DE60107718T2

DE60107718T2 - Konservierung von zellen

Info

Publication number: DE60107718T2
Application number: DE60107718T
Authority: DE
Inventors: Nathan Benjamin John Carmarthen GRIFFITHS; Peter John Cyncoed EVANS
Original assignee: University College Cardiff Consultants Ltd; Cardiff University
Current assignee: Abcellute Ltd Cardiff Gb
Priority date: 2000-12-20
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2005-12-01
Also published as: AU2002216223B2; JP2008073054A; ATE284140T1; KR20030094224A; DE60107718T8; NZ526647A; JP4243638B2; US20040053207A1; GB0031065D0; CA2432123C; DE60107718D1; ES2234771T3; KR100564813B1; AU1622302A; JP2004516020A; US20090042289A1; JP4129396B2; CA2432123A1; WO2002049428A1; DK1343369T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Konservieren von Zellen, insbesondere von Primärzellen, wie zum Beispiel Hepatozyten. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein Gel, das hydrolysierte Gelatine enthält.
Die Einführung von Kollagenase-Perfusionsverfahren bei ganzen Organen (Krebs et al., Regulation of Hepatic Metabolism, 726-75, 1974: und Seglen, Meth. Cell Biol., 13, 29-83, 1976) führte zu der weit verbreiteten Isolation lebensfähiger Hepatozyten. Die verwendeten Isolationsverfahren sind sanft, was zur Folge hat, dass die Zellen in vitro anfangs in vivo-artige Eigenschaften beibehalten. Aus einer einzigen Leber werden jedoch hohe Zellerträge erhalten, und im Allgemeinen übersteigt die Zahl der hergestellten Zellen die experimentellen Bedürfnisse wesentlich.
Isolierte Hepatozyten sind eine bessere Annäherung an die Situation in vivo als etablierte Zellinien oder Hepatomzellen (Sirica und Pitot, Pharmacol. Rev., 31, 205–227, 1980), jedoch weisen sie den Nachteil der eingeschränkten Lebensfähigkeit in Suspensionskultur auf.
Hepatozyten weisen viele Merkmale auf, die sie zu einem besonders geeigneten in vitro Modellsystem machen. Sie weisen eine hohe Stoffwechselgeschwindigkeit auf und sind die Hauptzellarten, die an der Entgiftung beteiligt sind. Jedoch teilen sich die Zellen in Kultur schlecht, wenn überhaupt, und sie unterlaufen phänotypische Veränderungen, wobei viele ihrer leberspezifischen Prozesse verloren gehen. Die Zellen werden im Allgemeinen unmittelbar nach der Isolierung verwendet, und eine nachhaltige Lebensfähigkeit hängt von der Bildung einer Monoschicht ab. Vertiefungen Die Pflege großer Anzahlen an Platten ist arbeitsintensiv, da das Medium alle 24 Stunden gewechselt werden muss.
Eine weitere Komplikation bei der Kultivierung von Hepatozyten ist ihre beschränkte Lebensdauer sowie das Auftreten phänotypischer Veränderungen (Bissell, Ann. N.Y. Acad. Sci., 349, 85–98, 1980). Diese Veränderungen führen dazu, dass die Ergebnisse, die durch die Verwendung von Langzeitkulturen erhalten wurden, für ein intaktes Organ nicht besser anwendbar sind als diejenigen, die mit etablierten Zelllinien erhalten wurden.
Die hypotherme Konservierung von Hepatozyten auf Gelatinegelen wurde bereits offenbart (Evans, Cell Biology International, 18, 999–1008, 1994; Evans, Cell Biology International, 19, 855–860, 1995; Evans, Cell Biology International, 23, 117–124, 1999; und Griffiths & Evans, Cryobiology, 40, 176–181, 2000). Für das Verfahren wird die Herstellung von Gelen, die aus einem Kulturmedium hergestellt sind, das unbehandelte (nicht-hydrolysierte) Gelatine umfasst, benötigt, ebenso wie die Anhaftung von Hepatozyten auf die Oberfläche der Gele. Die Hepatozyten werden dann mit Kulturmedium überlagert und bei einer Temperatur von 10°C kultiviert. Eine derartige Konservierung von Hepatozyten auf Gelatine-enthaltenden Gelen ermöglicht eine Lagerung der Hepatozyten von wenigstens 7 Tagen, ohne eine wesentliche Verschlechterung der Funktionen der Zellen. Zur Ablösung der Zellen von der Geloberfläche ist es notwendig, das Gel durch Erhitzen auf 37°C zu schmelzen. Das Erhitzen des Gels auf 37°C kann den Zellen Schäden zufügen. Ein weiteres Problem dieses Verfahrens des Standes der Technik ist, dass das Kulturmedium, das die anhaftenden Zellen überdeckt, gewechselt werden muss. Da die Zellen an der exponierten Oberfläche des Gels anhaften, kann es sein, dass die Zellen bei dem Austausch des Mediums entfernt oder beschädigt werden. Des Weiteren kann das Kulturmedium bei dem Transport einer Kulturschale leicht ausgeschüttet werden.
Die US-Patente Nr. 5,635,344 und Nr. 5,736,397 offenbaren ein Verfahren zur Konservierung von Zellen, das die Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 0 bis 5°C umfasst, wobei die Zellen in einem Gel enthalten sind, das nicht-hydrolysierte Gelatine umfasst. Die Kultivierung von Zellen zwischen Schichten von nicht-hydrolysierter Gelatine ist nicht offenbart. Die vorliegende Erfindung überwindet zumindest einiger der Probleme, die mit den Verfahren des Standes der Technik zur Konservierung von Zellen zusammenhängen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Konservierung isolierter Zellen zur Verfügung, umfassend die Anhaftung der Zellen auf ein Gel, das hydrolysierte Gelatine umfasst, und umfassend die Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 0°C bis 5°C.
Die Verwendung von hydrolysierter Gelatine erzeugt ein Gel, das stark genug ist, um als Träger zu fungieren, an den die Zellen anhaften können, andererseits aber auch schwach genug ist, um durch das Hinzufügen einer wässrigen Lösung wie zum Beispiel eines Überschusses an kaltem Kulturmedium dispergiert zu werden. Rimming (d.h. die Verwendung einer Nadel oder einer ähnlichen Vorrichtung zur Erleichterung der Trennung des Gels aus dessen Behälter) kann ebenfalls zur Unterstützung der Dispergierung verwendet werden.
Die Verwendung von hydrolysierter Gelatine in dem Gel vermeidet somit die Anforderung, dass das Gel auf 37°C erhitzt werden muss, damit die Zellen losgelöst werden, und vermeidet jeglichen Schaden, der den Zellen durch ein solches Erhitzen zugefügt wird. Es kann zudem durch die Verwendung des hydrolysierte Gelatine umfassenden Gels eine Unterscheidung zwischen hypothermischem Schaden und einem Schaden, der durch ein Erhitzen auf 37°C verursacht wird, getroffen werden.
Des Weiteren wird durch die Verwendung von hydrolysierter Gelatine in einem Gel die Anhaftung von Zellen auf einen festen Träger (d.h. ein mit einer Standardgewebskultur behandelter Kunststoffträger wie zum Beispiel eine Kulturschale oder Well, zum Beispiel Primaria^® und Corning) inhibiert, vorausgesetzt, dass das Gel kein Serum enthält. Die festen Träger wurden behandelt, so dass sie eine Nettoladung ihrer Oberfläche aufweisen, um die Anhaftung der Zellen auf dem Träger zu unterstützen. Es wurde herausgefunden, dass die Hydrolyse von Gelatine zu dem Verlust an Faktoren führt, die die Zellen dazu animieren, an einen festen Träger zu haften und/oder Faktoren bildet, die die Anhaftung der Zellen inhibieren. Dementsprechend ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren dem Fachmann, die Anhaftung der Zellen an einen festen Träger zu verhindern, und dabei ermöglicht es eine leichtere Ernte der kultivierten Zellen und es erleichtert insbesondere die Isolierung von Spheroiden. Spheroide sind Zellen, die ein multizelluläres Aggregat bilden. Das Aggregat ist für gewöhnlich sphärisch. Die Spheroide können funktionelle Komplexe wiederherstellen und gewebespezifische Funktionen zeigen (siehe Hamamoto et al., J. Biochem., 124, 972–979, 1998).
Da das Vorhandensein hydrolysierter Gelatine die Anhaftung der Zellen auf feste Träger hemmt, wenn kein Serum vorhanden ist, hat der Fachmann mehr Zeit, Zellen ohne die Komplikation einer Anhaftung von Zellen auf einen festen Träger wiederzugewinnen. Das nicht-Vorhandensein von Serum hilft bei der Verhinderung einer Anhaftung von Zellen auf einen festen Träger. Das nicht-Vorhandensein von Serum in dem Medium führt zu einer Verringerung des Zeitraumes, in dem die Zellen aufbewahrt werden können, von etwa 7 Tagen auf etwa 3 Tage . Es ist zudem bevorzugt, dass der feste Träger keine Beschichtung mit einem extrazellulären Matrixfaktor aufweist, wie zum Beispiel Kollagen, Fibronectin und Matrigel. Solche extrazellulären Matrixfaktoren helfen Zellen dabei, an den festen Träger anzuhaften und sollten vermieden werden, wenn die Zellen nicht an der Oberfläche des festen Trägers anhaften sollen.
Ferner wurde durch die Verwendung hydrolysierter Gelatine in einem Gel herausgefunden, dass das Gel gleichmäßig bei etwa 37°C schmilzt. Bei der Erhitzung eines Gels, das hydrolysierte Gelatine umfasst, schmilzt das Gel gleichmäßiger als ein Gel, das nicht-hydrolysierte Gelatine umfasst. Der Begriff „gleichmäßig", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass das Zentrum des Gels im Wesentlichen mit derselben Geschwindigkeit schmilzt wie die Randbereiche des Gels. Dieses gleichmäßige Schmelzen des Gels hat den Vorteil, dass alle Zellen zur im Wesentlichen selben Zeit aus dem Gel isoliert werden können.
Der Begriff "konservieren" wie hierin verwendet, ist als Beibehaltung der Lebensfähigkeit und/oder der in vivo-artigen Funktionen der Zellen definiert. Die Lebensfähigkeit kann durch die Retention von cytosolischen Markerenzymen, wie zum Beispiel Laktatdehydrogenase (LDH), und durch die Beibehaltung der Fähigkeit der Zellen, sich danach an einen festen Träger unter nicht-inhibitorischen Kulturbedingugen anzuhaften, beurteilt werden. Die Retention der in vivo-artigen Funktion kann durch die Zellen, die die Proteinsynthesegeschwindigkeiten beibehalten, durch Zellen, die in vivo-artige Reaktionen auf Hormone zeigen, durch Zellen, die den Cytrochom P₄₅₀-Spiegel sowie dessen spezifische Isoenzyme beibehalten und durch das nicht-Vorhandensein atypischer Enzymcharakteristika oder phänotypischer Veränderungen beurteilt werden. Zur Bestimmung der in vivo-artigen Zellfunktion kann mehr als eines dieser Verfahren verwendet werden.
Die in vivo-artige Zellfunktion wird bevorzugt durch die Bestimmung der Beibehaltung der Cytrochom P₄₅₀-Spiegel gemessen. Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigkeit und der in vivo-artigen Zellfunktionen der Zellen sind in Evans, 1994 (supra), Evans, 1995 (supra), Griffiths und Evans, 2000 (supra) und Evans, 1999 (supra) offenbart.
Der hierin verwendete Begriff "Anhaften" bezieht sich auf die Immobilisierung der Zellen auf einer Oberfläche des Gels oder die Immobilisierung in dem Gel.
Der Begriff "isolierte Zelle", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine beliebige Zelle, außer Gelatinease-erzeugende Bakterien. Die isolierte Zelle ist bevorzugt eine eukariotische Zelle, wie zum Beispiel eine Zelle eines Säugetieres, die Zelle einer Pflanze (einschließlich Protoplasten), Zellen von Insekten, usw. Insbesondere bevorzugt betrifft der Begriff Primärzellen, wie zum Beispiel Hepatozyten, proximale Nierentubuluszellen, Säugetier-Epithelzellen und primäre Pankreaszellen. Die isolierte Zelle kann auch eine genetisch veränderte Zelle sein, die eine oder mehrere heterologe Gene oder modifizierte Gene enthält. Die isolierte Zelle ist bevorzugt ein Hepatozytenzelle, die nach der Durchführung eines Gesamtorgan-Kollagenase-Perfusionsverfahrens oder durch äquivalente Verfahren erhalten wurde. Dem Fachmann sind Verfahren zum Erhalt isolierter Hepatozyten bekannt. Insbesondere sind geeignete Verfahren in Evans (Biochim. Biophys. Acta, 677, 433–444, 1981) und Evans und Mayer (Biochim. Biophys. Res. Comm., 107, 51–58, 1982) offenbart.
Verfahren zum Erhalt von proximalen Nierentubuluszellen sind in Evans (Biochem. Biophys. Acta, 1133, 255–260, 1992) und Evans (Biochem. Biophys. Acta, 1221, 243–249, 1994) beschrieben. Es wurde gezeigt, dass sich bei der Konservierung der proximalen Nierentubuluszellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zusätzlich zu der Beibehaltung der in-vivo-artigen Enzymprofile, sich die proximalen Nierentubuluszellen normal teilen, wenn sie von dem Gel freigesetzt werden. Die Konservierungsbedingungen haben keine cystostatischen Wirkungen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher sowohl für sich nicht teilende, als auch für sich teilende Zellarten geeignet. Überdies stützen sich die proximalen Nierentubuluszellen zur Energiebildung fast ausschließlich auf eine aerobe Respiration, wohingegen die Hepatozyten eine erhebliche Fähigkeit zur anaeroben Respiration haben. Die erfolgreiche Konservierung dieser Primärzellenart, die sehr unterschiedliche Charakteristika aufweist, zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren bei einer großen Vielzahl an Zellarten angewendet werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein sehr nützliches Verfahren zum Erhalten von Primärzellen, und es ist auch zur Verwendung mit etablierten Zellinien geeignet. Insbesondere entfällt dadurch die Notwendigkeit, die Zellen unmittelbar vor der Verwendung „wachsen zu lassen". Aus diesem Grund können auch Experimente, die konfluente Zellmonoschichten benötigen, zum Beispiel Caco 2-Zellen, vereinfacht werden.
Der Begriff „Kultivierung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Erhalten und/oder das Wachstum von Zellen.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges Gel, das hydrolysierte Gelatine umfasst, verwendet werden, vorausgesetzt, es ist zur Kultivierung von Zellen geeignet. Das Gel umfasst vorzugsweise ein Zellkulturmedium und hydrolysierte Gelatine. Das Zellkulturmedium kann ein beliebiges Zellkulturmedium sein, mit dem die Zellen, die konserviert werden sollen, kultivieren werden können. Ein geeignetes Kulturmedium ist ein Leibovitz (L-15)-Medium, das vorzugsweise mit Hepes anstatt von Biicarbonat gepuffert wird, wodurch es der Atmosphäre ausgesetzt werden kann. Andere geeignete Medien umfassen Medien nach Waymouth, Williams, Dulbecco oder Ham, die mit Bicarbonaten gepuffert sind und eine 95% Luft- 5% CO₂ Gas-Phase benötigen. Falls nötig, kann das Medium ergänzt werden. Geeignete Ergänzungen umfassen Kohlenstoffquellen wie zum Beispiel Glukose, Wachstumshormone wie zum Beispiel Insulin, Serum, wie zum Beispiel durch Hitze inaktiviertes Kalbsserum von neugeborenen Kälbern, und Antibiotika wie zum Beispiel Gentamycin. Das Gel umfasst bevorzugt 1,5% (w/v) hydrolysierte Gelatine in Leibovitz (L-15) Medium (pH 7,4), umfassend Glukose (8,3 mM) und Hepes (25 mM).
Zum Schutz der Zellen gegen Schäden durch erneutes Erwärmen kann das Zellkulturmedium zusätzlich ein Zytoprotektivum umfassen, wie zum Beispiel Glutathion. Von Glutathion ist bekannt, dass es bei niedrigen Temperaturen in Zellen eindringt.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt die Kultivierung von Zellen bei einer Temperatur von zwischen 4 und 14°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 8 und 12°C und am meisten bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 10°C.
Der Begriff "hydrolysierte Gelatine", wie hierin verwendet, bedeutet Gelatine, die zur Verringerung ihrer Gelfestigkeit zumindest teilweise hydrolysiert worden ist. Gelatine, die noch nicht hydrolysiert wurde, erzeugt ein relativ starkes Gel. Wird hydrolysierte Gelatine verwendet, wird ein schwächeres Gel gebildet, das durch das Hinzufügen einer wässrigen Lösung dispergiert werden kann. Der Begriff "hydrolysierte Gelatine", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Gelatine, die auf ein Maß hydrolysiert wird, dass ein Gel erzeugt wird, das ausreichend stark ist, um einen festen Träger zur Verfügung zu stellen, an den Zellen bei einer Temperatur zwischen 0 und 15°C anhaften können, das aber ausreichend schwach ist, um bei der Hinzufügung einer wässrigen Lösung dispergiert werden zu können. Die hydrolysierte Gelatine ist vorzugsweise eine hydrolysierte 300 Bloom Gelatine vom Typ A aus Schweinehaut.
Gelatine kann durch ein beliebiges bekanntes Verfahren hydrolysiert werden, einschließlich durch thermische Hydrolyse, proteolytischen Verdau mit Gelatinease oder Trypsin, und durch chemische Verfahren einschließlich saurer- und alkalischer Hydrolyse. Die Gelatine wird vorzugsweise durch thermische Hydrolyse hydrolysiert. Es ist insbesondere bevorzugt, dass hydrolysierte Gelatine durch Erhitzen der Gelatine auf eine Temperatur zwischen 85 und 121°C über 0,2 bis 3 Stunden lang erhitzt wird. Besonders bevorzugt wird die Gelatine auf eine Temperatur von 90 bis zu 100°C für 1 bis 2,5 Stunden lang erhitzt. Ganz besonders bevorzugt wird die Gelatine hydrolysiert, indem sie etwa 2 Stunden lang auf etwa 95°C erhitzt wird oder indem sie etwa 20 Minuten lang auf etwa 121°C erhitzt wird.
Das Gel umfasst ausreichend hydrolysierte Gelatine, um ein Gel zu erzeugen, das ausreichend stark ist, um ein festes Gel zu erzeugen auf dem, oder in dem, Zellen bei einer Temperatur von 0 bis 15°C erhalten werden kann, das jedoch auch ausreichend schwach ist, um durch die Hinzufügung einer wässrigen Lösung dispergiert werden zu können. Das Gel umfasst bevorzugt 0,5% bis 5,0% (w/v) hydrolysierte Gelatine. Es ist ferner bevorzugt, dass das Gel 1% bis 2% (w/v) hydrolysierte Gelatine, besonders bevorzugt 1,5% (w/v) Gelatine, umfasst.
Das Gel kann zusätzlich zu der hydrolysierten Gelatine nicht-hydrolysierte Gelatine umfassen, vorausgesetzt, dass das gebildete Gel ausreichend schwach ist, dass es durch das Hinzufügen einer wässrigen Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 15°C dispergiert werden kann.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haften die Zellen an einer Oberfläche des Gels, das hydrolysierte Gelatine umfasst, und sie sind vorzugsweise mit einem flüssigen Zellkulturmedium bedeckt. Im Allgemeinen ist das flüssige Zellkulturmedium mit demjenigen, das zur Bildung des Gels verwendet wird, identisch, außer, dass es keine Gelatine oder hydrolysierte Gelatine umfasst, und Zusatzstoffe aufweisen kann, die in dem Gel nicht vorhanden sind. Es ist insbesondere bevorzugt, dass das flüssige Zellkulturmedium ein Zytoprotektivum umfasst, wie zum Beispiel Glutathion. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haften die Zellen an einer ersten Schicht des Gels, das hydrolysierte Gelatine umfasst und werden dann mit einer zweiten Schicht des hydrolysierten Gelatinegels bedeckt, so dass die Zellen zwischen den zwei Gelschichten gehalten werden. In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Zellen mit dem Gel, das hydrolysierte Gelatine umfasst, vermischt, bevor dieses sich verfestigt (d.h. bei einer Temperatur von etwa 37°C). Bei der Verfestigung des Gels (d.h. bei einer Temperatur von etwa 10°C) werden die Zellen mit dem Gel immobilisiert. Bei Bedarf kann ein flüssiges Zellkulturmedium hinzugefügt werden, um zu verhindern, dass das Gel austrocknet und um beliebige benötigte Nährmittel zu liefern. Dadurch, dass die Zellen zwischen den zwei Schichten des Gels liegen oder in dem Gel immobilisiert sind, werden die Zellen vor Transportschäden geschützt, und zudem ist es einfacher, das flüssige Kulturmedium zu wechseln, ohne die Zellen durcheinanderzubringen. Bei der Dispergierung des Gels können die Zellen an der Oberfläche des festen Trägers haften, in dem das Gel gebildet ist, vorausgesetzt, dass das Gel Serum umfasst und/oder die Oberfläche des festen Trägers mit einem extrazellulären Matrixfaktor beschichtet ist. Alternativ kann verhindert werden, dass die Zellen an dem festen Träger haften, indem ein Gel verwendet wird, das kein Serum umfasst und vorzugsweise, indem ein fester Träger verwendet wird, der nicht mit einem extrazellulären Matrixfaktor beschichtet worden ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Zellen direkt an einen festen Träger haften, wie zum Beispiel an eine Kulturschale oder an einem Well, und dann mit einer Schicht des Gels, das hydrolysierte Gelatine umfasst, bedeckt werden. Die Zellen werden dann durch das Gel bedeckt. Falls nötig, kann das Gel dann mit Zellkulturmedium bedeckt werden, um zu verhindern, dass das Gel austrocknet und um beliebige benötigte Nährmittel zuzuführen. Auch in diesem Fall werden die Zellen vor Transportschäden geschützt sowie vor Schäden, die im Zusammenhang mit dem Wechsel des Zellkulturmediums entstehen. Wenn eine Verwendung der Zellen erwünscht ist, wenn sie an einer Oberfläche haften, ermöglicht dieses Verfahren ferner, dass die Zellen direkt nach der Dispergierung verwendet werden können, ohne, dass auf eine Anhaftung der Zellen gewartet wird. Die Oberfläche des festen Trägers weist bevorzugt eine Beschichtung eines extrazellulären Matrixfaktors auf. Des Weiteren kann die Gelschicht mit hydrolysierter Gelatine mit einer nicht-hydrolysierten Gelschicht bedeckt werden. Die Gelschicht mit nicht-hydrolysiertem Gel ist vorzugsweise dünn, d.h. die Dicke beträgt ca. von 0,5 und 2 mm. Die obere Gelschicht mit nicht-hydrolysierter Gelatine kann zum Schutz während der Verteilung als eine robustere Oberschicht dienen. Der Begriff "nicht-hydrolysierte Gelatine" wird untenstehend definiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter der Verwendung eines beliebigen geeigneten festen Trägers zur Unterstützung des Gels durchgeführt werden. Geeignete feste Träger umfassen Kulturschalen, Wells, wie zum Beispiel Platten im 96-Well-Format und Säulen. Das Verfahren kann zum Beispiel zur Herstellung fester Träger verwendet werden, bei denen an der Oberfläche Zellen haften, die für Standardscreening- oder biochemische Assay-Verfahren, die, wie obenstehend angegeben, dem Fachmann wohlbekannt sind, sofort einsatzbereit sind.
Es ist überraschend, dass es möglich war, die Zellen mit dem Gel zu bedecken, da bisher bekannt war, dass Zellen leicht durch Scherkräfte beschädigt werden können. Scherkräfte werden zum kontrollierten Aufbruch der Zellen durch Homogenisierung, Sonifikation und Stickstoffkavitation verwendet. Es wäre zu erwarten gewesen, dass die Gelierung der Gelatine starke Kräfte auf die umliegenden Zellen ausübt und möglicherweise Wasser aus den Zellen entfernt. Aus diesem Grund war es überraschend, als herausgefunden wurde, dass nach dem Bedecken und der Immobilisierung der Zellen in dem Gel keine cytotoxischen Effekte auftraten.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Gel, das hydrolysierte Gelatine umfasst, zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Verfügung. Wie obenstehend angegeben kann zur Bildung des erfindungsgemäßen Gels ein beliebiges Kulturmedium in Kombination mit der hydrolysierten Gelatine verwendet werden.
Wie obenstehend angegeben, hat das erfindungsgemäße Gel den Vorteil, dass es die Konservierung der Zellen bei Temperaturen von 0 und 15°C ermöglicht, wobei die Zellen durch Dispergierung des Gels nach dem Hinzufügen einer wässrigen Lösung von dem Gel abgelöst werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem einen festen Träger zur Verfügung, auf dem das erfindungsgemäße Gel gebildet ist.
Der feste Träger kann ein beliebiger Träger sein, auf dem das Gel gebildet werden kann. Insbesondere kann der feste Träger eine Kulturschale, ein Well oder eine Säule sein. Der feste Träger kann eine Beschichtung aus einem extrazellulären Matrixfaktor aufweisen.
Ferner ist bevorzugt, dass Zellen an dem Gel anhaften, das auf dem erfindungsgemäßen festen Träger gebildet ist. Wie obenstehend angegeben, können die Zellen

1. an einer Oberfläche des Gels haften;
2. zwischen zwei Schichten des Gels gehalten sein;
3. in dem Gel immobilisiert sein; oder
4. an dem festen Träger haften und mit dem Gel bedeckt sein.

Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Gel zur Verfügung, das hydrolysierte Gelatine und eine oder mehrere isolierte Zellen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Konservierung von isolierten Zellen zur Verfügung, umfassend das Anhaften der Zellen auf einer ersten Schicht eines Gels und nachfolgendes Bedecken mit einer zweiten Gelschicht, so dass die Zellen zwischen den beiden Gelschichten gehalten werden und die Zellen bei einer Temperatur von 0 bis zu 15°C kultiviert werden, bei der wenigstens eine der Gelschichten eine nicht-hydrolysierte Gelatine umfasst.
Der Begriff "nicht-hydrolysierte Gelatine" bezieht sich auf Gelatine, die noch nicht hydrolysiert worden ist. Vorzugsweise bezeichnet der Begriff "nicht-hydrolysierte Gelatine" Gelatine, die in vitro noch nicht hydrolysiert worden ist. Ferner ist bevorzugt, dass die Gelatine noch nicht durch thermische Hydrolyse, durch proteolytischen Verdau mit Gelatinase oder Trypsin oder durch chemische Verfahren, die eine saure oder alkalische Hydrolyse umfassen, hydrolysiert worden ist.
Die Gelatine ist vorzugsweise eine 300 Bloom Gelatine vom Typ A aus Schweinehaut, die noch nicht hydrolysiert worden ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen beide Schichten des Gels nicht-hydrolysierte Gelatine.
Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Schicht des Gels hydrolysierte Gelatine und die zweite Schicht umfasst nicht-hydrolysierte Gelatine.
Bei einer weiteren bevorzugten alternativen Ausführungsform umfasst die erste Gelschicht nicht-hydrolysierte Gelatine und die zweite Schicht umfasst hydrolysierte Gelatine. Werden die Zellen benötigt, kann die zweite Schicht durch eine wässrige Dispergierung entfernt werden, wobei die Zellen immer noch an der ersten Schicht angehaftet bleiben. Derartige immobilisierte Zellen sind für Mikroinjektionsuntersuchungen besonders geeignet. Verschiedene Substanzen (z.B. DNA, RNA und Proteine) können direkt in die immobilisierten Zellen injiziert werden. In Anbetracht der geringen Stoffwechselgeschwindigkeit der Zellen, führt die progressive Mikroinjektion der immobilisierten Zellen im Wesentlichen zu einer gleichmäßigen Startzeit für nachfolgende Stoffwechselversuche.
Das die nicht-hydrolysierte Gelatine umfassende Gel kann zudem zusätzlich hydrolysierte Gelatine umfassen; jedoch enthält das Gel, das nicht-hydrolysierte Gelatine umfasst, im Wesentlichen keine hydrolysierte Gelatine. Im Wesentlichen keine hydrolysierte Gelatine bedeutet, dass das Gel nicht mehr als den endogenen Spiegel an hydrolysierter Gelatine umfasst, die in einer nicht-hydrolysierten Gelatineprobe vorhanden ist. Der Spiegel an hydrolysierter Gelatine beträgt vorzugsweise weniger als 10% (w/w) der Gelatine. Hydrolysierte Gelatine wird als Gelatineprotein angesehen, das in Trichloressigsäure löslich ist. Dementsprechend ist es bevorzugt, dass nicht-hydrolysierte Gelatine weniger als 10% (w/w) Trichloressigsäure-lösliches Protein enthält. Das Gel, das die nicht-hydrolysierte Gelatine umfasst, bildet bevorzugt ein starkes Gel, auf dem Zellen bei einer Temperatur von 0 bis 15°C konserviert erhalten werden können, jedoch nicht durch das Hinzufügen einer wässrigen Lösung dispergiert werden kann. Geeignete nicht-hydrolysierte Gelatinegele wurden bereits beschrieben (siehe Evans, Cell Biology International, 18, 999–1008, 1994; Evans, Cell Biology International, 19, 855–860, 1995; Evans, Cell Biology International, 23, 117–124, 1999; und Griffiths & Evans, Cryobiology, 40, 176–181, 2000). Desweiteren wurde festgestellt, dass hydrolysierte Gelatine im Allgemeinen ein 30 kDa Proteinfragment umfasst, wohingegen nicht-hydrolysierte Gelatine kein 30 kDa Proteinfragment umfasst (bestimmt unter Verwendung einer SDS-PAGE).
Die bevorzugten Merkmale des Gels, das nicht-hydrolysierte Gelatine einschließlich der verschiedenen Bestandteile des Gels umfasst, sind die selben, wie obenstehend für das Gel, das hydrolysierte Gelatine umfasst, angegeben, außer, dass das Gel eine nicht-hydrolysierte Gelatine aufweisen muss. Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen festen Träger zur Verfügung, der eine erste Schicht aus darauf gebildetem Gelatinegel aufweist, und eine zweite Schicht aus Gelatine aufweist, die auf der ersten Schicht des Gelatinegels gebildet ist, wobei die Zellen zwischen den zwei Gelatinegelschichten gehalten werden. Das zur Bildung der ersten und zweiten Schicht gebildete Gelatinegel kann unabhängig aus einem hydrolysierten Gelatinegel oder einem nicht-hydrolysierten Gelatinegel ausgewählt werden.
Der feste Träger und die Zellen sind wie obenstehend beschrieben.
Diese zweischichtige Anordnung wurde zuvor noch nie erfolgreich zur hypothermischen Konservierung von Zellen verwendet. In der Tat führt sie bei dem einzigen Fall, bei dem sie versucht wurde (Stevanovich et al., Cryobiology, 32, 389–403, 1995), zu einer schnellen Blasenbildung der Membranen und zum Tod der Zellen.
Die erfindungsgemäße zweischichtige Anordnung weist eine Reihe von Vorteilen auf. Der erste Vorteil ist, dass die zweischichtige Anordnung die Bildung einer gleichmäßigen Zellmonoschicht auf der unteren Gelatineschicht ermöglicht, bevor die obere Gelatineschicht hinzugefügt wird. Im Gegensatz dazu ist die Lagerung in einer Zellsuspension nicht gleichmäßig und kann örtlich hohe Zelldichten am Grund des Behälters oder möglicherweise in dem Körper der sich verfestigenden Gelatine zur Folge haben. Die schnelle Geschwindigkeit der Zellabsetzung legt nahe, dass dieser Effekt nahe dem Behälter und an dessen Boden am deutlichsten ist. Da die Zellen sich absetzen, ist es wahrscheinlich, dass auch die Zellstapelung ein Problem darstellt. Ein weiterer Vorteil betrifft die Diffusion durch Gelatinegel. Es sollte daran gedacht werden, dass Stoffwechsel unter hypothermischen Bedingungen weitergeht, d.h. die Zellen sind nicht in suspendierter Bewegung. Es wird immer noch Energie zu Erhaltungszwecken benötigt (z.B. Ionenpumpen und Proteinabbau). Die zweischichtige Anordnung ermöglicht die Diffusion über die gesamte Zelloberfläche, was nicht möglich ist, wenn die Zellen entweder auf der Oberfläche des Gelatinegels angeordnet sind oder auf einem festen Träger anhaften und dann mit dem Gelatinegel bedeckt werden.
Desweiteren ist die Tiefe der Gelatinegele über den Zellen im Allgemeinen geringer als die Tiefe der Gelatinegele, wenn die Zellen auf einem festen Träger immobilisiert und mit dem Gel bedeckt sind, dies erlaubt wiederum eine bessere Diffusion der Nährstoffe zu den Zellen.
Durch die Konservierung der Zellen zwischen zwei Schichten haben die Zellen desweiteren gleichmäßige Kräfte über ihren gesamten Oberflächenbereich hinweg. Daher verformen sich die Zellen weniger und die Wahrscheinlichkeit nimmt ab, dass sie sich phänotypisch verändern. Darüber hinaus fanden die Erfinder heraus, dass Zellen länger in einem nicht-hydrolysierten Gelatinegel in zweischichtiger Anordnung überleben, als wenn die Zellen, die an einem festen Träger haften, mit einer nicht-hydrolysierten Gelatinegelschicht bedeckt sind, oder wenn die Zellen innerhalb eines nicht-hydrolysierten Gelatinegels immobilisiert sind.
Folglich gibt es zahlreiche Vorteile, die mit der zweischichtigen Anordnung zur Immobilisierung der Zellen in Verbindung stehen.
Wie vorher bereits angegeben, ist es wünschenswert, dass die Gelatineschichten mit einem flüssigen Kulturmedium bedeckt sind, jedoch ist dies nicht notwendig. Dies ist insbesondere bevorzugt, wenn die Dauer der Konservierung über einen langen Zeitraum andauert.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden zudem heraus, dass nach der Lagerung der Zellen über einen langen Zeitraum bei Temperaturen zwischen 0 und 15°C, Organellen wie zum Beispiel Mitochrondrien im Zentrum der Zellen aggregieren (Griffiths et al., Cryobiology, 40, 176–181, 2000). Dies ist auf den Zusammenbruch des Zellskeletts der Zelle zurückzuführen. Es wurde herausgefunden, kurze Zeiträume in denen sie Zellen Temperaturen zwischen 20 und 37°C ausgesetzt werden, ausreichen, um die Struktur des Zellskeletts wieder herzustellen, wohingegen diese Zeiträume zu kurz sind, um in den Zellen phänotypische Veränderungen auszulösen.
Zudem ist in den erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt umfasst, dass die Zellen wenigstens einmal alle paar Tage (d.h. etwa alle 2 bis 5 Tage) etwa 1 bis 16 Stunden lang (bevorzugt etwa 5 Stunden lang) Temperaturen zwischen etwa 20 und 37°C ausgesetzt werden. Führt die erhöhte Temperatur jedoch zu einem Schmelzen des Gelatinegels (z.B. wenn ein hydrolysiertes Gelatinegel einer Temperatur von etwa 25°C ausgesetzt wird, oder wenn ein nicht-hydrolysiertes Gelatinegel einer Temperatur von etwa 37°C ausgesetzt wird) ist es bevorzugt, dass die Zellen für die Dauer der erhöhten Temperatur in eine Kultur in Suspension übertragen werden, und dann zur weiteren Konservierung an ein Gelatine-enthaltendes Gel angehaftet werden. Dem Fachmann sind Kulturen in Suspension wohlbekannt. Eine Kultur in Suspension für Hepatozyten ist insbesondere in Evans, Biochim. Biophys. Acta., 677, 433–444, 1981 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Konservierung isolierter Zellen zur Verfügung, umfassend das Anhaften der Zellen an ein Gel, das nicht-hydrolysierte Gelatine und/oder hydrolysierte Gelatine umfasst, und die Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 0 bis 15°C. Ferner umfasst das Verfahren, dass die Zellen wenigstens einmal alle paar Tage (d.h. etwa alle 2 bis 5 Tage) etwa 1 bis 16 Stunden lang (bevorzugt etwa 5 Stunden lang) Temperaturen zwischen etwa 20 und 37°C ausgesetzt werden. Die Zellen können an einer Oberfläche des Gels haften, zwischen zwei Schichten des Gels gehalten werden, in dem Gel immobilisiert werden, oder an einen festen Träger anhaften und mit dem Gel bedeckt sein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben, dass "Zellbanken" aus Primärzellen aus einem Tier hergestellt werden können. Die Zellen können danach über einen Zeitraum von Tagen verwendet werden, wobei die Komplikationen einer genetischen Veränderung vermieden werden. Die Verfahren machen es möglich, dass Zellen sofort verwendet werden können, ohne dass man eine Vervielfältigung der Zellen abwarten muss. Die Verfahren ermöglichen die Konservierung von Zellarten, die bei einer Cryokonservierung empfindlich sind, und durch die Verfahren können genetisch modifizierte Zellen mit minimalem Verlust an entfernte Orte transportiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Verfügung, durch das isolierte Organe oder Gewebefragmente konserviert werden, umfassend das Durchtränken des Organs oder Gewebes mit einem verflüssigten Gel, das hydrolysierte und/oder nicht-hydrolysierte Gelatine umfasst, wobei nach dem Durchtränken das Organ oder Gewebe bei einer Temperatur zwischen 0 und 15°C gelagert wird.
Ein großes Problem bei einer Organtransplantation ist der kurze Zeitraum, in dem das Organ verfügbar ist, bevor es zerfällt (bei einer Leber z.B. 36–48 Stunden). Es wird häufig behauptet, dass dies zunächst nicht auf die schlechten Konservierung der organspezifischen Zellen zurückzuführen ist, sondern auf die höhere Empfindlichkeit der Endothelialzellen, die die Blutgefäße säumen (T. Ebert et al., Modern Trends in BioThermoKinetics, 3, 288–293, 1994). Diese Zellen "schälen" bei dem Versuch einer erneuten Perfusion die Wände, was zur Okklusion der Blutgefäße und zu nachfolgendem Organschaden aufgrund der gestörten Zirkulation führt. Die Perfusion eines frisch isolierten Organes mit einem Gelatine-Konservierungsmittel verhindert diese Veränderungen. Nach der vollständigen Perfusion wird das Organ bei Temperaturen von 0 bis 15°C gelagert, mit dem Ergebnis, dass sich die Gelatine in den Blutgefäßen, usw. verfestigt und die Endothelialzellen in ihren korrekten Positionen gehalten werden. Das Gelatinegel verbindet die Merkmale einer festen Trägermatrix mit einer guten Diffusionsgeschwindigkeit in den Geweben und mit einer niedrigen Schmelztemperatur. Wird das Organ benötigt, kann es mit einem Medium (z.B. Salzlösung) bei 37°C durchtränkt werden. Das konservierende Gelatinegel wird schnell ausgewaschen. Die Verwendung der Gelatine hat einen weiteren Vorteil, dass Gelatine ein normales Körpermaterial ist und es nicht wahrscheinlich ist, dass es eine Immunoreaktion auslöst.
Das Organ kann ein beliebiges Organ sein, wie zum Beispiel ein Herz, eine Leber, eine Niere, usw. Das Gewebe kann ein beliebiges Gewebe sein, das Blutgefäßversorgung aufweist, die durchtränkt werden kann. Bevorzugt wird ein Organ durchtränkt, und es werden dann von dem durchtränkten Organ Gewebeproben genommen. Alternativ kann eine Gewebeprobe direkt durchtränkt werden, vorausgesetzt, es hat eine ausreichende Gefäßversorgung, die die Perfusion gestattet.
Das verflüssigte Gel ist ein Gelatinegel, das dadurch verflüssigt wird, dass es auf einer ausreichend hohen Temperatur erhalten wird (z.B. 25 bis 37°C), um sicherzustellen, dass es sich nicht verfestigt. Das Gelatinegel umfasst bevorzugt hydrolysierte Gelatine oder nicht-hydrolysierte Gelatine und es ist bevorzugt wie obenstehend beschrieben. Ganz besonders bevorzugt umfasst das Gelatinegel hydrolysierte Gelatine wie obenstehend definiert.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der Beispiele beschrieben, wobei auf die folgenden Figuren Bezug genommen wird:
1 ist eine schematische Darstellung von Zellen, die auf einer Gelschicht, die hydrolysierte Gelatine umfasst, konserviert sind.
2 ist eine schematische Darstellung von Zellen, die zwischen zwei Gelschichten, die hydrolysierte Gelatine umfassen, konserviert sind.
3 ist eine schematische Darstellung von Zellen, die in einer Gelschicht, die hydrolysierte Gelatine umfasst, konserviert sind.
4 ist eine schematische Darstellung von Zellen, die auf einem festen Träger immobilisiert sind und mit einer Gelschicht, die hydrolysierte Gelatine umfasst, konserviert sind.
5 zeigt die Rückgewinnung von Rattenhepatozyten nach einer hypothermen Konservierung bei 10°C. Die Werte beziehen sich auf die Enzymaktivität, die danach in Zellen festgestellt wurde, die nach 2 Stunden anhafteten.
6 zeigt die Wirkung einer hypothermen Konservierung auf die Geschwindigkeit der Proteinsynthese.
7 zeigt die Aktivität einer Tyrosinaminotransferase, ± Hormonzusätze, nach der Konservierung. (∎) basales Kulturmedium, (☐) basales Kulturmedium mit Dexamethason und Dibutyryl-cAMP.
8 zeigt die γ-Glutamyltranspeptidase-Aktivität während der Kultivierung der Hepatozyten. Die Hepatozyten wurden ununterbrochen konserviert (⦁) oder nach 96 Stunden Konservierung bei 37°C (o) erneut kultiviert. Das γ-GT-Induktionsprofil ist identisch zu dem, bei dem frisch isolierte Hepatozyten ohne vorherige Konservierung kultiviert wurden.
9a stellt die Wirkung einer Kultur (37°C) auf die Hepatozytspiegel von Cytochrom-P₄₅₀ und Cytochrom-b5 dar, und 9b stellt die Wirkung der Konservierung auf die Hepatozytspiegel von Cytochrom-P₄₅₀ und Cytochrom b5 dar.
10 stellt die Erhaltung von Cytochrom P₄₅₀1A1 in konservierten Hepatozyten dar.
11a stellt den intrazellulären Proteinabbau in Hepatozyten dar, die bei 37°C kultiviert wurden, und 11b stellt den intrazellulären Proteinabbau in konservierten Hepatozyten dar. Trichloressigsäure-unlösliche Radioaktivität (∎) und Trichloressigsäure-lösliche Radioaktivität (☐).
12 stellt die Morphologie von Hepatozyten in vitro dar. Frisch isolierte Zellen (a) besitzen eine abgerundete Form. Bei einer herkömmlichen Kultivierung dehnen sich die Hepatozyten derart schnell aus, dass innerhalb von 24 Stunden der Nukleus deformiert und die Zelle sehr flach wird (b). Wird das Konservierungsgelatinegel verwendet und geschieht dies unter Hypothermie, wird die abgerundete Morphologie beibehalten (c), was etwa der in vivo-Situation entspricht. Die Zellen behalten diese Form währen der gesamten Konservierung bei.
13 stellt die Lebensfähigkeit der Zellen während der Konservierung in Abwesenheit von Serum (∎), Nährstoffen (⦁) oder Hormonen (☐) dar.
14 stellt den TCA-löslichen Gehalt an natürlicher Gelatine, thermisch hydrolysierter natürlicher Gelatine, 75 Bloom Gelatine dar. Die Gelatinelösungen wurden bei 37°C und 40°C (⦁), 50°C (
), 60°C (♦), 70°C (☐), 80°C (∎), und 95°C (X) über den angegebenen Zeitraum hinweg erhitzt. Der TCA-lösliche Proteingehalt der autoklavierten natürlichen (– – –) (obere Linie) und 75 Bloom Gelatine (– – –) (untere Linie) sind ebenfalls dargestellt.
15 stellt die Anhaftung von Hepatozyten an Primaria^®-Platten bei 37°C 2 Stunden nach der Auslösung aus dem Konservierungsgel, das nicht-hydrolysierte oder hydrolysierte Gelatine aufweist, dar. Die erste Säule zeigt Zellen, die durch Erhitzen (37°C) freigesetzt wurden und die 2 Stunden zur Anhaftung Zeit hatten. Die zweite Säule zeigt die Lebensfähigkeit der Zellen, die durch das Hinzufügen eines Überschusses an L-15-Medium bei 10°C zurückgewonnen wurden und dann von der Suspension durch Zentrifugieren/Pelletieren getrennt wurden. Entweder war Serum in dem Gel vorhanden (+ve Serum) oder es war in ihm nicht vorhanden (–ve Serum).
16 stellt den SDS-PAGE von natürlicher Gelatine (a); 80°C (2,5 Stunden) wärmebehandelter Gelatine (b); 95°C (2,5 h) wärmebehandelter Gelatine (c); und autoklavierter natürlicher Gelatine (d) dar

Gel a: (i) MW: 95 KDa
Gel b: (i) MW: 95 KDa; (ii) MW: 30 KDa
Gel c: (i) MW: 30 KDa
Gel d: (i) MW: 30 KDa

17 stellt die Lebensfähigkeit der Hepatozyten dar, die in verschiedenen Anordnungen (relativ zu dem Gel) konserviert wurden und/oder in Gelen konserviert wurden, die entweder aus nicht-hydrolysierter oder hydrolysierter Gelatine bestanden. Die Daten werden als Prozentsatz der Anzahl der lebensfähigen Zellen (wie durch die LDH- Aktivität bestimmt) in dem nicht-hydrolysierten Gelatinesandwich zu jedem Zeitpunkt ausgedrückt. Natürliche Gel/Zell-Aufschlämmung (–♦–), bei der Hepatozyten in einem Gel aus nicht-hydrolysierter Gelatine aufgelöst sind; vorher angehaftete Hepatozyten mit natürlicher Geldecke (–∎–), wobei Hepatozyten sich an das Substrat anhaften können, bevor sie durch ein Gel aus nicht-hydrolysierter Gelatine bedeckt werden; hydrolysierte Gelatineaufschlämmung (–x–), wobei Hepatozyten in einem Gel aus nicht-hydrolysierter Gelatine bei 95°C hydrolysiert werden; 75 Bloom Aufschlämmung (–⦁–), wobei Hepatozyten in einem Gel bestehend aus 75 Bloom-Gelatine (im Handel von Sigma erhältlich) suspendiert werden; vorher angehaftete Hepatozyten mit hydrolysierter Geldecke (–o–), wobei sich die Hepatozyten vor der Bedeckung durch ein Gel aus hydrolysierter Gelatine an das Substrat heften konnten.
18 stellt das Erhitzungs- und Abkühlungsprofil eines Konservierungsgels dar, das nicht nicht-hydrolysierte Gelatine in einer 60 mm Corning-Platte enthält.
19a stellt das Temperaturprofil in verschiedenen Wells einer 96-Welt Mikrotiterplatte während der Abkühlungsphase (10°C) dar. Für die relative Position einer jeden Vertiefung wird auf 19b verwiesen.
BEISPIEL 1
Materialien & Verfahren
Collagenase wurde von Boehringer Mannheim, Opti Phase X von LKB, Croydon, Surrey, U.K., erworben, und Leibovitz (L-15) Kulturmedium, Kälberserum von neugeborenen Kälbern und Gentamycin wurden von ICN durch Biomedicals LID, High Wycombe, Bucks U.K. geliefert und Insulin wurde von Boots, Nottingham, UK gekauft. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma, Poole, Dorset, UK gekauft.
Hepatozyten wurden wie obenstehend beschrieben hergestellt (Evans 1981 (supra), Evans und Mayer, 1982 (supra)). Das Gel der vorliegenden Erfindung umfasst Zellkulturmedium bestehend aus einem Leibovitz (L-15)-Medium (pH 7,4) umfassend Glucose (8,3 mM) und Hepes (25 mM), und hydrolysierte Gelatine. Hydrolysierte Gelatine wurde erhalten, indem Gelatine (3%, Sigma-Typ I aus Schweinehaut) in sterilem Wasser auf 95°C 2 Stunden lang erhitzt wurde. Eine Menge der 3% hydrolysierten Gelatinelösung wurde einer Menge einer 2x-Lösung des Zellkulturmediums hinzugefügt, um eine Lösung zu bilden, die 1,5% (w/v) hydrolysierte Gelatine umfasst. Das die hydrolysierte Gelatine umfassende Gel wurde in einer 60 mm Kulturschale auf 10°C abkühlen gelassen. 2,5×10⁶ Hepatozyten wurden in 3 ml Leibovitz (L-15) Medium (pH 7,4), das mit Glucose (8,3 mM), Hepes (25 mM), Insulin (0,8 μg ml^–1), Gentamycin (50 μg/ml^–1) und Wärme-inaktiviertes Kälberserum neugeborener Kälber (10% v/v) ergänzt wurde. Eine Stunde wurde zur Anhaftung der Zellen an das Gel bei 10°C gestattet. Die Zellen hafteten sich fest an das Gel, waren jedoch nicht in der Lage, sich über das Substrat zu verteilen oder zu migrieren. Die Platten wurden in einen befeuchteten 10°C-Inkubator angeordnet. 1 stellt schematisch die an der Gelschicht haftenden Hepatozyten dar.
Von den Platten wurden in täglichen Intervallen Proben entnommen und es wurde herausgefunden, dass sie eine hohe Lebensfähigkeit beibehalten, was durch ihre Retention des cytosolischen Markerenzms Lactatdehydrogenase (LDH) und ihre nachfolgende Fähigkeit, sich an einen festen Träger zu haften, beurteilt wurde. Es wurde zudem herausgefunden, dass die Zellen ihre Proteinsynthesegeschwindigkeiten beibehalten und in vivo-artige Reaktionen auf Hormone zeigen. Es wurde herausgefunden, dass die Spiegel an Cytochrom-P₄₅₀ und dessen spezifischen Isoenzymen beibehalten wurden. Desweiteren traten keine atypischen Enzymcharakteristika einer phänotypischen Veränderung auf.
Die konservierten Hepatozyten behielten die obenstehend genannten Eigenschaften für wenigstens sieben Tage bei.
Die Hepatozyten wurden von dem Gel abgelöst, indem mit Rimming ein Überschuss an kaltem Kulturmedium hinzugefügt wurde.
Die von dem Gel abgelösten Hepatozyten wurden abgeerntet und konnten in Analysen oder anderen Experimenten verwendet werden.
BEISPIEL 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Experiment wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass nach der Anhaftung der Hepatozyten an die Gelschicht das Kulturmedium entfernt wurde und mit 1 ml des L-15 Zellkulturmediums, das 1,5% (w/v) hydrolysierte Gelatine umfasst, ersetzt wurde. Der oberen Gelschicht wurde 1 Stunde Zeit gegeben, sich bei Raumtemperatur an die untere Gelschicht anzuhaften. Die Gelschichten und Zellen wurden dann bei 10°C angeordnet, damit das Gel sich verfestigen kann. Ein weiterer 1 ml Zellkulturmedium wurde oben auf die obere Gelschicht hinzugefügt (vgl. 2).
Es wurde herausgefunden, dass die konservierten Hepatozyten auf die gleiche Weise konserviert waren wie die Hepatozyten von Beispiel 1.
Die Zellen wurden wieder durch Hinzufügen eines Überschusses an kaltem Kulturmedium von dem Gel abgelöst (mit Rimming).
BEISPIEL 3
Das L-15 Medium, das wie obenstehend in Beispiel 1 beschreiben 1,5% hydrolysierte Gelatine umfasst, wird bei 37°C geschmolzen, und Hepatozyten werden hinzugefügt. Danach wird das die Hepatozyten enthaltende Gel bei 10°C angeordnet, so dass sich das Gel verfestigt und die Hepatozyten in dem Gel immobilisiert werden (vgl. 3).
Es wurde herausgefunden, dass die konservierten Hepatozyten auf die gleiche Weise konserviert waren wie die Hepatozyten von Beispiel 1.
Die Zellen wurden abermals durch Hinzufügen eines Überschusses an kaltem Kulturmedium mit Rimming von dem Gel abgelöst.
BEISPIEL 4
Hepatozyten werden in einer Petrischale in dem in Beispiel 1 beschriebenen L-15-Medium, das keine 1,5% hydrolysierter Gelatine umfasst, bei 37°C 2 Stunden lang kultiviert. Die Hepatozyten haften an der Oberfläche der Schale an. Das L-15-Medium wird entfernt und durch das in Beispiel 1 beschriebene L-15-Medium, das 1,5% hydrolysierte Gelatine umfasst, ersetzt. Die Schale wird bei 10°C angeordnet, und das Gel verfestigt sich, wobei die Zellen, die an der Oberfläche der Schale haften, bedeckt werden. Vgl. 4.
Es wurde herausgefunden, dass die konservierten Hepatozyten auf die gleiche Weise konserviert waren wie die Hepatozyten von Beispiel 1.
Das Gel wurde durch Erhitzen oder durch das Hinzufügen eines Überschusses an kaltem Kulturmedium mit Rimming entfernt, und die Zellen blieben bereit zur Verwendung bei Untersuchungen oder anderen Experimenten an der Oberfläche der Schale haften.
Wie für den Fachmann offensichtlich ist, kann die Gelatinemenge, der feste Träger, an den die Zellen sich haften können, und die Art des Kulturmediums, das zur Bildung des Gels verwendet wird, je nach den genauen Anforderungen der Untersuchung variieren. Die Beispiele 2 bis 4 wurden auch unter Verwendung von nicht-hydrolysierter Gelatine anstatt der hydrolysierten Gelatine durchgeführt, und die Zellen wurden durch Erhitzen des Gels auf 37°C abgelöst.
BEISPIEL 5
Messung der funktionellen Integrität der konservierten Zellen
Die funktionelle Integrität der konservierten Zellen wurde unter Anwendung der folgenden Kriterien untersucht:

1. Über einen Zeitraum von 7 Tagen hinweg waren 90–95% der Zellen, die aus den Gelatinegelen (sowohl nicht-hydrolysiertes Gelatinegel als auch hydrolysiertes Gelatinegel) freigesetzt werden, nicht durch Trypanblau anfärbbar. Diese Zahl ist im Wesentlichen dieselbe wie die Lebensfähigkeit der frisch isolierten Zellen.
2. Die nicht-Anfärbbarkeit durch Vitalfarbstoffe oder die Retention löslicher Enzyme zeigt an, dass die Zellen in diesem Moment leben. Jedoch wird durch diese Techniken nicht notwendigerweise eine anhaltende Lebensfähigkeit angezeigt. Poullain et al. (Hepatology 15, 97–106, 1992) berichteten, dass die Laktatddehydrogenaseaktivität nach der Lagerung im Kalten in der University of Wisconsin-Lösung relativ hoch ist, selbst wenn die Zellen nicht in der Lage waren, an den Kunststoff anzuhaften und zu überleben. In ähnlicher Weise weisen cryokonservierte Zellen ebenfalls häufig diese "wiedersprüchlichen" Eigenschaften auf. Aufgrund dieser Unsicherheit wurden die durch das erfindungsgemäße Gelatinegel konservierten Zellen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, sich über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 37°C an Träger anzuhaften und den biochemischen Marker Lactat-Dehydrogenase (LDH) zu exprimieren, gescreent. Es wurde herausgefunden, dass sich die konservierten Zellen auf die gleiche Art und Weise wie frisch isolierte (nicht-konservierte) Zellen an Träger anhaften. Vgl. 5.
3. Die Anhaftung an einen Träger ist kein endgültiger Beweis, dass die Hepatozyten im Nachfolgenden bei 37°C ihre Funktion beibehalten. Überdies kann es sein, dass die Zellen eine Erholungsphase benötigen und eine verschlechterte metabolische Funktion aufweisen, wie es bei cryokonservierten Zellen (De Loecker et al. Cryobiology 30, 12–18, 1993; Chesne et al. Hepatology 18, 406–414, 1993) beobachtet werden kann. Dementsprechend wurden die Proteinsynthesegeschwindigkeiten als Kriterium für normales Verhalten verwendet. Die Proteinsynthese benötigt einen hohen Grad an metabolischer Integration. Typische Reaktionen der Zellen nach der Konservierung in dem erfindungsgemäßen Gelatinegel sind in 6 dargestellt. Die Proteinsynthesegeschwindigkeiten wurden durch die Inkorporierung von L-[4,5-³H] Leucin in eine Trichloressigsäure-unlösliche Form gemessen. Die Geschwindigkeiten waren wenigstens 7 Stunden lang linear und ihnen ging keine Lag-Phase voraus.
4. Die Messungen der Proteinsynthese zeigen eine allgemeine Zellfunktion, sie geben jedoch nicht an, ob letztere gewebespezifisch ist. Nach der Konservierung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gelatinegels wurden die Zellen auf ihre hormonelle Induktion des Enzyms Tyrosinaminotransferase geprüft. Dies ist eine leberspezifische Eigenschaft, bei der das Binden des Hormons an den Rezeptor, die Translokation des besetzten Rezeptors, die Transkription und Translation umfasst sind. Typische Ergebnisse sind in 7 dargestellt, bei der die konservierten Zellen in Gegenwart der Induktoren Dexamethason und Dibutyryl-cAMP erhöhte Spiegel an Tyrosinaminotransferase aufweisen, wohingegen die konservierten Zellen ohne Gegenwart der Induktoren (basales Kulturmedium) keine erhöhten Spiegel aufweisen. Insbesondere von Interesse ist, dass die induzierten konservierten Zellen in vivo-artige Enzymspiegel aufweisen, im Gegensatz zu nicht-konservierten Zellen, die bei 37°C in vitro kultiviert wurden.
5. Wenn die konservierten Zellen zusätzlich zu der Beibehaltung der leberspezifischen Funktionen frisch isolierten Zellen ähneln sollen, sollten sie während der Konservierung keine phänotypischen Veränderungen durchmachen. Das Auftreten des Enzyms Gammaglutamyltranspeptidase ist ein Marker zur Früherkennung von Leberkrebs und wird induziert, wenn Hepatozyten bei 37°C kultiviert werden (Edwards, Cancer Res., 42, 1107–1115, 1982). 8 zeigt, dass der phänotypische Marker während der Konservierung nicht auftritt, dies jedoch deutlich nach 48-stündiger Kultivierung bei 37°C tut. Es ist interessant, dass nach der Konservierung die Kultivierung der Zellen über den selben Zeitraum hinweg zu der Induktion von γ-Glutamyltranspeptidase führt wie für frisch isolierte Zellen. Dies zeigt, dass ihre Funktion durch die Konservierung beibehalten wurde, aber die Zellen sich letztendlich auf dieselbe Art und Weise verhalten wie frisch isolierte Zellen, wenn sie nachfolgend bei 37°C kultiviert werden.
6. Es ist deutlich, dass "langfristige" phänotypische Veränderungen (wie zum Beispiel die Induktion von Gammaglutamyltranspeptidase) verhindert werden. Phänotypische Veränderungen treten jedoch mit verschiedenen Geschwindigkeiten auf. Es war möglich, dass in den Konservierungssystemen immer noch schnelle Veränderungen auftreten. Möglicherweise ist die frühste phänotypische Veränderung das Absenken von Cytochrom-P₄₅₀, was den Wert der langfristigen Hepatozytkulturen bei der Toxizitätsprüfung letztendlich verringert. Die Wirkung von verschiedenen Kulturformen auf die Spiegel von Cytochrome-P₄₅₀ und das stabilere Cytochrom b₅ wurden verglichen. Wie erwartet, führte die herkömmliche Kultur zu einem schnellen Absinken des Cytochrome-P₄₅₀-Spiegels (9a). Die Konservierungsmodelle behielten jedoch hohe Cytochrome-P₄₅₀-Spiegel, die fast gleich wie diejenigen von Cytochrom b₅ waren (9b).
7. Als ein weiterer Test der Bedeutung der in vivo Situation sollte das Isoenzymprofil von Cytochrom P₄₅₀ nicht durch das Konservierungsverfahren verändert werden. 10 stellt die Aufrechterhaltung des spezifischen Cytochrom-P450-Isoenzyms 1A1 durch die Konservierungsverfahren dar.

BEISPIEL 6
Stoffwechsel findet unter Konservierungsbedingungen weiterhin statt
Anders als bei der Cryokonservierung befinden sich die Zellen während der Konservierung in den erfindungsgemäßen Gelatinegelen nicht in einem Zustand der suspendierten Bewegung. Ein Teil des Stoffwechsels findet weiterhin statt, jedoch mit einer sehr geringen Geschwindigkeit. Um zu zeigen, dass dies der Fall war, wurde ein Verfahren benötigt, das über einen langen Zeitraum hinweg beobachtet werden konnte. Proteinsynthesemessungen können aufgrund der Erschöpfung des markierenden Radioisotops und/oder des Umsatzes der neu synthetisierten Proteine nur über einen relativ kurzen Zeitraum hinweg beobachtet werden. Es können jedoch Proteinabbaumessungen, in Gegenwart der erhöhten Spiegel an unmarkierter Substanz, die ursprünglich in das Protein eingebunden war (zur Verhinderung einer erneuten Verwendung), über einen ausgedehnten Zeitraum vorgenommen werden. Die Messungen können sowohl hinsichtlich des Verlustes an Trichloressigsäure -unlöslichem Material in den Zellen als auch hinsichtlich des Erscheinungbildes des Tricholoressigsäure-löslichen Materials in dem Megium vorgenommen werden. 11a und 11b zeigen die Geschwindigkeiten des Proteinabbaus von identischen "langlebigen" Proteinen bei 37°C in normalen Kulturen und im Konservierungssystem. Die konservierten Zellen wurden direkt von der Konservierungsmatrix geerntet, anstatt sie 2 Stunden lang an die Schale anhaften zu lassen. Dies wurde durch Erhitzen des Gels 20 Minuten lang auf 37°C (nicht-hydrolysiert) oder durch wässrige Dispersion (hydrolysiert) durchgeführt. Die resultierenden Zellsuspensionen wurden zentrifugiert und die Zellpellets und Überstände wurden separat auf ihren radioaktiven Gehalt hin untersucht.
Die Konservierung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gelatinegels erhöhte die Halbwertszeit der Proteine 20-fach. Unter beiden Umständen entsprach die aus den Trichloressigsäure-unlöslichen Formen freigesetzte Radioaktivität vollständig der Radioaktivität, die in dem Trichloressigsäure-löslichen Teil wieder gewonnen wurde. Aus diesem Grund war der Zelltod bei beiden Bedingungen minimal. Dies wurde durch die Messungen des Gesamtproteingehalts überprüft, die zeigten, dass sich die Zellen bei 37°C in einem konstanten Proteinstoffwechselzustand befanden, wobei während der Konservierung nur ein marginaler Rückgang des Proteingehalts stattfand. Der Proteinabbau ist ein energieabhängiger Prozess. Während der Konservierung bleibt die Proteinabbaugeschwindigkeit unverändert, was zeigt, dass in der gemessenen Zeitspanne keine schädlichen Wirkungen stattfinden.
BEISPIEL 7
Beibehaltung der Zellmorphologie
Zellmorphologie steht intrinsisch mit der Zellfunktion in Verbindung. Die Erfinder führten Untersuchungen durch, die zeigten, dass Veränderungen am Phänotyp während der Kultivierung bei 37°C mit Veränderungen an der Zellform assoziiert sind. Viele andere Studien bemerkten ebenfalls die Wichtigkeit der Beibehaltung der in vivo-Zellform, wenn die Zellfunktion beibehalten werden soll. Vgl. 12, die zeigt, dass Zellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gelatinegels die abgerundete Morphologie beibehalten.
BEISPIEL 8
Lebensfähigkeit der Zellen während der Konservierung ohne Gegenwart von Serum, Nährstoffen oder Hormonen
Zu Untersuchungszwecken kann es wünschenswert sein, dass, Zellen Faktoren ausgesetzt werden, um deren Wirkung auf die Zellfunktion zu beobachten, so werden z.B. Zellen Hormonen ausgesetzt, um die Induktionsprofile zu untersuchen. Werden die Zellen vor der Untersuchung ausgesetzt, kann die Wirkung des Testmittels ungültig sein. Mit diesem Hintergrundgedanken wurde die Wirkung der verschiedenen Gelatinegelbestandteile auf ihre konservierende Fähigkeiten untersucht, mit dem potentiellen Ziel, dessen Herstellung zu vereinfachen. 13 zeigt die Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen, wenn einer der drei Schlüsselbestandteile weggelassen wird: Serum, Nährstoffe oder Hormone. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird zum relevanten Zeitpunkt mit der Lebensfähigkeit der Zellen verglichen, wenn das Gelatinegel das gesamte Komplement der Bestandteile enthielt.
Diese Untersuchung offenbart die Stabilität des Systems, was die Entwicklung eines Gels mit einer genau definierten Zusammensetzung ermöglicht.
BEISPIEL 9
Konservierung von primären proximalen Nierentubuluszellen
Hepatozyten weisen viele vorteilhafte Eigenschaften auf, doch sie weisen wenigstens einen offenkundigen Unterschied im Vergleich zu vielen Zellen in Kultur auf. In vitro weisen Hepatozyten ein geringes Wachstumspotential auf, und die anfänglich isolierten Zellen können nicht durch Abimpfung aufrechterhalten werden. Zur Beurteilung der Wirkung der Konservierungssysteme auf wachsende Zellen wurden primäre proximale Nierentubuluszellen hergestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die proximalen Tubuluszellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gelatinegels anhand derselben Verfahren konserviert werden können. Markerenzyme diesen Zelltyps, wie zum Beispiel alkalische Phosphatase und Gammaglutamyltranspeptidase werden wenigstens eine Woche lang auf dem Niveau der frisch isolierten Präparation beibehalten. Die Zellen werden in einem Konservierungsmedium, das kein Bicarbonat aufweist, aufrechterhalten. Die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen wird dadurch gezeigt, dass sie nicht durch Trypanblau anfärbbar sind. Die Lebensfähigkeit der Tubuli wird dadurch gezeigt, dass sie in einem hypotonischen Medium angeordnet werden. Anfangs ist eine Blasenbildung an den Enden der Tubuli sichtbar, jedoch treten sie später auf der gesamten Länge auf. Nach dem Auftreten der Blasen fangen die Zellen in den Tubuli an, durch Trypanblau anfärbbar zu sein. Die konservierte proximale Tubuluspräparation zeigt einen Unterschied hinsichtlich der von Hepatozyten. Die proximalen Tubuluszellen haften nicht an einen Träger, es sei denn, dass die Gelatine durch Waschen der Zellen entfernt wird. Zur Bildung einer konfluenten Monoschicht mit derselben Geschwindigkeit wie die frisch isolierten proximalen Tubuluszellen, wachsen nach der Anhaftung der Zellen bei 37°C die Zellen normalerweise in einem mit Bicarbonat ergänzten Medium. Die Konservierungsverfahren haben auf das Zellwachstum keine schädliche Wirkung. Daten nicht angegeben.
Beispiel 10
Physikalisch-mechanisches Wesen des Gelatine-enthaltenden Gels
Das physikalisch-mechanische Wesen des hydrolysierten Gelatinegels weicht von demjenigen des nicht-hydrolysierten Gelatinegels ab. Das hydrolysierte schmilzt bei einer geringeren Temperatur als das nicht-hydrolysierte Gelatinegel. Zudem kann das hydrolysierte Gelatinegel durch das Hinzufügen eines Überschusses an wässrigem Medium (z.B. Zellkulturmedium) dispergiert werden. Das nicht-hydrolysierte Gelatinegel kann nur unter Verwendung eines Schrittes der Erhitzung dispergiert werden.
Das hydrolysierte Gelatinegel wird durch die thermische Behandlung natürlicher Gelatine unter kontrollierten Bedingungen gebildet. Veränderungen der molekularen Natur der resultierenden Gelatine wird durch Veränderungen in der Beständigkeit der Gelatine gegenüber Präzipitation durch TCA (14) offenbart.
Durch Experimente wurde herausgefunden, dass hydrolysierte Gelatine die Hepatozytanhaftung an synthetische Zellkultursubstrate (in diesem Fall Primaria^®) inhibiert. 15 offenbart, dass der Inhibierungsspiegel fast 100% beträgt. Wässrige Ernte (d.h. das Wiedergewinnen der Zellen unter Verwendung wässriger Medien zum Dissipieren des Gels) und Tests zur Anfärbbarkeit mit Farbstoff ergaben, dass die Zellen lebensfähig sind (bitte beachten Sie, dass bei einem nicht-hydrolysierten Gelatinegel keine wässrige Ernte möglich ist). Die Inhibierung geht verloren, wenn Zellen in Gegenwart von Serum kultiviert werden. Auch die Anhaftungs-inhibierten Zellen waren schnell in der Lage, anzuhaften, wenn sie in komplettem, Serum-enthaltenden Medium wieder kultiviert waren.
Eine SDS-PAGE-Analyse von Gelatine, hydrolysiert zu unterschiedlichen Graden (Vgl. 16), ermöglichte eine detailliertere Untersuchung der Zusammensetzung der Gelatine. Es ist ersichtlich, dass sich die Verteilung der Gelatinepolypeptide verändert, ausweitet und, in Übereinstimmung mit den TCA-Untersuchungen, fragmentiert, so, dass es eine erhöhte Frequenz an Polypeptiden mit geringeren Molekulargewichten (MWs) gibt. Überdies haben sich auch die vorherrschenden MWs verändert, von größeren 95 KDa-Fragmenten in nicht-hydrolysierter Gelatine zu einem kleineren KDa-Fragment in dem hydrolysierten Äquivalent.
Diese kleineren Polypeptide können das schwächere Gel bedingen, und dazu führen, dass es bei einer geringeren Temperatur schmilzt. Sie führen zudem zu der Anfälligkeit des Gels gegenüber Dispergierung durch wässrige Medien. Noch wichtiger ist jedoch, das dies zudem erklären kann, weshalb ein Gel, das hydrolysierte Gelatine umfasst, zur Beibehaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und deren Funktionieren besser ist, als ein Konservierungsgel, das nicht-hydrolysierte Gelatine umfasst.
BEISPIEL 11
Lebensfähigkeit von Hepatozyten, die in verschiedenen Anordnungen konserviert wurden
Hepatozyten wurden unter Verwendung eines konservierenden Gelatinegels konserviert, wobei diese nicht nur verschiedene Zusammensetzungen aufwiesen (siehe Beispiel 8), sondern auch unterschiedliche Anordnungen (d.h. das Verhältnis zwischen den Zellen und dem konservierenden Gelatinegel) wie in 17 dargestellt.
Die im Handel erhältliche 75-Bloom-Gelatine kann für die Konservierung von Hepatozyten nicht verwendet werden, da sie cytotoxisch ist und große morphologische Abnormalitäten hervorruft.
Die Verwendung von autoklavierter Gelatine zur Konservierung der Zellen ergab gleiche Ergebnisse wie die Verwendung der Konservierung bei Gelatine, die (2 Stunden) bei 95°C behandelt wurde.
Ein Ergebnis aus 17 ist, dass ein nicht-hydrolysiertes Gelatinesandwich zur Konservierung der Zellen besser geeignet ist als entweder eine nicht-hydrolysierte Aufschlämmung oder eine nicht-hydrolysierte Gelatineauflage. Dies kann entweder auf die Fähigkeit zur Bildung einer einheitlichen Monoschicht (Vermeidung der Zellstapelung) oder auf dessen verbesserte Diffusionseigenschaften zurückzuführen sein. Die in der nicht-hydrolysierten Aufschlämmung oder der Auflage auftretenden Einschränkungen sind in deren hydrolysierten Gegenstücken nicht vorhanden. Obwohl beide Formen des hydrolysierten Gelatinegels ähnliche Eigenschaften haben, bildet nur die bei 95°C (2 Stunden lang) wärmebehandelte Gelatine ein Gel, das ausreichend stabil ist, um eine Zellmonoschicht zu tragen. Das autoklavierte Gelatinegel wird durch wässriges Medium zu leicht dissipiert. Der Vorteil des 95°C-Trägers ist, dass er ermöglichen kann, dass sich das Kulturmedium während der Konservierung verändert (wodurch möglicherweise frische Zellstabilisatoren hinzugefügt werden). Dies ermöglicht die Untersuchung der Ursache der hypothermisch verursachten Schäden bei langfristiger Konservierung.
Bei thermischen Behandlungen ist eine progressive Schwächung der Gelstärke sichtbar. Sowohl das nicht-hydrolysierte Gelatinegel, als auch das bei 80°C behandelte Gelatinegel benötigen einen Erhitzungsschritt zur Freisetzung der Zellen. Im Gegensatz dazu können sowohl das bei 95°C behandelte Gel als auch die autoklavierte Gelatine durch ein wässriges Medium oder Erhitzung dissipiert werden. Auf die selbe Weise, wie bei 80°C behandelte Gelatine zur Auflösung einen kürzeren Erhitzungsschritt benötigt als die nicht-hydrolysierte Gelatine, wird das autoklavierte Gelatinegel leichter durch wässrige Lösungen dispergiert, während das (2 Stunden) bei 95°C behandelte Gel robuster ist und vor der Dispergierung in einem wässrigen Medium gerimmt werden muss.
BEISPIEL 12
Erhitzungs- und Abkühlungsgeschwindigkeit eines Gelatinegels
18 zeigt die Erhitzungs-/Abkühlungs-Geschwindigkeit des nicht-hydrolysierten Gelatinegels von 10°C–37°C und umgekehrt. Das Experiment wurde durchgeführt, indem ein Thermoelement an der Peripherie einer 60 mm Platte, die nicht-hydrolysierte Gelatine umfasst, angeordnet wurde. Es ist offensichtlich, dass es wenigstens 14 Minuten dauert, bis der Temperaturübergang stattfindet. Dieser Zeitraum ist wesentlich kürzer als die Zeit, die zur Plattierung erlaubt ist (2 Stunden). Es ist wahrscheinlich, dass sich durch die Platte ein Temperaturgradient zieht, und dass dies eine wesentliche Wirkung auf die Verteilung der Zellen vor der Verfestigung der Gelatine hat.
Zum Beweis, dass ein solcher Temperaturgradient existiert, wurde eine 96-Well-Mikrotiterplatte verwendet. Jeder Vertiefung wurde eine nicht-hydrolysierte Gelatine hinzugefügt, und das Thermoelement konnte nun genau in einer einzelnen Vertiefung lokalisiert werden. Die 19a und 19b zeigen die Abkühlungsgeschwindigkeit der Gelatine in den verschiedenen Vertiefungen. Es ist klar, dass sich die zentral gelegenen Vertiefungen weniger schnell abkühlen als die außen gelegenen Vertiefungen, und dieser Temperaturgradient würde bedeuten, dass in einer nicht-hydrolysierten Gelaufschlämmung eine ungleichmäßige Verteilung der Zellen verursacht wird, was zu Stapelungswirkungen führt. Die niedrigere Schmelztemperatur hydrolysierter Gelatine bedeutet, dass die Wirkung des Temperaturunterschieds minimiert wird.
Die 18 und 19 legen nahe, dass die besseren Zellkonservierungseigenschaften hydrolysierter Gelatineaufschlämmungen und -Auflagen, relativ zu ihren nicht hydrolysierten Gegenstücken, auf bessere Diffusionseigenschaften und/oder die Vermeidung von Zellstaplung zurückzuführen sind. Um die wichtigen Wirkungen der Diffusion bei der Konservierung von Hepatozyten darzulegen, ist es nennenswert, dass das System cytotoxisch wird, wenn Glycerin (0,5M) in dem System umfasst ist (zur Untersuchung der Fähigkeit des Systems, die Zellen wie bei einer Cryokonservierung zu schützen). Die Lebensfähigkeit der Zellen wird hierdurch wesentlich verringert (nach 7 Tagen verbleiben 10%). Wir können eine offenkundige cytotoxische Wirkung von Glycerol nicht ausschließen, aber dessen viskose Natur würde sicherlich die Diffusion zu den Zellen einschränken.

Claims

Verfahren zum Konservieren von isolierten Zellen umfassend das Anhaften der Zellen an ein Gel, umfassend hydrolisierte Gelatine und Kultivieren der Zellen bei einer Temperatur von zwischen 0 und 15°C, wobei das Gel ausreichend schwach ist, um durch die Hinzufügung einer wässerigen Lösung dispergiert zu werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Gel ein Zellkulturmedium und hydrolisierte Gelatine umfaßt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zellen bei einer Temperatur von zwischen 4 und 14°C kultiviert werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zellen bei einer Temperatur von etwa 10°C kultiviert werden.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die hydrolisierte Gelatine durch die thermische Hydrolyse der Gelatine produziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die hydrolisierte Gelatine durch das Erhitzen der Gelatine auf eine Temperatur von 85 bis zu 121°C für zwischen 0,3 und 3 Stunden produziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die hydrolisierte Gelatine durch das Erhitzen der Gelatine auf eine Temperatur von etwa 95°C für etwa zwei Stunden produziert wird.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gel zwischen 0,5% und 5,0% (W/V) hydrolisierte Gelatine umfaßt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Gel zwischen 1 und 2% (W/V) hydrolisierte Gelatine umfaßt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Gel etwa 1,5% (W/V) hydrolisierte Gelatine umfaßt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gel 1,5% (W/V) hydrolisierte Gelatine in Leibovitz-Medium umfassend Glukose und Hepes umfaßt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zellen Primärzellen sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Zellen Hepatozyten sind.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zeilen an die Oberfläche des Gels angehaftet sind und mit flüssigem Kulturmedium bedeckt sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Zellen an die Oberfläche einer ersten Schicht des Gels angehaftet sind und dann mit einer zweiten Schicht des Gels bedeckt sind, so daß die Zellen zwischen zwei Gelschichten gehalten werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Zellen mit dem Gel vermischt werden, bevor es sich verfestigt, was darin resultiert, daß die Zellen in dem Gel immobilisiert werden, wenn sich das Gel verfestigt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Zellen an eine Feststoffunterstützung angehaftet sind und dann mit einer Schicht des Gels bedeckt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Feststoffunterstützung eine Kulturschale, ein Well oder eine Säule ist.
Gel umfassend hydrolisierte Gelatine für die Verwendung bei dem Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gel ausreichend schwach ist, um durch die Hinzufügung einer wässrigen Lösung dispergiert zu werden.
Gel umfassend hydrolisierte Gelatine und eine oder mehrere isolierte Zellen, wobei das Gel ausreichend schwach ist, um durch die Hinzufügung von einer wässerigen Lösung dispergiert zu werden.
Feststoffunterstützung mit dem Gel gemäß Anspruch 19 oder Anspruch 20, das darauf gebildet ist.
Feststoffunterstützung gemäß Anspruch 21, welche eine Kulturschale, ein Well oder eine Säule ist.
Feststoffunterstützung gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei die Zellen an das Gel angehaftet sind, das auf der Feststoffunterstützung gebildet ist.
Verfahren zum Konservieren von isolierten Zellen umfassend das Anhaften der Zellen an die Oberfläche einer ersten Schicht eines Gels und dann das Bedecken mit einer zweiten Schicht eines Gels, so daß die Zellen zwischen den zwei Schichten des Gels gehalten werden, und Kultivieren der Zellen bei einer Temperatur von zwischen 4 und 14°C, wobei wenigstens eine der Gelschichten nicht-hydrolisierte Gelatine umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei beide Gelschichten nicht-hydrolisierte Gelatine umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die erste Gelschicht hydrolisierte Gelatine umfaßt und die zweite Gelschicht nicht-hydrolisierte Gelatine umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die erste Gelschicht nicht-hydrolisierte Gelatine umfaßt und die zweite Schicht hydrolisierte Gelatine umfaßt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, zusätzlich umfassend das Aussetzen der Zellen gegenüber Temperaturen von zwischen 20 und 37°C für etwa eine bis zu 16 Stunden wenigstens einmal alle paar Tage.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die erhöhte Temperatur darin resultiert, daß das Gelatinegel schmilzt, zusätzlich umfassend das Übertragen der Zellen an eine Suspensionskultur für die Dauer der erhöhten Temperatur und dann das Anhaften an ein Gel enthaltend Gelatine für die fortgesetzte Konservierung.
Feststoffunterstützung mit einer ersten Schicht Gelatinegel, die darauf gebildet ist, einer zweiten Schicht Gelatinegel die auf der ersten Ge latineschicht gebildet ist, und wobei Zellen zwischen den zwei Gelatinegelschichten gehalten werden.
Feststoffunterstützung gemäß Anspruch 28, wobei die Gelatinegelschichten unabhängig ausgewählt werden aus hydrolisiertem Gelatinegel und nicht-hydrolisiertem Gelatinegel.
Verfahren zum Konservieren von isolierten Organen oder Gewebefragmenten umfassend das Durchschwemmen des Organs oder des Gewebes mit einem verflüssigtem Gel umfassend hydrolisierte und/oder nicht-hydrolisierte Gelatine, wobei anschließend an die Durchschwemmung das Organ oder das Gewebe bei einer Temperatur von zwischen 0 und 15°C gelagert wird und sich das verflüssigte Gel verfestigt.