JP2000507202A - 生体人工装置及びそのための細胞マトリックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ホルモンを含めた細胞成分の有効な放出のための装置であって、それに含まれる、ホルモンを産生する細胞成分を含有するマトリックスは、免疫原性物質の通過を遮断し、かかる細胞成分およびそれによって産生されるホルモンのための有効な栄養分は通過させることができる有孔性を備えたまく分を有する、ポリパラキシリレンあるいは他の芳香族ベースの成分の非免疫原性ポリマー材料で被包されている。細胞成分の保存、製造、機能試験、およびウイルス感染試験のための改善されたマトリックスであって、それに含まれるコラーゲンベースのヒドロゲルは、宿主温度で液相を示すように処理されており、細胞付着のためのマトリックスとして機能し、またかかるマトリックスは熱および圧による損傷を制限するために有効な添加物を含む。さらに、器官から組織を分離するための改善された方法。

Description

【発明の詳細な説明】 生体人工装置及びそのための細胞マトリックス 技術分野 本出願は１９９２年２月２４日出願の米国特許番号０７／８４１，９７３の一 部継続出願である、１９９４年９月２日出願の米国特許出願番号０８／３００， ４２９の一部継続出願である。 発明の背景 本発明はホルモン生産組織を含む、細胞部分の被包(encapsulation)、及び特 に糖尿病被験者への異種移植のためのインシュリン生産膵島の膜被包に関する。 さらには、本発明は組織に対する改良したマトリックス、特に、組織の長期貯蔵 、組織機能の定期的評価、移植に先立つ組織包含装置の非破壊試験を可能にし、 その組織成長を促進する、ホルモン生産組織に関する。 糖尿病は米国だけで約２０００万人を冒す難病である。この難病はインシュリ ンのほぼ完全な欠如（Ｉ型糖尿病）又は循環インシュリンの正常水準への耐性（ II型糖尿病）のいずれかで特徴づけられる。どちらの状態も現在外部性インシュ リンを毎日皮下注射して、ある程度まで制御できる。インシュリン注射は予め決 められた薬量で定期的に間隔を置かれるので、開ループ系としての治療法は、代 謝要求によってインシュリンを放出するのでもなく、それによって非糖尿病被験 者で達成される範囲内へと血糖水準を制御するのでもない。従って、この種の治 療は疾患に関連する血管合併症を防ぐために必要な血糖の代謝制御を達成できな かったことは良く認識されている。これらの合併症には、失明、腎不全、心臓疾 患、卒中及び末稍知覚神経機能の喪失が含まれる。さらに、インシュリンが約１ ０分毎に不連続な薬量で放出される喪失又は正常インシュリン脈動性は、Ｉ型 及び１１型の両方の糖尿病で、正常なインシュリン感受性を維持するために必要 である。この正常脈動性の喪失及びインシュリン耐性の悪化は、糖尿病関連大血 管疾患の進展で第一に重要であると考えられる。糖尿病は現在米国において第三 位の死亡原因疾患で、治療のために年間約２０〜３０億ドルを要する。 糖尿病被験者にインシュリンを送達するために、プログラム化した又は手動操 作のインシュリン分注ポンプが、血糖を狭い範囲内に制御する試みでインシュリ ンの多数で少量の薬量を提供するために使用されている。このようなポンプは、 依然として開ループ系として機能するもので、インシュリンの必要量を予期しよ うとはするが、代謝要求に対応しない。このようなポンプからのインシュリンは 正常には皮下組織を通じて吸収されるので、分注されたインシュリンは不連続投 与とはならない。従来のインシュリン注射に比較して、現在のポンプによる治療 の効率は明らかに優位なものでもなく、臨床的にも受容されていない。閉ループ 制御を提供するために血糖センサでポンプを制御する試みはあったが、現在まで 長期間生体適合性及び機能性を有する移植可能なセンサは達成されていない。 多年にわたって医学研究者は、選択的透過膜を通って代謝要求に従ってインシ ュリンを放出する、生きたインシュリン生産細胞、膵島又は分離ベータ細胞を取 り込む閉ループ移植装置の望ましさを認識してきた。「生体人工膵臓」と名づけ られたこれらの装置は、機能的及び性能的制約によって定義されている。第一に 、このような組織は血糖濃度の増加及び減少に応答し、適当な時間内に必要量の インシュリンを放出しなければならない。第二に、装置はインシュリン生産を支 持して、抑制してはならない。第三に、装置は免疫拒絶反応に対する保護を提供 しなければならない。第四に、膵島は機能的に生き残らねばならず、又は装置は 容易に置換されえなけらばならない。第五に、膜は適当に選択性で、患者に生体 適合性で、宿主組織との接触でその機能的特性が変えられてはならない。 種々のカプセル接近が膵島を含み、平面状又は管状膜を用いる物理的装置に関 して取られた。技術上提案された膜の例はＡｍｉｃｏｎ中空糸、アルギン酸ポリ リジンカプセル、ポリアクリロニトリルシート並びに中空糸、アガロースゲルカ プセル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ膜、修飾コロジオン、酢酸セルロース、ポリ二フッ 化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎからのＮｕｃｌｅｐｏｒｅ膜、Ｐｏｒｅｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎからのＰｏｒｅｔｉｃ膜及びその他を含む。一般に、生理的グルコース信号 入力及びインシュリンの放出を適当に可能にするために膵島組織に適用すると、 これらは膜の汚染につながる生体適合性の欠如及びそれらの厚さのために失敗し た。拒絶反応を克服するための試みとして、高度に精製されたベータ細胞が、シ クロスポリンのような有効な免疫抑制剤を大量摂取しているヒト被験者に移植さ れた。知られている限りでは、この接近を用いて長期の好結果の移植はなかった 。 最近、膵島はアルギン酸ナトリウムのようなヒドロゲルにマクロ被包され、ア クリル共重合体を用いる、乾‐湿式紡糸技術で作られた中空糸に注入された。マ ウスのグルコース水準を制御する能力を示したが、線維の長期生体適合性は確立 しなかった。 発明の簡単な要約 本発明は、要求によって閉ループインシュリン送達を提供するための前述の問 題を克服し、認知された生体適合性材料による宿主の免疫防御から膵島(islet) を選択的に保護することにより拒絶反応の上記問題を克服しながら、上記基準を 満足する移植可能な装置を提供する。 さらに特別に、ヒトの又は好適にはより容易に入手可能な動物の膵島が、栄養 素、グルコース信号、電解質、水、及び膵島で放出されるインシュリン（それら の全てが約６，０００以下の分子量を有する）の通過が可能である多孔性の膜部 分を有するポリパラキシリレンを含む高分子材料で包まれる。しかしこの膜の多 孔性は、４０，０００〜５００，０００の分子量を有する免疫グロブリン及び抗 体の通過に必要な多孔性よりは小さい。特にポリパラキシリレンは移植に対して 生体がある適合性表面マトリックスとして認知され、フィブリンのような血漿因 子又は血小板のような細胞と相互作用しない。従って、カプセルの孔は閉塞しな いであろうし、宿主自身のグルコース濃度の関数としてのインシュリン放出が生 じるだろう。ポリパラキシリレンの選択的膜多孔性及びその内外表面に対する生 体適合性を提供しながら、装置は新鮮な又は凍結した膵島に基づき、種々の細胞 配列を形成して、種々のデザインが可能である。 本発明はヒドロゲルマトリックスを用いた選択的透過性膜による上記装置のコ ンフォーマルコーティングのための方法をも提供する。この方法は細胞損傷又は ヒドロゲルの侵食無しに、高真空条件下で、ヒドロゲルを含む膵島の被覆を可能 にする。この被覆は共形的あるいは相似的な（装置の形状に適合する）性質と適 切な厚さを有するので、本発明は独特にグルコース信号への非常に急速なインシ ュリン応答を可能にし、生理的インシュリン脈動性が生じることを可能にする。 本発明はさらに、機能性の定期的試験や、膜の使用のための改良したマトリッ クス、細胞部分並びに関連装置の非破壊試験、このような装置の長期貯蔵、膵島 を含む細胞部分の長期貯蔵を可能にする、改良した細胞マトリックスを提供する 。製造後の装置の機能性試験を移植に先立って行うことができる。さらに、マト リックスは膵島複製及び他の細胞部分の複製を促進する環境を提供する。従来、 膵島移植の当業者は、全て日々の問題内で、装置製造のための膵島単離及び精製 から直接着手する必要があった。装置製造後、装置は非破壊的試験装置機能性に 対する可能性もなく、移植されてきた。本発明は、膵島がそこに付着し、繁殖す るコラーゲン性及び／又はゼラチン性基材からなる天然膵臓システムに類似する マトリックスを提供する。さらに特に、マトリックスは、媒体及び添加物と共に 、膵島が単独で及び一団になって付着する高分子鎖を提供する、煮沸コラーゲン を使用する。以下に詳細に記載するように、マトリックス調合は汚染無しで六ヶ 月 以上の貯蔵で膵島の機能性を維持し、移植に先立つ機能性試験に対する能力付き で数カ月間完成した装置の貯蔵を可能にし、性能の低下無しに、時間と共に改善 するインシュリン生産の証拠を示しながら、インビボ寿命を延ばした。さらに、 移植した装置に関して補足的に使用したマトリックスは膜の直近で血管分布を促 進した。 本発明は、熱的に依存する水素結合生成及び双極子モーメント相互作用に基づ いて、膵島、肝細胞又は同類の細胞付着のためのマトリックスを使用する細胞マ トリックスを提供する。好適なマトリックスは部分的に、細胞成長のための自然 環境を提供し、アミン、カルボキシル基、水酸基、及びスルフヒドリル基水素結 合生成及び双極子モーメント相互作用に基づいて煮沸又はその他の方法で変性す ると容易にゲルを形成する極性並びに非極性アミノ酸を含む、コラーゲンベース のゼラチンを含む。力に対するこのマトリックスの抵抗性は、水素結合及び双極 子モーメント相互作用から二価陽イオン干渉を除くキレート化剤の添加により増 加する。露出した活性基は、この水素結合生成を経て低温で水を不動化するため に使用され、低温における熱的障害を最少にする。 本発明はさらに、核損傷、及び他の関連傷害から細胞死を生じることが知られ る、酸化窒素及びその代謝物からの保護を生じる細胞マトリックスを提供する。 細胞マトリックスは、構成的又は誘導的のいずれかで、酸化窒素合成酵素による 酸化窒素の生成からＬ‐アルギニンを抑制するために役立つアミノ酸及び関連化 合物を使用する。特に、コラーゲン性物質に見られる、システイン及び他のスル フヒドリル基のある関連化合物は酸化窒素を除去するのに役立ち、その有害（又 は有益）特性を制限する。 本発明はさらに、熱依存性細胞膨張及び収縮に対し不活性クッションを提供す る、代謝的に安定な凍結保存剤を含む細胞マトリックスを提供する。好適な凍結 保存剤は硫酸化デキストランで、ここではスルフヒドリル基はジスルフィド結合 のための部位を提供し、力に対するマトリックスの抵抗性を増加し、及び酸化窒 素集積を抑制する。このような硫酸化基も、継続した膵島成長及び維持に必要で あることが当業者に知られている、ＩＧＦ‐Ｉ及びＩＧＦ‐IIのような成長因子 のための部位を提供する。 本発明はさらに、望ましい細胞部分を放出するための酵素溶液を用いる消化の ための改良した方法を提供し、そこでは酸化窒素阻害剤の有効な量が、内皮合成 を増加し、改良した酵素開裂を生じる方法で溶液に加えられる。 生物学移植の当業者は、簡単に記述したような装置及びマトリックスが、制限 無しで、変性コリン性ニューロンの喪失を防ぐためのヒト神経成長因子を分泌す る細胞、心筋再生のためのサテライト細胞、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ病のための線 状体脳組織、肝臓細胞、骨髄細胞、パーキンソン病のためのドーパミンが豊かな 組織及び細胞、アルツハイマー病のためのコリンが豊かな神経系、中枢神経系へ の鎮痛剤送達のための副腎クロム親和性細胞、皮膚移植のための培養上皮、及び 筋委縮性側索硬化症のための毛様体神経親和性因子を放出する細胞を含む、種々 の移植治療における応用を発見するであろうことを評価するだろう。 図面の簡単な説明 本発明の上記の並びに他の特徴及び利点が、そこに伴う図面と結びつけて、好 適な実施態様の次に書かれた説明を読んで明らかになるだろう： 図１は本発明の実施態様に一致する生体人工内分泌装置の横断面図であり、 図２は本発明の別の実施態様の横断面図であり、 図３は図２の線３‐３に沿って採られた横断面図であり、 図４は本発明の別の実施態様の横断面図であり、 図５は発明のさらに別の実施態様の断面図であり、 図６はさらにマトリックスのコラーゲン線維への膵島の集団の付着を示す走査 電子顕微鏡写真であり、 図７はマトリックス中の膵島の付着した及び付着しない集団を図解する図６の 部分の拡大図であり、 図８は膵島の付着しない集団を示す図７の部分の拡大図であり、 図９は膵島の付着した集団を示す図８に同様なものであり、 図１０Ａは線維へ付着のための結合部位を含む単独膵島の図６と同様な図で、 図１０Ｂは細胞分裂を受ける単独膵島の図であり、 図１１は変性コラーゲン鎖に付着した膵島の集団を示す図６の部分の拡大図及 びコラーゲンのそのままの鎖を示す差し込み拡大図であり、 図１２及び１３はマトリックスからの除去を受ける膵島の光学顕微鏡写真であ り、 図１４は本発明による装置に対する１００ｍｇ／ｄｌグルコースのインビボ挑 戦に応答するインシュリン対時間のグラフであり、 図１５は図１４の装置に対する５０ｍｇ／ｄｌグルコースのインビボ挑戦に応 答するインシュリン対時間のグラフであり、 図１６は本発明による装置の別の実施態様の上面及び横立面図であり、 図１７は図１６に示した装置を移植した糖尿病イヌに関する日を関数とした血 糖値であり、 図１８はマトリックス培養の時間の関数としての膵島ＲＮＡ含量、インシュリ ン分泌、及び生存膵島数であり、 図１９は図１７のイヌに対するブタＣ‐ペプチド対移植後日数であり、 図２０は図１７のイヌに対する静脈内グルコース耐性試験（ＩＶＧＴＴ）デー タであり、 図２１Ａ及び２２Ｂは移植後６、４０及び５７日のイヌに関するＩＶＧＴＴデ ータであり、 図２２Ａ及び２２Ｂは移植後４５及び５９日の別のイヌに関するＩＶＧＴＴデ ータであり、 図２３は図２１のイヌについての移植後日数を関数とするブタＣ‐ペプチド量 であり、 図２４は図２１のイヌに対するＩＶＧＴＴデータであり、 図２５〜３０は一連の試験イヌからの最大血清Ｃ‐ペプチド値であり、 図３１は移植の１４日後、及び膵臓切除後５０日にイヌＡＸＡに再移植した２ １日齢膵島の静脈内グルコース耐性試験であり、及び 図３２は移植後８０日のイヌＣ３２４からの静脈内グルコース耐性試験である 。 好ましい実施例の態様 本発明は、膵臓、甲状腺、上皮小体、胸腺、脳下垂体、副腎皮質、及び副腎髄 質のような内分泌腺に正常に関連する、細胞部分により正常に生産される生物物 質の提供における特別の効用を有する。膵臓及び脳下垂体の細胞部分が好適であ る。ここで用いるように、細胞部分は、天然に生じる物質及び合成又は他の方法 のその同族の両方を分泌する、天然に生じる及び遺伝的に変換された細胞の両方 を含む。本発明の方法で有用な細胞は、限定されないが、成長ホルモン分泌細胞 、催乳ホルモン分泌細胞、甲状腺剌激ホルモン細胞、性腺刺激ホルモン細胞、及 び皮質脂質剌激ホルモン細胞を含む。 本発明の方法で提供される生物物質は典型的にホルモンと呼ばれる。ここで用 いるように、「ホルモン」は特異的組織により分泌される生物物質として定義さ れ、分泌の部位で活性を有し、ときとしてオートコイド(autocoide)と呼ばれる それらの物質及びその前駆体を含む。典型的ホルモンはペプチド、蛋白質、糖蛋 白質、脂肪、脂質、多糖類、及び炭水化物を含む。ペプチドが好適で、ここで用 いるように用語「ペプチド」は分離した分子又は蛋白質内にあるものを指す。 脳下垂体又は下垂体前葉で分泌されるホルモンは成長ホルモン（ＧＨ）、プロ ラクチン、ゴナドトロピン、チロトロピン、コルチコトロピン、メラニン細胞刺 激ホルモン、ソマトメジン、及びリポトロピンを含む。 ゴナドトロピンは一般に脳下垂体により分泌される糖蛋白質で、卵胞刺激ホル モン（ＦＳＫ）、黄体ホルモン（ＬＨ又はＩＣＳＨ）、塩素イオン性ゴナドトロ ピン（ＣＧ）、チロトロピン（ＴＳＨ）、その個々のペプチド鎖、及びそれと結 合する炭水化物を含む。エストロゲン、プロゲスチン、及びアンドロゲン同族の ホルモンと共に、これらのホルモンは不妊症の治療に有用であろう。卵胞刺激ホ ルモン放出ホルモン（ＦＳＨＲＨ）又は黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ） のような、ゴナドトロピン放出ホルモンも本発明により提供される。 メラニン細胞刺激ホルモンは、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、アルファメラ ニン細胞刺激ホルモン（ａｌｐｈａ‐ＭＳＨ）、ベータメラニン細胞刺激ホルモ ン（ｂｅｔａ‐ＭＳＨ）、ベータリポトロピン（ｂｅｔａ‐ＬＰＨ）、ガンマリ ポトロピン（ｇａｍｍａ‐ＬＰＨ）、及びその共通前駆体、プロオピオメラノコ ルチンを含む。 ソマトメジンは分子量で約７，０００から８，０００ドルトンまでの範囲のペ プチドホルモンの一族で、神経成長因子（ＮＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、 線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と同様である。一つの典型的ソマトメジンはイン シュリン様成長因子（ＩＧＦ）である。組織成長因子のような、成長因子自体は さらに皮膚／骨成長を促進し、創傷治癒を促進するために、本発明の適用範囲に 含まれる。成長因子は小さい及び大きい形の両方で本発明によって提供される。 上皮小体で分泌される典型的ホルモンは上皮小体ホルモン及びその前駆体、プ ロパラチロイドホルモンである。ホルモンカルシトニン及びプロラクチンは甲状 腺、上皮小体及び胸腺で分泌される。成長因子のように、プロラクチンａは小さ い及び大きい形の両方で本来生じ、その両方が本発明の細胞部分により提供され る。副腎皮質で正常に分泌されるホルモンは、アデノコルチコトロピン、及びそ の合成同族のような、副じん皮質ステロイドを含んで、本発明の実施によりさら に提供される。 本発明は脳内に正常に見られ、神経学的に活性な物質を分泌する、細胞部分を 提供するために使用されるだろう。したがって、神経ペプチドはエンドルフィン の神経ペプチド同族、グルカゴンセクレチン、及び物質Ｐ神経ペプチドを含んで 、発明の実施で提供されるだろう。エンドルフィンはプロオピメラノコルチン、 プロエンケファリン、プロジノルフィン及びそれから誘導されるホルモンを含む 。グルカゴンセクレチンは、両方とも膵島に見られる、グルカゴン、血管作用性 小腸ポリペプチド、セクレチン及び成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）を含む。 物質Ｐ神経ペプチドは、バソトシン、バソプレシン及びオキシトシンを含む。オ キシトシン、バソプレシン、ＬＨＲＨ、ＧＨＲＨ、及びプロオピオメラノコルチ ンのような、神経の単一で大きい集団で分泌される物質、及びソマトスタチン、 コレシストキニン及びエンケファリンのような、脳全体に正常に分布した細胞で 分泌される物質が本発明の範囲に含まれることが特異的に意図される。 本発明は特別な細胞部分としてマスト細胞を提供するためにも使用されるだろ う。したがって、ペンタガストリンのような、ヒスタミン同族中のもの及びその 合成同族を含む、これらの細胞で分泌された物質が発明の方法で提供されること は、発明の一層の見地である。 本発明の細胞部分で提供される他の生物物質は、限定されないが、次を含む： ポリペプチドオータコイド（例えばアルドエステロン）、血漿キニン（例えばブ ラジキニン及びカリジン）、オートジオテンシン好酸球走化因子（ＥＣＦＡ）、 好中球走化因子（ＮＣＦＡ）、移植における器官拒絶反応の治療に有用なペプチ ドに基づく免疫抑制剤、骨髄移植を可能にするのに有用なヒト顆粒球コロニー刺 激因子、自己免疫及び結合組織疾患の治療に有用なＴ細胞受容体ペプチド、二糖 ペプチド、免疫増強薬、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、アミリン、グルカゴ ン、プラミンチド、及びトロムポエチン。 本発明は第一にヒト被験者の治療に関するが、ウシ、ブタ、ヤギ、ネコ、及び イヌのような、他の被験ほ乳類の治療に対して、家畜の目的で、使用されるだろ う。例えば、発明の一つの実施態様はホルモン分泌のための移植であり、ウシ、 ヤギ、又は他のいずれかの乳生産動物の乳生産の増加のためのソマトトロピンの ような、家畜及び／又は農業目的のための動物の類似のものである。成長ホルモ ンは乳生産増加の目的で被験動物に投与されるだろう。 以下に詳細に記載される好適な実施態様は、第一に、受容患者の内分泌欠乏を 克服するための移植、特にインシュリン生産細胞部分が血清グルコースの変化に 応答してインシュリンを放出する、生体人工膵臓の生体人工内分泌装置に関する 。しかし、当業者は、種々の細胞及び分子欠乏疾患を治療するために受容者に生 きている細胞を移植するための研究が広い基礎で行われていることを予期するで あろう。これらの移植細胞は、疾患、傷害又は他の不全の理由の結果として、受 容者が自身では生産できない生物生産物を生じさせることを目的とする。 好適な実施態様だけを記述する目的で図面を参照すると、図１はホルモンの有 効放出のための生体人工内分泌装置を示す。装置はその上下の底面に生体適合性 接着剤で付けられた一対の選択的透過膜１４を有する円筒１２からなる。スリー ブへの膜の及びスリーブ同志の付着のための適当な接着剤はシリコーン接着剤、 Ｄｏｗ‐Ｃｏｒｎｉｎｇで製造されたＳｉｌａｓｔｉｃ Ｔｙｐｅ Ａ、シアノア クリレート、Ｌｏｃｋｔｉｔｅで製造したＰｒｉｓｍ４５４、エポキシ又は他の 接着剤で、好適には生体適合性で、空洞の保全を密封して維持するために十分な 接着を提供するものである。内部体積又は室１５は円筒１２の内壁及び膜１４で 限定される。室１５は液体又はゲルマトリックス中のホルモン生産組織、好適に はブタ膵島、又は他のホルモン生産細胞部分１６を含む。マトリックスという用 語は、組織を支持するための材料として当該技術において受容された意味におい てここで使用される。ここに具体的に記載されたものに加えて、マトリックスは アルギン酸基剤（Ｓｃｈｒｅｚｅｎｍｅｉｒ，Ｊ．ら．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｔｉｏｎ５７：１３０８−１４，１９９４）、寒天又はアガロース基剤（Ｉｗ ａｔａ，Ｈ．ら．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３８：２２４‐２２５，１９８９）であ ろう。 充填に先立って、組立てられた装置は熱又はガンマ線で滅菌される。円筒の側 壁は、室１５へ細胞マトリックスを導入するための下の放射状管接続口及び充填 中室１５を通気するための上の放射状管接続口を備えられる。管接続口１８、２ ０は滅菌生体適合性部品２２で封じられる。 円筒１２金属又はプラスチックのような、いずれかの適当な材料で作られるだ ろう。部品１４はポリパラキシレン（ポリパラキシリレンＮ）、又はポリモノク ロロキシリレン（ポリパラキシレンＣ）、及びポリジクロロキシリレン（ポリパ ラキシリレンＤ）のような、共通にパラレンとして名づけられるその同族及びそ の混合物の高分子膜である。膜１４は、細胞部分のための有効栄養素及びそこで 生産されるホルモンの通過を可能にする、多孔性を有する。生体人工膵臓装置で は、以下に記載のように、約２，０００から５，０００オングストロームまで及 び好適には約２，５００から３，５００オングストロームまでの厚さでポリパラ キシリレンＮからなる膜は望む多孔性特性を与える。下限は、厚さが不十分な膜 強度を生じない限り、前記のもの以下であろう。 膜は従来からある真空蒸着法により作られ、選択性膜が確立するように正確に 制御できる多孔性を有する。上記のように、パラレン被覆は、パラレン二量体を 供給する、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏａｔｉｎｇｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｉｎｄｉ ａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ又はＰａｒａ Ｔｅｃｈ Ｃｏａｔｉｎｇ，Ｉ ｎｃ．ｏｆ Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能な従来 の装置を用いて施される。装置は様々な形状が採られ、被膜を可能にする。一つ の特別な機械構成がＲｉｌｅｙに発行された米国特許第４，６８３，１４３号に 発表される。基本的に、全てのこのようなシステムは、コールドトラップで保護 した真空ポンプで減圧された真空室に結合される熱分解器に結合される気化器を 用いる。真空及び熱で、パラレン二量体は気化器で気化され、熱分解器を通って 、そこで二量体は熱的に単量体に開裂され、それは長鎖高分子として、環境温度 で、室内の装置上に共形で蒸着される。よく知られているように、被覆部分の被 覆の厚さは、被覆工程中に被覆器中の平面ウイトネスプレート(planar witness plate)を配置して決定されるだろう。全室、固定具及び部品は実質的に均一な被 覆を受けるので、ウイトネスプレートは除かれ、従来の厚さ測定装置で試験され て、それによって被覆部分の厚さを決定する。以下の実施態様のあるものに記載 のように、これは予備成形膜に対する便利な方法である。しかし、以下の他の実 施態様に記載のように、被覆がヒドロゲルマトリックス上に施されると、マトリ ックスの冷却が液体のガス放出のために起こり、その間の色変化に基づいて視覚 的に観察可能なように、ウイトネスプレートと施された膜の間の厚さの変化を生 じ、パラレンは特色のある着色スペクトル対厚さを有することが、気づかれる。 現在、出願者はこれらの条件下で膜の厚さの直接測定を提供するための入手可能 な厚さ測定装置に気づかない。にもかかわらず、本発明による膜装置の特異的属 性は下記のように基本パラメータ必要条件で補足されるように機能的インビトロ 試験で決定されるだろう。 本発明では、最大孔寸法は、４０，０００から約５００，０００の分子量を有 する免疫グロブリン及び抗体の通過を防ぐために選ばれる。最少孔寸法は、グル コース、電解質並びに水、及びホルモン、約５，６００の分子量を有するインシ ュリンのような、栄養素分子の通過を可能にするように選ばれる。他の細胞部分 では、前述の最大空孔率は適用可能であるが、最小空孔率は、当業者が理解する ように、放出される生物生産物に依存するだろう。例えば、脳組織から分離され るｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｍｉｇｒａ細胞を含むパーキンソン病の治療のための 装 置はドーパミン及び関連化合物の通過を可能にするために少なくとも１０００の 分子量カットオフを必要とするが、分離した甲状腺組織による甲状腺機能低下症 の治療は、甲状腺ホルモンの移動を可能にするために５００だけの分子量カット オフを必要とする。 本発明は、芳香族環が活性化学部位を有する直鎖炭素高分子よりも少ないイン ビボ化学結合部位を提供する限り、脂肪族鎖の代りに第一に芳香族環を利用する 何らかの高分子を利用するだろう。パラレンのような芳香族高分子は容易に入手 可能な結合部位を有しないので、被験者の免疫システムは外来として認識せず、 その表面に結合できず分子の孔は閉塞されないままである。他のこのような高分 子は例としては、ポリフェニルオキシド、ポリフェニルスルフィド、ポリフェニ ルアミン及び繰り返し芳香族部分を有する他の高分子を含む。 実施例１ ３２７１オングストロームの厚さを有するポリパラキシリレンＮの膜は円筒ス リーブに取り付けられ、部分的に蒸留水に浸された。変化する分子量の液体含有 成分が膜の上部表面におかれた。その後水の試料がＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに適用 され、分子量によって試料を分離するために電気泳動にかけられた。グルコース 、インシュリン及び細胞栄養素に対応する低分子量が同定された。高分子量成分 、すなわち、２６，０００以上が排除された。 さらに詳細に、移植可能な生体人工膵臓装置に対して、細胞部分は複数のイン シュリン生産膵島を含む。膵島は、ヒト及び動物の両方の供与者の膵臓器官から 、コラーゲン消化及びフィコル又はデキストラン、勾配分離を用いる方法で誘導 される。膵島はミクロリットル当たり約１０から５０膵島の濃度でマトリックス を形成するために従来の培養媒体と混和される。 円筒は、取扱、被覆及び移植の考慮、及び受容者に必要な治療用インシュリン 生産の目的で形と寸法を変えうるだろう。 移植生体適合性の目的で、円筒は医用級ステンレス鋼又は好適にはポリパラキ シレンを共形（形に沿うように）被覆して、のような適当な材料で作られ、その 厚さは特に重要ではなく、しかし約０．５ミクロンの被覆厚さが好適である。こ の被覆は従来の技術によって制御された厚さで正確に施されるだろう。被覆及び 膜材料はヒト移植に対して非免疫マトリックスとして認知される。材料はフィブ リンのような血漿要素又は線維芽細胞、マクロファージ又は血小板のような細胞 と相互作用しない。したがって、装置及び膜孔は閉塞されず、宿主組織成長の関 数としてインシュリン放出を損なわない。 実施例２ 約３１００オングストロームの厚さでポリパラキシリレンＮの膜は円筒スリー ブ上に取り付けられ、部分的に蒸留水に浸された。７５個の成体ブタ膵島が膜の 上部表面でＲＰＭＩ培養媒体中におかれた。媒体は定期的に試料採取され、核採 取後変えられた。二分割量が四日目及び六日目に媒体から抽出された。分割量は １２５１インシュリンＲＩＡ（Ｖｅｎｔｒｅｘ）で複製で試験された。四日目の 試料のインシュリン水準は７０＋１４９ｕＵ／ｍｌで、六日目の試料は２３５＋ １５０ｕＵ／ｍｌで、インシュリンが膜を横切って膵島から分泌されることを示 した。フィブリン又は他の細胞付着は起こらなかった。 実施例３ 移植装置は二つのＰＶＣスリーブ、１／２０．Ｄ．，３／８”Ｉ．Ｄ．，３／ １６”厚さを用いて調製された。スリーブは約０．５ミクロンの厚さまでポリパ ラキシリレンＮで被覆された。２９５９オングストロームの厚さを有する円形ポ リパラキシリレン膜がシリコーン接着剤でスリーブの上部表面に接着された。ス リーブはついで放射線滅菌された。 一つの膜スリーブは２０デカリットルの細胞マトリックスで充填された。マト リックスは約５，０００個のブタベータ細胞膵島を含んだ。膵島はコラーゲン消 化法によって調製された。その後スリーブはシリコーン接着剤で結合された。装 置は非肥満糖尿病マウスで腹腔に移植された。 移植に先立って三週間、マウスの絶食血糖（ＦＢＧ）はグルコースオキシダー ゼ分析で決定されて７６０ｍｇ／ｄｌであった。移植に続く日に、絶食血糖水準 は３８０ｍｇ．ｍｌであった。装置が移植に続いて除かれると、装置又は膜への 線維又はリンパ芽球の付着は観察されなかった。 実施例４ 移植装置は図１の実施態様によって構築された。つばは１／２インチの外径及 び１／４インチの内径を有した。約３０００Ａ（オングストローム）のポリパラ キシリレンＮの膜は、シリコーン接着剤でつばの面に接着された。放射状充填孔 を通って、装置の内容積が約５，０００個の成体ブタ膵島で充填された。充填孔 はシリコーン栓で密封された。４個のこのような装置が、約１２ｋｇの体重の膵 炎雌雑種イヌの腹腔に移植された。移植に続く第１日、血漿インシュリン水準は ２１．２及び２２．２ｕＵ／ｍｌと測定された。移稙に続く第二日に、血漿イン シュリン水準は２１．５及び２０．５ｕＵ／ｍｌｔ測定された。 図２及び３を参照して、装置３０は一般に長方形ポリパラキシレン被覆板３６ 中の貫通孔の列で限定されるように円筒室３２の複数性で提供される。孔３４の 上部及び底部は上記のようにポリパラキシリレン膜３８で密封される。液体マト リックス中の細胞組織は放射状充填管接続口４０を通って室３２へ送達され、そ れはその後栓で密封される。室３２のアレーは膜損傷又は汚損、細胞生産の減少 及び同類の事象で装置に対して過剰を提供する。 図４を参照して、装置は、その上に配列した細胞液滴７２の複数性を有し、上 記のようにポリパラキシリレンの膜７４で覆われる板７０からなる。装置は、ポ リパラキシリレン被覆板上で、液体状で、又はアルギン酸ナトリウムのような保 護被覆中にマクロ被包されて、組織媒体を析出して形成される。析出後、液滴及 び板はポリパラキリシレンで望む厚さまで被覆される。選択的に、液滴及び板は 凍結され、被覆され、移植が用意されると、装置は細胞を再構成するために解凍 される。細胞は、Ｒ．Ｖ．Ｒａｊｏｔｔｅ（Ｃｒｙｏｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｉｓｌｅｔｓ，２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ ｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｕｓｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｏ ｒｇａｎｓ Ｓｅａｒｃｈ Ｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８ ５，ｐａｇｅｓ ４５‐５１）に述べられたプロトコルによって凍結され、解凍 される。 装置は前述の膜で被包される個々の液滴として形成されるだろう。凍結され、 又は被包された、個々の液滴は自由落下被覆工程で在来的に被覆され、又は埋め 込まれた糸に吊るされ被覆されるだろう。細胞はその後再構成され、適当な媒体 に混和され、ついで選ばれた部位に注射で移植される。 本装置８０は図５に示される形を取ってもよい。より具体的には、長方形プレ ート８２には複数の通し孔１０２が設けられている。プレートの上面およびホー ルの先端開口部はポリパラキシリレン被膜１０４で被覆されており、上記の膜を 作っている。プレートの底表面およびホールの底開口部は、適当な生物適合接着 剤により付着させたポリパラキシリレン被覆裏カバー１０６で被覆されている。 ホールの側壁、膜およびカバーにより定められた内部室は液体またはゲルマトリ ックス内のインシュリン産生細胞で満たされている。 図５の装置は、開口部を定める壁等のすべての表面に連続した相似被覆を提供 するようにプレート８２を最初にポリパラキシリレンで被覆することにより作ら れるのが好ましい。底は封止されてホールが上面の僅かに下の高さまで蒸留水で 満たされている。この満たされたプレートを次に凍結し、その後にポリパラキシ リレンで所望の厚みになるまで被覆する。被覆後、該装置を温めて解凍し、裏プ レートを外し、水を蒸発により除去する。装置をさかさまにしてホール中および 膜中を所望の細胞濃度とする。次に、裏プレートを示されたように底表面に付着 させる。 もしくは、細胞含有媒質をホール内で凍結してプレートを膜厚みまで相似に被 覆し、細胞は上記のように凍結する。そのような装置において、上部膜と下部膜 は各区画で設けられよう。 生体人工膵臓および他の生物学的装置の開発に大きな重要性を持つのは、（１ ）将来利用のための膵島の保存とそのリストを作り；（２）インビボでの性能規 格値を保証するための機能性を証明し定量するためのリストの膵島を定期的に試 験し；（３）膵島を所望のマトリックスおよび移植装置中へ導入し；（４）移植 前の装置の機能性のリストを作り、機能性を試験、測定し；そして（５）ヒトの 利用のために安全性を確保するために潜在的ウイルスまたは他の病理学的生物汚 染物の存在を十分な時間で決定することである。これまで報告された膵臓島のイ ンビトロでの機能性の保持の成功は限定されてきた。 これらの目標は、保存、製造、機能性試験リスト、および病原性試験のために 患者の体温前後で易流動性であるか、注射可能であるか、または液体の状態を提 供するために水素結合を切断するように処理されたハイドロゲルに基づくマトリ ックスを利用することにより達成される。さらに具体的には、ハイドロゲルは、 分子内水素結合を壊すことができる結果としてトロポコラーゲン構造が解かれる Ｒ基を有するアミノ酸の長鎖配列からなる骨格により特徴付けられる。これらの 分子内結合はＲ基の水素と水との水素結合に置き換えられる。ハイドロゲルには 、非コラゲナーゼハイドロゲルの場合、効果的な量の未変性コラーゲンおよび／ または煮沸または変性コラーゲン、すなわちゼラチンが補われる。いずれも細胞 部分が付着することのできる結合部位を安定な環境に提供するのに効果的である 。コラーゲン系化合物は、熱依存性水素結合形成と双極子モーメント相互作用に 基づいて、膵島、肝細胞等の細胞付着のマトリックスとして働き、自然な環境を 細胞成長に提供する。コラーゲン系化合物は煮沸させると、アミン、カルボキシ ル 基、ヒドロキシル基、およびスルフヒドリル基の相互作用に基づくゲルを容易に 形成する極性および非極性アミノ酸を含有する。力に対するマトリックスの抵抗 は、水素結合および双極子モーメント相互作用から二価カチオン干渉を除くキレ ーターを添加することにより増強することができる。露出された活性基は低温で この水素結合形成により水を固定するために用いられ、こうして低温での熱的外 傷を最小化する。 保存のために、マトリックスを低温で細胞を損傷することなく保存することを 可能とする効果的な量の高分子量の凍結保護剤を加えることにより、低温保存の 必要性なしに抑制代謝条件が得られる。さらに、本発明は、熱依存性細胞の膨張 と収縮に不活性な緩和物を提供する代謝的に安定な低温保存剤を包含する細胞マ トリックスを提供する。好ましい低温保存剤は、スルフヒドリル基がジスルヒド 結合部位および力に対する増強マトリックス抵抗を提供し、ならびに酸化窒素の 蓄積を抑制している硫酸化デキストランである。そのような硫酸化された基は、 継続した膵島の成長と保持のために必要であると当業者に知られているＩＧＦ− ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ等の成長因子の部位も提供する。 −ＮＨ₂と−ＣＯＯＨとの水素結合の阻害を取り除くことにより、スーパーオ キシドからの有害ヒドロキシルフリーラジカル（ＯＨ−）の形成を、これが起こ るために必要とされる遷移金属および重金属をキレート化することにより阻害す ることにより、ならびにその微生物汚染に対して保護することによりマトリック スの剛性を高めることのできるクエン酸、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ等の二価キレ ーターの添加が保存マトリックスに有利である。マトリックスを構成する液体は 細胞に栄養を提供するための認識された成長媒質の形を取ってもよい。微生物学 的汚染に対する付加的な保護を提供するために、従来の抗生物質を添加すること ができる。 採取した直後に細胞部分を装置に直接に導入して移植が低温保存を必要とせず に行われる場合、低温保存剤は減少させても省いてもよい。しかし、経膜による 向上した運搬のために、マトリックスはホストまたは患者体温では実質的に液体 であるのが望ましい。これは二価キレーターの量により達成することができる。 生長媒質および抗生物質を補うことも望ましいであろう。 マトリックスおよび細胞部分が、装置の製造中に外傷、力および温度変化を受 ける場合、液化温度に影響を与えることなくマトリックスの剛性の増加させるこ とが望ましいであろう。下記のように、これは、異なる水素結合潜在性の−Ｒ基 を有するアミノ酸を利用して結合形成を高めることにより得られよう。 そのようなアミノ酸および関連化合物は、核の破壊と他の関連した障害から細 胞死を引き起こすことが知られている酸化窒素およびその代謝物からの細胞の保 護を提供する。細胞マトリックスはこれらのアミノ酸および関連化合物を利用し てＬ−アルギニンが酸化窒素合成酵素のいずれかのイソ型タンパク質により酸化 窒素を形成するのを阻害する。特に、システイン、およびコラーゲン材料中に見 られるスルフヒドリル基を有する他の関連化合物も既に形成された酸化窒素を除 去することで酸化窒素が誘導する損傷の防止にも役立つ。 本発明は、生人工膵臓の目的のために新しいハイドロゲルマトリックスを利用 するもので、ここにおいて単離されたブタの膵島は準周囲温度、例えば冷蔵庫温 度の４℃で６ヶ月以上の長期間にわたって保存することができる。上記のように 、改良ハイドロゲルマトリックスは、デキストラン、アミロペクチン、プロテオ グリカン類および類似の高分子量の凍結保護剤等の不活性高分子緩衝物質により 、低温条件に対して保護される加熱もしくは変性を受けた動物コラーゲンに基づ く。当業者には理解されるように、本改良ハイドロゲルマトリックスは煮沸また は化学処理による共有化学結合の破壊、および熱感受性水素結合の数および双極 子モーメント引力の増加に基づくものである。共有化学結合をそれらの温度感受 性結合および引力に置き換えることにより、保存のためににさらに低温で長期間 にわ たって所望の組織を固体のマトリックス処方物中に埋め込むことができる。所望 の組織をより固体のマトリックス中に保つことにより、水に常にさらされている ことから生じる損傷が減少し、代謝および気体交換が抑制される。事実上、本発 明は氷点下低温保存技術の極端に走ることことなく組織を保存する。次に、この マトリックスは所望の高い温度で液体となり代謝および成長を高め、栄養および ホルモン生成物の分散を促進することができる。元のハイドロゲルマトリックス はその分子間共有結合（スルフヒドリル結合等）を壊してしまっているので、マ トリックスは次に双極子モーメント引力または水素結合を増加させる部分を加え ることにより所望の規格値にしたがって改良することができる。 ゼラチンに加えてこの方法のために適当なハイドロゲルマトリックスの多くの 具体物が利用可能であり、例えば煮沸アガロース、アルギネート、ケラチンおよ び他のアミノ酸、アミノグルカン類およびプロテオグリカン類、および分子内水 素結合が壊されてＲ基の水素と水との水素結合と置き換えられてよく認識された ゲラチン状のコンシステンシーを生じうることのできるＲ基を有するアミノ酸の 長鎖配列からなる構成骨格を有する他のゲル等が挙げられる。これと関連して、 例えば、２０グラムの寒天を５ｍｌのＭｅｄｉａ １９９に置き、得られた溶液 を１Ｎの塩酸でｐＨ２に減少させた。溶液を３７℃で維持し、１０分間撹拌して 溶解した。この溶液に１００ｍｇのデキストランおよび１ミリモル濃度のＥＤＴ Ａを加えた。得られた処方物は受容者体温３７℃では液体であり、４℃の冷蔵庫 温度では相当にさらに粘性であった。そのような技術は、所望の目的を得るため に必要とされるように添加物を調整して他の所望の水素のために用いることもで きる。 所望の物理的性質に依存しながら、これらのマトリックスは他の薬品の添加に より増加もしくは減少した力（堅さ）に対する抵抗を有することができる。以下 の実施例に記載されるように、そのような堅さは、極性Ｒ基または接近可能な水 素／ヒドロキシル基を有するアミノ酸部分を添加することにより高められて、そ の増強マトリックスが冷却されるにつれて双極子モーメント引力と水素結合を高 める。基本的に未変性のコラーゲンまたは変性コラーゲン、ゼラチンの上記のハ イドロゲルマトリックスへの添加は、組織または単離細胞が固定するための格子 構造を提供する。よって、いずれの組織もこのタイプのハイドロゲルマトリック スに埋め込むことができ、その性質は、以下の実施例に記載のように単離組織の 所望の性能に応じて適合させることができる。 単離された膵臓島の保護と保存目的のために、一つの実例は加熱された動物コ ラーゲン、すなわちゼラチンを利用し、そしてデキストラン、アミロペクチン、 プロテオグリカン類、または水中での熱変化により誘導される外傷を制限するこ とのできる他の高分子量の低温保存剤等の効果的な量の不活性高分子緩衝物質を 用いることにより、低温条件に対して生存組織を保護する。これらのマトリック スは熱的な膨張と収縮に対する緩衝物質として働く。そのような緩衝物質がない と、膵島は熱的変化により引き起こされる膨張および収縮により誘導される物理 的外傷ならびに水の熱感受性移動の結果として細胞膜に対して誘導される外傷に 耐える能力を減少させてしまう。 さらに、本改良ハイドロゲルマトリックスは、ポリマー被覆操作中に遭遇する 真空圧等の激しい気圧外傷に対してそれら組織を防御する。これは、温度とマト リックスに依存する水素結合とジスルヒド結合の調節により力に対するゼラチン の抵抗を高めることにより達成される。カルボキシルまたはアミンＲ基（グルタ ミン酸またはアルギニン中に見られるもの）を含有するアミノ酸の添加による水 素結合形成の増強により、システインまたはメチオニン残基の添加によるジスル ヒド結合により、またはグルタミン、スレオニン、またはアスパラギン等の非荷 電であるが極性Ｒ基を有するアミノ酸の添加による増加した双極子モーメントに より保存および製造用マトリックスを強化してもよい。水素結合および双極子モ ーメント引力は、保存中にマトリックスの細菌汚染に対する保護も提供するＥＤ ＴＡ等の二価キレーターによりさらに高めることができる。 コラーゲンは他のタンパク質には通常見られないアミノ酸、例えばグリシン、 ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシジンからなる繰返しトロポコラーゲンポリ ペプチドサブユニットとしてすべての動物組織中に見られる。コラーゲンは、共 有架橋結合が成熟組織により形成された場合に高い引張強さを有する不溶性の繊 維を形成する。しかし、従来のゼラチンの製造方法におけるようにコラーゲンを 煮沸すると、これらの架橋結合は壊され、その三次元構造は解かれて緩やかな会 合による多くのポリペプチドが生じる。 コラーゲンは、剛性が高くなる順で挙げれば靭帯、腱、軟骨、骨および歯等の 多様な組織に見られる主要結合タンパク質であり、分子内および分子間結合力に 基づく多様な物理的性質を達成するコラーゲン能を示す。未変性トポコラーゲン は、長さが３，０００オングストロームである最も長い公知のタンパク質である が、直径はわずかに１５オングストロームである。コラーゲンの煮沸は、不溶性 の硬くコイルしたヘリックストロポコラーゲンサブユニットを壊して、不溶性の トロポコラーゲン分子をその元の硬くコイルされたケーブル立体配座を開いて三 つの分離したペプチド鎖に分させることができる。次に個々のペプチド鎖は埋め 込まれた膵島のために二つの重要な機能を果たすために用いられる。第一に、そ れらは単離された膵島組織が付着するための結合部位を提供し、第二にそれらは 上記の被覆方法の間に膵島の保護のために用いられる温度感受性マトリックスを 提供する。 硬くコイルされた三本鎖構造の損失は、協同的相互作用により協同的に互いを 強化する弱い個々の相互作用の和によりストランドが安定化されていることを示 している。煮沸は個々の鎖を解いてそれらの側鎖のＲ基を他の相互作用に利用可 能とさせる。煮沸されたコラーゲンは、膵島が付着するように多様な結合領域を 露出させる。図６は電子顕微鏡写真である（硬くコイルされたトロポコラーゲン ヘリックスから一度は構成されたもので、開かれた単一ペプチド鎖の一つに対し て結合している単離された３，０００倍の膵島）。不完全なほどけたヘリックス は図７の括弧内の領域にまだ存在し、未変性材料が結合部位を増加させる補足物 として用いられうることも示している。 個々のコラーゲン鎖を互いに結合させる横断水素結合が壊されて、ヒドロキシ プロリンおよびプロリン残基のピロリドン環の反発により与えられた立体安定性 を無効となる。その結果、十分な鎖間水素結合が壊されるときに、立体的反発は 超螺旋コイルを不安定にして個々の鎖を別々に分ける。グルタミン酸およびアル ギニン等の高い荷電の極性基を含有する補充アミノ酸を添加することにより、周 囲のゼラチン鎖に対する増加水素結合形成が生じて、３０℃以下の温度で他のゼ ラチン鎖上に水と極性基を引き付け固定する。水のこの固定は温度変化からの細 胞膜損傷を減少する。システインの添加により強いジスルヒド架橋結合を形成で きる。これらの種類の結合形成を高める他のアミノ酸としては、荷電または非荷 電の極性側鎖基を有するものとスルヒド結合形成能を有するものとが挙げられる 。 水素結合の数とジスルヒド結合形成とを高めることにより、マトリックスは３ ０℃以下の温度で力に対してより耐性がある。未変性ブタ皮膚コラーゲンは６５ ℃の熱安定性定数を有し、この温度でトロポコラーゲン鎖の５０％が解離する。 ヘリックス構造を壊すことにより、ゼラチン系マトリックスの融解温度は約３０ ℃まで低下する。これはマトリックスを体温（３７℃）で適切に液体とするため に重要で、パラキシリレン膜を経るグルコースおよび他の栄養の迅速で生理学的 運搬を可能とする。 水素結合に干渉する二価カチオンの除去により、力に対する抵抗性すなわちマ トリックスの剛性が向上する。これは、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸および類 似の二価カチオンキレーター等多くのキレーター（キレート化剤）の添加により 達成することができる。得られたマトリックス剛性の増加は、ある場合では膵島 に悪影響を与え得るポリマー被覆法、真空圧および低温度中のマトリックス組織 により経験される条件に対して保護を提供する。 膵島の結合を高めるために、ブタの未変性コラーゲンを少量で加えてブタの膵 島に更に結合ネットワークを提供してもよい。上記のように、保存および製造用 マトリックスは、保存中のマトリックス汚染に対して保護も提供するキレーター のＥＤＴＡ等の二価キレーターにより水素結合またはアミン−カルボキシル架橋 結合の増強により強化してもよい。インビボでの経膜による最大分散を提供する ために、マトリックスは受容者体温で易流動性であるか、注射可能であるか、ま たは液相である一方で、低い保存温度、好ましくは患者体温よりも僅かに低い温 度すなわち３５℃および保存温度で固相であるように設計される。膵島が低温で 減少した代謝を有し、膜の被覆法が該温度程度、通常は周囲温度で実施される限 り、被覆のために上記マトリックスを患者体温よりも僅かに低く保持することが 望ましい。 ブタの膵島とともに用いられるゼラチン、好ましくはブタ系のゼラチンが液体 、好ましくは従来の生物成長媒質の一つと混合される。所望のゲル温度に基づい て、ゼラチンは約０．０１〜３０ｍＭ濃度、通常０．１〜１０ｍＭ濃度、好まし くは約０．５〜５ｍＭ濃度で存在し、すべてが保存温度で固相を、移植温度で液 相を提供する。液体、水または実質的に活性のない液体、好ましくは少なくとも 部分的に成長媒質は、通常は１５〜９６．５重量パーセントのマトリックス、好 ましくは約４５〜８４．５重量パーセントのマトリックスの量で存在する。緩衝 物質は、選択された保存温度にて熱的保護を提供するのに十分な量でマトリック ス中に存在し、マトリックスに対して０．１〜３０重量％、通常は０．５〜２０ 重量％、好ましくは２〜１０重量％の濃度でゼラチンおよび液体マトリックス中 に存在する。二価キレーターはマトリックス中に、通常はマトリックスに対して 約 ０〜２０重量％、好ましくは約０．０５〜１０重量％で保存マトリックス中に存 在して所望の構造的結合性を与える。このタンパク質媒質は０．０〜３０．０重 量パーセントのマトリックス、通常は約０．０５〜２０重量パーセントのマトリ ックスの範囲、好ましくは５〜１５重量パーセントの範囲の量で媒質中に存在し て栄養を膵島に提供してもよい。抗生物質は０．０〜３０重量パーセントのマト リックス、通常は０．０５〜１０重量パーセントのマトリックスの範囲、好まし くは１〜６重量パーセントのマトリックスの範囲の量で存在させて従来の生物学 的パッケージ中での感染または汚染を防止する。未変性コラーゲンはマトリック ス中でマトリックスに対して約０〜３０重量％、通常は約０．１〜５重量％、好 ましくは約１〜３重量％で存在してもよい。アミノ酸は０〜３００ｍＭ濃度の量 で存在する。 実施例５ 力抵抗に対するマトリックスに望まれる要件に依存しつつ、広範囲の濃度の添 加物が組織の保存、組織培養、または上記の相似ポリマーによる組織の被覆のい ずれかのために存在する。適切なマトリックスは保存、製造および移植のために 下記のマトリックス基材を用いて上記にしたがって調製してもよい。 低温保存剤 ０．０１〜１０００マイクロモルのデキストラン、分子量５０，０００（Ｓｉ ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号Ｄ５２ ５１ ゼラチン ０．００１〜１００ｍＭのブタ由来コラーゲンからのゼラチン、だいたいの光 沢５−３００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉcaｌ社、Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭＯ） タンパク質添加物 ０〜３０％の新生ウシ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔ ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、カタログ番号１６０１０−４３ 抗生物質 ０．１〜３０％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）、カタログ番号９３６６ ０．００１〜３０％のフンギゾン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓ ａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）、カタログ番号９３５２ ０．００１〜３０％のコリスチン ０．００１〜３０％のセフタジジム コラーゲン ０．０１マイクロモル〜３０ｍＭの小ウシ皮膚からの酸可溶性タイプＩＩ（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号３５１ １ アミノ酸 ０．０１マイクロモル〜３００ｍＭのｄｌ−システイン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、カタログ番号９７６８ ０．０１マイクロモル〜３００ｍＭのグルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ）、カタログ番号Ｇ−７０２９ ０．０１マイクロモル〜３００ｍＭのｄｌ−アルギニン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号Ａ−４８８１ ０．０１マイクロモル〜３００ｍＭのｌ−システイン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号Ｃ−４８２０ ０．０１マイクロモル〜１０ｍＭのｌ−グルタミン酸塩酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号Ｇ−２１２８ 二価キレーター ０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ ＥＤＴＡ 生長培地 他成分を所望の濃度とする適当な容量、Ｍｅｄｉａ １９９（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号１２３４０−０２２ 本発明において、安定で固いコラーゲンの下部構造のこれらの条件は、好ましく は上記の緩衝物質の存在下、さらにＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸等の二価また はカルシウムキレーターの存在下に煮沸変性コラーゲンからなるマトリックスに 膵島を置くことにより造り直される。このマトリックスは、マトリックスの性質 が体温で液相を提供するように調節してもよいコラーゲン媒質に膵島を再び付着 させる。さらに、力に対するマトリックス抵抗は二価キレートにより調節して、 膜を適用するために、被覆サイクルで経験される被覆温度にて固相を提供する。 低温保存剤の熱的保護により高められた固体被覆相は、さもなければ被覆真空で 経験される気圧外傷からの保護を提供する。さらに、このマトリックスは膜適用 前膵島組織とその後の移植前膵島組織の試験を可能とするインビトロでの膵島の 生存度を向上させる。上記のマトリックス以前では、当業者により一般的に報告 されて受け入れられた膵島の生存は７〜１４日の範囲であった。以下に詳細に論 じられるように、存在するマトリックス中の膵島はインビトロで１７４日を超え た期間で機能性を減少させることなしに生存した。 コラーゲンを含有する媒質は変性コラーゲンまたは基本的に未変性コラーゲン であってもよい。適当な変性コラーゲンは、動物、鳥、魚およびヒト起源に由来 する通常の煮沸によるゼラチンである。例えば、未変性コラーゲンの三次元構造 が解かれ、得られたコラーゲンが緩い会合でポリペプチドを作る解かれた繊維構 造となるように処理された食物等級のゼラチンならびに医薬等級の煮沸コラーゲ ンを用いてもよい。ゼラチンには基本的に未変性の動物コラーゲンを補って未変 性コラーゲン性結合構造を提供してもよい。コラーゲンは、三次元マトリックス に所望の構造結合性を提供し、その内部の膵島に結合部位を提供するのに十分な 量で存在する。低温で膵島を保護するための緩衝物質は、好ましくは５００，０ ００分子量のデキストランで、好ましくは硫酸側鎖基のために水素結合形成の増 加に寄与するように硫酸化されている。他のものとしてはアミロペクチンが挙げ られる。生長媒質はＭｅｄｉｕｍ１９９、ＲＰＭＩ等の組織培養培地であってよ い。タンパク質媒質はヒトまたは動物起源に由来する血清であり、好ましい血清 は例えば新生ウシ血清または胎児ブタ血清である。 他のマトリックスが７％以上のデキストランを有した一方で、１％未満のデキ ストランを有する以外は同一のマトリックス成分を測定した一連の実験において 、１００ｍｇ／ｄｌグルコース誘発に応答してインシュリンを分泌する埋め込ま れた膵島の能力は、さらに多いデキストランを有するマトリックスにおいて二倍 となる一方で、デキストランが少ないかまたは存在しないマトリックス中の膵島 は同じ時間にわたって半減したインシュリン分泌能を有した。 実施例６ 新鮮なブタ膵臓の脾臓葉から従来のコラゲナーゼ消化およびフィコリ分離を用 いて膵島を単離した。次に、膵島をＭｅｄｉａ １９９中で３７℃で５日間イン キュベートした。膵島を、コラーゲンを含有する媒質、緩衝物質、成長媒質、タ ンパク質媒質、および二価キレーターからなるハイドロゲルマトリックスに移し た。マトリックスは抗生物質および細菌発育防止剤等の多様な従来の添加物も含 んだ。マトリックスは室温あたりで固体であるが、３７℃あたりの患者体温で液 相となる。 実施例７ 保存、製造および移植のためのマトリックス基材として以下のものを用いて、 上記にしたがって適当なマトリックスを調製してもよい。 低温保存剤 ６．０グラムのデキストラン、分子量５００，０００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ ｉ ｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号Ｄ−５２５１ ゼラチン １４．５グラムのＫｎｏｘ非味付ゼラチン（Ｋｎｏｘ Ｇｅｌａｔｉｎ社、Ｅ ｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ） 生長媒質 ６０ｍｌのＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌ ｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号１２３４０−０２２ タンパク質媒質 ０〜１５％の新生ウシ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔ ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、カタログ番号１６０１０−０４３ 抗生物質 ０〜３％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）、カタログ番号９３６６ １〜３％のフンギゾン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）、カタログ番号９３５２ コラーゲン ５０〜１００ｍｇの小ウシ皮膚からの酸可溶性タイプＩＩ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）、カタログ番号Ｃ−３５１１ マトリックス基材を処方するために、生長媒質をビーカーに置き、撹拌棒を用 いて迅速に撹拌しながら撹拌／加熱プレートで加熱して十分に混合する。緩衝物 質を、撹拌を維持しつつ生長媒質にゆっくりと加える。一緒にした溶液を１〜２ 分間音波処理し、その後に撹拌加熱しながら溶液にゼラチンをゆっくりと加える 。その後、溶液を５回の１０秒間の間隔でマイクロ波をかけ、次に１〜２分間音 波処理する。次に、２〜１０ｍＭのＥＤＴＡをその温かい溶液に加え、完全に混 合し、６０〜７０℃に加熱された／真空乾燥オーブン中におき、排気する。加熱 さ れ排気された溶液を少なくとも５分間平衡化し、膵島を加える前に３７℃まで冷 却する。 実施例８ 膵島を上記の実施例６のマトリックスに約２００膵島／１００μｌマトリック スの割合で加えた。膵島マトリックスの一部を３６ｍｍのポリスチレンウエルに 移した。残りの膵島マトリックスは、２２０膵島／１０ｍｌマトリックスの割合 で１８ｍｍ・６．５ｍｍの開放端円筒状装置に移した。装置を冷却してマトリッ クスを固化し、約４，０００オングストロームのポリパラキシリレンＮで形に沿 うように（ｃｏｎｆｏｒｍａｌｌｙ）被覆した。 ウエルに入れた膵島と装置を２週間までの期間冷蔵庫で保存し、その後種々の グルコース濃度で１〜３時間、静的インキュベーションを実施して３７℃にした 。 ウエル中の膵島には、環境栄養培地を３０日ごとに交換して与えた。分離後７ ３日目に、２２．０ｍＭグルコース中で１５分間インキュベートして３μＵイン シュリンを刺激した。分離後３６日目に２．２５、５．５および１１．０ｍＭグ ルコースでの１８０分間の静的インキュベーションに応答して、装置は１．６１ μＵ、６．６７μＵ、１５．６μＵのインシュリンを分泌した。すべての膵島に おいて７３日間細菌汚染を生じず、膵島構造は肉眼的に無傷のままであった。 図６〜１１は９０日齢の膵島の走査型電子顕微鏡写真（４５‐１８，０００倍 ）を示している。図６に示すように、代表的に２００の数字で指示された膵島の クラスターは、その長さに沿った種々の位置でコラーゲン線維２０２に結合して おり（４５倍）、膵島の粗構造を維持しながら、膵島組織がマトリックスポリマ ーに付着していることを示している。図７は図６をさらに拡大したもので、コラ ーゲン線維に沿った膵島の結合を例示しており（３，０００倍）、図７の挿入図 は図８に示されているまだ線維に結合していない膵島クラスターである。図９は 線維網に結合した代表的な膵島クラスターを示す（９，０００倍）。図１０Ａは 、 コラーゲン線維への付着のための単一ベータ細胞の結合部位２０４を示す（１８ ，０００倍）。図１０Ｂは、マトリックス中で細胞分裂が起こっていることを表 わす単一ベータ細胞を示している。図１１は、煮沸中に展開されなかったコラー ゲンの線維２０６を示す。図１２と１３は、二価カチオン（４ｍｍ塩化カルシウ ム）を加えてマトリックスから取り出した後の９０日齢の膵島の光学顕微鏡写真 で、肉眼的に無傷の形態を明らかにしている。 現在受け入れられている膵島分離の手法は、移植用の高度に精製された無傷全 膵島に頼っている。この成果を達成するために必要な時間と材料は長大で費用が かかり、概して収率が低い。これまで、膵臓が過剰消化されて膵島の実質的な断 片化が生じた時には、従来、断片化された膵島が機能を保持しているとは認めら れなかったため、分離は失敗であった。上述したマトリックスは、従来の保存媒 質あるいはマトリックス中での、無傷の機能を備えたそのような断片化した膵島 の使用を可能にする。 本発明はまた、過剰消化された膵を上述したマトリックスにおいて使用するこ とを可能にする。特に、ブタの膵臓を従来のようにコラゲナーゼ法によって消化 した。遊離した浮動全膵島が生じた時に消化を終了せずに、実質的な断片化が認 められるまで消化を継続した。その後、消化を終了させ、断片を繰り返し洗浄し て、実質的に腺房組織を含まない断片化した膵島のペレットが得られるまで遠心 分離にかけた。約３，０００膵島当量／ｍｌマトリックスの割合で膵島を上記の 実施例７のマトリックス製剤と混合した。次に膵島マトリックスを３６ｍｍプレ ートウエルに沈着させ、冷蔵した。毎日、膵島マトリックスを３７℃に加熱して 、顕微鏡下で観察し、ビデオテープに収めた。最初の数日間、各々の視野は多数 の遊離した浮動膵島断片を示した。しかし日にちが経過すると共に、断片は減少 し、見掛け上完全な膵島のクラスターが現われた。分離後１４日目には、実質的 に断片化の存在しない、膵島のクラスターだけが見え、１００ｍｇグルコースの 刺激 に応答して放出されたインシュリンレベルは１５０μＵであった。 上記のマトリックスはまた、１８ヵ月間液体窒素中で凍結した寒冷保存膵島に 関しても良好な成績を提供する。これまで、そのような寒冷保存膵島は低い機能 性を示していた。寒冷保存しておいた膵島を解凍し、１，０００膵島／１００μ ｌマトリックスの割合で上記のマトリックスに混合し、８つの開放端円筒を持つ 装置に分配して固化した。次に装置を約４，０００オングストロームのポリパラ キシリレンＮで形に沿うように被覆した。被覆後２日目の装置からの最大分泌は ２．２μＵ／ｍｌであった。その後３〜４日ごとに、１００ｍｇの正常血糖濃度 との接触に応答して最大分泌は４．４、８．３、１９．０、３３．０μＵ／ｍｌ とほぼ倍増した。非糖尿病被験者における平均空腹時血清インシュリン濃度は５ 〜２０μＵ／ｍｌの範囲であるので、解凍後の寒冷保存膵島が治療的な機能を提 供することは明白である。 装置の外部でインビボで使用した時のマトリックスも、筋肉内移植部位におい て膜に隣接する血管新生と脂質形成を促進する。これは今まで、膵島の長命化を 促進するのに十分な酸素付加と血管アクセスを提供するとはみなされていなかっ た。特に、図５の約３２の充填して被覆した開放端円筒を、１５ｋｇのビーグル 成犬において広背筋の間に筋肉内移植した。他の部位としては、皮下脂肪、腹腔 内区域、あるいは門脈循環付近の位置などの容易にアクセスできる領域が含まれ る。装置の挿入後手術部位に約２０ｍｌのマトリックスを充填した。円筒は全体 で約３０，０００の膵島を含んだ。イヌを膵切除し、血糖レベルおよびブタＣ‐ ペプチドレベルに関してモニターした。血糖レベルおよびＣ‐ペプチドレベルへ の装置の明確な寄与が認められたが、１７日目に、膵切除術から生じた重篤な器 官機能不全を認め、動物を犠牲剖検した。装置の除去後、病理的検査は膜の上に 存在するマトリックスにおいて、いずれも膵島の保持と長命化にとっての必要条 件である、実質的な微小血管形成と脂質成長を明らかにした。 膜と組み合わせたマトリックスも、グルコース誘発に応答して認められた時間 枠内でインシュリンを放出し、誘発除去後は放出を停止して、インシュリン放出 を刺激する膵島へのグルコースシグナルの速やかな伝達と、シグナルが除去され た時の、放出されたインシュリンの膜を越えた拡散を示す。さらに、グルコース レベルの正常化後装置を速やかに切ることができない場合、正常化後もインシュ リンの産生が継続され、潜在的に生命を脅かす低血糖状態をもたらすことがある 。本発明の装置は速やかにこれができることを以下に明瞭に示す。約４，０００ オングストロームのポリパラキシリレンＮで立体被覆した１８円筒装置にマトリ ックスを包埋した。その後３、８および１２日目に装置を検査した。図１４に示 すように、１００ｍｇ／ｄｌグルコースとの接触に応答して、装置は刺激後１５ 分以内にインシュリン産生の増加を示し、３００μＵ／ｍｌのインシュリンピー クに達した。装置を取出し、５０ｍｇ／ｄｌのグルコース溶液中に入れると、図 １５に示すように１３０μＵ／ｍｌのインシュリンピークに達し、前記と比較し て実質的に低下した。さらなる試験で、インシュリン産生は１０‐２０分以内に 休眠レベルに戻ることを確認した。さらに、装置を４００ｍｇ／ｄｌのグルコー ス溶液に入れた。その場合の刺激の傾向と遮断は同様であった。試験期間中にわ たってグルコースに応答した膵島分泌の明らかな低下はなく、膵島が被覆された 装置内でその機能を維持し、且つ改善しうることを示した。 実施例９ 細胞マトリックスを包含するのに適した装置は、多数の膵島含有カプセルを提 供する、ＣｏＳｔａｒ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから市販されてい る１８ウエルのポリエチレンストリップである。図１６に示すように、ストリッ プ２４２の各々のカプセルあるいはウエル２４０に約２０ｄｌのマトリックス２ ４４を注入した。各ストリップは、ウエルに実質上均一に分配された約３０，０ ００〜１００，０００の膵島を含んだ。マトリックスの上部表面はストリップの 上 部表面よりも下に引っ込んでいる。ストリップとマトリックスの上部表面を、ポ リパラキシリレンＮで約４，０００オングストロームの厚さに立体被覆する。引 っ込んだマトリックスは、移植の際に直接組織と接触することから保護された膜 表面２４６を備えている。さらに、宿主（被移植者）によって生じる流体の力は 膜に対する圧縮力をもたらすだけであり、それによってマトリックスは膜の断裂 あるいは裂傷の潜在的な可能性が低下する。 最初のイヌである、９ｋｇの意図的に飼育された雌性ビーグル犬、Ｄｏｇ Ａ ＳＹに、肩の後の左背側胸郭に沿った筋肉内切開を通して挿入した約３０，００ ０の膵島を含有する当量の３つのストリップを植え込んだ。その後、切開部に約 ２０ｍｌの非細胞マトリックスを浸透させ、切開を閉じた。７日後、Ｄｏｇ Ａ ＳＹに完全膵切除術を行った。Ｌｉｆｅｓｃａｎによって製造されたＯｎｅＴｏ ｕｃｈ Ｍｅｔｅｒを使用し、同時に標準臨床自動化学機器によって毎日血糖値 を測定した。毎日の空腹時血糖値の読取り結果を図１７に示す。血糖レベルを約 １５０ｍｇ／ｄｌ以下に保つため、Ｄｏｇ ＡＳＹにヒトＵｌｔｒａ‐Ｌｅｎｔ ｅインシュリンとレギュラーインシュリンの組合せを表示されている量で、実質 的に等しく分配して与えた。いずれも従来の慣例に従って、血糖レベルを抑える ためにレギュラーインシュリンを投与し、血糖レベルを維持するためにＵｌｔｒ ａ‐Ｌｅｎｔｅを登用した。装置中の膵島の数は、他の研究者達が血糖コントロ ールのために推定している数よりもはるかに低く、ｋｇ当り約８，０００膵島あ るいは試験した大きさのイヌについて約１２０，０００膵島である。 膵島が少ないことを考慮すると、やはり装置が宿主内で機能しているかどうか を調べることが重要である。これはブタ特異的放射免疫測定法（ＲＩＡ）を通し てＣ‐ペプチドレベルを測定することにより達成できる。この検定は、膵島を離 れる前にペプチダーゼによってプロインシュリン分子から開裂されて、生物活性 インシュリン分子を生じる、「Ｃ」形をしたペプチドを測定する。Ｃ‐ペプチド は種特異的である。Ｌｉｎｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯから市販さ れている極めて特異性の高いＲＩＡキットは、イヌＣ‐ペプチドとブタＣ‐ペプ チドを容易に識別する。後者が検出されることは移植した装置によるインシュリ ンの産生を示す。Ｄｏｇ ＡＳＹに関して、定期的に血液サンプルを採取し、ブ タＣ‐ペプチドについて検定した。その結果を図１９に示す。１日目に装置を移 植し、８日目に膵を切除した。膵を切除するまでの期間中は血液サンプル中にブ タＣ‐ペプチドが検出され、装置がブタインシュリンを産生していることを示し た。試験期間を通じて、明らかな静止期間を除き、検出可能なレベルが測定され た。 上述したマトリックスの、ＲＮＡ含量、たんぱく産生のための細胞遺伝子コー ド化の測定、およびインシュリン分泌能力への影響を調べるため、イン ビトロ 実験を実施した。図１８から、分離から７日目に５，５００膵島が最大のインシ ュリン分泌と、測定された総ＲＮＡの最低点を示したことがわかる。同様に、２ １日目に総ＲＮＡが最大濃度に達し、一方でインシュリン分泌機能は極めて低か った。測定期間中、膵島の生活能力は一定なままであった。これらのデータは、 ＭＲＮＡが増加すると共にインシュリン分泌能力が低下し、逆もまた同様で、経 時的なインシュリン分泌能力とＲＮＡ産生間の逆の周期を示唆している。これら のイン ビトロデータは、すぐ後に述べる実験記録の中のＩＶＧＴＴ Ｃ‐ペプチ ド測定によって裏付けられる。そのような静止期間後、Ｃ‐ペプチド産生は前の 試験期間中のレベルと実質的に同じかまたはそれを越えるレベルに回復した。１ ５日目に、Ｄｏｇ ＡＳＹに関して従来の静脈内耐糖能試験（ＩＶＧＴＴ）を実 施した。図２０に示す結果は、装置がグルコース負荷に応答して多量のブタイン シュリンを産生できたことを明らかにしている。 ２番目のイヌ、１０ｋｇの意図的に飼育した雌性ビーグル犬、Ｄｏｇ ＡＢＪ は、肩の後の左背側胸郭に沿った筋肉内切除を通して挿入した、約２００，００ ０膵島を含む当量の４つのストリップを有していた。その後、切開部に約２０ｍ ｌの 非細胞マトリックスを浸透させ、切開を閉じた。７日後、Ｄｏｇ ＡＢＪに完全 膵切除術を行った。血糖値を毎日測定した。血糖値の読取り結果を表2２４に示 す。Ｄｏｇ ＡＳＹと同様に、実質的に一日中血糖レベルを約１５０ｍｇ／ｄｌ 以下に維持するために、表示されている総量のＵｌｔｒａ‐Ｌｅｎｔｅインシュ リンとレギュラーインシュリンをＤｏｇ Ｂに与えた。 Ｃ‐ペプチドレベルも定期的に測定した。その結果を図２３および図２１Ａと ２１Ｂに示す。１日目に装置を移植し、８日目に膵切除した。膵を切除するまで の期間中、標準０．５ｇ／ｋｇＩＶグルコースボーラスに応答して、０．０４〜 ０．１８ｎｇ／ｍｌのレベルで血液サンプル中にブタＣ‐ペプチドが検出された 。試験期間を通じて、静止期間を除き、検出可能なレベルが測定された。そのよ うな静止期間後、Ｃ−ペプチド産生は前の試験期間中のレベルと実質的に同じか またはそれを越えるレベルに回復した。図２１Ｂは、移植後４０日目と５７日目 （膵切除後３１日目と４８日目）のＤｏｇ ＡＢＪに関するＩＶＧＴＴグルコー ス、Ｃ‐ペプチド、および総インシュリン値を示す。４０日目には、グルコース ボーラスの１分後に最大グルコースレベルが６９２ｍｇ／ｄｌ、５７日目には６ ９０ｍｇ／ｄｌであった。しかし、５７日目まで、Ｃ‐ペプチドは１分で第１期 の最大放出レベルに達し、初期値からの有意の低下（０．１４ｍｇ／ｍｌ）はな かった。 ３番目のビーグル犬、ＡＢＭは、移植後２１日目、膵切除後２週間目に、０． １４ｍｇ／ｍｌの最大Ｃ‐ペプチド濃度を示した。膵切除術前のＩＶＧＴＴデー タを図２２Ａに示す。４５日目に、反復ＩＶＧＴＴは０．２８ｍｇ／ｍｌの最大 ブタＣ‐ペプチド濃度を示し、５９日目には０．４８ｍｇ／ｍｌの最大濃度を示 した（図２２Ｂ）。同様に、ＩＶＧＴＴグルコースボーラスに応答してＡＢＭの 最大血糖値は１７４０ｍｇ／ｄｌから７９０ｍｇ／ｄｌに低下した。 上述したように、マトリックス製剤において膵島が生育し、複製することは明 白である。この改善の性質を調べるため、マトリックスの電子顕微鏡評価とＭＲ ＮＡの定量を行った。再び図６‐１１を参照すると、膵島のクラスターが７４日 目にコラーゲン線維に沿って付着していることは明らかであるが、当初の所見は そのような付着がごくわずかであることを示している。イン ビボおよびイン ビ トロで、前述したマトリックスにおける経時的なＣ‐ペプチド産生量の改善が認 められる。これは、膵島細胞が刺激を受けてインシュリンを産生できるようにな る前に起こるような、膵島のコラーゲン下部構造への結合に関係している。膵島 の外側表面のくぼみが、コラーゲン線維への膵島の結合に関与すると考えられる ２つの部位のひとつである。 膵島組織複製しているかどうかをさらに調べるため、硫酸デキストラン（５％ ｗ／ｖ）培地１９９、５％新生児ウシ血清、子ウシ皮膚およびブタ皮膚コラーゲ ン、ｄｌ‐システイン、ｌ‐グルタミン酸、ｄｌ‐アルギニン（５０−１００マ イクロモル）、ならびに酸化窒素阻害物質として働く、アミノグアニジン、Ｎ‐ モノメチルＬ‐アルギニン、Ｎニトロ‐Ｌ‐アルギニンを含めたｌ‐アルギニン 類似化合物を含有する前述のマトリックスにおいて培養した分離ブタ膵島を、培 地１９９で培養した膵島と比較して、標準トリチウム標識チミジンの取り込み実 験を実施した。前駆物質（トリチウム標識チミジン、１μＣｉ／ｍｌ）を３日間 のインキュベーション期間にわたってＤＮＡレベルに増殖させ、その後組織から 抽出した。かかる手順はＬｅｖｙａとＫｅｌｌｅｙ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６２：１７３‐９，１９７４）の方法に基づいている。 トリス緩衝液中で凍結／解凍処理を繰り返して細胞を溶解し、全核酸を沈澱させ 、過塩素酸で加水分解した。試料の一部を用いて、シンチレーション計数によっ て検出される放射能としてチミジンの取り込みを測定した。もうひとつ別の部分 標本を用いて、ジフェニルアミンとアセトアルデヒドを使用して６００ｎｍで検 出可能な色を生じさせ、存在する全ＤＮＡの定量を行った。 これらの試験は、４℃あるいは３７℃での従来の表面培養に比べて、マトリッ クス中で３日間培養した膵島ではチミジンの取り込みが増強されることを明らか にした。さらに、これら２つの条件下で３０日間まで保持した膵島を比較すると 、著しい増殖活性の差を示し、標識してマトリックスに包埋した膵島は対照培地 で認められた量のほぼ３０倍の取り込みを生じた。対の培養を分析すると、マト リックスと培地培養物の両方について、標識取り込み量に関して極めて緊密な一 致を示した。経時的なトリチウム標識チミジンの取り込みを検討した。２つの実 験からの結果は、初期培養期間におけるこの活性の期限を明らかにし、先に、膵 島培養における遺伝子発現とインシュリン分泌に関して認められたように、この 過程の３０日までの期間での周期的性格を示唆した。ＤＮＡ定量の結果は、上記 のマトリックスに包埋した２８，０００膵島から３００μｇ以上のＤＮＡを確認 し、この含量が３０日間にわたって安定なままであることを認めた。これらのデ ータはさらに、インシュリン分泌によって測定されるように、マトリックスが膵 島の生活能力ならびに機能を増強させうることを確認している。 上述した酸化窒素阻害物質とスカベンジャー、すなわちＬ‐アルギニン類似化 合物と、デキストラン、ヘパリン、システイン、シスチン等のような硫酸化合物 を添加することは、膵島の生存率と分泌機能を改善する。前述したマトリックス の一部は、高い構造的安定性を提供することにより先に述べたような二重の働き をするが、同時に膵島の相対的な低酸素状態から生じる酸化窒素形成も抑制する ように働く。従って、酸化窒素が阻害されるために、前述したマトリックスに包 埋した膵島は、比較的低い酸素状態で数ヵ月間保存した後でも中心壊死を示さな い。酸化窒素は、結合転位あるいは、スーパーオキシド（０２‐）から毒性と反 応性が極めて高いヒドロキシル基（ＯＨ‐）への変換のための触角として働く鉄 あるいは亜鉛のような重金属による虚血性灌流亢進損傷において保護的役割を果 たす。酸化窒素は金属結合部血に結合することができ、従ってより毒性の高いヒ ドロキシル基の形成を阻害し、金属キレート化剤あるいはスーパーオキシドジス ムターゼのような抗酸化剤として働く。マトリックスにＥＤＴＡを加えると、も はやこの機能を果たすことができない結合酸化窒素の代わりにヒドロキシル基を 阻害する役割を果たす。 寒冷保存が必要でなければ、上述したマトリックスは煮沸したコラーゲンを添 加せずに製剤することができ、膵島は、３７℃のより普通の液体環境で数週間保 持することができる。広範囲の硫酸化合物およびＬ‐アルギニンの添加は、滅菌 培養条件下で数週間、そのように保持された膵島の生活能力を増強する。 さらに、これらの酸化窒素阻害物質およびスカベンジャーを、遊離膵島のため の膵臓、肝細胞を調製するための肝臓、脂肪細胞を調製するための皮膚、脾細胞 を調製するための脾臓のような器官および組織を消化するための酵素溶液に加え て使用すると、収率の改善が得られる。たとえば、膵臓から膵島を分離する時点 で従来のコラゲナーゼ消化媒質に加えると、酸化窒素阻害物質およびスカベンジ ャーは内皮の硬さを増強し、それによって結合組織の伸張を防ぎ、また完全な酵 素開裂が膵島の大きさと数の改善をもたらす。適切な酸か窒素阻害物質およびス カベンジャーは、デキストラン、ヘパリン、システインおよびシスチンを含めた 前述の物質、ならびにアミノグアニジン、Ｎ‐モノエチルＬ‐アルギニン、Ｎ‐ ニトロ‐Ｌ‐アルギニンあるいはＤ‐アルギニンを含めたＬ‐アルギニン類似化 合物を含む。許容される酵素溶液は、コラゲナーゼ、トリプシン、Ｌｉｂｅｒａ ｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ‐Ｍａｎｈｅｉｍ）および蛋白分解酵素を含む。有 効量は消化される組織あるいは器官と消化溶液の成分に依存して変動するが、使 用する量は、完全な内皮開裂をもたらすような内皮の硬さを達成するのに十分で なければならない。一般に、器官および組織、特にブタ膵臓に関しては、酸化窒 素阻害物質およびスカベンジャーの量は約０．００１〜２０％重量である。 試験したすべてのイヌにおいて、Ｃ‐ペプチドは上記の周期に従って時間と共 に増加したり減少したりする傾向があったが、経時的に上向きの傾向にあった（ 図２５〜３０）。イン ビトロで認められたように、ほとんどのイヌが６日目に Ｃ‐ペプチドのスパイクを示し、その後２１日目に最低点を示して、これまでに 述べた周期を示唆した。図３１は、膵島を移植前に２１日間培養条件下に保持し た時の、ＡＸＡにおける活発なＣ‐ペプチド反応を示す。イン ビボで絶対重要 なのは、静脈内耐糖能試験で調べたように、移植された装置がグルコース誘発に 応答して速やかにインシュリン（Ｃ‐ペプチド）を産生する能力である。図３１ では、時間を経た装置（１２０，０００膵島当量）は、良好な最大Ｃ‐ペプチド 応答だけでなく、５０日前に膵切除されたイヌにおいて血糖値の正常化を示した 。（時間を経た装置の生活能力を調べるため、試験動物のそれまでの装置は除去 した。）図は、グルコース濃度のスパイクに応答した二相性のＣ‐ペプチド放出 （ＡおよびＢ）を明瞭に示している。これは試験動物Ｃ３２４においても示され ており（図３２）、移植した装置は８０日を経過していたが、９０分以上にわた ってグルコースピーク刺激からＣ‐ペプチドピークが生じた。これらのデータは 、１１型糖尿病患者にとって治療上の恩恵となるであろうイン ビボでの正常な インシュリン拍動性を明らかにしている。 好ましい具体化を説明するために、前述の被包はブタ膵島の異種移植を参照し て述べたが、細胞移植の当業者は、本発明が、甲状腺欠損、成長ホルモン欠損、 先天性副腎過形成、パーキンソン病等のような内分泌状態の欠損している個人へ のホルモン産生あるいは組織産生移植のための他の適用において、また中枢神経 系疾患や他の慢性疾患の治療のための生物学的に活性な物質および遺伝子治療物 質のための移植可能な供給送達系から恩恵を受ける治療条件のための適用におい て有効に使用しうることを認識するであろう。特に、上述した装置およびマトリ ックスは、制限を伴わずに、変性コリン作動性ニューロンの喪失を防ぐためのヒ ト神経成長因子を分泌する細胞、心筋再生のための衛星細胞、ハンチントン病の ための線条体脳組織、肝細胞、骨髄細胞、パーキンソン病のためのドパミンに富 む脳組織および細胞、アルツハイマー病のためのコリン作動性の高い神経系、中 枢神経系に鎮痛薬を送達するための副腎クロム親和性細胞、皮膚移植のための培 養上皮、ならびに筋萎縮性側索硬化症のための毛様体神経向性因子を放出する細 胞を含めて、種々の移植治療における適用が見出せるであろう。それ故、上述し た具体化の様々な修正は当業者には明白であろう。従って、本発明の範囲は添付 の特許請求の範囲によってのみ定義される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/36 Ａ６１Ｋ 47/36 // Ａ６１Ｋ 35/37 35/37 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次のものを含む約１５〜９６．５％重量の水性栄養溶液から成る、細胞組 織の長期保存に適したヒドロゲルマトリックス。 ０．００１〜１００ｍＭのコラーゲン ０．０１〜１０００マイクロモル濃度の凍結保護物質 ０．００１〜１００ｍＭの二価キレート化剤 ０．０１マイクロモル濃度〜３００ｍＭの酸化窒素阻害物質。 ２．コラーゲンが、変性コラーゲンである請求項１に記載のマトリックス。 ３．コラーゲンが、変性コラーゲンと天然コラーゲンの組合せである請求項１ に記載のマトリックス。 ４．凍結保護物質が長鎖炭水化物を主成分とする糖である、請求項１に記載の マトリックス。 ５．凍結保護物質が、デキストランと、硫酸デキストランと、アミロペクチン と、プロテオグリカンとからなるグループから選択される、請求項１に記載のマ トリックス。 ６．酸化窒素阻害物質がアミノ酸である、請求項１に記載のマトリックス。 ７．酸化窒素阻害物質が、デキストランと、ヘパリンと、システインと、シス チンとからなるグループから選択される、請求項１に記載のマトリックス。 ８．酸化窒素阻害物質が、Ｌアルギニン類似体である、請求項１に記載のマト リックス。 ９．該アルギニン類似体が、アミノグアニジンと、Ｎ‐モノエチルＬ‐アルギ ニンと、Ｎ‐ニトロ‐Ｌ‐アルギニンと、Ｄ‐アルギニンとから成るグループか ら選択される、請求項８に記載のマトリックス。 １０．二価キレート化剤が、クエン酸塩と、ＥＤＴＡと、ＥＧＴＡとからなる グループから選ばれる、請求項１に記載のマトリックス。 １１．栄養溶液が水に可溶性のタンパク質を含む、請求項１に記載のマトリッ クス。 １２．さらに抗生物質を含む請求項１に記載のマトリックス。 １３．４℃で固体であり、３７℃で液体であることを特徴とする請求項１に記 載のマトリックス。 １４．約５，０００〜４０，００００の分子量有孔性を有する半透過性膜によ り被包された請求項１のヒドロゲルマトリックス中に細胞部分を含む移植可能な 生体人工装置。 １５．半透過性膜によって被包されたヒドロゲルマトリックス中に細胞成分を 含有し、該マトリックスが約０．０１〜３０ｍＭの量のゼラチン、約１５〜９６ ．５重量％の量の液体、および約０．０１μＭ〜３００ｍＭの量の酸化窒素阻害 物質を含む、移植可能な生体人工装置。 １６．該細胞成分が治療上所望される物質単位を産生し、該膜が前記の物質単 位の分子量から約４０，０００までの間の分子量有孔性を有するポリパラキシリ レンから成る、請求項１５に記載の移植可能な生体人工装置。 １７．該マトリックスが約０．００１〜１００ｍＭの濃度で存在する二価キレ ート化剤を含む、請求項１５に記載の装置。 １８．マトリックスが抗生物質を約０．０１μＭ〜３００ｍＭの量で含む、請 求項１５に記載の装置。 １９．組織から所望する細胞成分を放出するための酵素溶液を用いた組織の消 化における、次から成る改良。 該酵素溶液に約０．００１μＭ〜３００ｍＭの酸化窒素阻害物質を添加するこ と。 ２０．該酸化窒素阻害物質が、デキストランと、ヘパリンと、システインと、 シスチンとからなるグループから選択される、請求項１９に記載の発明。 ２１．該酸化窒素阻害物質が、Ｌ‐アルギニン類似体である、請求項１９に記 載の発明。 ２２．該Ｌ‐アルギニン類似化合物が、アミノグアニジン、Ｎ‐モノエチルＬ ‐アルギニン、Ｎ‐ニトロ‐Ｌ‐アルギニン、あるいはＤ‐アルギニンから成る グループから選択される、請求項２１に記載の発明。 ２３．該酵素溶液がプロテアーゼである、請求項１９に記載の発明。 ２４．該プロテアーゼが、コラゲナーゼと、トリプシンと、リブラーゼ(Libra se)と、タンパク分解酵素とからなるグループから選択される、請求項２３に記 載の発明。 ２５．酵素溶液中に完全な膵島と共に相当量の膵島断片が存在するようになる まで、前記の溶液で膵臓を消化するステップと、かかる溶液を精製して前記の膵 島および膵島断片のペレットを得るステップと、約０．０１〜３０ｍＭの濃度の ゼラチンと約０．０１〜１，０００μＭの濃度の凍結保護物質を含むマトリック ス中にかかるペレットを入れるステップと、前記膵島断片が実質的に識別できな くなるまで液体温度で該マトリックスを保存するステップとを含んでなる膵臓か ら膵島を分離する方法。 ２６．該酵素溶液がプロテアーゼである、請求項２５に記載の方法。 ２７．該プロテアーゼが、コラゲナーゼと、トリプシンと、リブラーゼ(Libra se)と、タンパク分解酵素とからなるグループから選択される、請求項２６に記 載の方法。 ２８．凍結保護物質が、デキストランと、硫酸デキストランと、アミロペクチ ンと、プロテオグリカンとから成るグループから選択される、請求項２５に記載 の方法。