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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein Tissue-Engineering. Die
vorliegende Erfindung stellt insbesondere einen mittels Tissue-Engineering gebildeten
Stent bereit, der sich zur Behandlung von Strikturen eignet.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Zylinderförmige Organe
und Strukturen wie Blutgefäße, die
Speiseröhre,
Därme,
die ableitenden Gänge
endokriner Drüsen
und die Harnröhre
können alle
von Strikturen betroffen werden, d.h. einer Verengung bzw. Okklusion
des Lumens. Strikturen können von
verschiedenen traumatischen oder organischen Erkrankungen verursacht
werden, und die Symptome können
von einer leichten Reizung und Unbehagen bis zu Paralyse und Tod
reichen.
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Strikturen
der Harnröhre
können
angeboren oder erworben sein. Erworbene Harnröhrenverengungen kommen bei
Männern
häufig
vor, sind jedoch bei Frauen selten. Die meisten erworbenen Strikturen
sind auf Infektionen oder Traumata zurückzuführen. Außer von durch Geschlechtskrankheiten
verursachten Infektionen werden Traumata der Harnröhre von
Infektionen aufgrund einer langfristigen Anwendung von Harnröhrenkathetern
und der Anwendung von für
medizinische Zwecke in die Harnröhre
eingeführten
großkalibrigen
Instrumenten herbeigeführt. Auch
externe Traumata, z.B. Brüche
des Hüftknochens
oder Sattelverletzungen, können
Urethrastrikturen zur Folge haben. Durch die Verengung des Lumens
wird der Harnfluss eingeschränkt.
In chronischen Fällen
wird der Blasenmuskel hypertroph, und später kann es in der Blase zu
einer Zunahme des Restharns kommen. Eine längerfristige Obstruktion kann
zu einer Inkompetenz des Abflusskontrollmechanismus führen, was
Inkontinenz oder hohe Drücke
in der Blase, die zu Nierenschäden
und Nierenversagen führen,
zur Folge hat. Restharn kann ein prädisponierender Faktor für Harnröhreninfektionen sein,
zu denen Infektionen der Prostata, Harnleiterabszesse und auch Blasensteine
zählen.
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Eine
vollständige
Beschreibung der Pathologie der männlichen Harnröhre findet
sich in Campbells Urology, 5. Auflage, 1986, Band 1, Seiten 520–523 und
1217–1234,
und Band 3, Seiten 2860–2886
(erschienen bei W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pa., USA).
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Die
Behandlung von Strikturen erfolgt stellenspezifisch und hängt von
der Beschaffenheit und dem Ausmaß der Okklusion ab. Harnröhrenstrikturen lassen
sich mit palliativen Behandlungen wie Harnröhrenerweiterungen, die nicht
kurativ sind, da durch die Erweiterung das Narbengewebe aufgebrochen wird
und das Lumen lediglich temporär
vergrößert wird,
behandeln. Mit dem Fortschreiten der Heilung kommt es zu einer Rückbildung
des Narbengewebes.
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Bei
der Behandlung von Urethrastrikturen kommt auch die optisch gesteuerte
interne Urethrometrie zum Einsatz. In den meisten Fällen kommt
es jedoch zu einem Wiederauftreten der Striktur, und die Prozedur
muss wiederholt werden.
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Bei
der Reparatur der Striktur durch plastische Chirurgie handelt es
sich um eine genau durchzuführende
und komplizierte Prozedur. Bei dieser Prozedur kommt es jedoch zu
einem häufigen
Wiederauftreten von Harnröhrenverengungen,
und da es an Chirurgen mit ausreichender Erfahrung für rekonstruktive
Operationen mangelt, werden die meisten Fälle durch nicht-kurative Verfahren
behandelt.
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Frühere Studien
haben gezeigt, dass es bei fast der Hälfte bis zu zwei Dritteln der
Harnröhren- und
Harnleiterstrikturen innerhalb des ersten Jahres nach der Behandlung
zu einem Wiederauftreten kommt.10–15 Mehrere
Materialien wurden für
einen permanenten Austausch bei der Behandlung von Strikturkrankheiten
im Urogenitaltrakt vergeschlagen. In den letzten zwei Jahrzehnten
wurden permanente Stents aus Metall und temporäre Stents aus Metall und Polyurethan
eingeführt.16–18 Aufgrund
enttäuschender
Ergebnisse bei langfristigem Einsatz finden diese Anfertigungen
jedoch nur in bestimmten Situationen Anwendung.14,19,20
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Bei
typischen Verfahren zum Legen eines Harnröhrenstents wird der Stent transurthral
eingeführt
und innerhalb des gewünschten
Abschnitts der Harnröhre
positioniert. Damit ein Stent am vorteilhaftesten angewendet werden
kann, ist es wünschenswert,
dass der Stent beim Legen einen Durchmesser hat, der beträchtlich
kleiner ist als der Durchmesser des Körperlumens. Bei der Einnahme
seiner endgültigen
Position sollte der Stent einen Enddurchmesser annehmen, der im
Wesentlichen dem Durchmesser des Körperlumens entspricht.
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Die
Verwendung von Stents in der Harnröhre bringt spezielle Probleme
mit sich. Im Harn suspendierte Mineralien können zu Verkrustungen an den Innenwänden des
Stents führen,
die letztendlich den Durchfluss von Harn durch den Stent blockieren
können.
Durch eine Epithelialisierung, bei der die Zellen der Harnröhre den
Stent überwachsen,
kann eine Entnahme des Stents verkompliziert oder sogar verhindert
werden. Unbeabsichtigtes Bewegen, auch als Migration bezeichnet,
des Stents aus seiner gewünschten
Platzierung kann dazu führen,
dass der Stent nicht den gewünschten
Teil der Harnröhre stützt. In
einigen Fällen
kann ein mi grierender Stent sogar die Harnröhre blockieren bzw. verletzen.
Ein migrierender Stent kann auch zu Inkontinenz führen, beispielsweise
wenn ein Stent in eine Position zwischen den distalen Sphinkter
in der Harnröhre
wandert.
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Beispiele
für intraurethrale
und andere intraluminale Stents finden sich in den US-Patentschriften Nr.
4,740,207 (Kreamer); 4,877,030 (Beck et al.); 5,059,211 (Stack et
al.); 5,078,726 (Kreamer); 5,192,307 (Wall); 5,306,294 (Winston
et al.); 5,354,309 (Schnepp-Pesch et al.) und 5,383,926 (Lock et
al.).
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Im
Jahre 1988 berichteten Milroy et al. von der erfolgreichen Anwendung
eines selbstexpandierenden metallischen Harnröhrenstents.16 Kurz
darauf wurde beobachtet, dass diese Stents bei vielen Patienten
zu lokalen Schmerzen und Beschwerden, zu einer hypertrophen Proliferation
des Epithels und zu einer Obstruktion des Lumens führten. Diese
Symptome erforderten wiederholte endoskopische Resektionen oder
sogar operative Entfernungen der Stents, die weitere chirurgische
Rekonstruktionen erforderlich machten. Bei rekursiven Urethrastrikturen
wurden auch biologisch resorbierbare Harnröhrenstents eingesetzt, die
Ergebnisse waren jedoch enttäuschend.21 Epithelhyperplasie und obstruktive Fibrose in
den Stents hatte ein Versagen zur Folge.22 Da
die gegenwärtigen
Verfahren zur Behandlung von Harnröhren- und Harnleiterverengungen
suboptimal sind und die Rückfallraten
hoch, ist es nötig,
neue Behandlungsverfahren zu erproben.
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KURZE DARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Verwendung von natürlichen
Stents aus autologem Gewebe wäre
vorteilhaft für
die Behandlung von Harnröhren-
und Harnleiterstrikturen, da sie biologisch kompatibel und dazu
fähig sind,
hohen Kompressionskräften
zu widerstehen, was ihnen erlauben würde, im Harntrakt zu fungieren.
Es ist daher eine primäre
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine wirksame Vorrichtung für die Verwendung
bei der Behandlung von Strikturkrankheiten bereitzustellen. Der
Stent gemäß der vorliegenden
Erfindung kann bei Strikturkrankheiten der Harnröhre, des Harnleiters, der Blutgefäße, der
Gallenwege, der Därme,
der Luftwege der Lungen und der Eileiter von Nutzen sein. Es liegt
im Ermessen des behandelnden Arztes, inwieweit die neue Vorrichtung
bei der Behandlung von stenotischen Bedingungen einer Leitungsbahn
im menschlichen Körper
zur Anwendung gelangen kann.
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Eine
weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Harnröhrenstents
oder eines anderen intraluminalen Stents, mit dem sich eine Striktur
effektiv behandeln lässt
und ein Wiederauftreten verhindert werden kann.
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Diese
und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden erfindungsgemäß durch
einen mittels Tissue-Engineering gebildeten Stent gelöst, der
eine im Wesentlichen zylindrische Konstruktion mit einem ersten
Ende und einem zweiten Ende beinhaltet, wobei eine mauerartige Oberfläche zwischen
dem ersten und dem zweiten Ende angeordnet ist, wobei die mauerartige
Oberfläche
ein biologisch abbaubares Polymergerüst beinhaltet, das mit dissoziierten
Chondrozyten besät
ist. Das besäte
Gerüst wird,
bevor man es einem Wirt einpflanzt, vorzugsweise in vitro kultiviert.
Vorzugsweise erfolgt das Kultivieren über einen Zeitraum, der für die Bildung
von Knorpelgewebe ausreicht.
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Die
Chondrozyten können
autolog, allogen oder xenogen sein.
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Der
Ausdruck "biologisch
abbaubar" bezieht sich,
so wie er hier verwendet wird, auf Materialien, die in vivo enzymatisch
oder chemisch zu einfacheren chemischen Spezies abgebaut werden.
Zum Bilden der Matrix kann man entweder natürliche oder synthetische Polymere
verwenden, wenngleich aus Gründen
der Reproduzierbarkeit und einer steuerbaren Freisetzungskinetik
synthetische biologisch abbaubare Polymere bevorzugt werden. Als
synthetische Polymere können
beispielsweise Polymere wie Poly(lactid) (PLA), Poly(glykolsäure) (PGA),
Poly(lactid-co-glycolid)
(PLGA), Poly(caprolacton), Polycarbonate, Polyamide, Polyanhydride,
Polyaminosäuren,
Polyorthoester, Polyacetale, Polycyanoacrylate und abbaubare Polyurethane
und nicht-erodierbare Polymere wie Polyacrylate, Ethylen-Vinylacetat-Polymere
und andere acrylsubstituierte Celluloseacetate und Derivate davon
verwendet werden. PGA und PLGA sind bevorzugt.
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Zu
den bevorzugten biologisch abbaubaren Polymeren zählt ein
Polymer ausgewählt
aus der aus Polyestern von Hydroxycarbonsäuren, Polyanhydriden von Dicarbonsäuren und
Copolymeren von Hydroxycarbonsäuren
und Dicarbonsäuren
bestehenden Gruppe. Bei anderen Ausführungsformen handelt es sich
bei dem Material um ein von wenigstens einem der folgenden Monomere
abgeleitetes Polymer: Glycolid, Lactid, p-Dioxanon, Caprolacton,
Trimethylencarbonat, Butyrolacton. Bei bevorzugten Ausführungsformen
ist das Material ausgewählt
aus der aus Polymeren oder Copolymeren von Glykolsäure, Milchsäure und
Sebacinsäure
bestehenden Gruppe. Am meisten bevorzugt sind Polyglykolsäurepolymere.
Ein Polyhydroxyalkanoat-(PHA-) Polymer kann ebenfalls eingesetzt
werden.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines
mittels Tissue-Engineering gebildeten Stents bereit. Das Verfahren
beinhaltet die folgenden Schritte:
- (a) Bereitstellen
eines Substrats, das gestaltet ist, um eine im Wesentlichen zylindrische
Konstruktion zu bilden, wobei das Substrat ein biologisch abbaubares
Polymer beinhaltet;
- (b) In-Kontakt-Bringen des Substrats mit dissoziierten Chondrozyten,
die in der Lage sind, daran anzuhaften und Knorpel zu bilden, wodurch
eine mit Zellen besäte
Konstruktion gebildet wird;
- (c) Halten der mit Zellen besäten Konstruktion für eine Wachstumsperiode
in einem Flüssigkeitsmedium,
das für
das Wachstum der Chondrozyten geeignet ist, um einen mittels Tissue-Engineering gebildeten
Stent zu bilden.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
wird während
der Wachstumsphase auf die mit Zellen besäte Konstruktion Stress ausgeübt, um physiologische
Bedingungen zu stimulieren, die der Stent antrifft, wenn er einmal
eingepflanzt ist. Vorzugsweise handelt es sich bei diesem Stress
um zyklische Druckzunahmen.
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Andere
Aspekte der Erfindung sind unten offenbart.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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Für ein eingehenderes
Verständnis
der Erfindung sollte man auf die Figuren Bezug nehmen, wobei:
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1 eine
im Wesentlichen zylindrische Konstruktion (10) mit einem
ersten Ende (12) und einem zweiten Ende (14) und
einer zwischen ihrem ersten Ende und ihrem zweiten Ende angeordneten mauerartigen
Oberfläche
(16) zeigt.
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2A eine
rasterelektronen mikroskopische Aufnahme einer Polymermatrix vor
dem Besäen
(× 200)
ist und 2B eine mit 60 × 106 Chondrozyten/cm3 besäte Polymermatrix
72 h nach dem Besäen
(× 200)
ist.
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3A eine
tubularisierte Polymermatrix vor dem Besäen zeigt und 3B einen
10 Wochen lang in einem Bioreaktor kultivierten Knorpel-Harnröhrenstent
darstellt.
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4A–4D Gewebeschnitte
von mittels Engineering gebildeten Knorpelstents zeigen. Mit Chondrozyten
besäte
und in einem Bioreaktor kultivierte PGA-Gitter in vitro nach 4 Wochen
(4A) und 10 Wochen (4B), eingepflanzt
in den subkutanen Raum von Nacktmäusen nach 4 Wochen (4C)
und 10 Wochen (4D). Die Schnitte wurden mit
Hämatoxylin
und Eosin angefärbt
(× 250).
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5A–5F Gewebeschnitte
von mittels Engineering gebildeten Knorpelstents zeigen. Gezeigt
ist eine Anfärbung
mit Massons Trichrom auf Kollagen nach 10 Wochen in vitro (× 250) in 5A und
nach 10 Wochen in vivo (× 250)
in 5B. Eine Safarin-O-Färbung auf GAG nach 10 Wochen
in vitro (× 250)
und nach 10 Wochen in vivo (× 250)
ist in 5C bzw. 5D gezeigt.
Eine Alcian-Blau-Färbung
auf Chondroitinsulfat nach 10 Wochen in vitro (× 250) und nach 10 Wochen in
vivo (× 250)
ist in 5E bzw. 5F gezeigt.
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6 eine
in-vitro- und in-vivo-Messung des Kollagengehalts mit dem Sircol-Kollagen-Assay
(Biocolor; Belfast, Nordirland) ist. Bei den in vitro kultivierten
Stents kam es zwischen dem 4-Wochen- und dem 10-Wochen-Zeitpunkt zu einer
Zunahme des Kollagengehalts von 94 % (3,6 %; Standardabweichung ± 0,22
% beziehungsweise 7 %; Standardabweichung ± 0,41 %). Bei den in vivo
kultivierten Stents kann es zwischen dem 4-Wochen- und dem 10-Wochen-Zeitpunkt
zu einer mehr als dreifachen Zunahme des Kollagengehalts (4 %; Standardabweichung ± 0,33
% beziehungsweise 12,4 %; Standardabweichung ± 0,91 %).
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7 die zur Verringerung des Durchmessers
des in vitro kultivierten Knorpelstents um 20 % nach 4 Wochen (a)
und 10 Wochen (b) zeigt.
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8 die zur Verringerung des Durchmessers
des in vivo kultivierten Knorpelstents um 20 % nach 4 Wochen (a)
und 10 Wochen (b) zeigt.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Traumata,
Operationen oder das Einführen von
Instrumenten in die Harnröhre
oder den Harnleiter können
bei Erwachsenen und Kindern zu Strikturkrankheiten führen. Die
vorliegende Erfindung stellt einen mittels Tissue-Engineering gebildeten
Stent bereit, der eine im Wesentlichen zylindrische Konstruktion
(10) mit einem ersten Ende (12) und einem zweiten
Ende (14) beinhaltet, wobei eine mauerartige Oberfläche (16)
zwischen dem ersten und dem zweiten Ende angeordnet ist, wobei die
mauerartige Oberfläche
ein biologisch abbaubares Polymergerüst beinhaltet, das mit dissoziierten
Chondrozyten besät ist.
Das besäte
Gerüst
wird, bevor man es einem Wirt einpflanzt, vorzugsweise in vitro
kultiviert.
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Bevorzugte
biologisch abbaubare Polymere schließen Polyglykolsäurepolymere
(PGA), Polymilchsäurepolymere
(PLA), Polysebacinsäurepolymere
(PSA), Poly(milch-co-glykol)säure-Copolymere (PLGA),
Poly(milch-co-sebacin)säure-Copolymere (PLSA),
Poly(glykol-co-sebacin)säure-Copolymere (PGSA)
und Polyhydroxyalkanoat (PHA) ein. PHAs und deren Herstellung sind
beispielsweise in den PCT-Veröffentlichungen
Nr. WO99/14313, WO99/32536 und WO00/56376 beschrieben. Es können Kombinationen
von biologisch abbaubaren Polymeren, z.B. PGA und PLGA, angewendet
werden.
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Andere
biologisch abbaubare Polymere, die für die vorliegende Erfindung
von Nutzen sind, schließen
Polymere oder Copolymere von Caprolactonen, Carbonaten, Amiden,
Aminosäuren,
Orthoestern, Acetalen, Cyanoacrylaten und abbaubaren Urethanen sowie
Copolymere davon mit geradkettigen oder verzweigten, substituierten
oder unsubstituierten aromatischen oder Alkanyl-, Halogenalkyl-,
Thioalkyl-, Aminoalkyl-, Alkenyl-hydroxy- oder -dicarbonsäuren ein.
Darüber
hinaus können
die biologisch wichtigen Aminosäuren
mit reaktiven Seitenketten wie Lysin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin, Threonin,
Tyrosin und Cystein oder deren Enantiomere in den Copolymeren mit
einem der oben erwähnten
Materialien enthalten sein.
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Beispiele
für synthetische
biologisch abbaubare Polymere sind in den US-Patentschriften Nr. 5,431,679; 5,403,347;
5,314,989 und 5,502,159 beschrieben.
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Die
Oberflächeneigenschaften
aller medizinischen Gegenstände
sind extrem wichtig, da diese Oberfläche mit dem Wirt in Wechselwirkung
tritt. Da bei der Erfindung für
das Tissue-Engineering mit Zellen besäte Gerüste verwendet werden, ist es
nicht nur erforderlich, dass das Gerüst biologisch kompatibel und
biologisch abbaubar ist, es ist auch wesentlich, dass die Oberfläche das
Anhaften von Zellen und das anschließende Gewebewachstum fördert. Es
wäre daher
wünschenswert,
wenn man die Oberflächeneigenschaften
so einstellen kann, dass sie zu der beabsichtigten Anwendung passen,
ohne dass man andere Eigenschaften des Gerüsts wie seine mechanische Stärke oder
seine thermischen Eigenschaften dabei verändert. Nützliche Oberflächenmodifikationen
könnten
beispielsweise Veränderungen bei
der chemischen Gruppenfunktionalität, der Oberflächenladung,
der Hydrophobizität,
der Hydrophilizität
und der Benetzbarkeit umfassen. So wäre es beispielsweise wünschenswert,
das Anhaften von Zellen zu verbessern bzw. zu maximieren oder das
Anhaften eines gewünschten
Zelltyps oder mehrerer gewünschter
Zelltypen zu ermöglichen.
Dies lässt sich
beispielsweise erzielen, indem man auf der Oberfläche eine
biologisch aktive Verbindung oder ein Peptid, die/das das Anhaften
von Zellen fördert, anbringt
bzw. die Oberfläche
damit beschichtet. Die Beschichtung bzw. die biologisch aktive Verbindung kann
entweder kovalent oder nicht-kovalent an der Oberfläche angebracht
werden. Solche Fertigkeiten sind im Stand der Technik gut bekannt.
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Das
Gerüst
aus biologisch abbaubarem Polymer ist so gestaltet, dass es eine
im Wesentlichen zylindrische Konfiguration bildet.
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Vor
dem Besäen
des Gerüsts
mit Chondrozyten wird eine Sterilisation durchgeführt. Eine
Sterilisierung durch Erhitzen ist häufig unpraktisch, da das Gerät durch
die Hitzebehandlung verformt werden könnte, insbesondere wenn der
Schmelzpunkt der Materialien unter der für die Sterilisierung durch
Hitzebehandlung erforderlichen Temperatur liegt. Dieses Problem
lässt sich
umgehen, indem man als Mittel für
die Sterilisierung Ethylenoxidgas verwendet.
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Das
Gerüst
wird vor dem Einpflanzen mit den Chondrozyten besät. Die Chrondrozyten
können
aus einem gesunden Schnitt des Gewebes des Individuums, beispielsweise
Gelenkflächenknorpel
oder der epiphysären
Wachstumszone, vorzugsweise dem Ohr, geerntet, in vitro nach Vorschriften
zur Kultivierung von Zellen expandiert und dann auf das Gerüst gesät werden.
Alternativ dazu kann man die Chondrozyten aus den Geweben anderer
Spender oder aus bestehenden Zelllinien gewinnen. Es ist auch möglich, aus
Knochenmark erhaltene mesenchymale Zellen unter entsprechenden Kulturbedingungen
wie beispielsweise bei Butnariu- Ephrat
et al., Clinical Orthopaedics and Related Research, 330: 234–243, 1996
beschrieben zu Chondrozyten zu differenzieren. Andere Quellen, aus
denen sich Chondrozyten erhalten lassen, schließen Hautzellen und pluripotente
Stammzellen ein.
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Die
Chrondrozyten können
nach einem beliebigen Standardverfahren auf das Gerüst gesät werden.
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Geeignete
Wachstumsbedingungen und Medien für Zellen in Kultur sind im
Stand der Technik gut bekannt. Zellkulturmedien enthalten typischerweise essentielle
Komponenten, können
jedoch gegebenenfalls auch zusätzliche
Elemente (beispielsweise Wachstumsfaktoren, Salze und Mineralien)
enthalten, die dem Wachstum und der Differenzierung bestimmter Zelltypen
angepasst werden können.
Bei der bevorzugten Ausführungsform
wurden Zell-Polymer-Konstruktionen in HAMMs F12 Medium (Gibco; New
York, NY, USA), das 10 % fötales
Rinderserum mit L-Glutamin
(292 μg/ml),
Penicillin (100 μg/ml)
und Ascorbinsäure
(50 μg/ml)
enthielt, suspendiert. Es können
auch andere Medien verwendet werden. Beispielsweise "Standardzellwachstumsmedien" einschließlich Dulbecco's Modified Eagles
Medium mit niedrigem Glucosegehalt (DMEM) mit 110 mg/l Pyruvat und
Glutamin, ergänzt
mit 10–20
% fötalem
Rinderserum (FBS) oder 10–20
% Kälberserum
(CS) und 100 E/ml Penicillin. Andere Standardmedien schließen Basal
Medium Eagle, Minimal Essential Media, Mc Coy's 5A Medium und dergleichen ein, die vorzugsweise
wie oben ergänzt
sind (im Handel erhältlich
beispielsweise von JRH Biosciences, Lenexa, KS; GIBCO, BRL, Grand
Island, NY, USA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).
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Die
mit Zellen besäte
Konstruktion kann zur Bildung von Stents durch Tissue-Engineering
in einen Bioreaktor gegeben oder direkt eingepflanzt werden. Man
kann einen Bioreaktor verwenden, der eine Wachstumskammer mit einem
Substrat enthält,
an dem die Chondrozyten angeheftet werden, und Vorrichtungen zum
Ausführen
einer relativen Bewegung zwischen einem flüssigen Kulturmedium und dem Substrat,
so dass Scherströmungsstress
ausgeübt werden
kann. Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 5,928,945. Der Bioreaktor
funktioniert, indem auf die in einer Wachstumskammer befindlichen
Zellen ein Scherströmungsstress
ausgeübt
wird, wodurch als Reaktion auf die durch eine Pumpe ausgeübte Kraft
ein kontinuierlicher Fluss von flüssigem Wachstumsmedium aus
dem Reservoir mit dem Medium durch die Wachstumskammer und zurück ins Reservoir
ermöglicht
wird. Falls gewünscht
kann der Bioreaktor die Vorrichtung Druckveränderungen aussetzen.
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Der
mittels Tissue-Engineering gebildete Stent wird unter Anwendung
von chirurgischen Standardverfahren operativ eingepflanzt.
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Es
versteht sich, dass, während
die Erfindung in Verbindung mit bevorzugten spezifischen Ausführungsformen
davon beschrieben wurde, die obige Beschreibung sowie die folgenden
Beispiele den Umfang der Erfindung erläutern, jedoch nicht einschränken sollen.
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BEISPIELE
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Polymer-Stent-Konstruktion
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Die
zylindrischen Konstruktionen wurden aus Gittergelegen (Dicke 2 mm)
aus PGA-Fasern gebildet (2A). Sechzehn
französiche
Foley-Katheter aus Silikon (Bard, Covington, GA, USA) wurden jeweils
einmal (360°)
mit den PGA-Blättern
umwickelt. Die Konstruktionen wurden mit einer 50:50 Lösung von
Polymilch-co-glykolsäure
(PLGA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) in Chloroform besprüht, so dass die
Kanten des PGA-Gitters verklebt und die umlaufende Form des Katheters
aufrechterhalten wurde. Die Konstruktionen waren 10 mm lang, mit
einem Innendurchmesser von 5 mm und einem Außendurchmesser von 9 mm (3A).
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Ernten und
Säen der
Zellen
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Gelenkflächenknorpel
wurde unter sterilen Bedingungen aus den Schultern von innerhalb
von 8 h nach dem Schlachten aus einem örtlichen Schlachthaus erhaltenen,
2–3 Wochen
alten Rinderkälbern
geerntet. Chondrozyten wurden durch Verdauen mit Kollagenase Typ
II (Worthington; Freehold NJ, USA) isoliert und in Suspension konzentriert.8 40 PGA-PLGA-Konstruktionen wurden mit Chondrozyten
in einer Dichte von 60 × 106 Zellen/cm3 besät. Die Zell-Polymer-Konstruktionen
wurden 4 Stunden lang in vitro (37°, 5 % CO2)
inkubiert, um es den Chondrozyten zu ermöglichen, sich an die Matrix
anzuheften.
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In-vivo-Implantation
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Alle
Arbeitsschritte wurden gemäß den Vorschriften
des Children's Hospital
Animal Care Committee durchgeführt.
Zwanzig mit Zellen besäte
Konstruktionen wurden unmittelbar nach dem Besäen in den subkutanen Raum von
8 Wochen alten Nacktmäusen
(Jackson Laboratories; Bar Harbor, ME, USA) eingepflanzt. 4 bzw.
10 Wochen nach der Implantation wurden die Mäuse für Untersuchungen getötet.
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In-vitro-Bioreaktorsystem
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Zwanzig
Zell-Polymer-Konstruktionen wurden in HAMMs F12 Medium (Gibco; New
York, NY, USA), das 10 % fötales
Rinderserum mit L-Glutamin (292 μg/ml),
Penicillin (100 μg/ml)
und Ascorbinsäure (50 μg/ml) enthielt,
suspendiert. Fünf
Tage nach dem Säen
wurden die Zell-Polymer- Konstruktionen,
die in einem Inkubator (37°,
5 % CO2) unter statischen Bedingungen gehalten
worden waren, in einem Bioreaktorsystem frei suspendiert. Fünf Konstruktionen wurden
in jeweils magnetisch gerührte
Spinnerkolben (Belico Glass, Vineland, NJ, USA) gegeben. Das Medium
(150 ml) wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht. Der Gasaustausch
erfolgte über
gelöste
Seitenarmkappen.9
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Analytische
Assays
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Vier
bzw. 10 Wochen nach dem Aussäen
der Zellen wurden die Zell-Polymer-Konstruktionen
sowohl aus dem subkutanen Raum der Nacktmäuse als auch aus den Bioreaktoren
entnommen. Das Brutto-Nassgewicht
der Zell-Polymer-Konstruktionen wurde bestimmt. Für die histologische
Analyse wurden Proben mit 10 %igem gepuffertem Formalin (Fisher
Scientific) fixiert und in Paraffin eingebettet, und es wurden Schnitte
angefertigt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin, mit Safranin
O auf Glycosaminoglycane (GAG), mit Alcian Blau auf Chondroitinsulfate
und mit Massons Trichrom auf quervernetztes Kollagen angefärbt.
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Zur
Bestimmung des Kollagengehalts wurde der Sircol-Kollagenassay (Bicolor;
Belfast, Nordirland) angewendet. Kurz gesagt wurden 10 mg Gewebe
(von jedem Zeitpunkt 3 Stents; aus jedem Stent 2 Probent) in 10
mg Pepsin und 0,5 ml 0,5 M Essigsäure in einem Schüttler bei
4°C 24 h
suspendiert. Die Pepsin-Gewebe-Suspensionen wurden jeweils einer Reihenverdünnung mit
Essigsäure
unterzogen. Reihenverdünnungen
eines Kollagenstandards in Essigsäure dienten als Referenzkurve
für die
Kollagenkonzentration. Alle Standard- und Pepsin-Gewebe-Verdünnungen
wurden mit Farbstoff gemischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Die Pellets wurden mit 0,5 ml Ethanol gewaschen und
mit 1 ml Alkalireagens versetzt. Die Werte wurden mit einem Spektrophotometer
(Milton Roy; Rochester, NY, USA) bei 540 nm abgelesen. Essigsäure und
Alkalireagentien alleine dienten als Kontrollen.
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Zur
Bestimmung der Verteilung der Chondrozyten in den Polymergerüsten vor
dem Einpflanzen und 4 bzw. 10 Wochen nach dem Einpflanzen wurden
Aufnahmen mit dem Rasterelektronenmikroskop angefertigt. Die Proben
wurden in 1 %igem (v/v) gepuffertem Glutaraldehyd und 0,1 %igem
(v/v) gepuffertem Formaldehyd 30 Minuten bzw. 24 Stunden lang fixiert,
mit einer abgestuften Ethanolreihe entwässert und an der Luft getrocknet.
Die getrockneten Proben wurden auf Aluminiumträger aufgebracht und mit Gold
sprühbeschichtet.
Für die
Aufnahme von Bildern wurde ein Rasterelektronenmikroskop (JOEL, Modell
JSM-35, Peabody, MA, USA) mit einer Spannung von 25 kV betrieben.
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Die
mechanischen Komprimiereigenschaften des röhrenförmigen Knorpels (n=3) wurden
4 bzw. 10 Wochen nach dem Säen
der Zellen mit einem mechanischen Testgerät (Modell 5542, Instroncorp.,
Canton, MA, USA) untersucht. Verwendet wurde eine Druckmessdose
mit einem Maximum von 500 Newton. Die Längsachse von Proben wurde mit einer
Druckfinnengeschwindigkeit von 0,5 Zoll/min komprimiert, bis 80
% der ursprünglichen
Dicke erreicht waren, und dann wurde mit der gleichen Geschwindigkeit
auf die Originaldicke entspannt. Das Kompressionsmodul erhielt man
aus der Steigung des anfänglichen
linearen Abschnitts der Auftragung von Stress gegen Verformung unter
Belastung (stress-strain curve).
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ERGEBNISSE
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Die
Aufnahmen mit dem Rasterelektronenmikroskop, die 3 Tage nach dem
Aussäen
der Zellen auf den PGA-Matrizen aufgenommen wurden, zeigten eine
gleichmäßige Verteilung
der Chondrozyten über
das gesamte Gerüst
(2B). Alle Knorpelstents, die 4 bzw. 10 Wochen
nach dem Säen
der Zellen aus dem subkutanen Raum der athymischen Mäuse bzw.
aus den Bioreaktoren entnommenen worden waren, zeigten allgemein
gesagt ein fest und glänzend
aussehendes Knorpelgewebe, ohne dass der Knorpel in die Region des
Lumens hineingewachsen war (3B). Vier
Wochen nach dem Besäen mit
den Zellen hatten die in vitro und in vivo hergestellten Konstruktionen
ein mittleres Nassgewicht von 0,42 Gramm beziehungsweise 0,71 Gramm. Zehn
Wochen nach dem Besäen
mit den Zellen hatten die in vitro und in vivo hergestellten Konstruktionen
ein mittleres Nassgewicht von 0,53 Gramm beziehungsweise 0,97 Gramm.
Es wurde eine Zunahme beim mittleren Nassgewicht zwischen der Bestimmung
nach 4 Wochen und der Bestimmung nach 10 Wochen festgestellt, und
zwar von 26 % bei den in-vitro-Konstruktionen und von 37 % bei den
in-vivo-Konstruktionen. Die histologischen Analysen aller Konstruktionen
mit Hämatoxylin
und Eosin nach 4 Wochen zeigten eine gleichmäßige Verteilung der Chondrozyten
auf den PGA-Fasern. Nach 10 Wochen konnte eine Zunahme bei der Ablagerung
von extrazellulärer
Matrix ohne verbliebene PGA-Fasern beobachtet werden. Diese Befunde
wurden mit dem Rasterelektronenmikorskop bestätigt. Der durch Massons Trichrom
nachgewiesene Gehalt an quervernetztem Kollagen war zu beiden Zeitpunkten
bei den in-vivo-Explantaten höher
als bei den Bioreaktorproben (5A und 5B).
Mit Safranin O und Alcian Blue wurde die Abscheidung von GAG und
Chondroitinsulfat bei allen experimentellen Gruppen bestätigt. Bei
den in-vivo-Gruppen wurde zu beiden Zeitpunkten eine höhere Ablagerung
von Kollagen und GAG beobachtet (5C–5F).
-
Aus
dem durch den biochemischen Sircol-Assay bestimmten Kollagengehalt
geht hervor, dass die in vitro kultivierten Konstruktionen einen durchschnittlichen
Kollagenanteil in der Zusammensetzung von 3,6 (Standardabweichung ± 0,22
%) des Gesamtgewichts nach 4 Wochen und von 7 % (Standardabweichung ± 0,41
%) nach 10 Wochen (6) halten. Die in vitro kultivierten
Konstruktionen wiesen in der Zusammensetzung einen durchschnittlichen Kollagenanteil
von 4 (Standardabweichung ± 0,33
%) nach 4 Wochen und 12,4 (Standardabweichung ± 0,91 %) nach 10 Wochen auf
(6).
-
Die
mechanische Untersuchung ergab, dass die Knorpelzylinder in beiden
Gruppen sehr elastisch waren und hohen Drücken widerstehen konnten. Die auf
bis zu 80 % ihrer ursprüngliche
Dicke zusammengedrückten
Knorpelstents nahmen beim Entspannen wieder ihren ursprünglichen
Zustand an. Die zum Verringern des Durchmessers der hergestellten
Konstrukte um 20 % erforderlichen Kompressionskräfte waren zu allen Zeitpunkten
bei den in-vivo-Proben höher
als bei den in-vitro-Proben (4 Wochen: 0,101 ± 0,27 kgf gegenüber 0,050 ± 0,013
kgf; 10 Wochen: 0,570 ± 0,070
kgf gegenüber
0,115 ± 0,017
kgf; 7 und 8).
Die in vivo hergestellten Knorpelzylinder zeigten nach 4 Wochen
beziehungsweise 10 Wochen verglichen mit den in vitro hergestellten
eine 2fach höhere
Steifigkeit (0,007 ± 0,03
kgf gegenüber
0,014 ± 0,003
kgf; 0,015 ± 0,001
kgf gegenüber
0,07 ± 0,008kgf).
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