SU1724687A1

SU1724687A1 - Способ получени желатиновых микроносителей дл культивировани клеток животных

Info

Publication number: SU1724687A1
Application number: SU904820903A
Authority: SU
Inventors: Владимир Григорьевич Литовченко; Юсуф Хаджи-бекович Хапчаев; Любовь Леонидовна Миронова; Валентина Дмитриевна Попова; Нина Александровна Семенова
Original assignee: Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР
Priority date: 1990-05-05
Filing date: 1990-05-05
Publication date: 1992-04-07

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии , а именно к способам получени микроносителей дл культивировани клеток животных. Цель изобретени - повышение адгезивных свойств микроносител , упрощение процесса культивировани клеток и увеличение выхода клеточной массы. Дл этого к 3,5-4,0%-ному раствору желатины добавл ют 0,14-0.20% ДЕАЕ-декстрана, 10- кратного раствора Эрла до объемного соот- ношени 1 00:(2,6-3,0)хи глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08- 0,1 %. После формировани гел его замораживают при (-20)-(-25)&deg;С, затем размораживают, дроб т, отмывают и стерилизуют . Частицы микроносител представл ют чеистую структуру с размером частиц 0,05-2,0 мм и размером чеек 40-80 мкм. По сравнению с прототипом на 14% увеличиваетс адгезивность частиц микроносител , выход клеточной биомассы увеличиваетс в 1,3 раза. Кроме того использование полученного микроносител исключает необходимость подбора условий в начальный период культивировани клеток. 1 табл. сл

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , а именно к способам получени микроносителей (МН) дл культивировани клеток животных с зависимым от прикреплени к твердой подложке ростом.

Использование МН дл выращивани клеток животных позвол ет значительно оптимизировать процессы как получени биомассы самих клеток, так и продуктов, синтезированных ими, к примеру гормонов, вирусов и других биологически активных веществ . При этом достигаетс снижение тру- доемкости биотехнологических процессов в результате того, что по вл етс возможность испбльзовать дл культивировани клеток ферментационного оборудовани , и тем самым становитс возможным осуществл ть процесс в одном объеме культивационной среды.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению вл етс способ получени желатиновых МН дл культивировани клеток животных, предусматривающих формирование частиц МН путем диспергировани 10-25%-ного раствора желатины, содержащего 1.4-1,75% глютарового альдегида, в непол рном органическом растворителе с последующей отмывкой сформированных частиц МН и их сепарированием.

Однако получаемые в результате известной обработки желатины частицы МН обладают низкими адгезивными свойствами в отношении клеток животных, что значительно усложн ет процесс их использовани .

зь

XJ

ю

О iOO

XS

так как при этом необходимы подбор режимов посадки клеток, а также требуетс специальное оборудование дл осуществлени начальных этапов культивировани клеток.

Целью изобретени вл етс повышение адгезивных свойств МН, увеличение выхода клеток и упрощение процесса культивировани .

Дл этого в раствор желатины (3,5- 4,0%) внос т дополнительно ДЕАЕ-де- кстран (до 0,14-0,20%), дес тикратный раствор ЭРЛА (в объемных соотношени х 100:(2,6-3,0), а дл полимеризации желатины в нее добавл ют глютаровый альдегид (0,08-0,10%). Полученную смесь охлаждают до образовани гел , а гель замораживают при (-20)-(-25)°С, После разморозки гел частиц МН формируют из него путем дроблени .

В предлагаемом способе на этапе полимеризации желатины органическа фаза заменена на водную с формированием МН с пористой структурой. Предлагаема в способе совокупность признаков позвол ет получить МН с адгезией достаточной дл прикреплени клеток животных во взвес х, что обеспечивает равномерное распределение их на поверхности МН и увеличивает выход клеточной массы.

Способ осуществл ют следующим образом .

В 50 мл 3,5-4.0%-ного раствора желатины , приготовленного из пищевой желатины I или II сорта, внос т последовательно ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14-0,20%, дес тикратный раствор ЭРЛА в объемных соотношени х 100:(2,6-3,0)и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08-0,10%, причем последний ингредиент добавл ют к раствору желатины капельно, тщательно перемешива . Последнее обсто тельство вызвано тем, что в нагретом до 50°С растворе желатины глютаровый альдегид вызывает неравномерное формирование гел с узелковыми уплотнени ми темного цвета. Затем полученную смесь охлаждают до 4-20°С и выдерживают ее до образовани гел (полимеризаци ). В последующем гель замораживают при (-20)-{-25)0С. Формирова- ние частиц МН производ т путем дроблени гел в ножевом гомогенизаторе при скорости вращени вала с ножами 100- 250 об/мин в течение 5-7 мин. По своей форме частицы МН представл ют чеистую структуру с размером частиц 0,05-2,0 мм и размером чеек 40-80 мкм.

Частицы МН в последующем отмывают последовательно в дистиллированной воде и физиологическом растворе. Перед использованием МН стерилизуют автоклавирова- нием, отмывают раствором Хенкса до достижени рН 7.2-7.4 с последующим ресуспендированием МН в питательной среде.

П риме р 1. К50мл 3,5%-ногораствора

желатины добавл ют последовательно ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14%, дес тикратный раствор Э Р Л А в соот- ношении к объему желатины, равном

0 100:2,6, и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08%. Полученную смесь выдерживают в течение 2 ч при 4°С до образовани гел . Затем гель замораживают при -20°С, оттаивают до комнатной температу5 ры и гомогенизируют до образовани частиц размером 0,05-2,0 мм. Полученные частицы отмывают также в избытке физиологического раствора и автоклавируют в этом же растворе при 121°С в течение 20

0 мин, Выход целевого продукта составл ет. 45 г (масса влажных частиц МН). После ав- токлавировани МН отмывают раствором Хенкса до рН 7,2-7,4 с последующим ресус- пендировэнием его в питательной среде.

5 П р и м е р 2. Процесс получени частиц МН осуществл ют аналогично примеру 1, за исключением того, что конечную концентрацию ДЕАЕ-декстрана довод т в смеси до 0,20%, содержание дес тикратного раство0 ра ЭРЛА - до 100:3,0, глютарового альдегида - до конечной концентрации, равной 0,10%. При этом смесь выдерживают при 22°С до образовани гел , который в последующем замораживают при -25°С. Выход

5 целевого продукта в этом случае составл ет 47 г (влажна масса частиц).

Адгезивную способность МН дл клеток животных, в частности дл клеток 4647 (перевиваема лини клеток почек зеленой

0 мартышки) и клеток FAF-28 (перевиваема лини клеток китайского хом чка Blld-li FAF-28 (клон 237S), исследует при культивировании упом нутых клеток в присутствии МН во взвеси. Через 5 ч после начала куль5 тивировани клеток с носителем из культиватора берут пробу, центрифугированием удал ют культура ьную среду, а осадок, содержащий МН с прикрепленными к его поверхности клетками, обрабатывают смесью

0 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02 %-ного раствора Версена, вз тых в равных объемных соотношени х, после чего подсчитывают количество ресуспендированных клеток в камере Гор ева. Прикрепление клеток

5 4647 к поверхности МН к п тому часу инкубировани составл ет 85,4-86%, а прикрепление клеток FAF-28 к этому же сроку инкубировани составл ет 87,9-95%. Прирост клеточной массы через б сут культивировани дл клеток 4647 вл етс 8,6-8,7- кратным, а дл клеток FAF-28 - 8,9-9,1-кратным .

По сравнению с известным способом, где процент прикрепившихс клеток к поверхности желатиновых МП (Цитолар) составл ет через 5 ч инкубировани (в оптимальном дл этого типа МН режиме, при периодическом кратковременном перемешивании МН с клетками в течение первых 5 ч инкубировани ) 72%, а количество прикрепленных клеток к МН, получаемому с помощью предлагаемого способа, увеличиваетс на 14%. В одинаковых услови х культивировани , а именно в услови х посто нного перемешивани МН с клетками в течение всего срока культивировани , включа и период адгезии, количество при- крепленных клеток к МН, получаемому с помощью предлагаемого способа, на 76% выше, чем при использовании Цитолара. Прирост клеточной массы при использовании предлагаемого МН в 7,1 и 1.3 раза по сравнению с Цитоларом выше соответственно при различных режимах культивировани .

Результаты исследований сведены в таблицу.

5Форму л а изо бретени

Способ получени желатиновых микроносителей дл культивировани клеток животных , включающий полимеризацию раствора желатины с образование гел ,

0 формирование частиц микроносител с последующей их отмывкой, отличающий- с тем, что, с целью повышени адгезивных свойств частиц микроносител , увеличени выхода клеток и упрощени процесса их

5 культивировани , перед полимеризацией в 3,5-4,0%-ный раствор желатины дополнительно внос т ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14-0.20%. дес тикратный раствор Эрла до объемных соотношений

0 100:(2.6-3,0), полимеризацию гел осуществл ют добавлением глютарового альдегида до конечной концентрации 0,08-0,10%. гель замораживают при (-20)-(-25)0С и после замораживани из него формируют частицы

5 микроносител дроблением.

Посто нное переме- имвание после внесени клеточной

60

о,б:о,02

10

7,3±0, t

1,2

Claims

Формула изобретения

Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток животных, включающий полимеризацию раствора желатины с образование геля, формирование частиц микроносителя с последующей их отмывкой, отличающийс я тем, что, с целью повышения адгезивных свойств частиц микроносителя, увеличения выхода клеток и упрощения процесса их культивирования, перед полимеризацией в 3,5-4,0%-ный раствор желатины дополнительно вносят ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14-0,20%. десятикратный раствор Эрла до объемных соотношений 100:(2,6-3,0), полимеризацию геля осуществляют добавлением глютарового альдегида до конечной концентрации 0,08-0,10%, гель замораживают при (-20)-(-25)^оС и после замораживания из него формируют частицы микроносителя дроблением.

Микроноситель Условия культивирования ———- Исходная концентрация клеток, хЮЗ Концентрация клеток в 1 мл через 5 ч культивирования, хЮЗ Прирост клеточной биомассы через 6 сут культивирования Количество прикрепившихся клеток, ·* Концентрация клеток в 1 мл через бсут культивирования, х10⁴ Постоянное перемеимвание после внесения клеточной 60 0,6:0,02 10 7,3i0,4 1,2 Цитолар (известньй) взвеси Постоянное перемешивание через 5 ч после начала культивирования 60 Ц ,0*0,А 72 '•О,2±о,3 6,7 Микроноси* тель,лриготовленнъй по предла- Постоянное перемешивание сразу после внесения клеточной взвеси 60 51,010,5 86 52.2t0.25 8,6

гаемому способу

Составитель В, Литовченко Редактор И. Дербак Техред М.Моргентал Корректор А. Осауленко

Заказ 1150 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент”, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101