 내에 기재된 것과 동등 또는 유사한 임의의 방법 및 물질들이 본 발명의 실행 또는 평가에서 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기술된다.

"분화(differentiation)"는 세포들이 특정 특화된 기능을 띠고 특정의 다른 특화된 기능 유닛으로 변화하기 위한 능력을 잃도록 하기 위한 세포 내 발생하는 변화를 나타낸다. 분화할 수 있는 세포는 임의의 전능(totipotent), 만능(pluripotnet) 또는 다능(multipotent) 세포일 수 있다. 분화는 성숙한 성체 세포에 대해 완전하거나 부분적일 수 있다.

줄기 세포는 자가 복구(self-renew), 및 자가 복구 전구자(progenitor), 비 복구 전구자, 및 최종 분화된 세포를 포함하는, 자손 세포(progeny cell)을 생성하기 위한 분화를 위한 단일 세포의 능력에 의해 정의된 미분화된 세포이다. 줄기 세포는 또한 다중 배엽(germ layer)(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포계보(cell lineage)의 기능 세포 내로 인 비트로 분화 뿐만 아니라, 이식 후 다중 배엽의 조직을 가져오고 배반포(blastocyst) 주입 후 비록 전부는 아닐지라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 능력에 의해 특징지워진다. 신경 줄기 세포는 배아(embryonic) 또는 성체의 중추 신경계(CNS) 조직, 신경관 조직 또는 장 신경계 조직으로부터 분리될 수 있다.

줄기 세포는 이들의 발달 잠재력에 따라 (1) 전능; (2) 만능; (3) 다능; (4) 소능(oligopotent); 및 (5) 단능(unipotent)으로서 추가로 분류될 수 있다. 전능 세포는 모든 배아 및 배체외(extra-embryonic) 세포 타입을 가져올 수 있다. 만능 세포는 모든 배아 세포 타입을 가져올 수 있다. 다능 세포는 특정 조직, 기관 또는 생리학적계 내의 모든 것 이외에 세포 계보의 서브세트(subset)를 가져올 수 있는 것들을 포함한다(예를 들면, 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가 복구), 혈구(blood cell) 제한 소능 전구자, 및 혈액의 일반적인 성분인 모든 세포 타입 및 성분(예를 들면 혈소판)을 포함하는 자손을 생성할 수 있다). 소능인 세포는 다능 줄기 세포보다 제한적인 세포 계보의 서브세트를 가져올 수 있고, 단능인 세포는 전형적으로 오직 단일 세포 계보를 가져올 수 있다.

넓은 의미에서, 전구자 세포는 그 자체보다 더 분화된 자손을 생성할 수 있는 능력을 가지는 세포이지만, 전구자의 풀(pool)을 보충하는 능력을 보유한다. 이 정의에 의해, 줄기 세포 자체는 또한, 최종적으로 분화된 세포로의 보다 즉각적인전구체(prescusor)와 같은 전구자 세포이다. 이하 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 본 발명의 세포에 관련될 때 전구자 세포의 상기 넓은 정의가 사용될 수 있다. 좁은 의미에서, 전구자 세포는 종종 분화 경로에서 중간체인 세포로서 정의되고, 즉 줄기 세포로부터 발생하고 성숙 세포 타입 또는 세포 타입의 서브세트의 생성에 있어서 즉각적이다. 이러한 타입의 전구자 세포는 일반적으로 자가 복구할 수 없다. 따라서, 만일 이러한 타입의 세포가 본 명세서 내에 나타난다면, 비 복구 전구자 세포 또는 즉각적인 전구자 또는 전구체 세포로서 나타날 것이다.

본 명세서 내에서 사용된 바와 같은, 어구 "신경 계통 또는 표현형으로의 분화"는 CNS 또는 PNS의 특이 신경 표현형에 부분적으로 또는 완전히 구속되어진 세포, 즉 뉴런 또는 신경교세포를 나타내고, 후자의 카테고리는, 비제한적으로, 성상세포(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte), 슈반세포(schwann cell) 및 마이크로글리아(microglia)를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "신경(neural)"은 모든 전기적 활성 세포, 예를 들면 앞서 언급된 뉴런, 신경교세포, 성상세포, 올리고덴드로사이트, 슈반세포 및 마이크로글리아를 포함하는, 전기적 또는 화학적 신호를 통해 정보를 진행시키거나 전송할 수 있는 세포들을 포함하는 것이다.

본 개시의 목적으로, 용어 "신경 전구자 세포(neural progenitor cell)" 또는 "신경 전구체 세포(neural precursor cell)"는 뉴런 세포(예를 들면 뉴런 전구체 또는 성숙(mature) 뉴런) 또는 신경교세포(예를 들면 신경교 전구체, 성숙 성상세포, 또는 성숙 올리고덴드로사이트) 중 하나인 자손을 생성할 수 있는 세포를 의미한다. 전형적으로, 상기 세포들은, 신경 계통의 특성인, 일부의 표현형 마커를 발현한다. 전형적으로, 이들은 달리 일부 방식으로 탈분화시키거나 리프로그램 (reprogrammed)되지 않는 한, 인 비트로 이들 스스로 배양될 때 다른 배아의 배엽의 자손을 생성하지 않는다.

"뉴런 전구자 세포(neuronal progenitor cell)" 또는 "뉴런 전구체 세포(neuronal precursor cell)"는 성숙 뉴런인 자손을 생성할 수 있는 세포이다. 이들 세포는 또한 신경교세포를 생성할 수 있는 능력을 가져도 또는 가지지 않아도 된다. "신경교 전구자 세포(glial progenitor cell)" 또는 "신경교 전구체 세포(glial precursor cell)"는 성숙한 성숙세포 또는 성숙한 올리고덴드로사이트인 자손을 생성할 수 있는 세포이다. 이들 세포는 뉴런 세포를 생성할 수 있는 능력을 가져도 또는 가지지 않아도 된다.

어구 "생체적합성 물질(biocompatible substance)" 및 용어 "생체재료(biomaterial)" 및 "기질(substrate)"은 서로 교환하여 사용되고, 환자 내로 이식 또는 주입에 적합한 재료에 관한 것이다. 생체적합성 물질은 환자 내에 일단 이식되면, 독성 또는 해로운 효과를 일으키지 않는다. 일 구현예에서, 생체 적합성 물질은 세포외 매트릭스의 적어도 하나의 성분을 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 또한 복구 및 치환(replacing)을 요구하는 바람직한 구조로 형상화될 수 있는 표면을 가진 고분자를 포함할 수 있다. 고분자는 또한 복구 및 치환을 요구하는 신체 구조의 일부로 형상화될 수 있다. 다른 구현예에서, 생체적합성 기질은 타겟 사이트에서 환자 내에 주입될 수 있다.

일 구현예에서, 기질은, 전형적으로 물에 불용성 또는 난용성인, 가교된 고분자 네트워크로 구성될 수 있지만 과잉의 물 존재 하에 평형 크기로 부풀 수 있는, 주입 가능하거나 또는 이식 가능한 생체재료이다. 예를 들면, 하이드로겔은 기관 내 바람직한 위로 주입될 수 있다. 일 구현예에서, 콜라겐은 단독으로 주입될 수 있다. 다른 구현예에서, 콜라겐은 다른 하이드로겔로 주입될 수 있다. 하이드로겔 조성물은, 비제한적으로, 예를 들면, 폴리(에스터), 폴리(히드록시산), 폴리(락톤), 폴리(아미드), 폴리(에스터-아미드), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르소-에스테르), 폴리(카보네이트), 폴리(포스파진), 폴리(티오에스터), 폴리사카라이드 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 또한, 예를 들면, 폴리(알파-히드록시)산 및 폴리(베타-히드록시)산을 포함하는 폴리(히드록시) 산을 포함할 수 있다. 상기 폴리(히드록시)산은, 예를 들면 폴리락트산, 폴리글리코산, 폴리카프로산, 폴리부티르산, 폴리발레산, 및 이들의 공중합체 및 혼합물을 포함한다.

10-100 nm 범위 및 100 nm-10 마이크로미터 범위 내 유효 기공 크기(effective pore size)를 가지는 하이드로겔은, 각각 "미세다공성(microporous)" 및 "마크로다공성(macroprous)" 하이드로겔로 칭한다.

미세다공성 및 마크로다공성 하이드로겔은 종종 고분자 "스폰지"로 불린다. 모노머, 예를 들면 히드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 가 물 내 45(W/W)% 또는 그 이상의 초기 모노머 농도에서 중합할 때, 하이드로겔은 균일한 하이드로겔보다 높은 공극률(porosity)로 생성된다. 하이드로겔은 또한 희석(보통 물)의 존재 하에 확장할 수 있다. 본 발명의 매트릭스 재료는 통상적인 폼(foam) 또는 스폰지 재료 및 소위 "하이드로겔 스폰지" 모두를 포함한다. 하이드로겔의 추가의 기재를 위해, 본 명세서 내에 참고에 의해 도입된 U.S. Pat. No. 5,451,613(Smith 등에 발부)을 참조한다.

용어 "세포외 기질(extracellular matrix)" 또는 "ECM"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 나타내기 위해 본 명세서 내에 사용된다: 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌, 헤파란 설페이트, 또는 하나 이상의 상기 단백질의 단편(fragment).

"콜라겐 I"은 세포 배양, 동물 조직 또는 재조합 수단으로부터 유래된 콜라겐 I 또는 콜라겐 I 조성물을 나타내고, 인간, 쥐, 돼지 또는 소 소스(source)로부터 유래될 수 있다. "콜라겐 I"은 또한 콜라겐 I 또는 콜라겐 I 조성물에 적어도 실질적으로 상동인(homologous) 물질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 추가로, "콜라겐 I"은 콜라겐 I 단편을 포함하지 않는 콜라겐 I 또는 콜라겐 I 조성물을 나타내고, 예를 들면 본질적으로 오직 완전한 콜라겐 I 단백질만을 포함한다.

"콜라겐 IV"는 세포 배양, 동물 조직 또는 재조합 수단으로부터 유래된 콜라겐 IV 또는 콜라겐 IV 조성물을 나타내고, 인간, 쥐, 돼지 또는 소 소스로부터 유래될 수 있다. "콜라겐 IV"는 또한 콜라겐 IV 또는 콜라겐 IV 조성물에 적어도 실질적으로 상동인 물질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 추가로, "콜라겐 IV"는 콜라겐 IV 단편을 포함하지 않는 콜라겐 IV 또는 콜라겐 IV 조성물을 나타내고, 예를 들면 본질적으로 오직 완전한 콜라겐 I 단백질만을 포함한다.

"라미닌"은 세포 배양, 재조합 수단 또는 동물 조직으로부터 유래된, 라미닌, 라미닌 단편, 라미닌 유도체, 라미닌 유사체 또는 라미닌 조성물을 나타낸다. "라미닌"은 인간, 쥐, 돼지 또는 소 소스로부터 유래될 수 있다. "라미닌"은 라미닌-1, 라미닌-2, 라미닌-4 또는 이들의 조합을 포함하는 라미닌 또는 라미닌 조성물을 나타낸다. "라미닌"은 또한 라미닌-1, 라미닌-2, 또는 라미닌-4에 적어도 실질적으로 상동인 물질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 추가로, "라미닌"은 라미닌 단편을 포함하지 않는 라미닌 또는 라미닌 조성물에 관한 것이고, 예를 들면 본질적으로 오직 완전한 라미닌 단백질을 포함한다.

용어 "라미닌이 실질적으로 없는" 및 "라미닌이 없는"은, 라미닌이 신경 줄기 세포 분화에서 임의의 상당한 역할을 하지 않는 상기 낮은 농도 내에서 존재하거나 부재인 조성물을 나타내기 위해 본 명세서 내에서 상호 교환하여 사용되고, 예를 들면 라미닌은 기판 코팅 상에서 5 ㎍/cm² 또는 하이드로겔 내 5 ㎍/ml 미만, 보다 바람직하게는, 기판 코팅 상에서 2 ㎍/cm² 또는 하이드로겔 내 2 ㎍/ml 미만, 또는 기판 코팅 상에서 1 ㎍/cm² 또는 하이드로겔 내 1 ㎍/ml 미만, 및 일부 예에서, 기판 코팅 상에서 0.1 ㎍/cm² 또는 하이드로겔 내 0.1 ㎍/ml 미만의 농도로 오직 존재한다.

용어 "헤파란 설페이트가 실질적으로 없는" 및 "헤파란 설페이트가 없는"은, 헤파란 설페이트가 신경 줄기 세포 분화에서 임의의 상당한 역할을 하지 않는 상기 낮은 농도 내에서 존재하거나 부재인 조성물을 나타내기 위해 본 명세서 내에서 상호 교환하여 사용되고, 예를 들면 헤파란 설페이트는 기판 코팅 상에서 5 ㎍/cm² 또는 하이드로겔 내 5 ㎍/ml 미만, 보다 바람직하게는, 기판 코팅 상에서 2 ㎍/cm² 또는 하이드로겔 내 2 ㎍/ml 미만, 또는 기판 코팅 상에서 1 ㎍/cm² 또는 하이드로겔 내 1 ㎍/ml 미만, 및 일부 예에서, 기판 코팅 상에서 0.1 ㎍/cm² 또는 하이드로겔 내 0.1 ㎍/ml 미만의 농도로 오직 존재한다.

일반적인 기법

본 발명의 실시에 유용한 일반적인 기법의 추가의 상술을 위해, 실시자들은 세포 생물학, 조직 배양 및 발생학(embryology)에서의 리뷰(review) 및 표준 교과서를 참고할 수 있다. Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P. D. Rathjen et al, Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998)이 포함된다.

신경계 이상(abnormalities) 및 다양한 타입의 신경 세포, 마커, 및 관련 용해성 인자(soluble factor)의 특성 평가의 상술을 위해, CNS Regeneration: Basic Science and Clinical Advances, M. H. Tuszynski & J. H. Kordower, eds., Academic Press, 1999가 언급된다.

분자 유전학 및 유전 공학에서의 방법이 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Sambrook et al, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); the series Methods in Enzymology (Academic Press); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 & 1995); 및 Recombinant DNA Methodology II (R. Wu ed., Academic Press 1995)에 기재되어 있다. 본 개시에 관련된 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터, 및 키트가 BioRad, Stratagene, Invitrogen, 및 ClonTech와 같은 상업적 판매회사로부터 이용가능하다.

항체를 배양(raising), 정제 및 변형하는 것에 사용된 일반적인 기법, 및 면역조직화학(immunohistochemistry)을 포함하는 면역 분석법의 디자인 및 수행은 Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); 및 R. Masseyeff, W. H. Albert, and . A. Staines, eds. Methods of Immunological Analysis (Weinheim: VCH Verlags GmbH, 1993)에 기재되어 있다.

줄기 세포 소스(Source)

본 발명은 하기 비제한적인 예들을 포함하는 다양한 타입의 줄기 세포를 사용하여 수행될 수 있다: U.S. Pat. No. 5,851,832는 뇌 조직으로부터 얻은 다능 신경 줄기 세포를 보고한다. U.S. Pat. No. 5,766,948은 신생아 대뇌 반구로부터 신경모세포(neuroblasts)를 생산하는 것을 보고한다. U.S. Pat. Nos. 5,654,183 및 5,849,553은 포유류의 신경능 줄기 세포의 사용을 보고한다. U.S. Pat. No. 6,040,180은 포유류의 다능 CNS 줄기 세포의 배양으로부터 분화된 뉴런의 인 비트로 생성을 보고한다. WO 98/50526 및 WO 99/01159는 신경상피(neuroepithelial) 줄기 세포, 희소돌기아교세포-신경교세포(oligodendrocyte-astrocyte) 전구체, 및 계통 제한 신경세포 전구체(lineage-restricted neuronal precursor)의 생성 및 분리를 보고한다. U.S. Pat. No. 5,968,829는 배아 전뇌(embryonic forebrain)로부터 얻어지고, 글루코스, 트랜스페린(transferrin), 인슐린, 셀레늄(selenium), 프로게스테론(progesterone) 및 몇몇 다른 성장 인자를 포함하는 배지로부터 배양된 신경 줄기 세포를 보고한다.

달리 요구되지 않는 이상, 본 발명은 임의의 척추동물(vertebrate) 종의 줄기 세포를 사용하여 실행될 수 있다. 인간 뿐만 아니라, 비인간 영장류(non-human primates), 가축(domestic animals, livestock), 및 다른 비인간 포유류로부터의 줄기 세포를 포함한다.

신경교 분화(Neural Glial Differentiation)

장 신경 전구세포(Enteric neuronal progenitor cells)는 성체 포유동물 장에서 동정되어 왔고, 80세까지 및 그 이상의 나이의 인간으로부터 분리되어 왔다. 이전에, 몇몇 그룹은 Sox 2, SoxlO, 네스틴(Nestin) 및 p75 양성 신경능 유도 전구 세포의 자가 복구 집단이, 성체 포유류 장의 전층(full-thickness), 근육(muscularis) 또는 점막 생검(biopsy) 중 하나로부터 분리될 수 있다. 이들 세포는 억제 및 흥분성 운동 뉴런 및 교질을 포함하는 몇몇 신경세포 아형으로 분화하기 위한 잠재력을 가지는 것으로 증명되었다.

비신경 장의 조직절편배양(explant culture)으로부터 다양한 타입의 신경 전구 세포들(CNS 유도, 신경관 유도, 배아 및 성체 ENS 유도)은 또한 이식될 수 있다. 중간엽(gut mesenchyme)의 세포외 기질 내 변경(alteration)은, 발달하는 장(developing gut) 내 신경능 세포의 분화 및 자궁 내 정착(colonization)에 효율을 증진시키기 위한 복제를 허용하는(permissive) 세포외 환경의 중요성을 제시하면서, 설치류 장의 무신경절(aganglionic) 부위 내에 기록되어 왔다(documented). 이식 및 부차적인 기능성 신신경지배(neo-innervation)는 하나의 임상적 목적의 신경 줄기 세포 이식이기 때문에, 인 비트로 연구는 복제를 허용하고 양호한(favorable) ECM(예를 들면 3차원 환경)에 관하여, 인 비보 발달 상태(developmental conditions)를 모방해야 한다. 성체 장 신경 전구세포의 신경교 분화에 영향을 미치는 ECM의 역할을 이해하는 것은 이식시 안정한 표현형의 생존성(survivability) 및 유지를 향상시킬 수 있다.

인 비보 포유류의 근육층 신경절은, 타입 IV 콜라겐, 라미닌, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulphate proteoglycan), 및 엔탁틴(entactin)이 주로 포함되는 매트릭스에 의해 둘러싸여진다. 장근신경총(enteric plexus)은 말초 신경계처럼 혈관을 위한 큰 결합조직(connective tissue) 공간이 없다. 2차원 배양 기판(substratum)은 ECM 조성물에 기초한 뉴런 및 신경교 분화를 조절할 수 있다. 다른 ECM 성분은 장 신경교에 영향을 미칠 수 있고 뉴런은, 콜라겐 IV, 라미닌 및 헤파란 설페이트와 같은, 인 비보 성체의 근육층간신경얼기(myenteric plexus) 내에서 접촉한다.

콜라겐 기질에 대한 라미닌의 첨가는, 보다 긴 신경돌기 길이와 함께 신경돌기 진전(neurite outgrowth)을 예상치 못하게 향상시킨다(156.1±7.2 μm를 215.1±7.6 μm와 비교). 뉴런의 분화뿐만 아니라 신경돌기 진전에 있어서 전반적인 향상이 있는 반면, 5 또는 10 μg/cm² 의 라미닌의 첨가 사이에 유의미한 차이가 없다. 이 경험적인 결정은, 탈신경 조직(denervated tissues)의 신신경지배를 요구하는 상황에서 역으로 신경돌기 진전에 영향을 미치지 않고 신경교 분화에 영향을 미칠 수 있는 라미닌의 최소량을 결정하는 데 중요하다.

복합 콜라겐 혼합물에 대한 헤파란 설페이트의 첨가는 또한 뉴런의 분화를 향상시킨다. 뉴런의 네트워킹 및 뉴런의 클러스터링(clustering)은 후자의 시점에서 뚜렷하다. 헤파란 설페이트는 GDNF 및 다른 신경영양(neurotrophic) 인자와 상호작용하여 안정화하고, 상기 인자들을 국소적으로 이용가능하게 만든다. 헤파란 설페이트는 콜라겐 IV 및 라미닌과 상호작용하여 뉴런의 분화를 양성으로 조절하게 한다. 일 구현예에서 헤파란 설페이트는 콜라겐 혼합물에 첨가된다.

라미닌 및/또는 헤파란 설페이트를 가진 복합 콜라겐 기판은, 나중(later) 시점에서 보다 자명하게 되는 성상세포 네트워크의 시작과 함께, 낮은 레벨의 GFAP 양성 신경교 세포를 유지한다. 일반적으로 뉴런의 분화를 지지한 기판은 뉴런 세포의 표현형 또는 생존을 가능하게 지지하도록 하기 위해 요구되는 거의 최소의 신경교세포들을 증명한다.

뉴런의 분화를 지지한 기판은, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% 초과 또는 임의의 중간 백분율을 포함하는 뉴런 세포의 풍부한 집단을 가져올 수 있다.

장 신경구는 라미닌 및 헤파란 설페이트의 부재 속에 복합 콜라겐 기판 상에서 뿐만 아니라 PLL 코팅된 기판 상에서 교질로 분화되는 경향을 증명했다. 수축에서, 라미닌 및 헤파란 설페이트를 가진 배양 기판은 동시에 오직 최소의 신경교세포 집단을 지지하는 반면, 광범위한 뉴런의 분화를 촉진시킨다. 라미닌 및 콜라겐 IV 코팅된 커버슬립(coverslip)은, 뉴런 당 신경 돌기의 수의 증가 및 섬유상 콜라겐 I에 비해 더 긴 신경 돌기 길이에 의해 뉴런의 분화를 양성으로 조절한다(도 2B-D, F-H).

종합해보면, 이들 결과는 뉴런의 전구 세포를 전달하기 위한 적절한 3D 매트릭스 조성물을 동정한다. 3차원 하이드로겔 환경은 또한 신경 분화를 위한 기계적 신호(cue)를 제공하고, 무한 강성(infinitely stiff) 유리 기판보다 인 비보 조건에 대해 보다 용이하게 변환가능하다.

세포외 매트릭스(extracellular matrix, ECM)는 줄기 세포의 운명을 좌우하는 데 막대한 역할을 한다. ECM 조성물, 구조 및 기계적 물성은 모두 전구세포 분화를 조절할 수 있다. 성체 포유류 근육층 신경절은, ECM과 항상 직접 접촉하는 장 교질과 함께 콜라겐 IV, 라미닌 및 헤파란 설페이트 프로테오클리칸으로 주로 구성된 세포외 매트릭스에 의해 둘러싸여진다. 장 뉴런은, 비록 교질보다 훨씬 덜 자주이지만, ECM과 또한 직접 접촉한다. 라미닌, 피브로넥틴 및 프로테오글리칸은, 미주 신경(vagal) 신경능 세포에 의해 군집화를 목적으로 하여 배아 장 내로 발현된다. 콜라겐 IV는 신경능을 따라 발달 신경계에 기여한다. 추가로 라미닌은 신경 세포 접착 및 축삭 진전(axonal outgrowth)을 촉진한다. 헤파란 설페이트는 장 내 GDNF 신호에 대해 중요하고, 안정화하고 인 비트로 뉴런의 분화에 영향을 준다.

신경 ECM의 성분들은 신경능 계통의 장 유도 뉴런 전구 세포의 분화에 영향을 줄 수 있음이 발견되었다. 2개의 시점이 초기 및 늦은 분화 이벤트를 동정하기 위해 정의된다- 이전 실험에 기초하여 5일(초기) 및 15일(늦음). βIII 튜블린(뉴런 특이 미세소관) 및 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)에 대한 면역조직화학이 코팅된 배양 기판 상의 분화된 뉴런 및 교질을 동정하기 위해 사용되었다.

신경교 분화가 지지된 기판은, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% 초과 또는 임의의 중간 백분율을 포함하는 신경교 세포의 풍부 집단을 가져올 수 있다.

뉴런의 아형 분화

신경 줄기 세포 이식은 장 신경절 내 뉴런을 재군락(repopulate)시키기 위한 유망한 치료학적 접근법이다. 뉴런의 완전한 손실이 HSCR 내에 보고되고, 선택적인 뉴런 아형의 부분적 손실이 식도이완불능증(achalasia) 및 협착증(stenosis)에 기록된다. 몇몇 그룹들은, 이식의 가능성을 입증하는, 무신경절증의 실험 모델 내로 장 뉴런의 전구 세포를 주입하였다. 그러나, 성숙 뉴런 아형으로 전구 세포의 분화에 부적절한 초점 및 부차적인 기능성의 평가가 있다. 여기서, 우리는 이식에 앞서 인 비트로 장 뉴런 전구 세포의 분화를 편향시키기 위한 신규 방법을 기재함에 의해 본 발명의 일 구현예를 기재한다.

콜라겐, 라미닌 및 프로테오글리칸으로 이루어지는, ECM 마이크로 환경은 세포를 위한 구조적 프레임워크(framework)로서 작용할 뿐만 아니라, 신경 영양(neurotrophic) 신호를 목적으로 적극적인 역할을 한다. 본 발명의 구현예에서, 4개의 ECM 성분(콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 및 헤파란 설페이트)이 평가되었고, 이중 3개는 성체의 근육층 신경절에 존재하는 것으로 알려져 있다. 콜라겐 IV는 신경돌기 진전 및 뉴런의 분화를 위해 우호적인 것임이 기록되었다. 라미닌은, 중추, 말초 및 장 뉴런에서, 그 신경돌기 촉진 활성에 대해 오랫동안 알려져 왔다. 뉴런의 분화에서 헤파란 설페이트 프로테오글리칸의 역할은 또한, 발달적으로 및 재생 약제 용도에서 모두 잘 기록되어 있다. 섬유사 콜라겐 I은 부가적으로 3D 하이드로겔 내 다른 ECM 성분의 도입 및 겔화의 용이함을 위한 이들 연구에서 추가로 사용되었다.

조성물을 제외하고, 기판 탄성이, 100-500Pa 사이에 보고된 뉴런의 분화와 함께, 성체 신경 줄기 세포의 분화에 영향을 주는 것으로 증명되었다. ECM 하이드로겔 조성물은, 뉴런의 분화에 적합한 범위 내로의 이들의 점탄성 계수를 유지하기 위해 조정되었다(도 10, 표). 구조 아키텍쳐(architecture)는 주사 전자 현미경을 사용하여 입증되었고, 여기서 콜라겐 IV의 첨가는, 포유류 기저막(basement membrane) 내 자기 조립된 콜라겐 IV와 유사한, 네트워크 구조의 존재를 증명하였다. 라미닌의 첨가는, 콜라겐 섬유를 고르게 코팅하는 것으로 예상되기 때문에, 미세구조(ultrastructure)를 변경하지 않았다. 대안적으로, 라미닌은 또한 콜라겐과 상호작용의 방식으로 주어진, 겔의 강성/점탄성을 변경하는 것으로 예상되지 않았다. 헤파란 설페이트의 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan) 사슬은 라미닌 및 콜라겐 IV 사이를 가교 결합하기 위해 기록되고, 이에 의해 보다 소형의 구조로 섬유를 끌어당기고, ECM 겔의 점탄성을 다소 증가시킨다.

조직 조작된(engineered) 시트 내 평활근 세포는 장 뉴런 전구 세포의 분화를 유도한다. 조직 조작된 시트는 우수한 양상(modality)을 제공하여 ECM 조성물 뿐만 아니라 분화된 뉴런의 기능성으로 인한 분화된 뉴런의 변동성(variability)을 평가한다. 평활근에 대한 근접은 장 뉴런 전구 세포의 분화를 광범위하게 촉진한다. 장 유도 인자의 존재 하에 신경 줄기 세포의 인 비트로 분화는 우리 및 다른 사람들에 의해 이미 증명되었다. 장 뉴런 전구세포 증식 및 분화를 유도할 수 있는, 신경영양 인자(NT-3, 뉴트린(Neurturin), GDNF) 및 형태형성물질(morphogen)(BMP-2/4)은, 발달 및 성체 장의 평활근 및 간엽(mesenchyme)으로부터 발생하는 것으로 증명되었다. 최근에, 출산후 창자(postnatal bowel)는 장 뉴런 전구 세포의 분화를 지지하는 것으로 증명되었고, 이는 분화를 위한 신호가 출산후 장으로부터 유도될 수 있다는 사실을 강화한다. 따라서, 조직 조작된 시트 내 평활근 세포는 장 뉴런 전구 세포의 분화를 유도하는 것으로 예측되었다. 우리는 구성(constituent) 평활근 세포가 스무셀린(smoothelin)을 발현하는 수축성(contractile) 표현형을 증명한다는 것을 확실히 하기 위해 모든 조직 조작된 시트를 평가했다.(도 14B). 스무셀린 발현은 평활근의 수축을 위해 필수적인 것임을 이미 증명했다. 스무셀린의 동등한 발현에 따라, 근원성 전기기계 커플링 무결성(myogenic electromechanical coupling integrity) 또한 조직 조작된 시트에서 동등하였다(도 14A-D). 수축의 유사한 패턴이, ECM 조성물에 상관 없이, KCl에 반응하여, 조직 조작된 시트에서 관찰되었다.

ECM은 전반적인 평활근 유도된 뉴런의 분화를 지지하는 동안 특이한(differential) 뉴런의 아형을 조절한다. 평활근의 존재 하에, 장 뉴런 전구 세포는 분화되고, 유사한 양의 전체 뉴런의(pan-neuronal) 마커 βIII 튜블린을 발현하였고(도 14A), 이것은 평활근 유도 인자 및 기판 점탄성이 전반적인 뉴런의 분화에 적합하였다는 것을 암시한다. 그러나, 신경 아형의 보다 자세한 검사에서, 다양한 ECM 조성물을 가진 조직 조작된 시트 내 흥분성 및 억제 마커의 특이한 발현이 있었다(도 14). 라미닌을 포함하는 시트는 ChAT 및 nNOS 모두의 균형있는 발현을 가졌다. 라미닌 시트 내 Ach 유발 수축의 동역학(kinetics)은 실제 조직(native tissue)에 가장 유사하고, 이는 복합 콜라겐/라미닌 시트 내 증가된 생존가능한(viable) 콜린작동성 뉴런 성분의 존재를 나타낸다. 또한, L-NAME에 의한 EFS-유발 이완의 약화(~62%)는 또한 실제 조직(~78%)과 동역학적으로 유사하였고, 이는 질소활성(nitrergic) 뉴런 성분의 존재를 나타낸다.

임의의 다른 매트릭스(matrix) 성분의 부재 하에, 콜라겐 I은, 현저히 감소된 질소활성 뉴런 집단과 함께, 풍부한 콜린작동성 뉴런의 집단이 요구될 때, ECM의 선택이었다(도 14C-D). 이들 시트는 고조된(heightened) ChAT 단백질 발현에 비례하는(commensurate) 강건한 TTX-민감 Ach-유발 수축을 증명하는 반면, 전기장에 응답하는 이완은 감소하였다. 또한, 낮은 nNOS 발현과 관련한 nNOS 억제시 이완의 최소의 약화가 있었다.

콜린작동성(cholinergic) 뉴런 분화가 지지된 기판은, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% 초과 또는 임의의 중간 백분율을 포함하는 콜린작동성 뉴런의 풍부한 집단을 가져올 수 있다.

복합 콜라겐 I/IV 시트는, EFS 유발 이완에서의 증가와 관련하여, 향상된 nNOS 단백질 발현을 가졌다(도 18B). 복합 콜라겐 I/IV 시트에서의 AUC의 이완은 실제 장 조직에 비교할만하다. 그러나, ChAT 발현 및 수축 모두는 복합 콜라겐 시트에서 더 낮았다.

질소활성 뉴런 분화가 지지된 기판은, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% 초과 또는 임의의 중간 백분율을 포함하는 질소활성 뉴런의 풍부한 집단을 가져올 수 있다.

ECM은 평활근 유도 인자가 신경 아형의 분화를 조절하는 프레임워크이다. 우리는, 각각 흥분성 및 억제성 운동 뉴런을 촉진하는 ECM 환경을 함유하는 콜라겐 I 및 콜라겐 IV의 중요한 역할을 증명하였다. ECM 마이크로 환경은 신경영양 뿐만 아니라 형태형성(morphogenetic) 신호를 조절하는 역할을 한다. 태아 장에서 발현된 BMP계를 통한 형태형성 신호는, 질산염성(neurotrophic) 및 VIP활성(VIP-ergic) 뉴런 분화를 포함하는, 장 신경절의 표현형의 다양성을 위해 중요하다. 콜라겐 IV는 BMP 신호를 조절하기 위해 기록되고, 헤파란 설페이트는 장에서 GDNF를 조절한다. 신경영양 인자, NT-3의 면역 활성은 신경절 내에서 및 이들을 둘러싸는 ECM 분자 내에서 관찰되었고, 이는 NT-3 신호를 조절하기 위한 콜라겐 IV 기초의 ECM을 위한 역할을 암시한다. 조직 조작된 시트 내 구성 평활근 표현형은 수축성이었고, 스무셀린을 발현하고, 실제 장 조직에 의해 생성되는 것의 ~60%에 근접하는 수축 및 이완을 생성한다. 구성 평활근 세포로부터 발생하는 분화 신호가 장 뉴런의 분화를 유도하였다. 또한, ECM은 이들의 효과를 향상시키거나 억제하고, 특이한 뉴런의 표현형의 생성을 가져오는, 평활근 유도 인자를 위한 프레임워크로서 작용할 수 있을 것이다.

실시예

시약

모든 조직 배양 시약은 특별히 달리 구체화하지 않는 한 인비트로겐(Carlsbad, CA)으로부터 구입하였다. 일차 및 형광단 콘쥬게이트된 이차 항체들은 Abcam(Cambridge, MA)으로부터 구입하였다. 랫트 꼬리 타입 I 콜라겐 및 원래의 마우스 타입 IV 콜라겐은 BD Biosciences(Bedford, MA)로부터 구입하였다. 헤파란 설페이트는 Celsus Labs(Cincinnati, OH)로부터 구입하였다.

토끼 장 뉴런 전구 세포 및 내장 평활근 세포

뉴질랜드 백색 토끼들은 케타민/자일라진을 이용하여 안락사시켰다. 평활근세포들은 분리되었고, 표준 프로토콜(예를 들면, Somara et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006;291(4):G630-9 참고)을 사용하여 배양되었다. 장 뉴런 전구 세포의 분리를 위해, 5cm² 생검을 공장(jejunum)으로부터 해부하였고, 2X 항생제/항진균제 및 1X 젠타마이신(gentamicin) 설페이트와 함께 HBSS(Hank's Buffered Salt Solution)로 회수하였다. 내강 내용물(Luminal content)은 세정되었고, 조직은 광범위하게 HBSS로 세척되었다. 장 뉴런 전구 세포들을 콜라게네이즈/디스파제 절단 방법(예를 들면, Almond et al, Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 2007;56(4):489-96. PMCID: 1856871 참고)을 사용하여 이들 조직으로부터 분리하였다. 세포들은 40㎛ 메쉬를 통해 여과된 후 뉴런 성장 배지(Neurobasal + 1X N2 보충제(supplement) + 1X 항생제)에서 박테리아 페트리 디쉬 상에 플레이트되었다.

토끼의 세로 평활근 세포(LSMCs)의 분리 및 배양

토끼 S상 결장(sigmoid colon)을 해부에 의해 제거한 후, 배설물 내용물을 없애주었다. 조직은 얼음에 보관하였고, 항생제 및 중탄산나트륨을 함유한 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 수분을 공급하였다. 세정된 결장은 플라스틱 피펫 상으로 미끄러지게(slipped) 하였다. 혈관 및 부착된 지방을 포셉으로 제거하였다. HBSS로 적셔진 Kimwipe® (Kimberly-Clark, Neenah, WI)를 사용하여 결장의 외층을 닦아내었다. 미세-팁 포셉을 이용하여 결장으로부터 세로 평활근층을 떼어내었고, 빙냉 HBSS에 저장하였다. 조직을 미세하게 갈고, 32℃에서 1시간 동안 타입 II 콜라게나아제(0.1%)로 2회 분해하고, 500-㎛ Nytex® (Tetko, Elmsford, NY)메쉬를 통해 여과하였다. 여과물을 3회 세척하고, 일반적인 조직 배양 플라스크 상에 10% FBS, 1.5% 항생제, 및 0.5% L-글루타민과 함께 DMEM에 플레이트되었다.

토끼 장 신경구(neurosphere)의 면역조직화학 특성 평가

배양물 내에 토끼 장 신경구의 초기 표현형을 특성화하기 위해, 신경구들을 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브에서 10분 동안 1000g로 원심분리하여 수확하였다. 생장 배지를 부드럽게 흡입하였고, 신경구는 3.7% 중성 완충 포름알데히드로 고정하였고, 10% 말 혈청으로 블록하였다. p75(Millipore, Billerica MA), Sox2 및 네스틴(Nestin)을 위한 일차 항체를 실온에서 30분동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체는 PBS(phosphate buffered saline)로 세척되었고, 적절한 형광단-콘쥬게이트된 이차 항체들은 추가로 30분 동안 인큐베이션되었다. 신경구들은 Prolong Gold 항페이드 봉입제(antifade mounting medium)(Invitrogen, Carlsbad CA)를 이용해 봉입(mount)되었고, 도립 Nikon TiE 형광 현미경을 이용해 시각화하였다.

ECM 하이드로겔의 유변학적 특성 평가

진동 레오미트리(ATS RheoSystems)를 사용하여 ECM 겔의 점탄성 계수를 측정하였다. 20mm 평행 베이스 플레이트를 사용하여 1Hz에서 샘플의 응력 스윕(sweep)을 수행하였다. ECM 겔은 37℃에서 평행 플레이트 사이에 인 시추 되도록 하였다. 점탄성 계수는 레오미터의 변형율 및 토크를 위한 민감도(sensitivity) 범위 내에, 10% 미만 변형율(strains)에서, 응력-변형율 곡선의 선형 영역으로부터 얻어졌다. 3-5 개별적으로 제조된 ECM 겔을 측정하여 평균 점탄성 계수를 결정하였다. 150-300Pa 범위 내의 매트릭스 점탄성으로 나타난 조성물들을, 강성(stiffness)이 신경교 분화에 영향을 주는 변수가 되지 않도록, 추가실험을 위해 사용하였다.

ECM 하이드로겔의 미세구조의 특성 평가

주사전자현미경을 위한 ECM 하이드로겔의 샘플 제작을 Stuart et al.[31]로부터 적용하였다. 겔은 점진적(graded) 에탄올(10% 내지 100%)을 통해 탈수되었다. 하이드로겔은 이산화탄소 교환을 이용하여 임계점에서 건조되었다. 생성된 탈수된 ECM 디스크를 도전성 탄소 테이프를 가진 금속성 스텁 상에 봉입하고, 금으로 스퍼터 코팅하고, AMRAY 1910 Field Emission 주사 전자 현미경을 이용하여 시각화하였다. 일정한 작업 거리와 배율을 모든 샘플들을 이미징하기 위해 유지하였다. NIH Image J가 사용되어 섬유 직경이 측정되고 비교되었다. 공극률은 탈수된 ECM 겔의 적어도 3개의 독립적인 샘플들로부터 수득된 현미경 사진으로부터 Image J를 이용하여 측정되었다.

조직 조작된 신경분포된(innervated) 내장 평활근 시트

간략하게, 500,000 세로 평활근 세포들은 웨이브있는 미세형태(wavy microtopography)를 포함하는 35mm 직경의 원형의 Sylgard 몰드 상에 4일동안 단축으로 정렬하였다. 장 신경구는 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 아큐타제(Accutase)로 처리되었다. 200,000 세포들은 적절한 ECM 용액에서 재현탁되었고, 정렬된 평활근 단층상에 덮어졌다. 겔화시, 신경 분화 배지(neuroobasal-A)가 첨가되었고, B27 및 1% 우태아 혈청으로 보충되었다. 분화 배지는 2일째마다 교환되었다. 장 신경 전구 세포들은 10일의 기간동안에 하이드로겔 내에 분화되도록 하였다. 평활근 세포들은 이후 10일에 걸쳐 ECM 하이드로겔에 밀집되었고, ~1cm 긴 신경분포된 평활근 시트를 형성하며, 실크 봉합사 사이에 앵커(anchor)되었다. 위상차 현미경을 사용하여 조직 조작된 시트의 가장자리에서 신경 분화를 이미징하였다.

조직 조작된 시트에서 신경교 조성물의 생화학적 특성 평가

10일에, 단백질을 분리하기 위해 조직 조작된 시트를 방사성면역침전 완충액에서 수확하였다. 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 어세이를 사용하여 분석광도적으로(spectophotometrically) 평가되었다. 각 샘플로부터 20㎍의 단백질을 전기영동으로 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 이동시켰다. 막은 뉴런(neuronal) βIII 튜블린, 뉴런 산화질소 신타제(nNOS), 콜린 아세틸트렌스퍼라아제(ChAT), 및 스무셀린을 위한 항체로 블롯팅되었다. β-액틴은 동일한(equal) 로딩을 확인하기 위해 사용되었다. HRP-콘쥬게이트된 이차 항체들은 향상된 화학발광을 이용하여 단백질을 시각화하기 위해 사용되었다.

조직 조작된 시트에서 뉴런 조성물의 면역조직화학 특성 평가

조직 조작된 시트들은 4% 포름알데히드에서 고정되고, 글리신 완충액에서 광범위하게 세척되었다. 면역조직화학적 염색은 생물공학적(bioengineered) 조직 내에 분화된 뉴런을 염색하기 위해 사용된 미리 확립된 프로토콜에 따라 수행되었다. 시트는 10% 말 혈청으로 블록되었고, 45분 동안 0.15% Triton-X에서 투과(permeabilize)되었다. 투과된 시트들은 실온에서 60분 동안, 혈관활성 내장 펩티드(Vasoactive Intestinal Peptide, VIP), ChAT 및 nNOS를 향해 유도된 일차 항체들과 함께 인큐베이션되었다. 항체 인큐베이션 후에, 시트들은 인산 완충 식염수 pH 7.4로 3회 세척되었다. 조직 조작된 시트는 적절한 형광단 콘쥬게이트된 이차 항체와 함께 45분동안 인큐베이션되었고, 인산 완충 식염수에서 세척되었고, 도립(inverted) 형광 현미경(Nikon Ti-E, Japan)을 이용하여 이미징되었다. 음성 대조군을 위해, 일차 항체와의 인큐베이션은 넘어가고, 오직 형광단 콘쥬게이트된 이차 항체들을 사용하여 배경 형광을 시각화하였다.

신경분포된 조직 조작된 시트들에서 생리학적 기능의 측정

근원성(Myogenic) 및 뉴런 기능성은 이전에 기재[30,33]된 바와 같이 실시간 힘 생성(real-time force generation)을 이용하여 평가되었다. 각각의 ECM 조성물을 위한 4-5개 개별적인 조직 조작된 시트들이 시험되었다. 조직 조작적 시트들은 0% 스트레치(stretch)에서 힘 변환기(Harvard Apparatus, Holliston MA)의 고정핀과 측정핀 사이에 앵커되었다. 장기 수조(organ bath)는 37℃의 온도에서 유지되었다. 추가적인 10% 스트레치는 버니어 제어(vernier control)를 이용하여 적용되었다. 조직들을 4ml 배지에 담구었고, 이것을 새로운(fresh) 배지에서 간단히 세척 후 매 실험의 마지막에 교환해주었다. 피크 수축 또는 최대 이완은 약리학적 또는 전기적 자극 후에 정량화되었고, ECM 조성물을 변화시키면서 조직 조작된 시트들 사이에 비교되었다. 각각의 처리 이전에, 조직들은 새로운 따뜻한 배지에서 세척되고, 기준치(baseline)에 평형을 유지하도록 하였다. 다음의 자극은 조직 조작된 시트들의 생리학적 기능성을 평가하기 위해 독립적으로 사용되었다: 1) 평활근의 전기기계적 커플링 무결성을 평가하기 위한 60mM 염화 칼륨; 2) 1 μΜ 아세틸콜린 (수축성 아고니스트); 3) 평행 플레이트 백금 전극을 이용하여 적용된 전기장 자극 (5Hz, 0.5ms, 40V). 수축/이완의 근원성 및 뉴런의 성분들의 분해를 위해 신경 차단제, 테트로도톡신(TTX)으로 전인큐베이션(preincubation)을 사용하였다. 특정 억제제로의 전인큐베이션은 기능성 뉴런 아형을 동정하기 위해 사용되었다: 1) nNOS-차단제 Νω-니트로-L-아르기닌 메틸 에스터 히드로크로라이드(L-NAME; 300μΜ); 및 2) VIP-수용체 아고니스트[D-p-Cl-Phe6, Leu17]-혈관활성 내장 펩티드(VIP-Ra; 2μΜ). 자극 및 이어지는 수축/이완 및 회복 이후에, 조직들은 새로운 배지로 세척되고, 다음의 처리 전에 기준치에 재확립(re-establish)되도록 하였다. 평형을 유지시킨 기준치는 자극으로 인한 수축/이완을 측정하기 위하여 임의로 0으로 맞추었다.

세포외 기질 조성물의 기능으로서 신경구 분화

22x11mm 기판은 Neutrad(Decon Labs, King of Prussia PA)에서 세척되었고, 탈이온수로 광범위하게 린스(rinse)되었다. 커버슬립은 70% 에탄올에 의해 살균되었고, 이어지는 45분동안 UV에 노출시켰다. 커버슬립은 poly-L-라이신 (PLL; 1 mg/ml), PLL+ 10㎍/cm² 타입 I 콜라겐, PLL + 10㎍/cm² 타입 IV 콜라겐 또는 PLL + 10㎍/cm² 라미닌으로 코팅되었다.

복합물(composite) 코팅들은:

5㎍/cm² 콜라겐 I + 5 ㎍/cm² 타입 IV 콜라겐;

5 ㎍/cm² 콜라겐 I + 5 또는 10 ㎍/cm² 라미닌;

5 ㎍/cm² 콜라겐 IV + 5 또는 10 ㎍/cm² 라미닌;

5 ㎍/cm² 콜라겐 I + 5 ㎍/cm² 콜라겐 IV + 0.1 ㎍/cm² 헤파란 설페이트 (HS);

5 ㎍/cm² 콜라겐 I + 5㎍/cm² 콜라겐 IV + 5 ㎍/cm² 라미닌 + 0.1 ㎍/cm² HS

를 포함한다.

코팅되지 않은 글래스 기판을 토끼 결장 평활근 세포들로 시딩하고, 밀집되도록 하였다. 토끼 장 신경구를 수확하고, 아큐타제(Accutase)로 처리하여 단일 세포 뿐만 아니라 작은 신경구들의 혼합물을 얻었다. 10,000 뉴런 전구 세포들을 수확하고, 코팅된 커버슬립 상에 플레이트하였다. 용해성(soluble) 평활근 인자들을 통해 유도된 분화를 자극하기 위해, 각 플레이트들은 부착된 신경구들을 함유하는 코팅된 커버슬립을 따라 하나의 밀집된 평활근 커버슬립으로 공유되었다. 장 신경구들은 매 2일마다 신경 분화 배지(Neurobasal- A 배지 + 1X B27 보충제 + 2% 신생우아혈청+ 1X 항생제)의 보충과 함께, 15일 기간 동안 분화되도록 하였다.

뉴런 및 신경교 분화의 면역조직화학 분석

두 개의 시점(time points)이 뉴런 및 신경교 분화를 위해 분석되었다- 분화 개시 후 5일 및 15일. 배지는 흡입되었고, 커버슬립 상에 세포들은 3.7 중성 완충 포름알데히드로 고정되었다. 세포들은 0.15% 트리톤-X 100으로 투과되었고, 10% 말 혈청으로 차단되었다. βIII 튜블린은 뉴런 세포를 염색하기 위해 사용되었고, 신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)은 신경교 세포들의 염색을 위해 사용되었다. 일차 항체는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었고, 결합되지 않은 항체들은 PBS로 세척되었다. 형광단 콘쥬게이트된 이차 항체들(FITC-항 마우스 및 TRITC-항 토끼)는 도립 Nikon TiE 형광 현미경을 이용하여 형광을 시각화하였다. 일차 항체 없이 FITC-콘쥬게이트된 이차 항체로의 염색은 음성 대조군으로써 사용되었다. 밀집된 평활근 커버슬립은 분화된 뉴런 또는 교질(glia)을 동정하는 반면 위양성 염색을 피하기 위해, 뉴런 또는 신경교 마커들로 염색되었다.

데이터 분석

신경돌기 길이들은 동일한 증폭기 이득(gain) 및 노출에서 얻어진 개별 10X 현미경사진으로부터 측정되었다. 신경돌기들은 뉴런 모폴로지와 동시에 βIII 튜블린을 위한 면역반응성의 발현에 의해 일차적으로 확인되었다. 각각의 커버슬립 상에, 한 가장자리로부터 다른 가장자리까지, 커버슬립 면적을 커버하면서 5 이하의 연속적인 시야 범위가 측정되었다. 모든 세포들은 각각의 커버슬립 상에서 뉴런 커버슬립의 전체 면적을 커버하면서 측정되었다. 각각의 기판 코팅을 위해 측정된 신경돌기의 수는 20-50 측정값(readings)들 사이에서 다양하였다. 자유형(freeform) 툴을 이용하는 NIH Image J를 이용하여 각각의 세포로부터 가장 긴 신경돌기의 길이가 측정되었다. 배양 기판을 달리함으로써 신경돌기 길이들에서 유의차(p<0.05)를 동정하기 위해, 코팅들 사이의 신경돌기 길이들은 Bonferroni 효과측정시험(post-test)과 함께 일원 배치 분산분석(one way ANOVA)을 이용하여 비교되었다. GFAP 면역형광은 Nikon Elements 이미징 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다. 평균 레드(Mean red)(TRITC) 형광은, 10X 현미경사진으로부터 시야범위 100%를 커버하는 일정한(constant) 직사각형 면적 툴을 이용하여 계산되었다. 동일한 배율에서 다수의 (적어도 5) 연속적인 시야 범위는 평균 형광을 얻기 위하여 각각의 샘플을 위해 선택되었다. 코팅된 배양 기판들 사이에 적색 형광 강도에서의 유의차를 동정하기 위해, Bonferroni 사후 시험(post-test)과 함께 일원 배치 분산분석이 사용되었다. 윈도우용 GraphPad Prism 5.1 (San Diego, CA)는 통계적 분석을 수행하기 위해 사용되었다. 모든 통계들은 각각의 세트 내에 다수의 현미경 사진과 함께, 3-5개의 개별적인 세트틀 사이에서의 실험들로부터 왔다. 보고된 숫자들은 평균±평균의 표준오차이다. 뉴런 아형 분석을 위해, 웨스턴 블롯 상 덴시토메트리는 BioRad Quantity One(Hercules, CA)을 이용하여 수행되었다. 미가공 데이터(Raw data)는 1000 샘플/초에서 힘 변환기(force transducer)로부터 얻어졌다. 이차 사비츠키-골레이 스무딩(Second order Savitsky-Golay smoothing)는 윈도우용 GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 적용되었다. 곡선하 면적(Area under the curve, AUC)은 약리학적 아고니스트/전기장의 첨가 시간부터 수축/이완 반응의 종료까지 측정되었다. 약리학적 억제제에 의한 억제의 정도는 억제제의 부재시 AUC 백분율로서 억제제의 존재 하에 수축/이완의 AUC를 표현함으로써 계산되었다. Tukey 사후 시험(post-test)과 함께 일원배치분산분석은 GraphPad Prism을 이용하여 평균을 비교하기 위해 사용되었다. p≤0.05가 유의미한 것으로 고려되었다. 생리학적 평가 및 덴시토메트리는 각각의 실험 세트 내에 3-5 조직 조작된 시트들 사이에서 수행되었고; 모든 수치들은 평균±SEM으로 표현되었다.

신경교 분화

토끼 장 신경구의 초기 표현형

디스파제로 토끼 공장 생검의 분해 시, 거의 단일 세포 현탁액들은 70㎛ 및 40㎛ 메쉬를 통해 여과에 의해 얻어졌다. 단일 세포들은 직경이 대략 7㎛였다. 이들 세포들은 비부착(non-adherent) 배양 디쉬에 플레이트되었다. 플레이팅 후 2주동안, 토끼 장 뉴런 전구 세포들은 응집되고 배양물에서 증식되었으며, 부유하는 구모양의 구조(이것을 장 신경구라고 부름)를 형성하였다(도 1의 A). 플레이팅 후 2주에, 평균 신경구는 98.17±8.33 ㎛(n=34)였다. 신경구들은 200-300 ㎛ 근접하도록 생장 및 응집이 계속되었고, 이들은 분쇄(trituration)에 의해 분해되었다. 면역조직화학 실험 시, 장 신경구들 내에 세포들은 낮은 친화도 신경 생장 인자 수용체 p75^NTR에 대해 양성이었다(도 1의 B). 이들은 추가적으로 Sox2(도 1의 C, SRY 관련된 호메오박스(homeobox) 인자 2) 및 네스틴(도 1의 D), 신경상피 줄기 세포 마커에 또한 양성이었다. 결과들은 이 절차에 따라 토끼 내장으로부터 유래된 신경구들은 장 뉴런 및/또는 장 교질로의 분화가능한 신경능(neural-crest) 유래된 세포들을 포함하는 것을 나타낸다.

뉴런 전구 세포들은, 부유하는 구형의 콜로니들, 복제된(dubbed) 장 신경구를 형성하기 위해 배양물에서 응집되는 성체 토끼 공장들의 전체층 생검(full thickness biopsies)으로부터 분리되었다(도 1의 A). 장 신경구들은 p75, Sox2 및 네스틴(도 1의 B-D)에 양성인 세포들로 구성되었다. p75^NTR의 존재는 분리된 세포들의 신경능(neural-crest) 계통임을 확인해준다. Sox2 및 네스틴의 존재는 분리된 세포들의 전구 지위를 확인해주며, 이것은 뉴런 및 교질로의 분화를 위한 잠재능을 가지는 소화관으로부터 미리 분리된 장 뉴런 전구 세포들과 이 세포들이 유사하다는 것을 나타낸다.

개별의 ECM 기판 상의 뉴런 분화(콜라겐 I, 콜라겐 IV 또는 라미닌)

Poly-L-라이신(PLL) 코팅은 유리 기판에 부착된 장 신경구의 전제조건이다. 임의의 코팅이 없는 유리 커버슬립은 뉴런 또는 교질로의 분화가 충분히 되도록 장 신경구 부착을 지지해주지 않았다. 균일성을 유지하기 위해, 모든 커버슬립들은 PLL로 처음에 코팅되었고, 추가적으로 라미닌, 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV로 코팅되었다. 모든 코팅된 커버슬립들은 장 신경구들을 부착하기 위해 2-4시간 사이를 필요로 한다.

코팅된 커버슬립 상에 장 신경구는, 뉴런 분화 배지를 단독으로 이용하여, 초기에 분화되도록 하였다. 그러나, 몇몇 실험 세트들은 15일 시점에서 분화의 어떠한 모폴로지 증거들도 없다는 것을 입증하였다. 이에 의해, 분화에 좋은 용해성 환경을 주기 위해, 결장의 평활근 세포들을 포함하는 밀집된 커버슬립을 동일한 배양 디쉬에 두었다(도 2). 이에 의해, 뉴런 커버슬립(ECM 기질로 코팅되고, 장 신경구를 포함) 및 평활근 커버슬립은 용해성 인자를 공유하였다. 평활근 커버슬립의 추가는 분화 개시(0 일)를 표지하였다.

뉴런 또는 신경교 분화의 형태학적 증거는 5일에 의해 쉽게 눈에 보였다. 이후의 시점(15일)은 ECM 조성물의 기능으로써 성숙한 뉴런 또는 신경교의 인 비트로 발달을 연구하기 위해 동정되었다. 분화 과정 동안, 배양 디쉬들은 초기 시점(5일) 또는 늦은 시점(15일)까지, 배지 보충을 제외하고는, 계속 방해하지 않은(undisturbed) 채로 유지했다. 뉴런 분화는 βIII 튜블린을 향해 유도된(directed) 항체를 가지고 5일 또는 15일에서 뉴런 커버슬립의 면역형광염색으로 동정되었다.

5일 시점: 평활근 존재하에서 조차, PLL 상의 장 신경구는 낮은 수준의 βIII 튜블린을 발현하는 신경구들 내에 몇몇 전구 세포들과 함께 계속 미분화된 상태로 있었다(도 3의 A). 그러나, 배양 기판상의 PLL에 라미닌, 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV의 첨가와 함께, 뉴런 분화는 5일까지 분명해졌다(도 3의 B-D). 신경돌기 길이들은 초기 시점에서 ECM 기판 상에 193 ㎛ 내지 288 ㎛ 에서 유의미하지 않게 달라졌다(도 9A). 콜라겐 IV 및 라미닌 코팅된 커버슬립 상의 뉴런은 높은 수준의 분지(branching)를 증명하였다 (세포 당 둘 이상의 신경돌기; 도 3의 B,D).

신경구 및 뉴런 전구 세포들은 PLL 코팅된 커버슬립 상에 부착되었고, 5일에 부착되어 유지되었으나, 뉴런 분화는 개시되지 않았다. 그러나, 신경교 분화는 5일에 의해 쉽게 눈으로 확인되었고, 15일에 의해 향상되었다(도 3의 A,E; 도 6의 A,E). PLL 기판 상의 장 신경구는 신경교 분화 대 뉴런 분화를 향한 선호도를 나타낸다.

15일 시점: 15일 시점에, PLL 커버슬립들 상의 신경구는 겨우 뉴런 분화를 개시하였고, 편평한(flatter) 모폴로지와 아주 적은 튜블린-양성(positive) 연장(extension)의 존재에 의해 입증되었다(도 3의 E). 라미닌, 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV의 첨가와 함께, 신경돌기 길이들은 PLL에 비하여 유의미하게 길어졌다 (p<0.001). 라미닌 커버슬립 상의 분화된 뉴런들은 가장 긴 신경돌기 연장(326.9 ±13.25㎛, n=27, 도 3의 F), 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV보다 유의미하게 길어짐 (p<0.05, 도 9의 A)을 입증하였다. 15일에 의해, 콜라겐 I 코팅된 커버슬립 상의 뉴런들은 콜라겐 IV-코팅된 커버슬립 상에 것들과 비교하여 유의적인 분지가 여전히 없었다(도 3의 G-H).

콜라겐-라미닌 기판 상의 뉴런 분화

다음 세트의 실험들에서, 콜라겐 및 라미닌의 조합들이 평가되었다. 라미닌의 두개의 농도가 뉴런 분화에 영향을 미치기 위해 필요한 라미닌의 최소 양을 동정하기 위해 평가되었다. 커버슬립들은 5㎍/cm² 또는 10㎍/cm²의 라미닌과 함께 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV로 코팅되었다. 개별적인 콜라겐 기판에 비교할 때(도 4를 도 3과 비교), 라미닌의 첨가는 뉴런 분화를 향상시켰지만, 라미닌의 두개의 농도 사이에 신경 돌기 길이에서 유의적인 차이는 전혀 관찰되지 않았다.

콜라겐 I 및 라미닌: 5일 시점에, 콜라겐 I에 라미닌의 첨가는 뉴런 분화를 거치는 전구 세포들의 수를 증가시켰으나, 뉴런 분지 또는 신경 돌기 길이들을 유의미하게 변화시키지는 않았다(도 4의 A,B,E,F). 15일 시점에, 유의미하게(p<0.05) 향상된 뉴런 분화는 콜라겐 I과 비교하여 관찰되었다. 15일에 콜라겐-라미닌 기판 상의 신경돌기 길이(280㎛-290㎛; n=27-34)는 콜라겐 I 기판(235.5±10.05㎛; 도 9의 B)보다 길었다.

콜라겐 IV 및 라미닌 : 콜라겐 IV에 라미닌의 첨가는, 콜라겐 IV만으로 개별적으로 코팅된 커버슬립과 비교했을 때 뉴런 분화를 향상시켰다(도 4의 C,D,G,H 와 도 3의 D,H 비교). 5일 시점에서, 라미닌의 첨가는 뉴런 분화를 거치는 세포 수를 증가시켰다. 5일에 신경돌기 길이에서의 유의미한 변화는 관찰되지 않았다(247㎛-288㎛; 도 9의 B). 15일 시점에서, 콜라겐 IV 및 라미닌 모두로 코팅된 커버슬립은 유의미하게(p<0.05) 긴 신경돌기(281㎛에 비교하여 324㎛, 도 4의 G-H)를 가졌다. 뉴런간 네트워킹의 개시 또한 관찰되었다. 사용된 라미닌의 두개의 농도들 사이에 신경돌기 길이에 있어서 관찰가능한 또는 유의미한 차이는 없었다( 5㎍/cm² 또는 10㎍/cm²; 도 9의 B).

라미닌 및 헤파란 설페이트를 가진 복합물 ECM 기판들 상의 뉴런 분화

이 추가적인 세트에서, 뉴런 분화 상의 콜라겐들의 조합의 효과가 조사되었다. 복합물 코팅들은 기준으로써 콜라겐 I/콜라겐 IV의 2:1 혼합으로 평가되었다. 이 복합물 콜라겐 기준은 먼저 평가되었다. 추가적으로, 뉴런 분화는 복합물 콜라겐과 조합한 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트를 포함하는 기판들 상에서 평가되었다.

헤파란 설페이트는 뉴런 분화를 양성적으로(positively) 조절하기 위하여, 콜라겐 IV 및 라미닌 모두와 상호작용을 하였고, 뉴런 네트워킹의 개시 및 향상된 신경돌기 길이로 입증되었다(도 4의 A-H). 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트를 가진 복합물 콜라겐 기판들은 모두 낮은 수준의 GFAP 양성의 신경교 세포들을 유지하였고, 성상세포 네트워킹의 개시와 함께, 이후의 시점에서 더 명확해졌다.

복합물 콜라겐 I/콜라겐 IV : 몇몇 세포들은 뉴런 분화를 거쳤으나(도 5의 A,E; 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV의 개별 코팅들과 유사), 신경돌기 길이들은 5일에 복합물 콜라겐 기판상에서 유의미하게 더 짧았다. 신경돌기 길이들은 5일에 156±7.23㎛로 측정되었다. 5일에, 뉴런 분화가 진행되었고, 개별적인 뉴런들은 다수의 분지 및 긴 신경돌기를 가지고 있었다(도 5의 E). 신경돌기 길이들은 15일에 241.2±9.387㎛로 평균되었다(도 9의 C).

라미닌의 첨가: 복합물 콜라겐 기판에 라미닌의 첨가는 5일에 의해 눈에 보이는 분화된 뉴런들의 수를 증가시켰다 (도 5의 B). 신경돌기 길이들은 라미닌을 포함한 기판상에서 유의미하게(p<0.05) 더 길었다(215±7.57㎛; n=43). 15일 시점에서, 복합물 콜라겐 및 라미닌을 포함하는 기판들은, 신경돌기 길이에서 추가적인 71 ㎛ 증가, 평균 286.8±9.521㎛, n=50와 함께, 뉴런들의 유의미한 클러스터링을 입증했다(도 5의 F).

헤파란 설페이트의 첨가: 헤파란 설페이트의 첨가는 또한 5일에 의해 뉴런 분화를 거치는 전구 세포들의 수를 극적으로 증가시켰다(도 5의 C). 복합물 콜라겐을 따라 헤파란 설페이트를 포함하는 기판들 상에서 평균 신경돌기 길이들은 5일에 212.8±9.46㎛; n=43였다. 15일에, 뉴런 네트워킹의 개시가 βIII 튜블린 염색으로 눈에 보였다(도 5의 G).

라미닌 및 헤파란 설페이트의 첨가: 복합물 콜라겐과 함께 라미닌 및 헤파란 설페이트의 첨가는 분화된 뉴런들의 수 뿐만 아니라 개별적인 뉴런 과정 및 신경돌기 분지를 증가시켰다(도 5의 D). 15일에, 뉴런들의 유의미한 클러스터링과 함께 뉴런 네트워킹의 개시가 관찰되었다(도 5의 H). 신경돌기 길이들은 복합물 콜라겐 단독에 비하여 유의미하게 더 길었다(325±19.37㎛)(도 9의 C).

개별 ECM 코팅들(콜라겐 I, 콜라겐 IV, 또는 라미닌)에서 신경교 분화

상술한 뉴런 분화 연구에 더하여, 신경교 분화가 배양 기판의 ECM 조성물의 기능으로써 또한 연구되었다. 장 신경구는 2개(in duplicate)의 코팅된 커버슬립상에 플레이트되었고, 하나의 커버슬립은 뉴런 분화를 평가하기 위해 사용된 반면, 다른 하나의(duplicate) 커버슬립은 신경교 분화를 평가하기 위해 사용되었다. 신경교섬유질산성단백질(GFAP)을 향해 유도된 일차 항체는 신경교 분화를 확인하기 위해 활용되었다. 형광 현미경은 TRITC 형광단 콘쥬게이트된 이차 항체를 이용하여 분화된 신경교를 시각화하기 위해 사용되었다. Nikon 기록(documentation) 소프트웨어는 일정한 영역(constant area)의 관측 시야에서 분화된 신경교의 수를 나타내는 평균 레드 형광을 계산하기 위해 사용되었다.

몇몇 축삭초의(axolemmal) 단편들의 존재는 교질의 증식을 막을 수 있다. 이것은 광범위한 뉴런 분화를 지지하는 기판들 상에 관찰된 낮은 수준의 GFAP 면역형광과도 비슷하다. 장 신경교 전구 세포들의 교질로의 분화를 광범위하게 지지하는 유일한 기판들은 PLL 및 콜라겐 I/IV의 개별적인 코팅이었다. 신경 분화는 이들 기판들 상에 존재하였으나, 라미닌 및 헤파란 설페이트를 포함하는 임의의 다른 복합물 코팅들만큼 광범위하지는 않았다.

5일 시점: 평활근 존재 하에, PLL 코팅된 커버슬립 상의 장 신경구들은 5일에 의해 유의미한 GFAP 염색을 증명하였다(15.29±1.29AU; 도 6의 A). 대조적으로, PLL 커버슬립들 상의 장 신경구들은 5일에 유의미한 뉴런 분화를 증명하지 못했고, 이는 PLL 커버슬립 상의 초기 시점에 교질로의 우선적인 분화를 나타낸다. 라미닌의 첨가와 함께, 장 신경구는 매우 유의미하게 감소된 GFAP 염색을 입증하였다 (0.3825±0.2AU). 라미닌 커버슬립들 상의 미분화된 신경구들은 GFAP에 양성인 몇몇 전구세포들을 포함하였다(도 6의 B). 동일한 라미닌 코팅된 커버슬립들 상에서, 뉴런 분화는 초기 시점에서 광범위하였고, 이는 라미닌 존재하에서 뉴런 분화에 대한 초기 선호도를 나타낸다(도 3의 B). 최소의 신경교 분화는 콜라겐 기판들에서 관찰되었다(도 6의 C-D).

15일 시점: 늦은 15일 시점에 의해, PLL 코팅된 커버슬립들은 교질의 가장 높은 수를 가졌고, 이는 매우 유의미한(p<0.0001) GFAP 형광강도, 평균 28.56±1.14AU 에 의해 나타내어졌다(도 6의 E, 9의 D). 교질은 ECM-코팅된 커버슬립 상에서 또한 분명했지만, PLL상에서 보다 낮은 정도였다. 대조적으로, 5일에, 라미닌 코팅된 커버슬립들은 15일 시점에서 몇몇 교질의 존재를 입증하였고, 강건한(robust) GFAP 형광 강도가 관찰되었다(도 5의 F, 16.54±0.32 AU). 몇몇 교질은 각각의 콜라겐 기판들 상에서 15일에 의해 11.84 내지 13.38 AU 범위의 형광과 함께 관찰되었다 (도 6의 G-H).

콜라겐-라미닌 기판들 상의 신경교 분화

뉴런 분화와 유사하게, 신경교 분화는 라미닌과 함께 콜라겐 IV 또는 콜라겐 I로 코팅된 기판들 상에서 평가되었다. 콜라겐 코팅된 커버슬립에 라미닌의 첨가는 신경교 분화를 억제하지 않았다. 몇몇 분화된 교질은 콜라겐-라미닌 기판들 상에서 5일에서 (8.4±0.75 - 14.08±0.3 AU) 관찰되었다 (도 7의 A-D). 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV 기판들에 라미닌의 첨가(5㎍/cm² 또는 10㎍/cm²)와 함께 초기 시점에서 GFAP 양성 세포들 수에 있어 유의미한 차이는 없었다(도 9의 D). 강건한 GFAP 발현(12.6±1.29 - 14.22±1.01 AU)은 15일 시점에서 모든 콜라겐-라미닌 기판들 상에서 관찰되었으며, 서로 유의미하게 다르지 않았다(도 7의 E-H).

라미닌 및 헤파란 설페이트를 가진 복합물 ECM 기판들 상의 신경교 분화

신경교 분화는 콜라겐 I 및 IV의 조합으로 배양 기판들을 다양화하여 평가되었다. 추가적으로, 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트의 첨가의 효과는 또한 신경교 분화 상에서 연구되었다.

복합물 콜라겐 I/콜라겐 IV: 신경교 분화는 콜라겐 I/IV 혼합물로 코팅된 커버슬립 상에서 5일에 피크(peaked)였다(도 8의 A). 레드 형광(15.75±0.49 AU)은 5일에 PLL 코팅된 커버슬립들 상에서의 것과 비교할만했다(도 9의 D). 대조적으로, 복합물 콜라겐 코팅된 커버슬립 상에서 뉴런 분화는 초기 시점에서는 저조하였고, 이는 초기에 교질로의 선호하는 분화를 나타낸다. 15일에 의해, 신경교 세포들의 클러스터링 개시가 레드 형광에서 유의미한 증가 없이 관찰될 수 있었다(도 8의 E).

라미닌 및/또는 헤파란 설페이트의 첨가: 5일에서 초기 신경교 분화는 복합물 콜라겐 기판들에 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트의 첨가와 함께 유의미하게 감소(10.16±0.8 내지 11.06±0.5)되었다(도 8의 B-D). 대조적으로, 이들 기판들은 광범위하게 뉴런 분화를 지지하였고(도 8의 A-D를 도 5의 A-D와 비교) 이는 초기 시점에서 선호하는 뉴런 분화를 나타낸다. 늦은 15일 시점에, 교질의 수에 있어서 유의미하지 않은 증가 및 이에 의한 레드 형광에서의 증가가 관찰되었다(도 8의 E-H, 도 9의 D).

뉴런 아형 분화

ECM 하이드로겔의 점탄성 성질 및 미세구조( Ultrastructure ): 30분 이내에 37℃에서 ECM 하이드로겔 모든 조성물들은 겔화되었다. 주사전자현미경은 타입 I 콜라겐 겔들에서 섬유모양의 구조를 밝혔다(도 10의 A). 상기 섬유들은 무작위로 배향되어 있고, 평균 478.3±19.31㎛의 직경을 가졌다. 타입 IV 콜라겐의 첨가와 함께, 네트워크와 같은 구조들이 관찰되었다(도 10의 B). 네트워크화된 구조들 내에 섬유의 케이블(cable)은 더 두껍고, 평균 714.8±36.67㎛ 직경이다. 하이드로겔에 라미닌의 첨가는 네트워크화된 상부구조(suprastructure) 또는 미세구조(ultrastructure)를 변경하지 않았다(도 10의 C). 헤파란 설페이트의 첨가와 함께, 네트워크화된 구조들 내 섬유들은 함께 보다 단단히 당겨졌고, 케이블화(cable)되었다(도 10의 D). 탈수된 ECM 겔들은 평균 공극률 40.77% - 43.95% 범위인 다공성 외관을 나타냈다(도 1, 표).

점탄성 계수(viscoelastic moduli)들은 진동 레오메트리를 이용하여 수화된 ECM 겔들에서 측정되었다. 타입 I 콜라겐 겔들은 72.6±4.86Pa (800㎍/ml) 내지 182.3±2.6 (1600㎍/ml) 내지 424±2 Pa (3200㎍/ml) 범위의 증가하는 콜라겐 농도와 함께 증가하는 점탄성 계수를 가졌다. 200㎍/ml 콜라겐 IV 내지 800㎍/ml 콜라겐 I의 첨가는 236±13.53 Pa까지 겔의 계수를 증가시켰다. 라미닌의 첨가는 점탄성 계수 상에 아무런 영향이 없었다(236±13.53 Pa과 220.7±16.27 Pa 비교). 10㎍/ml의 헤파란 설페이트는 ECM 하이드로겔의 계수들에서 증가를 가져왔다(287±20.1 1 Pa, p<0.05). 도 1(표)은 평가된 최종 ECM 겔들이 182Pa 내지 287Pa 범위의 점탄성 계수를 가진 것으로 요약하고 있다.

조작된(engineered) 신경분포된 내장 평활근 시트들에서 뉴런 분화: 전술한 바와 같이, 배양물에서 10일에 걸쳐 덮어놓은 ECM 하이드로겔에 단축으로 정렬된 평활근 세포들을 밀집시켰다(compacted). 생성된 조직 조작된 시트들은 ~1cm 길이였고, 몇몇 세포층들은 두꺼웠다. 평활근의 존재하에, 장 뉴런 전구 세포들은 ECM 하이드로겔 내에서 분화하였다. 뉴런 분화는 10일에 현미경 시험에 의해 형태학적으로 동정되었고, 인 비트로 및 조직 조작된 구성체(construct)에서 모두, 장 뉴런 전구 세포들에 의해 발현된 유사한 분화 프로파일을 입증한다. 몇몇 분화된 뉴런들은 조직 조작된 시트에서, ECM 조성물과 관계없이, 관찰되었다(도 11). 도면에서 화살표들은 뉴런 클러스터링 및 예비적인 뉴런 네트워킹의 다수의 예들을 나타낸다.

조작된 신경분포된 내장 평활근 시트 내 뉴런 조성물: 면역블롯팅은 조직 조작된 신경분포된 내장 평활근 세포들 내에 뉴런 조성물의 평가를 위해 사용되었다. β-액틴을 위한 블롯팅은 동일한 양의 단백질이 분석되었음을 입증해준다. 각각의 단백질을 위한 대표적인 블롯들을 보여주고, 이는 겔 상에서 나타나는 대략적인 분자량을 나타낸다(도 12의 E). 구성 평활근의 수축성 표현형은 조직 조작된 시트들 내에 스무셀린의 유사한 발현에 의해 입증되었다(도 12의 B). 스무셀린의 발현은 시트들의 ECM 조성물과 관계없이 일정하였고, 이는 구성 평활근 세포들이 수축성 표현형을 유지하였다는 것을 나타낸다.

뉴런 분화: 전체 뉴런 마커(Pan neuronal marker)βIII 튜블린 발현은 ECM 조성물에도 불구하고, 모든 조직 조작된 시트들 사이에서 유사하였다(도 12의 A). 이는 ECM 조성물과 무관하게, 평활근 세포들 존재 하에 장 신경구의 뉴런 분화가 유사하게 진행됨을 암시하였다. βIII 튜블린 발현은 21.65±1.43AU - 28.98±0.85 AU 범위였다. βIII 튜블린 발현은 다양한 ECM 겔 조성물들 사이에서 서로 유사하였고(ns; 도 12의 A), 이는 유사한 뉴런 분화를 나타내었다.

콜린작동성 뉴런들: 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT) 발현은 콜린작동성 뉴런들의 존재를 검출하기 위해 사용되었다(도 12의 C). 콜라겐 I(33.73±1.13 AU) 및 콜라겐 I/IV/라미닌(28.82±1.21 AU) 시트들은 복합물 콜라겐 및/또는 헤파란 설페이트들을 가진 시트들과 비교하여 ChAT의 유의미하게 상승된 발현을 가졌다. 면역블롯팅은 콜라겐 I만 가지고, 또는 라미닌과 함께 복합물 콜라겐 I/IV를 가지고 제조된 조직 조작된 시트들에서 풍부한 콜린작동성 뉴런 집단을 증명하였다. 콜린작동성 뉴런들의 존재는 추가적으로 면역조직화학을 이용하여 확인하였다(도 13의 E-H).

질소활성( nitrergic ) 억제 운동 뉴런들: 뉴런 산화 질소 신타제(nNOS) 발현은 억제성 질소활성 운동 뉴런들의 존재를 검출하기 위해 사용되었다(도 12의 D). 콜라겐 IV를 가진 시트들(라미닌/헤파란 설페이트가 있거나 또는 없는)은 26.37±1.29 AU - 28.15±2.69 AU 범위에서 유의미하게 더 높은 nNOS 발현을 가졌다. ChAT와 반대로, 콜라겐 I 시트들은 최소의 nNOS 발현(11.33±2.85 AU)을 가졌다. nNOS의 존재는 면역조직화학을 이용해 추가적으로 확인되었다(도13의 I-L).

VIP-활성 억제 운동 뉴런들: 혈관 활성 장 펩티드(VIP) 운동 뉴런들은 면역조직화학을 이용하여 동정되었다. 라미닌 및 헤파린 설페이트를 가진 복합물 하이드로겔에서 증가된 면역형광과 함께, VIP 뉴런들은 풍부하였다(도 13의 A-D).

펩티드성(peptidergic) 뉴런 분화를 지지했던 기판들은 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% 초과의, 또는 임의의 중간 백분율을 포함하는 펩티드성 뉴런의 풍부한 집단을 가져올 수 있다.

조직 조작된 신경분포된 평활근 시트들의 아고니스트-유도된 수축성

염화칼륨-유도된 수축: 구성 평활근 세포들의 전기기계적 커플링 무결성은 먼저 염화칼륨(KCl)을 이용하여 평가되었다. KCl 처리는 ~5분 동안 지속된 신속한 수축을 끌어내었다(도 14). KCl에 응답하는 피크(peak) 최대의 수축은 상이한 조직 조작된 시트들 사이에서 279.5±4.79μΝ 내지 296.5±6.26μΝ 범위로 유사하였다 (도 14의 A-D). 이것은 수축성 평활근 마커, 스무셀린의 동등한 발현과 상관관계가 있고, 이는 ECM 조성물과 관계없이 조직 조작된 시트들 내에 구성 평활근 세포들은 수축성 표현형을 유지한다는 것을 나타낸다. 또한, 조직 조작된 시트들 내에 KCl-유도된 수축들은 시간 경과에서 원래의 토끼 내장(intestine) 조직들과 유사하였으나(도 14의 E), 규모(magnitude)에서 다소 감소되었다. 원래의 조직에서 피크 KCl-유도된 수축들은 평균 373.5±10.63μΝ였다. KCl-유도된 수축은 신경 차단제 TTX(회색 선, 도 14)로의 전처리에 의해 영향을 받지 않았고, 이는 근원성 전기기계적 커플링 무결성을 나타낸다. 도 16의 F는 수축 곡선 하 면적이 모든 조직 조작된 시트들에서 유사하였고, 원래의 토끼 장 조직에서 유의미하게 더 높았다는 것을 증명하였다. 비록 원래의 조직과 비교하여 규모에서 감소되었지만, KCl-유도된 수축들은 다른 조직 조작된 시트들 사이에서 유사하였고, 이는 ECM 조성물에 의해 영향을 받지 않는 강건한 수축성 평활근 표현형을 나타낸다.

아세틸콜린-유도된 수축: 1μΜ 아세틸콜린(Ach)의 외인성(Exogenous) 첨가는 아고니스트-유도된 수축을 자극하기 위해 사용되었다. 모든 조직 조작된 시트들은 Ach에 응답하여 수축되었고, Ach로 자극 후 ~5분까지 수축을 유지하였다(도 15의 A-D). 라미닌을 가진 복합물 콜라겐 I/IV와 함께 조직 조작된 시트들은 수축 곡선하 증가된 면적(47606±2054 AU) 뿐만 아니라 유의미하게 상승된 피크(peak) 최대 Ach-유도된 수축을 가졌다(도 15의 C; 232.9±8.167μΝ). Ach-유도된 수축의 규모는 원래의 조직에서의 수축과 비교하여, 여전히 유의미하게 낮았다(342.6±3.15μΝ; 70448±5876 AU). 그러나, 수축의 시간 경과(course)는 라미닌을 포함한 조직 조작된 시트들에서 원래의(native) 조직과 매우 유사하였고, 1분의 아고니스트 자극 내에 최대 수축에 도달했다. 콜라겐 I 시트들은 또한 상승된 ChAT 단백질 발현에 상응하는, 상승된 Ach-유도된 수축(도 15의 A; 238.9±13.72 μΝ; 42668±2172 AU)를 또한 가졌다. 그러나, 수축의 동역학은 원래의 조직과 맞지 않았다.

Ach-유도된 수축의 평활근(근원성) 성분을 평가하기 위해, 신경독소 TTX는 전처리로서 사용되었다(회색 선, 도 15). 수축 곡선하 면적은 % 억제로 평가하기 위하여 TTX 전처리를 가지고 그리고 가지지 않고 비교되었다(도 15의 F). TTX 존재에서 Ach-유도된 수축의 퍼센트 억제는 두 ECM 조건들에서 가장 높았다: i) 콜라겐 I 시트들(72.77±2.45%); 및 ii) 콜라겐 I/IV/라미닌 시트들(60.58±1.66%). % 억제의 이러한 수치들은 TTX-전처리시 원래의 조직에서 관찰된 것(72.73±3.66%)과 유사하였다. Ach-유도된 수축에 이러한 증가된 뉴런의 기여는 또한 콜라겐 I에서 그리고 복합물 콜라겐 I/IV/라미닌 시트들에서 ChAT의 증가된 단백질 발현과 상관관계가 있다(도 12의 E,G). TTX-전처리는 콜라겐 I/IV±헤파란 설페이트 시트들에서 48.36±4.36 %(헤파란 설페이트) 내지 50.31±4.22%(콜라겐 IV; 도 15의 F) 범위에 이르는 유의미하게 더 낮은 정도로 Ach-유도된 수축을 억제하였다.

전기장 자극의 응답으로 조작된 신경분포된 시트들에서의 이완: 5Hz, 0.5 ms에서 전기장(EFS) 자극이 평활근의 이완을 생성하기 위해 조직 조작된 시트들 내에 뉴런들을 자극 시키는데에 사용되었다(도 16). 이완의 정도는 이완 곡선하 면적으로써 정량화되었다. 이완 정도는 다양한 ECM 조성물들로 조직 조작된 시트들 사이에 유의미하게 다양했다. 콜라겐 IV로 생물공학적으로 조작된 시트들은, nNOS 증가된 발현을 나타내고, 콜라겐 I만으로 생물공학적으로 조작된 시트들과 비교하여 높은 이완을 가졌다(콜라겐 I/IV 시트들에서 109693±8465 AU와 콜라겐 I 시트들에서 23142±4921과 비교). 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트를 함유하는 시트들은 또한 콜라겐 I 시트들과 비교하여 유의미하게 높은 이완을 가졌다(68395-69025 AU). EFS에 응답하여, 원래의 조직들은 101550±11279 AU를 생성하면서 이완시켰다. 콜라겐 IV 및/또는 라미닌 및/또는 헤파란 설페이트를 가진 조직 조작된 시트들은 추가적으로 원래의 조직과 가장 유사한 이완의 시간 경과(course)를 가졌다. 최대 이완은 EFS의 2분 내에 달성되었고, 기준(basal) 힘의 이어지는 회복은 10분 내에 완료되었다. TTX로 전처리시, EFS-유도된 이완은 전부 억제되었다(회색 선, 도 16).

산화질소 신타제의 억제: 질소합성 뉴런들의 존재와 기능성을 동정하기 위하여, 산화질소 신타제의 억제제(L-NAME)가 사용되었다(회색 선, 도 17). 퍼센트 억제는 L-NAME 전처리(pre-treatment)를 가지고 그리고 가지지 않고 최대 이완의 곡선하 면적들을 비교함으로써 결정되었다. L-NAME 처리를 가진 퍼센트 억제는 콜라겐 I 시트들에서 가장 낮았다 (33.37±8.37%; 회색 선(trace), 도 17의 A). 이것은 콜라겐 IV를 포함하는 시트들과 비교하여 콜라겐 I 시트들에서 nNOS의 낮은 단백질 발현과 상응되었다(도 12의 D). 대조적으로, nNOS 활성의 억제는 61.71±2.82%까지 콜라겐 I/IV 시트들에서 이완을 약화시켰다(회색 선, 도 17의 B). 라미닌 및 헤파린 설페이트를 포함하는 시트들에서, L-NAME을 가진 % 억제는 62.28±2.75%(라미닌, 도 17의 C) 내지 57.16±1.91%(헤파란 설페이트)에서 다양하였다. 이러한 억제는 콜라겐 I/콜라겐 IV 시트들에서 관찰된 nNOS의 증가된 발현과 상응하여, 콜라겐 I 시트들과 비교할때 유의미하게 증가된다(도 12의 C). 원래의 조직들은 L-NAME와 함께 더 높은 % 억제를 가졌다(78.02±2.85%).

VIP-수용체의 억제: VIP-활성화된(VIP-ergic) 뉴런의 기능성은 VIP 수용체 안타고니스트(VIP-Ra)를 이용하여 평가되었다. VIP-Ra로의 전처리는 55.55±3.92% - 65.92±5.38%의 범위의 다양한 정도로 모든 조직 조작된 시트에서 최대 이완을 억제하였다(회색 선, 도 18). EFS-유도된 이완의 억제는 조직 조작된 시트에서 분화된 VIP-활성화된 뉴런들의 존재를 나타낸다.

여기에 사용된 섹션 제목들은 오직 조직의(organizational) 목적인 것이고, 이것이 제한하는 것으로 해석되는 것이 아니다. 출원인의 교시는 다양한 구현예들과 함께 기술되며, 출원인의 교시가 그러한 구현예들로 한정되는 것을 의도하는 것이 아니다. 반대로, 출원인의 교시들은 다양한 대안, 변형 및 등가물들을 포괄하는 것이고, 당해 분야의 통상의 지식을 가진자에 의해 이해될 수 있을 것이다.

Claims (26)

1. 삭제
2. 단축으로(uniaxially)-배열된 평활근 시트를 형성하도록 평활근 세포의 집단을 배양하는 단계;
   적어도 하나의 세포외 기질(ECM) 성분을 포함하는 하이드로겔 내에 신경 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계; 및
   상기 신경 줄기 세포를 포함하는 하이드로겔을 상기 단축으로 배열된 평활근 시트에 적용하는 단계를 포함하고,
   상기 ECM 성분은 콜라겐 I을 포함하며, 콜린작동성(cholinergic) 뉴런이 풍부한(enriched) 분화된 신경 줄기 세포로 신경 줄기 세포의 분화를 편향시키는, 신경 줄기세포 분화의 편향 방법.
3. 삭제
4. 제2항에 있어서, 상기 하이드로겔은 적어도 800 ㎍/ml 콜라겐 I을 포함하는 방법.
5. 삭제
6. 단축으로(uniaxially)-배열된 평활근 시트를 형성하도록 평활근 세포의 집단을 배양하는 단계;
   적어도 하나의 세포외 기질(ECM) 성분을 포함하는 하이드로겔 내에 신경 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계; 및
   상기 신경 줄기 세포를 포함하는 하이드로겔을 상기 단축으로 배열된 평활근 시트에 적용하는 단계를 포함하고,
   상기 ECM 성분은 콜라겐 IV를 포함하고 라미닌이 실질적으로 없으며, 질소활성(nitrergic) 뉴런이 풍부한(enriched) 분화된 신경 줄기 세포로 신경 줄기 세포의 분화를 편향시키는, 신경 줄기세포 분화의 편향 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 하이드로겔은 적어도 200㎍/ml 콜라겐 IV를 포함하고, 라미닌이 실질적으로 없는 방법.
8. 삭제
9. 단축으로(uniaxially)-배열된 평활근 시트를 형성하도록 평활근 세포의 집단을 배양하는 단계;
   적어도 하나의 세포외 기질(ECM) 성분을 포함하는 하이드로겔 내에 신경 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계; 및
   상기 신경 줄기 세포를 포함하는 하이드로겔을 상기 단축으로 배열된 평활근 시트에 적용하는 단계를 포함하고,
   상기 ECM 성분은 콜라겐 I, 콜라겐 IV 및 라미닌을 포함하며, 펩티드성(peptidergic) 뉴런이 풍부한(enriched) 분화된 신경 줄기 세포로 신경 줄기 세포의 분화를 편향시키는, 신경 줄기세포 분화의 편향 방법.
10. 삭제
11. 제9항에 있어서, 상기 하이드로겔은 적어도 800㎍/ml 콜라겐 I, 적어도 200 ㎍/ml 콜라겐 IV, 및 적어도 5㎍/ml 라미닌을 포함하는 방법.
12. 삭제
13. 삭제
14. 제2항, 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화된 신경 줄기 세포는 단축으로 배열된 평활근 시트를 신경분포(innervate)하여 신경분포된 평활근 시트를 형성하도록 하는 방법.
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16. 평활근 세포 집단의 존재 하에 신경 줄기세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 신경 줄기 세포는 적어도 세포외 기질(ECM) 성분 콜라겐 I 및 콜라겐 IV를 포함하는 기판 코팅이 있는 기판 상에 부착하고, 상기 기판 코팅은 라미닌 및 헤파란 설페이트 중 적어도 하나가 실질적으로 없으며, 상기 ECM 성분은 신경교 세포가 풍부한 분화된 신경 줄기 세포로 상기 신경 줄기 세포의 분화를 편향시키는, 신경 줄기세포 분화의 편향 방법.
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24. 제16항에 있어서, 상기 기판 코팅은 적어도 5㎍/cm² 콜라겐 I 및 적어도 5㎍/cm² 콜라겐 IV를 포함하고, 라미닌 및 헤파란 설페이트 중 적어도 하나가 실질적으로 없는 방법.
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