KR101054725B1 - 세포외기질 성분을 함유하는 노화조절용 조성물 및 이를이용한 노화세포의 노화조절방법 - Google Patents

Abstract

세포외기질 성분을 함유하는 노화조절용 조성물 및 이를 이용한 노화세포의 노화조절방법에 관한 것이다. 본 발명의 노화조절용 조성물 및 노화조절방법은 이미 노화된 노화세포의 생물학적 기능이 회복되는 효과가 있었으며, 노화가 진행되면서 감소된 세포막 단백질인 인테그린 알파 v의 발현양은 젊은 세포외기질에 의해 회복된 노화세포에서 다시 증가하였다. 그러나 siRNA와 항체를 이용해서 인테그린 알파 v의 발현양을 인위적으로 감소시켰을 때, 노화세포는 젊은 세포에서 추출된 세포외기질에 의해 회복되지 않았다.

인간 섬유아세포, 세포외기질, 인테그린 알파 v, 생물학적 기능 회복, 노화 조절

Description

세포외기질 성분을 함유하는 노화조절용 조성물 및 이를 이용한 노화세포의 노화조절방법{Restoration of cellular senescence by alteration of cell to matrix interaction and Restoration}

세포외기질 성분을 함유하는 노화조절용 조성물 및 이를 이용한 노화세포의 노화조절방법에 관한 것이다.

인간 섬유아세포는 일정수의 세포 분열 후에 더 이상 분열을 하지 않는 노화세포 단계로 간다 (1-5). 이렇게 노화된 세포는 다양한 변화를 가지고 온다. 노화세포의 다양한 변화는 예를 들어, 세포주기를 방어하는 분자들의 증가 (6-8), 형태의 변화 (9-10), 노화세포 마커인 베타갈락토시다아제의 증가 (11), 산화적 손상의 축적, 성장을 자극하는 요소에 대한 반응성 감소 (12), 세포사멸에 대한 저항성 증가(9) 등이 이에 속하며, 이러한 변화가 축적되어 기능이 감소되며, 노화가 진행된다.

세포는 추출되는 세포외기질과 같은 환경적 요소에 의해서 세포 자신뿐 아니 라 주위 세포에도 영향을 준다. 세포외기질은 콜라겐, 엘라스틴 그리고 프로테오글라이칸 등으로 구성되어있다. 세포외기질은 조직의 세포 구성과 세포의 다양한 활성에 영향을 준다. 세포외기질의 구성성분들은 노화가 진행되는 동안 (13) 및 제2형 당뇨병, 워너 신드롬과 같은 노화 관련 질병에 따라 변화를 가져오는 것으로 알려져 있다 (14, 15). 노화세포에서 분비된 수용적, 비수용적 요소는 노화된 생물의 암화에 관여하는 것으로 보여진다 (16). 이렇게 활성화된 세포외기질은 세포의 운명에 영향을 준다. 또한, 노화 섬유아세포에서 추출된 요소는 상피세포의 성장과 암화에 영향을 준다 (17). 하지만 젊은 세포와 노화된 세포의 운명에 주는 영향에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다.

세포와 세포외기질의 관계는 세포와 결합 수용체 중 하나인 인테그린에 의해서 조절된다. 인테그린 조절에 의한 세포와 세포외기질은 세포의 성장, 이동, 손상 그리고 생존에 영향을 미친다 (18). 인테그린은 18개의 알파 체인과 8개의 베타체인으로 구성되어 있으며, 이들의 다양한 결합에 의해서 서로 다른 24개의 인테그린을 구성하게 된다. 이렇게 형성된 여러 종류의 인테그린은 세포 별 결합 특이성을 가진다 (19). 이들 중 인테그린 알파 v는 파이브로넥틴과 비트로넥틴 세포외기질에 결합하여 암의 형성에 중요 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (20). 최근 연구에 의하면 인테그린 알파 v는 흑색종이나 유방암과 같은 암의 성장과 손상에 큰 영향을 주는 것으로 알려져 있다 (21, 22).

이에, 본 발명자들은 노화를 조절 할 수 있는 인자를 찾기 위해 예의 노력하던 중, 노화된 인간 섬유아세포에서 추출된 세포외기질에 의해 세포의 기능적 소실과 구조적 변화를 일으킬 뿐만 아니라, 젊은 세포에서 추출한 세포외기질성분에 의해서는 이미 노화가 진행된 노화세포의 기능이 회복되는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 기술적 과제는 세포외기질 성분을 함유하는 노화조절용 조성물을 제공하는데 있다.

또한 상기 조성물을 이용한 노화조절방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 과제 및 이점은 첨부된 청구범위 및 도면과 함께 하기된 상세한 기재에 의해 보다 명확하게 된다.

또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 하나의 양태에 따르면, 세포외기질 성분을 함유하는 노화조절용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "노화 (senescene)"는 노화 (aging)와 동일한 의미를 갖는다. 따라서 "노화조절"은 노화현상을 조절하는 모든 현상을 의미한다. 구체적인 예시로서, 노화 세포의 생물학적 기능이 회복되어 젊은 세포와 유사한 생물학적 현상을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 조성물에 의해 처리된 노화 세포는 EGF (Epithelial growth factor) 와 같은 성장인자에 대한 반응성이 회복되어 성장인자에 의한 신호 전달이 회복되며, 세포순환 (cell cycle)이 정상적으로 가동하게 된다. 또한 노화를 가속화 또는 유도하는 현상도 포함된다. 예를 들어, 노화를 유도하여, 세포분열횟수를 느리게 하게하거나, 노화세포와 유사한 생물학적 현상을 나타내게 하는 것을 포함한다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 젊은 세포의 세포외기질 함유한 배지에서 배양한 세포의 분열능력 회복 또는 노화회복을 분석할 수 있다. 더 상세하게는, 인간 섬유아세포의 젊은 세포 및 노화세포를 혈청이 없는 배지가 담긴 배양접시에서 2-3일 동안 배양한 후, 세포만 제거하여 세포외기질을 얻고, 젊은 세포 또는 노화세포의 세포외기질성분이 포함된 각각의 배양접시에 젊은 세포 또는 노화세포를 시딩 (seeding)하여, '젊은 세포의 세포외기질함유 배지+ 젊은 세포, 노화 세포의 세포외기질함유 배지+ 젊은 세포, 노화세포의 세포외기질함유 배지+ 노화 세포, 노화 세포의 세포외기질함유 배지+ 노화세포'의 총 4그룹의 조건으로 세포를 키운 다음 각각 세포의 성장을 관찰하고 분석하여 분열능력 회복 또는 노화회복 여부를 분석할 수 있으며, 세포외기질이 함유된 배지 즉 조성물이 세포의 노화를 조절함을 증명할 수 있다. 또한, 군체 형성법 (soft agar assay) 수행을 통하여, 노화세포의 회복된 분열능력이 정상세포의 암적 변형에 의한 것인지 정상적인 분열능력이 회복된 것임을 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 세포외기질 성분을 함유하는 조성물에 의한 노화조절은, 노화세포의 마커로 잘 알려진 베타 갈락토시다아제 반응, 활성화 산소도, F-액틴염색정도, 노화세포의 세포분열 제어로 알려진 세포주기를 방어 분자 p21^Waf1 및 p16^INK4a의 양적변화, 세포주기 관련 단백질인 케베올린 발현양 변화 및 세포외기질인 파이브로넥틴과 결합자인 인테그린 알파 v의 발현양 및 결합도 등을 분석하여 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현에에 따르면, 인간 섬유아세포는 노화되면서 생산하는 세포외기질 성분에 의해 세포의 기능적 소실과 구조적 변화를 일으킨다. 또한 이와 같은 노화세포를 젊은 세포 유래의 세포외기질 성분이 함유된 배지에서 배양시 세포의 분열능력이 젊은 세포의 분열능력만큼 회복되고, 심지어 생리적 기능도 젊은 세포와 유사하게 변화한다. 이때, 노화세포에서는 세포외기질 성분 중 파이브로넥틴 또는 비트로넥틴 등과 결합하는 세포막 단백질의 일종인 인테그린 알파 v의 발현양이 감소되나, 젊은세포의 세포외기질 성분에 의해 회복된다. 그러나, 인테그린 알파 v에 대한 siRNA 또는 항체에 의해서 인테그린 알파 v의 발현양 및 활성정도를 인위적으로 감소시키면, 노화세포에서 분열능력 또는 노화가 회복되지 않는다.

따라서, 본 발명의 특징은 노화조절용 조성물로서, 세포외기질 성분을 함유하는데 있다.

본 발명에 있어서, 노화의 대상은 포유동물이다.

본 발명의 적합한 세포외기질 성분은 포유동물의 세포를 배양하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 포유동물로부터 유래하는 섬유아세포로 부터 얻을 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 유래하는 섬유아세포를 배양하여 얻을 수 있다.

또한 상기 세포외기질성분은 젊은 세포 및 늙은 세포로부터 유래하는 성분을 모두 포함하나, 특히 젊은 세포로부터 유래된 것이 가장 바람직하다. 바람직한 구현예의 결과에 따르면, 젊은 세포를 배양하여 얻은 세포외기질성분이 함유된 배양접시에 성장이 거의 멈춘 노화세포를 배양하면, 노화세포의 형태 및 성질(예를 들어 분열능력 등)이 젊은 세포의 형태 및 성질로 회복된다.

본 발명에 있어, 상기 노화조절용 조성물은 세포를 배양하는 배양배지에 혼합하여 사용하는 것이 바람직하며, 상기 세포외기질 성분 이외에 다른 성분을 추가로 혼합할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 노화조절용 조성물에 인테그린 알파 v에 대한 siRNA 또는 항체를 추가함으로써 노화세포의 생물학적 기능 회복을 억제하였다. 이러한 결과는, 노화세포의 생물학적 기능의 회복에 인테그린 알파 v의 관련성을 강력하게 시사하는 것이다.

따라서, 본 발명은 인테그린 알파 v의 DNA, RNA 또는 단백질에 결합하여 인테그린 알파 v의 발현 및 활성을 억제하는 물질 예컨대, 인테그린 알파 v의 mRNA에 상보적인 서열을 가지며 인테그린 알파 v의 발현을 억제하는 이중가닥 siRNA 및 세포막에 존재하는 인테그린 알파 v와 결합함으로써 인테그린 알파 v의 활성을 억제하는 인테그린 알파 v에 대한 항체, 리간드(길항제) 및 저해제 중 어느 하나를 포함하는 노화조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 화장료 제형, 약학적 제형 및 건강보조식품 또는 드링크제의 제형으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우에는 상기 유효성분인 뎁손 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산 화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우에는, 뎁손 이외에 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이에는 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 본 발명의 조성물은 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기 위해서 적정량의 염 및 PH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 유효성분이 효과적으로 작용하게하기 위해서 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함하여 투여할 수 있다.

적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있으며, 일일에 단회 수 회 나누어서 투여량을 결정할 수도 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 세포외기질 성분을 함유하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 노화조절방법을 제공한다.

또한, 인테그린 알파 v에 대한 siRNA, 항체, 리간드 (길항제), 또는 저해제를 포함하는 조성물을 대상에 처리하는 단계를 포함하는 노화조절방법을 제공한다.

바람직한 구현 예에 따르면, 세포외기질 성분은 젊은 세포로부터 유래된 것이며, 더욱 바람직하게는 인간의 젊은 세포이며, 가장 바람직하게는 인간의 섬유아세포이다. 또한, 상기 노화조절의 대상은 동물이며, 바람직하게는 포유동물이며, 가장 바람직하게는 인간의 섬유아세포이다.

본 발명의 방법 및 상술한 본 발명의 조성물 가운데, 중복된 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다. 또한 특별히 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.

본 발명은 세포외기질 성분을 함유하는 노화조절용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 조성물을 이용한 노화조절 방법에 관한 것이다. 본 발명의 노화조절용 조성물 및 노화조절방법은 이미 노화된 노화세포의 생물학적 기능이 회복되는 효과가 있었으며, 노화가 진행되면서 감소된 세포막 단백질인 인테그린 알파 v의 발현양은 젊은 세포외기질에 의해 회복된 노화세포에서 다시 증가하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 요지가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예>

실시예 1. 재료 준비: 항체, 시약 그리고 화약약품

실험에 사용된 항체는 아래 표기된 회사에서 구입하였다. 케비올린-1 단일 항체는 BD transductions 사에서 (Palo Alto, CA) 인테그린 알파 v (MAB2021Z), 인테그린 알파(v)베타3 (MAB1976), 인테그린 알파(v)베타5 (MAB1961) 및 인테그린 알파5베타1 (MAB1969) 항체는 Chemicon international사에서 구입하였다. Phospho-Erk 다클론 항체 (sc-7383), Erk-1/2 항체 (sc-94), p53 항체 (sc-126), p21 항체 (sc-6246)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc (SantaCruz, CA)에서 구입하였다. Horseradish peroxidase가 결합된 쥐, 토끼 이차　항체는 Zymed Laboratories. Inc (SanFrancisco,CA) 에서 구입하였다.

Chemiluminescent 확인 시약은 Pierce사 (Rockfor, IL) 에서 구입하였다. β-actin 단일　항체와 과산화수소 (216763) 는 Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였다. DiOC₆ (3,3-diethyloxacarbocyanine) 와 CM-H₂DCFDA(5-(and-6)-chloromethyl-2,7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate,acetylester) 는 Molecular Probes사에서 구입하였다. [methyl-³H]싸이미딘은 Amersham Biosciences사에서 구입하였다.

실시예 2. 세포배양 및 세포외기질 준비

신생 젊은 섬유아세포는 신생아에서 얻었으며, 젊은 인간 섬유아세포는 6살 남자아이의 포피에서 추출하였다. 상기 세포들은 60번 이상 계대배양 하여 노화를 유도하였으며, 계대배양 방법은 일반적인 배양방법으로 시행하였다. 대략적으로 서술하면, 상기 세포를 10　% 소태아 혈청, 100　units/ml 페니실린, 100　ug/ml 스트렙토마이신이 함유된 Dulbecco's modified Eagle의 배지가 담긴 직경 100　mm 배양 접시 및 37　℃, 5　% CO₂조건의 인규베이터에서 배양하였다. 계대배양은 배양 접시 바닥에 세포 점유율이 70-80　%　이상이 되면 0.5　% 트립신-EDTA을 이용하여 세포를 배양접시로부터 분리한 다음 배양배지가 담긴 새로운 배양접시에 옮겼다. 세포의 노화는 DNA 합성도와 베타갈락토시다아제 염색 반응여부로 확인하였다. 이때 세포외기질은 다음의 방법으로 얻었다. 혈청이 없는 배지가 담긴 배양접시에서 세포를 2-3일 동안 키운 후, 배지를 제거한 배양접시를 EDTA로 처리하여 세포를 제거하였다. 그런 다음 배양접시를 깨끗하게 씻어서 배양접시에 부착된 상태의 세포외기질을 얻었다. 이렇게 얻어진 세포외기질이 함유된 배양접시를 4℃에 하루 이상 보관한 후 사용하였다.

실시예 3. 노화 관련 베타 갈락토시다아제 염색, CM-H2DCFDA염색

인간 섬유아세포를 PBS로 씻은 후, 5분 동안 ４　% 파라포름알데하이드로 고정하였다. PBS로 씻은 세포를 베타갈락토시다아제 염색액에 (1　mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal), 40　 mM citric acid/ sodium phosphate-pH 6.0, 5 mM pottassium ferrocyanide, 5 mM pottassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2) 넣고, 37 ℃ 인큐베이터에서 염색시켰다. 그 후 현미경으로 세포의 베타 갈락토시다아제 염색 여부를 확인하였다.

인간 섬유아세포를 70 % 정도 키운 후, 1 uM CM-H2DCF-DA (5-(and-6)-chloromethyl-2,7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate,acetylester)에 넣은 후 37 ℃에 15분 동안 반응시켰다. 그 후 세포를 형광 현미경으로 확인하였다.

실시예 4. 세포 타임 랩스 현미경

세포외기질을 모으기 위해서 Lab-Tek II Chamber Slide w/Cover CC2 Glass Slide Sterile (Nalge Nunc international사) 에 젊은 세포를 혈청 함유되지 않은 배지에 키웠다. 3일 후, 세포를 EDTA로 제거하여 세포외기질을 얻었다. 동일 수의 노화세포를 젊은 세포외기질이 함유된 배양접시에 넣고 현미경 (Olympus 1X81) 으로 10일 동안 관찰하였다. 찍힌 사진을 meta Image Series software (Molecular Devices, ied Biosystems)로 분석하였다.

실시예 5. 면역형광분석

직경 12 mm φ cover glass (Marlenfel GmbH & Co. KG, Germany)에 넣은 세포를 PBS로 씻은 후 4 % 파라포름알데하이드에 10분간 고정하였다. 그리고 세포의 투과를 위해서 0.5 % Triton X-100 용액에서 10분간 처리하였다. 원하지 않은 단백질과의 결합을 방지하기 위해서 2 % bovine serum albumin에서 30분간 처리하였다. PBS로 씻은 세포를 Actin 단일 일차 항체와 반응 시킨 후, 결합하지 않은 단백질은 제거하였다. 세포를 Texas Red (Molecular Probes and Santa Cruz Biotechnology,Inc.) 에 1시간 동안 반응시켜 형광염색을 실시하였다. 핵은 Sigma에서 구입한 형광이 붙은 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 와 결합시켰다. Cover glass를 씻은 후 glass slide를 표본 제작하였다. 제작된 표본은 confocal 현미경으로 분석하였다.

실시예 6. 미토콘드리아 막전위

젊은 인간 섬유아세포와 회복된 노화세포를 각각 3 x 10⁵의 수만큼 직경 100 mm φ 배양접시에 키웠다. H₂O₂를 6시간 동안 처리한 후 세포를 trypsin 으로 모아서 80 nM DiOC₆ (3,3-diethyloxacarbocyanine; Molecularprobes) 와 37 ℃에서 30분 동안 반응하였다. 세포를 500 g로 5분간 모은 후 이렇게 모아진 세포를 배양 배지로 섞은 후 488 nm에서 유세포 분석기로 결과를 얻었다. 한 샘플 당 최소 10000개의 세포를 분석하였다. DiOC₆로 염색된 세포를 channel FL1-H로 확인되었으며, 분석 결과는 Becton Dickinson FACS 를 이용하였다.

실시예 7. 면역분석법

총 세포를 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 mM protease inhibitor cocktail (Roche), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 50mM sodium fluoride (NaF), 0.2 mM sodium vanadate (Na₃VO₄)가 함유된 완충액에 넣어서 용해질을 만들었다. 이렇게 만들어진 용해질을 10 %와 12 % SDS-PAGE로 분리한 후, nitrocellulose 멤브레인에 옮겨서 일차 항체와 4 ℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 일차 항체가 붙은 멤브레인을 조건에 맞게 peroxidase가 결합된 쥐, 토끼 이차항체에 1시간 반응시킨 후, enhanced chemiluminescence detection kit (Pierce Biothechonologies)로 확인하였다.

실시예 8. 싸이미딘 합성

세 번의 실험을 수행할 수 있도록 인간 섬유아세포를 24 well 배양 접시에 80 %가 되도록 키워서 준비하였다. 세포를 모으기 12시간 전에 1 mCi/mL 의 [methyl-3H] 싸이미딘 (2.0Ci/mmol; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) 을 넣어서 반응시켰다. 배지를 제거한 후, 세포를 차가운 PBS로 두 번 씻었다. 씻 어진 세포를 차가운 10 % trichloroacetic acid (TCA) 와 30분 동안 반응한 후, 5분씩 두 번을 똑 같은 방법으로 DNA를 침전시켰다. 한 well당 0.5 N NaOH가 함유된 용해액으로 5분간 반응하여서 세포를 모은 후, 5 mL scintillation liquid에 넣어서 6 N HCl와 잘 섞었다. 기계로 [methyl-3H] 싸이미딘 방사활성을 측정하였다.

실시예 9. 군체 형성법

소프트아가와 하드아가를 만들기 위해서 PBS를 이용하여 2.2 % 아가 용액을 만들었다. 0.75 ml 아가 용액을 10 % 어린 소에서 추출한 혈청, 100 units/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 1.75 ml과 혼합하였다. 혼합한 아가용액은 직경 60-mm φ 배양접시에 넣어서 굳혀 하드아가 층을 만들었다. 0.5 ml 아가용액 및 2 ml DMEM로 제조된 소프트 아가에 1 x 10⁴ 세포를 혼합하여 하드아가층 위에 부어 굳혔다. 이렇게 만들어진 아가는 5 % CO₂ 및 37 ℃ 조건의 인큐베이터에서 12 ± 2 일 동안 배양하면서 세포 배양 상태를 관찰하였다.

실시예 10. 유세포 분석법

젊은 세포와 노화세포를 트립신으로 떼어낸 후 1 % BSA가 함유된 차가운 PBS에 30분 동안 반응하였다. 1 x 10⁵ 수의 세포를 인테그린 알파 v 일차 항체와 1 % BSA가 함유된 PBS와 1:50의 비율로 섞었다. 한 시간 후, 인간 섬유아세포를 1 % BSA가 함유된 PBS로 두 번 씻었다. 씻은 세포를 1 % BSA가 함유된 PBS 100 ul에 PE (PE; phycoerythrin-group, B-phycoerythrin, Molecular Probes) 이차 항체를 넣었다. 분석 결과는 Becton Dickinson FACS 를 이용하였다.

실시예 11. 인테그린 알파 V siRNA 형질도입

Dharmacon Research (Lafayette, CO. USA)에서 구입한 인테그린 알파 v siRNA를 실험에 이용하였다. 주문한 합성 siRNA SMARTpool duplex는 인테그린 알파 v의 mRNA 발현을 방어하였다. 1 x siRNA buffer (diluted from 5 x siRNA buffer - Darmacon product Cat. # B-002000-UB-100)에 녹인 인테그린 알파 v siRNA SMARTpool duplexes를 2 x 10⁴개의 노화세포에 형질도입 시켰다. 형질도입을 위해서 혈청이 함유되지 않은 배지에 oligofectamine^TM (Invitrogen)와 siRNA를 넣은 후, 5 % CO₂가 들어가는 37 ℃에 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 4시간 후, 10 % 혈청이 함유된 배지에 세포를 넣고 24, 48, 72 시간 후 추출하였다.

실시예 12. 유전자 지문분석법

동일양의 DNA를 폴리머레이즈 연쇄 반응을 실시하였다. 폴리머레이즈 연쇄 반응은 AB Gene Amp PCR system 9700 Thermal Cycler (Applied Biosystems) 을 사용하였다. 분석을 통해서 나온 결과는 ABI Data Collection Software and GeneMapperTM 3.2을 이용해서 분석하였다.

<실시예 결과>

1. 젊은 세포에서 얻은 세포외기질의 노화세포 성장 자극

실험에 이용된 세포는 포피 (forskin) 에서 얻은 인간 섬유아세포를 사용하였다. 본 발명자들은 세포의 표현형이 세포외기질에 의해서 변화하는지 여부를 알아보기 위해서, 노화세포를 젊은 세포에서 추출된 세포외기질이 포함된 배지에서 키웠다. 젊은 세포는 계대배양 횟수가 26번 이상을 넘지 않은 세포를 이용했으며, 노화세포는 60번 이상의 계대 배양을 하여 3주 동안 더 이상 분열하지 않는 상태의 세포를 사용하였다. 또한 본 발명자들은 젊은 세포와 노화세포로 부터 세포외기질을 얻기 위해서, 각 세포들을 혈청이 함유되지 않는 배양액에서 3일 동안 배양하였다. 그리고 배양접시에서 세포들을 EDTA를 이용하여 떼어낸 후 (배양접시에 부착된 상태의) 젊은 세포와 노화세포의 세포외기질을 얻었다. 여기에 같은 수의 노화세포를 넣어서 생물학적 변화를 관찰하였다.

일반 배양접시에 함유된 젊은 세포에 비해서 노화세포의 세포외기질이 함유된 배양접시에 넣은 젊은 세포의 성장 속도는 초반에는 세포외기질의 영향 받아서 성장이 느려지는 듯하였다. 하지만 4일이 지난 후, 일반 배양접시에 젊은 세포와 동일한 성장패턴으로 돌아가는 것을 확인하였다 (도 1a, 1b). 노화세포를 젊은세포의 세포외기질이 함유된 배양접시에 넣고 키웠을 때, 7일째에서 노화세포의 형태가 젊은 세포로 변화는 것을 확인하였다. 이렇게 젊은 세포의 형태로 변화한 세포는 성장 속도 역시 빠르게 증가하였다. 하지만 노화세포로부터 얻은 세포외기질이 함유된 배양접시에 넣고 키운 노화세포에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다 (도 1c, 1d).

젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해서 변화한 노화세포가 세포분열을 하는지 여부를 확인하기 위해서, 노화세포를 젊은 세포외기질과 노화 세포외기질이 함유된 배양접시에 넣고 5일 후, 타임랩스를 이용하여 시간 별 변화를 확인하였다. 타임 랩스로 움직이는 세포를 관찰한 결과, 노화세포에서 얻은 세포외기질이 함유된 배양접시에 넣은 노화세포에서는 어떤 변화도 관찰되지 않은 반면, 젊은 세포외기질에 넣은 노화세포는 분열하는 것이 확인되었다 (도 6). 정상 상태의 납작하고 퍼진 모양을 하고 있는 노화세포가 가늘고 길쭉한 형태의 젊은 세포 형태로 변화하였고, 두 개의 딸세포로 분열하였다.

상기의 결과들은, 기존의 분열할 수 없고, 회복이 불가능하다고 알려진 노화세포의 내재하고 있던 본래의 성장능력을, 젊은 세포의 세포외기질이 포함된 배양배지에서 배양함으로써 잠재적인 분열능력을 회복시켜 젊은 세포로 조절할 수 있음을 증명하였다.

2. 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해서 회복된 노화세포의 분열능력

본 발명자들은 노화세포가 세포외기질에 의해서 회복되었을 때 가지는 분열능력이 정상세포의 변형에 의한 것인지 여부를 확인하기 위해서 soft agar assay를 수행하였다. 회복된 노화세포를 soft agar에 넣은 후, 12 ± 2 일 동안 관찰하였다. 실험 대조군으로 사용한 종양세포 Hela 세포는 soft agar 실험에서 2주 후에 군체를 형성하였다. 하지만 회복된 노화세포는 군체를 형성하지 않았다 (도 2a). 또한 이렇게 회복된 노화세포는 20-25번의 계대 배양 후에 노화세포의 전형적인 특징인 성장 속도가 다시 떨어지고 납작한 모양을 가지며 베타 갈락토시다아제에 반응을 보였다. (도 2b, 2c)

상기의 결과는, 회복된 노화세포의 성장 능력 회복은 노화세포의 암적 변형에 의한 것이 아니라는 증명하고 있다.

3. 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해서 회복된 노화세포가 가지는 세포적 형태

젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해서 회복된 노화세포는 정상 젊은 세포가 가지는 특징을 그대로 가지고 있다. 노화세포 여부를 확인하기 위해 노화세포의 마커로 잘 알려진 베타 갈락토시다아제 염색 (첫 번째 패널), CM-H₂DCFDA 염색 (두 번째 패널), F-actin 염색 (세번째 패널)을 통해서 확인할 결과, 회복된 노화세포는 젊은 세포의 특징과 동일함을 알 수 있었다 (도 3a).

본 발명자들의 이전 연구 따르면, 세포가 노화가 진행되면 미토콘드리아 막 전위가 낮아지는 것을 확인하였다 (23). 따라서 이전 문헌의 방법과 동일한 방법으로, 젊은 세포, 노화세포 및 회복된 노화세포에 1.5 mM H2O2를 넣고, 6시간 후에 80 nM DiOC6를 30분간 반응 한 뒤 488 nm 흡광도에서 세포의 생존도를 통해서 미토콘드리아 막 전위를 측정하였다. 그 결과, 회복된 노화세포에 H2O2를 넣은 후의 미토콘드리아 막 전위 값은 젊은 세포의 막 전위 값과 비슷하였다. 하지만 노화세포 에서는 어떠한 반응도 없었다 (도 3b).

세포는 노화가 되면 세포분열을 제어하는 세포주기 방어 분자인 p21Waf1와 p16INK4a들이 증가하는 것으로 알려져 있다 (24, 25). 본 발명자들은 이전 문헌에서 노화가 되면 증가한 케비올린-1은 EGF에 의지하는 성장 활성을 방어하는 것으로 확인하였다 (26). 따라서 세포주기와 성장에 영향을 주는 요소들이 회복된 노화세포에서 어떤 반응을 보이는지 확인하였다. 실험결과 회복된 노화세포에서 p21Waf1,p16INK4a과 케비올린의 단백질의 발현양이 감소되었으며 (도 3c), 젊은 세포와 같이 EGF의 자극을 주었을 때 Erk의 인산화가 일어났다 (도 3d). 앞의 결과들을 통해 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해 노화세포는 젊은 세포로 회복됨을 확인하였다.

4. 세포성장의 활성을 조절하는 인테그린 알파 v

본 발명자들은 젊은 세포와 노화세포의 인테그린 발현도를 유세포 분석기로 비교하였다. 도 4a 및 4b의 결과를 통해서 노화가 진행되면 세포와 직접적으로 결합하는 인테그린 알파 v의 단백질 발현양과 결합도가 감소하는 것을 알 수 있다. 세포외기질인 파이브로넥틴과 결합하고 있는 인테그린 알파5베타1은 노화에 중요인자로 알려져 있다 (28). 따라서 본 발명에서 이용된 세포도 같은 결과를 보이는지 여부를 확인하기 위해서 유세포 분석기를 통해서 확인한 결과, 인간 섬유아세포의 경우 노화세포와 젊은 세포의 인테그린 알파5베타1의 발현도에는 차이가 없었다 (도 4b). 젊은 세포와 노화세포에 항체를 이용해서 인위적으로 인테그린 알파5베타1의 발현양을 줄였을 때, 세포가 배양접시에 부착하지 않았다. 상기 결과를 통해서 파이브로넥틴과 이와 결합하고 있는 인테그린 알파5베타1은 노화여부에 관계없이 인간 섬유아세포에서의 결합자체에 중요한 역할은 한다는 것을 알 수 있다.

세포분열 과정에서 인테그린 알파 v의 정확한 역할을 알기 위해서, 본 발명자들은 젊은 세포에 방어 항체를 넣은 후 3H-싸이미딘 결합도와 세포 수를 측정하였다 (도 4d). 인테그린 알파(v)베타3와 인테그린 알파(v)베타5은 세포분열, 암 형성 그리고 혈관 기능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다 (29). 세포분열 능력을 확인하기 위해서 인테그린 알파(v)베타3와 인테그린 알파(v)베타5 방어 항체를 이용해서 젊은 세포의 세포분열 능력을 확인한 결과 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 두 가지 방어 항체를 동시에 이용했을 때, 세포 분열 능력이 한가지의 방어 항체만 이용했을 때 보다 확연히 감소하였다 (도 4c). 본 실험을 통해서 인간 섬유아세포는 인테그린 알파 v의 방어 항체에 의해 DNA의 합성도와 세포분열 능력 모두 동일하게 떨어진다는 결과를 얻었다.

5. 노화세포의 회복과정에서 인테그린 알파 v의 변화

인테그린 알파 v의 정확한 역할을 알아보기 위해서, 노화세포가 회복되는 과정에서 인테그린 알파 v의 발현 양을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 노화세포를 넣은 후, 날짜 별로 세포를 추출하여 인테그린 알파 v의 발현양을 확인하였다. 재미있게도 젊은 세포외기질에 넣은 노화세포를 1, 2, 3, 10, 14일 후 얻은 세포에서 인테그린 알파 v의 발현양은 젊은 세포에서 발현하 는 양과 동일하였다. 앞 결과를 통해서 젊은 세포외기질에 넣은 노화세포의 경우 형태적으로 젊은 세포로 변화하지 않더라도 인테그린 알파 v의 발현양은 젊은 세포와 동일함을 확인 할 수 있었다 (도 5a).

젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해서 노화세포가 회복될 때 인테그린 알파 v의 역할을 명백화하기 위해서 인위적으로 siRNA와 항체를 이용해서 인테그린 알파 v의 양을 줄여서 세포의 성장 속도와 DNA의 합성도를 확인하였다. 방어 항체를 넣었을 때, 노화세포는 젊은 세포외기질에 의해서 회복되지 않았다 (도 5b, 5c). 한번 더 정확히 명백화 하기 위해서 인테그린 알파 v의 유전자 발현 자체의 조절하기 위해서 siRNA를 이용해서 실험하였다. 실험결과, 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 회복되는 특성을 보이는 노화세포는 인테그린 알파 v 방어 항체와 siRNA을 이용하여 인위적으로 발현양을 줄였을 때는 젊은 세포로 회복되지 않음을 알 수 있었다 (도 5d, 5e, 5f).

<고찰>

인간 섬유아세포는 일정수의 세포분열 후에 변화 불가한 노화상태가 된다. 이렇게 변화된 노화세포는 젊은 세포와 암세포에 비해서 우성의 특성을 가지는 것으로 알려져 있다. 하지만 본 발명자들은 본 연구를 통해서 노화세포가 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해서 젊은 세포로 회복 될 수 있다는 결론을 얻었다. 따라서 기존의 변화 불가하다고 잘 알려진 노화의 개념에 질문을 가지게 되었다.

세포외기질은 세포의 결합과 세포 분열, 암세포와 줄기세포의 생존을 조절하 는 것으로 알려져 있다. 세포외기질 구성원들이 노화과정에서 일어나는 기작에 대해서 알려져 있지 않지만 중요한 요소로 생각된다. 본 연구에서 본 발명자들은 알려지지 않은 세포외기질이 세포의 노화 특징을 변화할 수 있다는 결론을 얻었다. 도 1을 통해서 노화세포는 젊은 세포에서 얻은 세포외기질의 영향을 받아 떨어진 기능이 회복되며, 형태 또한 젊은 세포로 변화 하였다. 하지만 노화세포에서 얻은 세포외기질에 노화세포를 넣었을 때는 어떠한 변화도 없었다. 앞 결과를 통해서 젊은 세포에서 얻은 세포외기질은 세포의 기능 변화에 중요 역할은 한다는 것을 알 수 있었다. 노화세포에서 얻은 세포외기질에 젊은 세포를 넣었을 때는 초반에는 세포 성장에 영향을 미쳤다. 하지만 이 세포의 성장 속도는 4일 안에 대조군으로 이용된 정상 젊은 세포의 성장 속도와 동일하게 회복 되었다. 앞 결과를 통해서 젊은 세포와 노화세포에서 얻은 세포외기질과 그것의 구성원의 특성은 다르다는 것을 추측할 수 있다. 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해 회복된 노화세포가 세포외기질로 이용된 세포가 아니라는 것을 증명하기 위해서 신생아에서 얻은 젊은 세포의 세포외기질에 어린아이에서 얻은 인간 섬유아세포를 넣었다. 실험결과 신생아에서 얻은 젊은 세포의 세포외기질과 어린아이에서 얻은 인간 섬유아세포의 세포외기질은 동일한 효과를 보였다 (도 7a, 7b). 신생아 세포외기질에 의해서 회복된 노화세포가 어린 섬유아세포와 동일 유전자를 가진다는 것을 확인하기 위해 지문분석법을 통해서 확인하였다. 도 7c에서 알 수 있듯이 어린아이에서 얻은 젊은 세포와 그것을 반복적으로 계대배양 한 노화세포, 젊은 세포의 세포외기질에 의해서 회복된 노화세포는 동일한 대립 유전자를 가지고 있었다. 하지만 세포외기질로 이용된 신생 아에서 얻은 세포는 전자와 다른 대립 유전자를 가지고 있었다. 신생아와 젊은 세포에서 얻은 외기질에 의해서 노화 세포가 모두 회복된다는 앞의 실험 결과들을 통해서 종에 관계없이 노화세포는 회복될 수 있음을 확인하였다. 또한, 현미경으로 시간 별 관찰을 통해서 노화세포의 회복을 정확히 확인하였다 (도 6). 유전자 분석법을 통해서 회복된 노화세포의 유전자 패턴을 분석한 결과 젊은 세포와 거의 동일하였다 (도 8). 앞 결과를 통해서 노화세포는 배양 조건의 조절에 따라서 젊은 세포와 동일하게 회복할 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 이전 논문에서 케비올린-1의 조절에 의해서 노화의 기능적, 형태적 회복이 완전하지는 않지만 부분적으로 일어남을 확인했다 (12). 노화세포에서 발현양이 증가된 케비올린-1은 성장 요소의 반응을 제어한다 (26). siRNA를 이용해서 케비올린-1의 발현양을 인위적으로 줄였을 때 노화세포는 성장 요소의 반응도, DNA 합성도가 증가하며 형태가 변화한다. 또한 p53/p21 의지하는 노화의 표현형은 p53을 활성화하지 않았을 때 젊은 세포로 회복된다 (33).

따라서 암 억제유전자로 알려진 케비올린-1과 p53을 노화세포에서 조절했을 때, 암의 활성 가능성 여부를 확인할 필요가 있었다. 본 연구에서 젊은 세포에서 추출된 세포외기질에 의해 회복된 노화세포에서 p53과 세포주기를 방어하는 분자들의 발현양이 감소되었다. 또한 회복된 노화세포가 조절하지 못하는 성장능력을 가지는지 결정하기 위해서 Hela 세포를 대조군으로 이용하여 군체 형성 능력을 확인하였다. 확인결과 회복된 노화세포는 군체 형성이 없었지만 대조군으로 이용된 Hela 세포는 군체를 형성 하였다 (Fig 2a). 회복된 노화세포에서는 베타 갈락토시다아제에 반응하지 않으며, 활성화 산소의 축적이 감소되며, 감소된 F-actin 염색이 증가되었다 (도 3). 또한 유전자 분석을 통해서 회복된 노화 세포와 젊은 세포의 유전자 패턴이 유사함을 확인하였다. 앞 결과들은 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의해서 세포 분열이 증가된 회복된 노화세포는 정상 젊은 세포로 회복됨을 의미한다.

재미있게도 젊은 세포의 형태와 유사한 회복된 노화세포는 몇 번의 계대 배양 후 다시 노화 상태로 돌아갔다. 본 발명자들은 회복된 노화세포의 세포 분열 능력이 20번의 계대 배양 후 형태가 변화하면서 베타갈락토시다아제에 반응을 보이는 노화로 돌아가는 것을 확인하였다 (Fig 2b). 젊은 세포외기질에 의해서 회복되는 노화세포도 비록 다시 노화로 돌아가지만 정상적으로 일어나는 현상이다. 이것은 노화세포의 회복 연구에 있어서 새로운 접근이지지만 현재 기작이 정확히 규명되지 않았으며, 앞으로 밝혀야 할 부분이다. 앞서 말한 연구에서 주요 요소를 밝히기 위해 본 발명자들은 세포외기질과 결합하는 인테그린에 초점을 맞췄다. 그래서 젊은 인간 섬유아세포와 노화된 세포의 인테그린 발현 양을 비교하였다.

인테그린은 알파와 베타 체인으로 구성되어 있는 세포외기질과 결합하는 세포막에 존재하는 수용체로써 세포뼈대를 구성하며, 세포 안의 신호전달로 생존, 성장, 분화 그리고 운동을 조절한다. 본 실험을 통해서 본 발명자들은 노화가 되면서 인테그린 알파 v 가 감소되었으며, 젊은 세포와 젊은 세포에서 추출된 세포외기질에 의해서 회복된 노화세포에서 세포 성장을 조절하는데 중요 역할을 하는 것으로 확인되었다 (도 4, 도 5). 앞 결과들을 바탕으로 젊은 세포의 세포외기질에 결합하는 인테그린 알파 v가 노화세포의 생리학적, 세포 분열의 회복을 자극하도록 하는 역할을 하는 것으로 추측하였다.

인테그린 알파 v는 인테그린의 구성원으로 분화에 중요역할을 하는 것으로 알려져 있다. 인테그린 알파 v가 없는 쥐는 태어난 지 얼마 지나지 않아 죽는 현상을 보이며 인테그린 알파 v가 knock out된 경우 뇌를 포함하여 비정상적 배야 형성, 장 혈관 형성에 문제를 보이는 것으로 알려져 있다 (34). 우리 연구를 통해서 인테그린 알파 v는 젊은 세포에서 추출된 세포외기질의 영향을 받아 노화세포가 회복되는데 중요 역할을 하는 것으로 생각된다. 이 결과는 인테그린 알파 v와 세포 성장의 신호전달에 관여하는 세포외기질의 새로운 기능과 효과를 밝히는 연구가 될 수 있다.

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도 1은 세포외기질에 의존한 젊은 세포와 노화 세포의 성장능력에 관한 것으로, 젊은 세포에서 추출한 세포외기질과 노화 세포에서 추출된 세포외기질에 젊은 세포를 배양한 후 7일 동안 관찰하였다. a, 노화 세포외기질과 젊은 세포외기질에 넣은 젊은 세포를 명시되어 있는 날짜별로 현미경을 이용하여 관찰하였다. b, a의 세포 수를 비교하였다. c, 젊은 세포에서 얻은 세포외기질과 노화 세포에서 얻은 세포외기질에 노화 세포를 넣은 후, 현미경으로 관찰하였다. d, c의 세포 수를 비교하였다. Y = 젊은 세포; O = 노화 세포; Y-ECM = 젊은 세포에서 추출된 세포외기질; O-ECM = 노화 세포에서 추출된 세포외기질

도 2는 젊은 세포외기질에 의한 노화세포의 성장 능력과 효과를 나타낸 것으로, a, 힐라 (암세포), 젊은 세포, 노화 세포 그리고 젊은 세포외기질에 의해 회복된 노화 세포를 이용해서 군체 형성 반응 실험을 하였다. 막대 그래프는 평균 군체 개수를 나타낸 것이다. 별표로 표시한 것은 Studnet's t test에 의한 P < 0.01 를 나타낸다. b, 젊은 세포외기질과 노화 세포외기질에 넣은 노화 세포의 성장곡선을 나타낸다. c, 젊은 세포, 노화 세포, 회복된 노화 세포, 회복된 노화세포가 노화된 세포의 베타 갈락토시다아제 염색결과를 나타낸다. P = 계대배양; OR = 회복된 노화세포; ORS = 회복된 노화세포가 노화된 세포

도 3은 회복된 노화세포의 특징을 나타낸 것으로, a, 베타 갈락토시다아제 염색 (첫번째 패널), CM-H2DCF-DA 염색 (두번째 패널), DAPI, F-actin 염색 (세번째 패널) 결과를 나타낸다. b, 젊은 세포, 노화 세포, 회복된 노화 세포에서 막 전위도를 측정하였다 (검정색, 혈청과 항생제가 함유되지 않은 미디어; 빨간색, H2O2 함유된 미디어) c, 젊은 세포, 노화 세포, 회복된 노화세포에서 p21, p16 그리고 케비올린의 발현양을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. d, 100 ng/ml의 EGF를 30분간 처리한 젊은 세포, 노화 세포, 회복된 노화세포에서 인산화된 Erk의 단백질 발현 양을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. CM-H2DCF-DA =5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate, acetylester

도 4는 젊은 세포와 노화 세포의 인테그린 발현도를 나타낸 것으로, a, 젊은 세포와 노화 세포의 인테그린 발현도를 유세포 분석법을 통해서 비교했다. (검정색, 젊은 세포; 파란색, 인테그린 항체 결합된 젊은 세포; 빨간색, 노화 세포; 초록색, 인테그린 항체 결합된 노화 세포) b, 알파(v)베타3, 알파(v)베타5, 알파 v 그리고 알파5베타1 항체를 이용해서 젊은 세포와 노화 세포의 발현 양을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. c, d, 인테그린 항체를 젊은 세포와 노화 세포에 넣은 후 세포 수와 DNA 합성정도를 측정하였다. 막대그래프는 ANOVA 프로그램을 이용했으며, 별표 표시는 P < 0.01 을 나타낸다. Con = 대조군; avb3 = 인테그린 알파(v)베타3 항체; avb5 = 인테그린 알파(v)베타5 항체; avb3 + avb5 = 알파(v)베타3 항체와 인테그린 알파(v)베타5 항체를 모두 넣은 것; a5b1 = 인테그린 알파5베타1 항체.

도 5는 젊은 세포외기질에 넣은 노화세포가 회복되는 과정에서 인테그린 알파 v의 발현을 나타낸 것으로, a, 젊은 세포외기질에 넣은 노화세포의 인테그린 알파 v 발현 양을 시간대 별로 웨스턴 블랏팅으로 비교하였다. b, 다른 조건 (노화 세포외 기질의 노화세포, 젊은 세포외기질의 노화세포, 젊은 세포외기질 위의 인테그린 알파 v 항체를 넣은 노화세포) 에 있는 노화세포의 b, 세포수와 c, DNA 합성도를 측정하였다. d, 인테그린 알파 v siRNA를 넣은 젊은 세포를 웨스턴 블랏팅으로 확인 한 후, 그 조건에 따라 노화세포에 넣은 후, 젊은 세포외기질이 함유된 배양접시에 배양했다. 10일 후에 회복되는 노화세포의 e, 세포수와 f, DNA 합성도를 측정하였다. 막대그래프는 평균치를 나타내며, 오류선은 표준편차를 나타낸다. 별표 표시가 된 것은 student t test에 따라 P < 0.01 인 것을 표시하였다.

도 6은 타임 랩스를 이용한 세포 이미지를 나타낸 것으로, a, 젊은 세포 외기질에 있는 노화세포와 b, 노화 세포외기질에 있는 노화세포를 타임랩스를 통해서 비교하였다. c, 젊은 세포외 기질에 있는 노화세포를 시간별로 스냅 사진으로 나타내었다.

도 7은 다른 개체의 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의한 노화세포의 회복을 나타낸 것으로, 노화 세포를 기존의 방법대로 다른 개체에서 얻은 젊은 세포외기질에 넣었다. a, 세포의 변화를 현미경으로 관찰하였다. b, 노화세포와 동일한 개체에서 얻어진 젊은 세포외기질과 다른 개체에서 온 젊은 세포외기질에 의한 노 화세포의 수명을 현미경으로 관찰하였다.

도 8은 다른 개체의 젊은 세포에서 얻은 세포외기질에 의한 노화세포의 회복을 나타낸 것으로, 젊은 세포, 노화 세포, 회복된 노화세포 그리고 다른 개체에서 온 젊은 세포를 유전자 지문 분석법을 통해서 15개의 STR loci 를 비교한 결과이다. (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA) O = 6살 어린 남자 아이의 포피에서 얻은 상피세포를 계대배양 해서 얻은 노화 세포; DY-ECM =; 신생아의 포피 세포에 의해서 얻어진 세포외기질

도 9는 유전자 비교의 결과를 나타낸 것으로서, 젊은 세포, 노화 세포, 회복된 노화 세포 그리고 다시 노화된 회복 노화세포를 CodeLink Bioarray (uniset Human 20K) 를 이용해서 유전자를 비교하였다. 측정된 Global M 값으로 표기했으며, (-) 는 젊은 세포를 기준으로 했을 때 감소된 유전자를 나타내며, (+) 는 젊은 세포를 기준으로 했을 때 증가된 유전자를 나타낸다.

Claims (14)

1. 계대배양 횟수가 26번 미만의 젊은 섬유아세포 유래의 세포외기질 성분을 함유하는, 노화 섬유아세포의 노화조절용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 세포외기질은 세포 배양을 통하여 수득되는 것을 특징으로 하는 노화조절용 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 세포는 포유동물로부터 유래하는 것임을 특징으로 하는 노화조절용 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 세포는 인간의 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 노화조절용 조성물.
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물에 인테그린 알파 v에 대한 siRNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노화조절용 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물에 인테그린 알파 v에 대한 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노화조절용 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 노화조절용 조성물.
9. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 노화조절용 조성물.
10. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 건강보조식품 또는 드링크제인 것을 특징으로 하는 노화조절용 조성물.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제

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