CN111849865A - 3d多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，旨在为类器官生长提供合适的立体空间微环境，促进类器官在立体空间内的延伸生长，并增强其应用灵活性。本发明构建的培养体系中多孔聚乳酸支架的中的孔径范围均一可控，孔隙间相互贯通，对小肠类器官的生物相容性良好，能够促使类器官在其中保持完整的生长形态以及较好的增殖状态。本发明所提供的3D多孔聚乳酸生物材料基质中培养类器官的方法可望应用于生物医药、再生医学及组织工程等生物医学领域。

Description

3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及了一种3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法。
背景技术
现阶段科学研究大多使用细胞模型与动物模型，然而大量的实验研究发现上述两种模型存在一定的弊端。一方面细胞模型无法模拟机体内多种细胞复杂的相关作用，另一方面动物模型与人存在物种差异不能完全直观地反映人类机体变化，这在某种程度上限制了生物医学的发展。
类器官(organoid)模型的出现为弥补上述不足带来了可能，类器官是将组织干细胞在体外进行培养，保持原始干细胞功能并不断分裂分化形成在空间和结构与来源器官组织、基因、结构和功能相似的微组织。与现有二维(two-dimensions，2-D)和三维(three-dimensions，3D)细胞培养相比，类器官是不同类型和功能细胞的有机结合体，更接近体内细胞生存空间、生长状态及功能。与动物模型相比，其不存在物种隔离并且能够在体外提供一个可长期大规模培养的“可视化”平台。这使得类器官模型在药物筛选与评价、个体遗传与发育、疾病发生与发展、生物医学材料及组织工程等方面显示出重要应用前景。现阶段类器官的培养主要以基于基质胶(Matrigel)的“无支架”方式为主。然而，该种培养方式使类器官生长受限于基质胶与培养皿中，不但阻碍类器官进一步生长并且限制了类器官的应用灵活性。
聚乳酸是一种典型的生物可降解高分子材料，具有良好的可塑性、生物相容性及完全降解性，并且无毒无害、机械强度高。其也是唯一具有优良抑菌性及抗霉特性的生物可降解材料，有“绿色塑料”之称，已广泛应用于生物组织工程材料领域，如药物缓解包装剂、组织修复材料、人造皮肤等。如Wurm等(Journal of Biological Engineering,2017,11:29-37)制备的PLA组织支架在体外试验中表现出良好的生物相容性。同时，秦课题组(人工晶体学报,2017,46:297-303)与Mathieu团队(Journal of Biomedical MaterialsResearch Part A,2010,75:89-97)分别制备的聚乳酸/羟基磷灰石复合支架材料与多孔聚乳酸-透明质酸支架，在骨组织工程实验中均显示出良好的优越性，并且能够满足骨组织支架要求。
本发明将小肠类器官接种于3D多孔聚乳酸支架中，改变其培养方式，将为类器官的生长提供更大的生长空间与移动可能。将进一步推进其在生物医药、再生医学领域的应用与发展。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其具有较强的可操作性以及较大的灵活性，有望扩大类器官的生长空间同时推动其向组织工程、再生医学及生物医药发展。
所述培养方式由3D聚乳酸生物材料和小肠类器官共同构建，所述聚乳酸为多孔海绵状，孔洞相互连通并均一可控，其尺寸及形状可通过设计聚四氟乙烯模具进行调整。
所述3D聚乳酸材料在适当温度下通过对蔗糖球热处理，以实现对聚乳酸支架内部孔洞的连接及尺寸的控制。
所述小肠类器官通过提取小鼠组织干细胞或复苏冻存类器官获得。
具体的，本发明技术方案如下：一种3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其包括如下步骤：
(1)在150-180℃温度下，将融化蔗糖加入至二甲基硅油中，以300-500rpm均匀搅拌20-30min，再倒入冷冻硅油，并将混合物于冰水混合物中充分冷却，后在正己烷中经筛网分选出糖球作为致孔剂；
(2)将糖球填充于聚四氟乙烯模具中，得到由糖球紧密填充的一定体积区域，于40-100℃下加热数分钟，使糖球之间相互连结，获得致孔剂模板；
(3)将聚乳酸溶解于1，4-二氧六环中，溶解完全后将其倒入致孔模板中，在真空干燥器中保持15-30min后冷冻干燥，利用超纯水溶解致孔剂获得多孔聚乳酸支架；
(4)取小鼠小肠组织用磷酸缓冲液清洗后剪碎，经乙二胺四乙酸消化分离出隐窝，清洗后加入基质胶于24孔板中凝固，后添加小肠类器官完全培养基培养3-5天；
(5)复苏冻存的小肠类器官于24孔板中培养3-5天；
(6)去除步骤(4)和(5)中的小肠类器官完全培养基，加入预冷的磷酸缓冲液吹打收集类器官悬液，吹打并清洗后，加入混合液，接种于多孔聚乳酸支架内，凝固后加入小肠类器官完全培养基培养。
作为优选的，所述步骤(1)经筛网分选出的糖球的粒径尺寸为300-1300μm。
作为优选的，所述步骤(1)中，以质量百分比5-50％的比例将融化蔗糖加入二甲基硅油中进行乳化，优选15-25％；冷冻二甲基硅油与乳化阶段二甲基硅油体积比例为0.5-5，优选1-2。
作为优选的，所述步骤(2)中，加热温度为50-70℃，加热时间为0.5-120min，优选5-60min。
作为优选的，步骤(2)中，聚四氟乙烯模具呈凹糟样几何结构，其形状可以为长方体、圆柱体、圆锥体等。
作为优选的，步骤(3)中，聚乳酸与1，4-二氧六环中的质量百分比例为1-10％，优选4％。
在本发明的一个具体实施例中，所述的步骤(4)中的取小鼠小肠组织用磷酸缓冲液清洗具体为：使用盖玻片刮去小肠组织内粪便、黏膜、绒毛，随后在预冷的PBS中反复吹打20-30次，以清洁小肠组织。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(4)中，以每40μL含100-300个类器官的比例加入基质胶，于24孔板中添加小肠类器官完全培养基，在37℃，5％CO2培养箱中培养3-5天。
在本发明的一个具体实施例中，所述的小肠类器官完全培养基为在DMEM/F12培养基中，加入如下体积百分比或浓度的各组分：1％4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Glutamax)、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、20％R-spondin条件培养基、10％Noggin条件培养基、0.05μg/mL表皮生长因子(EGF)、500nM N-乙酰半胱氨酸、1％神经元细胞培养补充剂N2和2％B27。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(6)中的混合液由小肠类器官完全培养基与基质胶均匀混合而得，其中小肠类器官完全培养基所占体积比例为0-30％；与混合液类器官充分混合后通过注射器接种于多孔聚乳酸支架中，20-30min后待基质胶凝固加入小肠类器官完全培养基至浸没多孔聚乳酸支架，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(3)所得的多孔聚乳酸支架中，孔的尺寸为300-1300μm；孔洞相互连通。
本发明步骤(4)-(7)中，所用小肠类器官可以为鼠源小肠类器官，也可以为其它动物来源及人源的小肠类器官。
本发明能够快速、便捷地构建出一个基于3D聚乳酸生物材料的新型小肠类器官培养体系，为类器官的生长提供合适的微环境，提供更大的生长空间与移动可能，在生物医药评价、再生医学、离体组织工程、微组织构建及其移植领域有重要应用潜力。
本发明考虑到小肠类器官培养过程对于支架孔径的要求，制备和筛选出300-1300μm粒径的糖球作为致孔剂，将糖球填充于模具中，并进行适当温度和时间的加热，使糖球间相互连接但仍能保持糖球的基本形状，从而得到致孔剂模板；该方法使得最终制备出的多孔聚乳酸支架孔洞丰富、孔径均一且相互连通。本发明的支架制备方法可适用于任何形状的模具，可根据实验需求自行设计获得对多孔聚乳酸支架的形态和孔径大小，同时实验证实，本发明的支架能够较好地支持小肠类器官的生长，培养过程“可视”；因此本发明方法和小肠类器官培养体系可满足类器官模型在药物筛选与评价、个体遗传与发育、疾病发生与发展、生物医学材料及组织工程等多方面的应用需求。
附图说明
图1为多孔聚乳酸支架的制备流程图。
图2中A、B、C、D分别为热处理5、25、45、60min时蔗糖糖球及对应聚乳酸支架扫描电子显微镜图。
图3为小肠类器官在多孔聚乳酸支架中的扫描电子显微镜图，其中圆圈内为小肠类器官，箭头所指为聚乳酸支架。
图4为小肠类器官在多孔聚乳酸支架中的HE染色结果图，其中圆圈内为小肠类器官，箭头所指为聚乳酸支架。
图5为不同时间下小肠类器官在多孔聚乳酸支架中激光共聚焦染色结果图。
图6为小肠类器官及结肠癌细胞Caco-2在多孔聚乳酸支架中的MTT毒性检测结果图。
具体实施方式
为使本发明更易理解同时技术路线更清晰，下面结合具体实施例对本发明的作进一步详细说明。所列实例仅用于解释本发明并不用以限制本发明。
实施例1：多孔聚乳酸支架的制备
首先，由蔗糖乳化法制备致孔剂。使用恒温磁力搅拌器使200mL二甲基硅油1温度保持在150-180℃并于300-500rpm搅拌20-30min。称取30-50g蔗糖，加热至全部融化后迅速倒入二甲基硅油1中，继续搅拌至金黄色。随后停止加热搅拌，迅速倒入200-400mL冷冻二甲基硅油2并转移至冰水混合物中使其充分冷却。冷却10-20min后取出，使用正己烷清洗糖球表面残留的二甲基硅油，重复3次以上。清洗后，在正己烷中过筛获得不同粒径糖球。室温下，可将糖球于正己烷溶液中保存。
将上述获得的糖球置于聚四氟乙烯模具中，50-70℃下加热数分钟以得不同黏连程度的致孔模板备用。称取4g聚乳酸加入至50mL 1，4-二氧六环中，以100-400rpm的速度持续搅拌至完全溶解。将聚乳酸溶液灌注到含糖球模板的模具中，放入真空干燥器中保持15-30min促使聚乳酸渗入糖球间隙。-20℃下相分离8h后冷冻干燥24h。将冷冻干燥后的支架在超纯水中浸泡24h以除去致孔剂，后放入60℃烘箱干燥12h，即获得多孔聚乳酸支架。支架形状及大小由聚四氟乙烯模具限定。
以蔗糖为致孔剂制备多孔聚乳酸支架的流程如图1所示。不同热处理时间下所得糖球及对应聚乳酸支架形貌通过场发射电子扫描电镜进行观察，结果见图2。所得糖球尺寸在300-1300μm之间，本实例筛选后获得糖球大小为572.70±72.39μm。热处理5-60min后，聚乳酸支架连接孔由19.02±4.86μm增加至265.13±22.04μm。
实施例2：小肠类器官的获取
将6周-1岁雄性C57BL/6小鼠颈部脱臼致死。于冰盒中打开腹腔，距胃部3-4cm处剪取小肠，约10cm。将小肠放入含预冷PBS的培养皿1中，纵向剖开。用盖玻片轻轻刮去肠道绒毛后将其剪为2-3mm大小的组织碎块。随后转移至含有10-20mL PBS的离心管1中，使用巴氏吸管反复吹打20-30次，重复数次至澄清。吸去上清，添加PBS至30mL。加入150μL乙二胺四乙酸后将组织悬液转移至培养皿2中，在摇床上室温消化20min。移入离心管3中吸去乙二胺四乙酸，再次加入15-20mL PBS。使用巴氏吸管反复吹打10-20次于0.22μm滤网收集上清，重复数次至滤液体积达27mL。添加3mL FBS混合均匀后于300g离心3min。弃上清，加入3mL DMEM/F12培养基重悬，在150g下离心3min，并再次重复。以每40μL含100-300个类器官的比例加入基质胶并混合均匀。取出37℃预热的24孔板，每孔加入40μL类器官悬液。于细胞培养箱(37℃、5％CO2)中培养15-30min待基质胶凝固后每孔加入500-600μL小肠类器官完全培养基生长培养3-5天。
在小肠类器官第3-4天可进行冻存操作。按照FBS：DMSO＝9:1的比例配置小肠类器官冻存液。去除孔板中的完全培养基，每孔加入500μL预冷PBS，使用移液枪反复吹打使基质胶破碎获得悬液。将小肠类器官悬液于4℃、150g下离心3min。弃上清后，加入冻存液，于-80℃中过夜冷冻后转移至液氮中保存。
小肠类器官的复苏。将冻存的小肠类器官于37℃迅速冻融，于150g离心3min去除冻存液。后按照上述比例依次加入基质胶与小肠类器官完全培养基于24孔板中继续培养3-5天。
实施例3：基于3D多孔聚乳酸生物材料的小肠类器官培养体系构建
将实施例1中所得多孔聚乳酸支架于紫外灯下照射过夜。使用浓度为75％的乙醇溶液浸泡30min，后使用PBS浸泡洗涤3次，每次10min。
去除实施例2中24孔板中的完全培养基，每孔加入500μL预冷PBS，使用移液枪反复吹打使基质胶破碎获得悬液。将类器官悬液于4℃、150g下离心3min。弃上清后加入3mL预冷PBS吹打10-20次后再次离心，重复1次。去除上清液，以每40μL含100-300个类器官的密度加入完全培养基与基质胶的混合液(完全培养基占0-30％)。将其接种于灭菌的多孔聚乳酸支架中，接种后于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中凝固20-30min。后加入500-1000μL小肠类器官完全培养基至浸没支架。每2-3天更换一次新的完全培养基。
上述小肠类器官完全培养基由DMEM/F12培养基、1％4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Glutamax)、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、20％R-spondin条件培养基、10％Noggin条件培养基、0.05μg/mL表皮生长因子(EGF)、500nMN-乙酰半胱氨酸、1％神经元细胞培养补充剂N2和2％B27。
图3为小肠类器官在多孔聚乳酸材料表面的场发射电子扫描电镜观察结果，结果表明聚乳酸材料能够为小肠类器官提供生长贴附位点。图4和5分别是HE染色及激光共聚焦显微镜观察结果，结果显示小肠类器官能够在本发明所构建的体系中由圆球状逐步分化出“花朵样”结构，同时保持完整的外形轮廓、细胞核型、细胞骨架等生物学特征，并且其生长形态与增殖状态较好。图6MTT实验结果显示，在本发明构建的培养体系中多孔聚乳酸支架在细胞水平(Caco-2细胞)与小肠类器官水平均展现出较小的生物毒性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (11)

1.一种3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于所用的3D多孔聚乳酸呈立体多孔结构，孔径分布范围可以为300-1300µm，孔径范围可控，孔隙间相互贯通。
2.一种在3D多孔聚乳酸生物材料中培养小肠类器官的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）在150-180 ℃温度下，将融化蔗糖加入至二甲基硅油中，以300-500 rpm均匀搅拌20-30 min，再倒入冷冻二甲基硅油，并将混合物于冰水混合物中充分冷却，后在正己烷中经筛网分选出糖球作为致孔剂；
（2）将糖球填充于聚四氟乙烯模具凹槽中，于40-100 ℃下加热数分钟以获得致孔剂模板；
（3）将聚乳酸溶解于1，4-二氧六环中，溶解完全后将其倒入致孔模板中，在真空干燥器中保持抽真空15-30 min后冷冻干燥，待干燥完全后，利用超纯水溶解致孔剂获得多孔聚乳酸支架；
（4）取小肠组织用磷酸缓冲液清洗后剪碎，经乙二胺四乙酸消化分离出隐窝，清洗后离心，去除上清后加入适量基质胶并混匀，置于细胞培养板中，待基质胶凝固后添加小肠类器官完全培养基并培养3-5天；
（5）使用移液枪吸去步骤（4）中的小肠类器官完全培养基，加入预冷的磷酸缓冲液吹打收集类器官悬液，吹打并清洗；
（6）将上述类器官悬液离心后，向其中加入混合液并使其混合均匀；
（7）使用注射器将步骤（6）中所得悬液接种于多孔聚乳酸支架内，凝固后加入小肠类器官完全培养基培养。
3.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于所述步骤（1）经筛网分选出的糖球的粒径尺寸为300-1300µm。
4.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于所述步骤（1）中，以质量百分比5-50%的比例将融化蔗糖加入二甲基硅油中进行乳化；步骤（1）中冷冻二甲基硅油与乳化二甲基硅油的体积比为0.5-5。
5.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于所述步骤（2）中，加热温度为50-70 ℃，加热时间为5-60 min。
6.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于步骤（3）中，聚乳酸与1，4-二氧六环的质量比例为1-10%。
7.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于所述的步骤（4）中的取小鼠小肠组织用磷酸缓冲液清洗，具体为：使用盖玻片刮去小肠组织内粪便、黏膜、绒毛，随后在预冷的PBS中反复吹打20-30次，以清洁小肠组织。
8.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于所述的步骤（4）中也可以选用冻存的小肠类器官，将其复苏后，添加小肠类器官完全培养基于细胞培养板中培养3-5天。
9.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于步骤（4）中控制每40 µL基质胶含100-300个类器官。
10.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于所述的小肠类器官完全培养基为在DMEM/F12培养基中，加入如下体积百分比或浓度的各组分：1% 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、100 µg/mL 青霉素、100 µg/mL链霉素、20% R-spondin条件培养基、10% Noggin条件培养基、0.05 µg/mL 表皮生长因子、500 nM N-乙酰半胱氨酸、1% 神经元细胞培养补充剂N2和2% B27。
11.根据权利要求2所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法，其特征在于步骤（5）中的混合液由小肠类器官完全培养基与基质胶均匀混合而得，其中小肠类器官完全培养基所占体积比例为0-30%；将混合液与类器官充分混合后通过一次性医用注射器接种于多孔聚乳酸支架中，20-30 min后待基质胶凝固后加入小肠类器官完全培养基并完全浸没多孔聚乳酸支架，置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。
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