DD159181A1 - Verfahren zur kultivierung von zellen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, insbesondere von embryonalen Mausefibroblasten. Anwendungsgebiet ist die Zellzucht, im weiteren Sinn die Human- und Veterinaermedizin sowie die Wirkstofforschung. Das Ziel der Erfindung liegt in der Verbesserung der Abloesung und Vereinzelung von Zellen aus Zellkulturen und -geweben sowie in der Passagierung von Zellen. Die Aufgabe, ein Kultivierungsverfahren mit Hilfe eines Enzyms von hoher Wirksamkeit zu entwickeln, wurde dadurch geloest, dass man zur Herstellung von Lebendzellsuspensionen das Enzym Thermitase auf Zellkulturen und -gewebe, insbesondere von embryonalen Maeusefibroblasten, einwirken laesst.

Description

Die Erfindung bezieht sich, auf ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, insbesondere von embryonalen Mäusefibroblastenkulturen, unter Verwendung des Bnzyms Thermitase_ö Mit Hilfe des erfinderischen Verfahrens gelingt die Ablösung und Vereinzelung von Zellen aus Zellkulturen und -geweben mit hoher Wirksamkeit - auch ohne den Zusatz von Komplexbildnern - wobei im Ergebnis der relativ geringen Enzymkonzentration und der kurzen Einwirkungsdauer biologisch wichtige Strukturen der Zellmembran weitgehend geschont werden©

Die Erfindung ist von Bedeutung für die pharmazeutische Industrie, für die Human- und Veterinärmedizin und insbesondere für die Wirkstofforschung zur Prüfung von Substanzen auf ihre pharmakologische Wirkung (Wirkungsmechanismus, Struktur-Wirkungsbeziehungen, Rezeptorstudien) und ihre Toxizität» Xn der experimentellen und praktischen Medizin findet die Zellzucht zunehmend breitere Anwendung in der Virologie, u» a« für die Vakzin-Produktion, in der Krebsforschung als Methode zur Tumordiagnostik sowie für Zytostatika-Wirkungstestungen in der Tumortherapie, in der Mutagenitätsforschung, der Zytodiagnostik (zum Nachweis von Chromosomenanomalien, z_e B· bei der Amniozetese) und in der Immunologie OU Halle, ins Zeil- und Gewebezüchtung bei Tieren, VSB Gustav-Piseher«Verlag, Jena 1976)*

Charakteristik der bekannten Lösungen

Es ist bekannt, in der Zellzüchtung Enzyme einzusetzen. So werden für die Züchtung von tierischen Zellen bei den verschiedensten Verfahren und Manipulationen, wie Zellablösung und »vereinzelung, Herstellung von Zellsuspensionen oder Subkultivierung und Passagierung proteolytische Enzyme verwendete Um Zellschädigungen zu vermeiden, werden die einwirkende Proteasekonzentration und die Einwirkzeit so gering wie möglich gehalten (Corziell, Lo C· ins Methods Enzymology £8^ 29; W· Β· Jakoby und J. Η«, Paetan (Hrsg*) (1979) β In den meisten Verfahren wird Trypsin mit und ohne Zusatz von Ethylendiamintetraacetat (EDTA) angewendet (Puck, Τβί J« Exp« Med· KHg, 615 (1962) Mc Keehan, W· L«: Cell, Biol_β Into Rep, I^ 335 (1977) Weinstein, D.: Εχρ_β Cell« Res« ^j. 234 (1966) Seglen, P. 0*s Exp. Cell. Res* 82^ 391 (1973) Steinberg, Mo S. j Exp. Cell· Res» £0^ 257 (1963)· Die Enzymkonzentration beträgt zwischen 0,1 mg/ml (Basher, M₀ Μ· in: Methods in Enzymol. _<§8_X 119, W, B. Jakoby und J« H. Pastan (Hrsg*) (1979)) und 2,5 mg/ml (Mc Meer, J. Α· und W. Η_β J. Douglas, ibid. ^8^ 132) bei einer Einv/irkungszeit von 2 bis 15 Minuten und einer Inkubationstemperatur zwischen 6⁰C und 37⁰C (Mc Keehan, W. L,, Cell« Biol. Int. Rep. I^ 335 (1977), Basher, M. M„ in: Meth. in Enzymol. £8^ 119 (1979))» Heben Trypsin wurden unter ähnlichen Bedingungen weitere hydrolytische Enzyme, wie Pronase, Kollagenase, Hyaluronidase_? Elastase und Papain (Wisemann, L« L. und W_e R« Hammond, J« Expl., Zool. V)J^ 429 (1976)) eingesetzt. Thermitase, die Proteasenhauptkomponente des Kulturfiltrates von Thermoactinomyces vulgaris, ist in der Zellzucht noch nicht eingesetzt worden* Sie besitzt eine gegenüber Kasein vergleichbare proteolytische Aktivität wie Trypsin, ohne eine ausgeprägte Spezifität für bestimmte Spaltstellen zu besitzen (Behnke, U₀, R_e Kleine, M« Ludewig

und H₀ Euttloff, Acta biol« med» germ« ^Za. 1205 (1973); Kleine , H· und U_e Rothe, Acta biol* med« germ. .36, K 27 - K 33 (1977)).

Das Ziel der Erfindung besteht darin, auf dem Gebiet der Zellzucht die Ablösung und Vereinzelung von.Zellen aus Zellkulturen und -geweben sowie die Passagierung von Zellen zu verbessern, indem die Einwirkungszeit der Enzymlösung verkürzt und die eingesetzte Enzymkonzentration erniedrigt werden, so daß .die Zellen in den Primär- und Subkulturen eine hohe Anheftungsgeschwindigkeit, eine normale, reguläre Zellform und eine gute und schnelle Vermehrung zeigen»

Pariegung_jäeg_Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Zellkultivierung zu entwickeln, das von einem Enzym mit hoher Wirksamkeit ausgeht und das deshalb in geringer Konzentration bei der Ablösung und Vereinzelung von Zellen aus Zellkulturen und -geweben verwendet werden kann. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß* Thermitase als Enzym bei der Kultivierung von embryonalen Mäusefibroblasten eingesetzt wird©' Zur Ablösung und Vereinzelung von Zellen aus Zellkulturen läßt man eine Thermitaselösung in Form eines dünnen Plüssigkeitsfilmes auf die Kultur kurzzeitig (wenige Sekunden) einwirken und suspendiert dann die Zellen in einem gebräuchlichen Kulturmedium·

Ein Vergleioh der Wirksamkeit von Thermitase und Trypsin zeigt, daß Thermitase auch bei niedrigeren Enzymkonzentrationen und ohne EDTA-Zusatz bezüglich Zellablösung und «vereinzelung ähnlich effektiv ist. Eine Konzentration von 0,05 mg/ml Thermitase entspricht der Wirksamkeit einer

Trypsinlösung von 1,25 mg/ml bei Zusatz von 4 ml EDTA« In "beiden !Fällen sind mit Trypanblau keine abgestorbenen Zellen nachweisbar» Die Subkulturen nachTnermitasebehandlung weisen keine Auffälligkeiten gegenüber denen nach Trypsinbehandlung auf» Die Wachstumsrate der Zellen in allen angelegten Subkulturen nach Thermitaseablösung entspricht etwa der nach Behandlung mit Trypsin; die ZeIlform ist regulär*¹

Die Ablösung und Vereinzelung von Zellen aus biologischem Material, z»^; B» Mäuseembryonen, zur Herstellung von Lebenzellsuspensionen gelingt durch Einwirken von Thermitase in einem Bruchteil der Konzentration von Trypsin«'Die Begutachtung der Zellablösung von der Unterlage bzw· vom Gewebe» der Zellvereinzelung, Zellanheftungsgeschwindigkeit, der Zellform und die Bestimmung des Prozentsatzes toter Zellen nach Enzymeinwirkung erfolgt lichtmikroskopisch, gegebenenfalls unter Zuhilfenahme einer geeigneten Zählkammer, die quantitative Auswertung für die Erfassung der Zellvermehrung in den Kulturen mit einem elektronischen Teilchen-Zählgeräte

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden«^;

Beispiel 1 ....... ....

Herstellung_vpn Zellsuspensionen aus Monolayerkulturen von

Beurteilung von deren Qualität anhand von*

- Zellablösungsgeschwindigkeitj Zellvereinzelung (Zeilhaufenbildung, % Einzelteilen)

- Prozentsatz toter Zellen

- Zellmorphologie

Die Kultivierung der aus frischen Mäuseembryonen nach Trypsinbehandlung (2,5 mg/ml Trypsin bei 37⁰C für 25 bis 30 Minuten) gewonnenen Primärzellen erfolgt in 25 ml-Müllerflaschen in Form von Monolayerkulturen bei 37⁰C in 5 ml des Kulturmediums Minimal essential medium (MBM, Staatl, Institut für Immunpräparate und Mahrmedien, Berlin) unter Zusatz von 0,014 % Penicillin, 0,01 % Streptomycin, 4,2 mM HaHCOo sowie von 10 % Rinderserum (RS).

Enzymtestlösungern

Wii 1 IMWiIiBtHi im in hu nium n— * 11 m ι r in ti !

} Die Enzyme Trypsin (zur Zellzucht, Leithold, KleinmachnovO und Thermitase (gereinigt entsprechend der Vorschrift nach Frömmel, C, G. Hausdorf, W. E. Höhne, U, Behnke und H_e Ruttloff, Acta biol« med« germ, ^Ls. 1193 (1978))bzw_e der Komplexbildner Dinatriumdihydrogenethylendiamintetraacetat (VEB Berlin-Chemie) werden Jeweils in entsprechender Konzentration (Tabelle) in isotonem Puffer (PBS, Staatl· Institut für Immunpräparate und Efährmadien, Berlin) unter Zusatz der Antibiotika Penicillin (0,014 %) und Streptomycin (0,01 %) gelöst und • anschließend sterilfiltriert (Miliporfilter, Durchmesser 0,45/tm)·

j Ablösung und Vereinzelung von Zellen und Herstellung von

Uach Entfernung (Abgießen) des Kulturmediums vom festen Zellrasen wird dieser mit einer geringen Menge der entsprechenden Enzymlösung (Flüssigkeitsüberschüsse sofort abgießen) benetzt. Man läßt diesen Enzym-Flüssigkeitsfilm .kurze Zeit einwirken (einige Sekunden bis maximal 2 Minuten, Tabelle) und suspendiert die so angelösten Zellen mechanisch im Kulturmedium MEM#

Die Beurteilung dieser Zellsuspensionen erfolgt lichtmikroskopisch (Geschwindigkeit der Zellablösung, Zeil« morphologie) bzw«, unter Zuhilfenahme einer Zeilzählkammer nach Fuohs-Rosenthai (Zellvereinzelung, Zellhaufenbildung) und des Farbstoffes 2rypanblau (0,3 # bis_0,5 %i Nachweis abgestorbener Zellen)«

Tabelle: Einfluß von Thermitäs© bzw·¹ Trypsin auf die Zellablö'sung und -vereinzelung

Konzentration Zellablösung

mg/ml

Zellvereinzelung 0-Anzahl von Zellhaufen (aus 3 und mehr Zellen) je 100 Einzelteilen

Größe der Zellhaufen tote ' Zellform Zellen der adhärierten Zellen

Thermitase 0_s1

0,05

0,02

0,01

innerhalb von Sekunden vollständig

nicht bestimmt

n·¹ keine

nach-

weisbar

in weniger als einer Minute, vollständig

8 bis 9

3 bis 4 Zellen

innerhalb

von Minuten . . je nach , mechan« Suspen- n» b· dierung

XL·· W

nicht erreichbar

b«

regulär

langgestreckt

spindelförmig

entfällt

Trypsin

2,5

5 Minuten und

langer in aus bis vielen, großen 32 bis 34 zu 20 Zellhaufen, un- . . . Zellen vollständig '

Thermitase und 4 EDTA

0,025

innerhalb von Sekunden, vollst and i g

1 bis 2

aus max· 3 Einzelzellen regulär

langgestreckt spindelförmig

Trypsin und

mM SDTA 1,25

innerhalb von Sekunden, vollständig

2 bis 3

3 bis Zellen

tf

n. b· = nicht bestimmt

' Dieser Vergleich mit dem Standardenzymgemisch 1,25 mg/ml Trypsin und 4 mM EDTA zeigt, daß 0,05 mg/ml Thermitase ohne weitere Zusätze für die Ablösung und Vereinzelung von Zellen und die Herstellung von Zellsuspensionen embryonaler läusefibroblasten geeignet ist* Die etwas verminderte Eate der Zellvereinzelung nach Thermitasebehandlung stört weitere Manipulationen - wie Zellzählung mit einem elektronischen Teilchenzählgerät und Anlegen von Subkulturen mit normaler Wachsturasrate -

nicht«

Wachstumsverhalten bei einwöchiger Kultivierung Bestimmung der Wachstumskurven der 1_e Subkultur von .embryonalen. Mäusefibroblast en ...

Zellkultivationsbedingungen; Herstellung der Enzym-

- lösungen sowie der Zellsuspension - · siehe Beispiel 1

Aus einer Primärkultur von Mäuseembryofibroblasten (4 Tage kultiviert in 80 ml MEM bei Zusatz von 10 % Einderserum, Zelleinsaat 3 χ 10 Zellen) wird entsprechend der Verfahrensvorschrift zur Herstellung von Zeilsuspensionen mit den Enzymlösungen

a) 1 j 25 mg/ml PBS Trypsin und 4 ml EDTA

b) 0,05 mg/ml PBS Thermitase ;

die erste Subkultur hergestellt* - . Zelleinsaats 160 000 Zellen/5 ml MEM, d_e ho je Eulturflasche + 10 % RS

Mit Hilfe des elektronischen Teilchenzählgerätes TUE ZG2 (VEB Transformatoren- und Böntgenwerk,Dresden) werden die im Kulturmedium schwimmenden Zellen sowie die an der Unterlage angehefteten Zellen (nach Einwirkung einer entsprechenden ablösend .wirkenden Enzymlösung) nach β Stunden, 24 Stunden sowie 2, 4 und ? Tagen quantitativ erfaßt«,

Wachsturaskurven der 1» Subkultur von embryonalen Mäusefibroblasten nach Behandlung mit 0,05 mg/ml Thermitase ^*~-~) bzvve mit der Standardlösung 1,25 mg/ml Trypsin und 4 ml EDTA im Vergleicht ')

.6 Stunden nach erfolgter Enzymbehandlung haben sich mit beiden Enzymlösungen etwa die Hälfte der eingesäten Zellen an die Flaschenunterlage angeheftet (größtenteils schon spindelförmig ausgebreitet); die andere Hälfte der Zellen schwimmt noch im Medium* Somit ist die Zellanheftungsgeschwindigkeit in beiden Fällen vergleichbar« Nach dem 1· Kultivationstag haben sich mit beiden Zellablösungs=Subkultivationsverfahren etwa drei Viertel aller Zellen adhäriert und ausgebreitet» Zu diesem Zeitpunkt und auch an den Folgetagen weist die Zellmorphologie keine wesentlichen Unterschiede auf (allerdings adhärieren die Zellen nach Thermit as ebehandlung z«, T» verstärkt in Form von Aggregatenj die sich jedoch nach dem 1« Kultivationstag wieder auflösen und auch nicht die Wachstumsrate negativ beeinflussen) (Figur 1)· , .

Subkultivierung von Mäuseembryofibrpblastenkulturen

Mit Hilfe einer Thermitaselösung von O₅05 mg/ml ist die Subkultivation von embryonalen Mäusefibroblasten unter den in den Beispielen 1 und 2 aufgeführten Bedingungen und Verfahren möglich. Im vorliegenden Beispiel werden 4 Subkulturen angelegt» Alle 3 Tage werden in aufeinanderfolgender Weise das verbrauchte Kulturmedium vom Zellrasen abdekantiert_s die Zellen mit Hilfe der genannten Enzymlösungen von der Unterlage abgelöst, im MEM mit 10 % Rinderserum resuspendiert und der Zeil-

inhalt einer Koux-Kulturflasche auf 2 oder 3 weitere verteilt«

Herstellung einer Lebendzellsuspension und Primärkultur aus frischen Mäuseembryonen

Etwa 15 Tage tragende weibliche Mäuse v/erden durch Genickstreckung getötet, durch Halsschnitt ausgeblutet und unter aseptischen Bedingungen die Embryonen herauspräpariert j von der Fruchtsackhaut befreit, mit einer Schere zerkleinert und mit Medium MM gewaschen.·

Je 10 bis 15 vorzerkleinerte und gewaschene Mäuseembryonen werden anschließend mit etwa 50 ml einer Bnzynilösung behandelt: Variante a) 0,05 mg/ml Thermitase in PBS Variante b) 2,5 mg/ml Trypsin in PBS als Vergleichs-. ..,. enzym ... . ,. .:

Gewebsaufschlußbedingungen: 20 bis 25 Minuten Einwirk-:

- zeit der o# go- Enzymlösungen bei 37⁰C und unter Rühren*

Die zellhaltige Aufschlußlösung wird vom unaufgeschlossenen Rest durch Filtration über eine doppelte Mullage abgetrennt und dieser Überstand zur Sedimentation der Zellen bei 1500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert (Labortischzentrifuge T 13 "H", Janetzki KG, DDE)* Das Zellsediment wird in 20 ml MERI suspendiert, homogenisiert und ein alig; oter Teil zur elektronischen Teilchenzählung abgenommene....:...' ..

Das Anlegen der Primärkultur aus diesen Zellen erfolgt in Eous-Kulturflaschen in 80 ml MEIiI unter Zusatz von 10 % .\'i .Yv erserum bei einer Zelleinsaat von 30 χ 10 Zellen je Flascheβ

Ausgehend von etwa gleichen Ausgangsmengen an Mäuseembryonen betragen die Zellausbeutens

Aufschlußvariante

a) 0,05 mg/ml Thermitase 135 χ 10 Zellen

b) 2,5 mg/ml Trypsin 72 χ 10⁶ Zellen

Um die Überlebens- und Wachstumsfähigkeit der so behandelten Zellen zu testen, werden diese kultiviert und die Anzahl der adhärierten, ausgebreiteten Pibroblasten bestimmt (Primärkultivation)♦ In beiden Fällen haben sich nach dreitägiger !Cultivation etwa 45 % der eingesäten Zellen (die Ausgangszellsuspension enthält neben Pibroblasten auch einen relativ großen Anteil an Erythrozyten) an der Glasunterläge'angeheftet und typisch fibroblastoid ausgebreitete

Zelleinsaat 30 χ 10 Zellen, pro Tlasche '

Anzahl der adhärierten Zellen nach dreitägiger Kultivierung

Variante a) 0,05.mg/ml Thermitase 13,6 χ 10 Zellen Variante b) 2,5 mg/ml Trypsin 13,7 χ 10° Zellen

Claims (3)

Erfindungsanspruch.

1* Verfahren zur Kultivierung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von lebendzellsuspensionen auf Zellkulturen und -gewebe zur Zell~ ~ ablesung und -Vereinzelung das Enzym Thermitase einwirkte

2e Verfahren nach Punkt 1, dadurch, gekennzeichnet, daß auf embryonale Mäusefibroblastenkulturen nach. Entfernen des Kulturmediums, bestehend aus Minimal essential medium (MM) unter Zusatz von 0,014 $ Penicillin, 0,01 % Streptomycin, 4_S2 ml UaHCO₃ und 10 la Rinderserum, für 0,5 bis 2 Minuten bei 25 bis 40⁰C, vorzugsweise bei etwa 37⁰C, eine Shermitaselb'sung von 0,02 mg/ml bis 0,1 mg/ml, vorzugsweise 0,05 mg/inl, einwirkt und nach.

Entfernen der Enzymlö'sung die Zellen in MM mechanisch suspendiert werden«

3« Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ablösung und Vereinzelung von Zellen aus biologischem Material, insbesondere aus Mäuseembryonen, zur Herstellung von lebendzellsuspensionen durch Einwirken von Thermitase in Konzentrationen von 0,02 mg/ml bis 0,1 mg/ml, vorzugsweise von 0,05 mg/ml, bei Temperaturen von 25 bis 40⁰C, vorzugsweise bei etwa 37⁰C, vorgenommen wird«.

Hierzu 1 S?i?@ Zeichnung