ES2222093A1 - Metodo para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro. - Google Patents
Metodo para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro.Info
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Abstract
Método para el almacenamiento y/o transporte de cultivos celulares in vitro. EL método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro comprende las siguientes etapas: a) recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado, b) solidificación a una temperatura de 15 a 25ºC de la gelatina adicionada al soporte, y c) almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de hasta 96 horas. La presente invención también proporciona un kit para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro según el método de la invención que comprende: i) un soporte asimétrico, y ii) una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 al 5%.
Description
Método para el alamacenamiento y/o transporte de
cultivos celulares in vitro.
La invención se relaciona con la obtención de un
método para el almacenamiento y de transporte de cultivos celulares
bidimensionales organizados in vitro, así como con la
obtención de un kit para el almacenamiento y transporte de dichos
cultivos.
Los cultivos celulares, homogéneos o no
(cocultivos), pueden constituir modelos útiles de algunos procesos
genéticos, bioquímicos, metabólicos o fisiológicos que tienen lugar
en el organismo vivo. La facilidad de su manipulación permite el
análisis de gran número de condiciones antes de realizar los
experimentos definitivos en animales o los ensayos clínicos en seres
humanos. Los modelos "in vitro" constituyen una
herramienta para la validación de nuevas dianas terapéuticas, para
la selección de cabezas de serie en sistemas de alto rendimiento,
para la definición del mecanismo de acción de nuevas moléculas y, en
general, para la investigación biomédica, biotecnológica o
cosmética.
En general, todos los modelos basados en cultivos
celulares tienen una vida útil limitada. Así, las células en cultivo
pasan por diferentes fases de diferenciación, y requieren de
manipulación continua para mantener las propiedades que las hacen un
modelo adecuado. Por ejemplo, el modelo de barrera gastrointestinal
basado en el cultivo confluyente de células Caco-2
requiere 21 días para alcanzar el estado de diferenciación que
permite reproducir muchas de las propiedades de la mucosa
intestinal (Le Ferrec et al., ATLA 29:649-668,
1999), y su utilidad se prolonga sólo durante una ventana de unos 3
a 5 días. Las células BC2, utilizadas como modelo de célula
hepática, requieren entre tres y cuatro semanas de diferenciación
antes de adquirir las propiedades que las hacen un buen modelo, y
las condiciones de cultivo posteriores son clave para que respondan
a los tratamientos experimentales de forma parecida al hepatocito
(MJ Gómez-Lechón, et al., Eur.J. Biochem.268:1448,
2001). Las células de cordón umbilical Huvec, crecidas hasta
confluencia, pueden ser inducidas a formar estructuras comparables a
los vasos sanguíneos en condiciones experimentales adecuadas, por lo
que constituyen un buen modelo de angiogénesis (Vailhe et al.,Lab.
Invest. 81:439-452, 2001). Sin embargo, el número de
divisiones celulares previo al experimento y el estímulo utilizado
son críticos para obtener una respuesta adecuada.
Estas limitaciones en la manipulación y
generación de los diferentes modelos celulares "in
vitro" los hacen de difícil implementación para los usuarios
ocasionales, y en general limitan la comercialización de los modelos
en su formato final. El problema se agudiza en modelos complejos, en
los que las células deben imitar a las barreras naturales del
organismo (Rubas et al., J. Pharma. Sci.,
85:165-169, 1996; Walter et al., J. Pharma. Sci.,
85:1070-1076; Irvine et al., J. Pharma. Sci.,
88:28-33, 1999; Gaillard et al., Eur. J. of Pharma.
Sci., 12:215-222, 2001); o los cultivos deben
realizarse sobre soportes asimétricos, separando dos compartimientos
o con una fuerte dependencia en la polarización de los componentes
del sistema. En estos casos, a la complejidad del modelo y a sus
limitaciones temporales se añaden problemas de tipo mecánico, que
hacen que los golpes o las sacudidas puedan invalidar el sistema.
Los investigadores pueden acceder a los diferentes componentes del
modelo (soporte, medio y aditivos de cultivo y líneas celulares), y
posteriormente deben combinarlos en el laboratorio utilizando
procesos más o menos laboriosos. En el mejor de los casos el
investigador final puede recibir las células ya listas para su uso,
pero con limitaciones que prácticamente obligan a realizar los
experimentos dentro de los dos días posteriores a la recepción, e
imponen serias restricciones en la distribución del modelo por parte
de la compañía que lo comercializa, como por ejemplo In Vitro
Technologies. El documento EP 702 081 describe un método para el
almacenamiento y transporte de tejidos tridimensionales que consiste
en situar dicho tejido tridimensional fijado sobre dos tipos de
esponjas en una solución de gelatina, de tal forma que por
enfriamiento ésta se gelifica, facilitando así su transporte y
almacenamiento.
Existe por tanto en el estado de la técnica la
necesidad de disponer de un método para poder suministrar modelos
basados en cultivos celulares bidimensionales organizados a punto
para ser utilizados y con sus propiedades funcionales intactas de
forma que, por un lado, el investigador disponga de margen de
maniobra para su utilización y, por otro, la compañía suministradora
pueda plantear tiempos de entrega dentro de los márgenes logísticos
razonables de la distribución internacional.
El objeto de la presente solicitud consiste en
proporcionar un método para el almacenamiento y el transporte de
cultivos celulares bidimensionales organizados in vitro que
resuelva las necesidades del estado de la técnica mencionadas
anteriormente.
La invención proporciona en su aspecto principal
un método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos
celulares organizados in vitro que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado,
- b)
- solidificación a una temperatura de 15 a 25ºC de la gelatina adicionada al soporte, y
- c)
- almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de hasta 96 horas.
La presente solicitud también proporciona en un
segundo aspecto de la invención un kit para el almacenamiento y el
transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in
vitro según el método de la invención que comprende:
i) un soporte asimétrico, y
ii) una solución de gelatina en el medio de
cultivo a una concentración del 1 al 5%.
La invención proporciona en su aspecto principal
un método para el almacenamiento y/o el transporte de cultivos
celulares bidimensionales organizados in vitro que comprende
las siguientes etapas:
- a)
- recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% en peso de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado,
- b)
- solidificación a una temperatura de 15 a 25ºC de la gelatina adicionada al soporte, y
- c)
- almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de hasta 96 horas.
En una realización particular, el método de la
invención comprende las siguientes etapas adicionales:
d) licuación de la gelatina,
e) eliminación de la gelatina y sustitución de la
misma por un medio de cultivo, y,
f) incubación del cultivo.
El método de la invención hace posible que
durante el almacenamiento y/o transporte del cultivo o modelo
celular se mantengan las propiedades fisiológicas de las células y,
además, que se protejan las propiedades mecánicas esenciales para el
modelo celular.
En el contexto de la presente invención se
entiende por soporte asimétrico aquellos recipientes que contienen
dos compartimentos físicamente separados por una membrana
semipermeable encima de la cual se sitúan las células del cultivo.
Como soporte asimétrico preferido la presente invención emplea el
soporte tipo transwell.
Los cultivos celulares bidimensionales de la
invención son cultivos organizados como por ejemplo: células Huvec
crecidas a confluencia sobre un soporte de colágeno; cultivo
confluyente de células Caco-2 diferenciadas; o
cualquier otro tipo de células capaz de crecer en monocapas tales
como fibroblastos, células tumorales, hepáticas, endoteliales, etc.
Así, ejemplos de líneas epiteliales intestinales derivadas de
tumores son Caco-2, TC7, HT29 M6; un ejemplo de
línea de epitelio de riñón es MDCK; un ejemplo de keratinocitos
humanos primarios de piel es HEK; finalmente ejemplos de líneas o
cultivos primarios endoteliales son HUVEC, HMEC-1,
BBEC, HAEC y BAEC. Preferentemente, el cultivo celular bidimensional
organizado de la invención está diferenciado, polarizado y es
funcionalmente activo.
Según la presente invención, la solución de
gelatina se prepara disolviendo gelatina en el mismo medio de
cultivo, que actúa como disolvente. Gracias al empleo del medio de
cultivo como disolvente se consigue que el cultivo almacenado y/o
transportado según el método de la presente invención garantiza al
usuario la preservación de las propiedades funcionales del cultivo
y una utilización inmediata. Preferiblemente la solución de gelatina
empleada es del 2.5% en peso.
En el método de la invención se puede emplear
cualquier gelatina comercial, como por ejemplo gelatina tipo A de
piel de cerdo. Similarmente, también se puede emplear cualquier
medio de cultivo comercial, como un medio DMEM (1 g/L glucosa). Es
"aconsejable" preparar la solución de gelatina con un máximo de
7 días antes de aplicarla al cultivo, ya que de lo contrario ésta
pierde parte de sus propiedades de "conservación", las cuales
son necesarias para el buen funcionamiento de la presente
invención.
La solución de gelatina en el medio de cultivo
puede ser suplementada con suero bovino fetal (FBS 10%) y
Penicilina/Streptomicina/L-Glutamina (medio de
cultivo completo).
El cultivo celular puede prepararse del siguiente
modo: realizar primeramente, antes de sembrar las células, un
coating que implica: 1) colocar los insertos o
transwells encima de los pocillos de tamaño correspondiente;
2) aplicar sobre la cara superior de los filtros (membranas
semipermeables) de cada inserto una solución de colágeno (u otro
componente de matriz extracelular, dependiente del tipo celular) en
medio de cultivo DMEM (1g/L glucosa) sin suero; y 3) dejar
preferiblemente a 37ºC en la estufa para cultivos celulares (90%
humedad, 5% CO_{2}). Antes de la utilización del inserto, se
aspira el exceso de solución de coating de la cara apical,
se deja aproximadamente de 15 a 30 minutos en la estufa para
cultivos, y se siembran las células correspondientes a la denidad
determinada para cada tipo celular y para cada tipo de ensayo. Se
mantiene el cultivo durante el tiempo necesario al alcance del
estado funcional del sistema, con cambios de medio preferiblemente
cada 48-72 horas si necesario. Las características
de los insertos o transwells utilizados (tamaño, diámetro de
poros, material) vienen determinadas de manera específica por el
tipo celular y el ensayo al cual se puede aplicar la presente
invención. En función del tipo de célula empleada en el cultivo y
del tipo de ensayo, tras un número de días transcurrridos, se
realizan controles para determinar el estado funcional del sistema
celular. Por ejemplo, en el caso de los sistemas celulares que se
utilizan como modelos de barreras, se pueden emplear medida de TEER
(Resistencia Eléctrica TransEpitelial) y permeabilidad
paracelular.
Según la presente invención, el cultivo celular
se recubre con una solución de gelatina en el medio de cultivo a
una concentración de 1 a 5%. De forma general, se aplicará la
gelatina en el preciso momento en que se haya comprobado que el
sistema celular acaba de alcanzar el estado funcional adecuado, de
manera que se inmoviliza el sistema celular ya funcional, pero se
deja al usuario un margen de tiempo para hacer sus ensayos al
recibir el sistema. Al tiempo de cultivo transcurrido se denomina
"tiempo de vida". De aquí la aplicación de la presente
invención a sistemas celulares
"ready-to-use". Los
tiempos de vida de los cultivos celulares, es decir el tiempo de
vida del cultivo en que se aplica la gelatina, dependen no sólo de
los tipos celulares del cultivo (fibroblastos, líneas tumorales,
etc.) sino también de su aplicación funcional (ensayo de paso de
barrera, ensayo de adhesión, ensayo de migración, ensayo de
invasión). Su determinación es una cuestión de práctica
experimental. Así, en el caso específico de los fibroblastos y
células HUVEC sembradas en soportes tipo transwell y en
condiciones bajo las cuales estas células estén funcionalmente
activas para un ensayo de migración, el tiempo de vida será entre 30
minutos y 1 hora después de sembrar las células. En el caso de un
ensayo de invasión, el tiempo será entre 1 y 24 horas. En cambio, en
el caso de las células Caco-2 sembradas en
transwells, el tiempo de vida será 13 días después de sembrar
las células, tiempo a partir del cual ya son funcionales como
barrera y se aplica la gelatina, dejando al usuario hasta el día 25
de cultivo para realizar el ensayo de paso de barrera.
En el contexto de la presente invención se
entiende por estado funcional adecuado, el estado que
presentan las células viables del cultivo cuando son capaces de
realizar la función que tienen asignada en el ensayo.
Para efectuar la aplicación de la gelatina sobre
el cultivo en primer lugar es necesario licuar completamente la
solución de gelatina, y equilibrarla a la temperatura del cultivo,
en general 37ºC. A continuación, se retira el medio de cultivo de
los 2 compartimentos de cada inserto y se lava el cultivo con medio
de cultivo completo en los 2 compartimentos de cada inserto.
Posteriormente se aplica gelatina 2,5% líquida en el compartimiento
apical y en el compartimiento basal, y se deja solidificar entre 2 y
3 horas en la campana de flujo y a temperatura ambiente
(20-25ºC). Una vez ha solidificado la gelatina, se
sellan las placas con parafilm y se mantienen a temperatura ambiente
hasta su utilización (máximo 4 días después).
En el momento en que se quiera utilizar el
cultivo inmovilizado, se incuba la placa con gelatina sólida dentro
de un incubador de células hasta la completa licuación de la
gelatina, preferiblemente a 37ºC, 90% humedad y 5% CO_{2} durante
3 a 4 horas hasta la completa licuación de la gelatina. A
continuación se elimina de ambos compartimentos mediante aspiración
y se lava el cultivo con medio de cultivo completo equilibrado a
37ºC. Posteriormente se aplica el medio de cultivo específico para
las células en cuestión y se incuban estas últimas preferiblemente
a 37ºC en 90% humedad/5% CO_{2} hasta su uso.
La presente solicitud proporciona en un segundo
aspecto de la invención un kit para el almacenamiento y el
transporte de cultivos celulares bidimensionales organizados in
vitro según el método de la invención que comprende:
i) un soporte asimétrico, y
ii) una solución de gelatina en el medio de
cultivo a una concentración del 1 al 5%.
En una realización particular, el kit de la
presente invención emplea como soporte asimétrico un soporte tipo
transwell.
Los ejemplos que se describen a continuación
sirven para ilustrar la invención.
Se utiliza gelatina tipo A de piel de cerdo,
disuelta en medio de cultivo DMEM (1g/L glucosa) a 50ºC y
directamente a la concentración de uso (máxima concentración que se
puede disolver: 10%). En el presente caso, se pesan 2,5g de gelatina
en polvo y se disuelve con 100 ml de medio de cultivo DMEM (1g/L
glucosa). Se esteriliza en seguida (en "caliente") mediante
filtración por filtros de 0,22\mum de poro. A continuación se
suplementa con suero bovino fetal (FBS 10%) y
Penicilina/Streptomicina/L-Glutamina (medio de
cultivo completo). Finalmente se guarda a 4ºC hasta su
utilización.
Coating: 12 horas antes de sembrar las
células, se colocan los insertos (transwells de 6,5mm de
diámetro) encima de los pocillos de tamaño correspondiente, y se
aplica sobre la cara superior de los filtros de policarbonato
(membranas semipermeables de 0,4\mum de diámetro de poro) de cada
inserto una solución de colágeno tipo I de cola de rata (20
\mug/ml) en medio de cultivo DMEM (1g/L glucosa) sin suero, y se
deja a 37ºC en la estufa para cultivos celulares (90% humedad, 5%
CO_{2}). Antes de su utilización, se aspira el exceso de solución
de coating de la cara apical, se deja de 15 a 30 minutos en
la estufa para cultivos, y se siembran las células
Caco-2 a una densidad de 5 X 10^{5}
células/cm^{2}. Se mantiene el cultivo durante 13 días, con
cambios de medio cada 48-72 horas, poniendo
300\mul de medio de cultivo completo en el compartimento apical y
900\mul en el basal. Al día 13, se realizan los controles de
estado de barrera (polarización) de la monocapa
Caco-2 mediante medida de TEER (Resistencia
Eléctrica TransEpitelial) y permeabilidad paracelular. Estos
controles permiten determinar el estado funcional del sistema
celular como barrera antes de recubrir con gelatina.
Se pone en un baño de cultivo a 37ºC hasta su
completa licuación y se equilibra a la temperatura del cultivo
(37ºC). A continuación, se retira el medio de cultivo de los 2
compartimentos de cada inserto y se lava el cultivo con medio de
cultivo completo en los 2 compartimentos de cada inserto.
Posteriormente se aplica 300\mul de gelatina 2,5% líquida en el
compartimiento apical y 900\mul en el compartimiento basal, y se
deja solidificar entre 2 y 3 horas en la campana de flujo y a
temperatura ambiente (20-25ºC). Una vez ha
solidificado la gelatina, se sellan las placas con parafilm y se
mantienen a temperatura ambiente hasta su utilización (máximo 4
días después).
En el momento en que se quiera utilizar el
cultivo inmovilizado, se incuba la placa con gelatina sólida dentro
de un incubador de células a 37ºC, 90% humedad y 5% CO_{2}
durante 3 a 4 horas hasta la completa licuación de la gelatina. A
continuación se elimina de ambos compartimentos mediante aspiración
y se lava el cultivo con medio de cultivo completo equilibrado a
37ºC. Posteriormente se aplica el medio de cultivo específico para
células Caco-2 y se incuban las células a 37ºC en
90% humedad/5% CO_{2} hasta su uso (mínimo 24 horas; máximo 9
días después), cambiando el medio cada 48-72
horas.
(ND: No Determinado)
Tal y como se presenta en la Tabla I, solo se
observa una disminución significativa en los valores de TEER
obtenidos después de 5 y 7 días de inmovilización en gelatina
comparando con los valores controles obtenidos antes de aplicarla.
Este resultado indica que el método de almacenamiento en gelatina
descrito en esta invención permite: 1) inmovilizar el sistema
Caco-2 hasta 4 días a temperatura ambiente sin
afectar su estado funcional de barrera; y 2) una vez quitada la
gelatina, mantener hasta 9 días después su estado funcional para
realizar ensayos de paso de barrera.
En la Tabla II se indican algunos de los tipos
celulares cultivables en soportes tipo transwells que forman
monocapas y que son susceptibles de ser almacenables y
transportables en gelatina en su estado de barrera y, por tanto,
cultivos a los cuales es aplicable el presente método de
transporte.
- -
- Caco-2, TC7, HT29 M6: líneas epiteliales intestinales derivadas de tumores,
- -
- MDCK: línea de epitelio de riñón,
- -
- HEK: keratinocitos humanos primarios de piel,
- -
- HUVEC, HMEC-1, BBEC, HAEC, BAEC: líneas o cultivos primarios de células endoteliales.
(ND: No Determinado)
Los tiempos de cultivo indicados en la Tabla II
se refieren al intervalo de tiempo óptimo de obtención de una
monocapa polarizada, más allá del cual pierde sus propiedades
funcionales óptimas como barrera celular.
La determinación de los tiempos de vida (momento
del cultivo en que se aplica la gelatina) de estos sistemas
celulares, que permitan a la vez preservar su estado funcional de
barrera y dejar tiempo al usuario para realizar el ensayo, se ha
efectuado de modo experimental mediante medida de TEER y
permeabilidad paracelular.
La gelatina se aplica al cultivo en el momento en
que éste alcanza el estado funcional adecuado. En el caso del
ensayo de paso de barrera de células Caco-2, la
gelatina se aplica preferiblemente a día 13 (tiempo mínimo
aproximado en el cual las células empiezan a formar una monocapa
polarizada funcional o barrera). Se pueden mantener en gelatina
hasta aproximadamente el día 17 a temperatura ambiente y utilizarse
hasta aproximadamente día 25, sin perder sus propiedades funcionales
de barrera.
Los tiempos de vida bien de otros tipos celulares
(fibroblastos, líneas tumorales), o bien de estos mismos descritos
en la Tabla II pero definidos para otras aplicaciones funcionales
diferentes del ensayo de paso de barrera (ensayo de adhesión,
ensayo de migración, ensayo de invasión), representan diferentes
tiempos de aplicación de la gelatina. Así, en el caso específico de
los fibroblastos y células HUVEC sembradas en soportes tipo
transwell y en condiciones bajo las cuales estas células
estén funcionalmente activas para un ensayo de migración, el tiempo
de vida será entre 30 minutos y 1 hora después de sembrar las
células. En el caso de un ensayo de invasión el tiempo será entre 1
y 24 horas.
Claims (13)
1. Método para el almacenamiento y el transporte
in vitro de cultivos celulares bidimensionales organizados
que comprende las siguientes etapas:
- a)
- recubrimiento con una solución de gelatina en el medio de cultivo a una concentración del 1 a 5% de un cultivo celular organizado inmovilizado sobre un soporte asimétrico, comprendiendo dicho cultivo celular células en el estado funcional adecuado,
- b)
- solidificación a una temperatura de 15 a 25ºC de la gelatina adicionada al soporte, y
- c)
- almacenamiento y/o transporte del cultivo celular a una temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de hasta 96 horas.
2. Método según la reivindicación 1 que comprende
las etapas adicionales:
- a)
- licuación de la gelatina,
- b)
- eliminación de la gelatina y sustitución de la misma por un medio de cultivo, y
- c)
- incubación del cultivo.
3. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque el cultivo celular bidimensional
organizado está diferenciado, polarizado y es funcionalmente
activo.
4. Método según la reivindicación 3
caracterizado porque el cultivo celular está seleccionado de
entre: células Huvec crecidas a confluencia sobre un soporte de
colágeno y células Caco-2 diferenciadas, o cualquier
otro tipo de células capaz de crecer en monocapas tales como
fibroblastos, células tumorales, hepáticas, endoteliales, etc.
5. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque la solución de gelatina empleada es del
2.5%
6. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque la gelatina se solidifica a una
temperatura de 15 a 25ºC, durante un periodo de 30 minutos a 12
horas.
7. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque el soporte asimétrico es un soporte
tipo transwell.
8. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque la licuación de la gelatina se efectúa
entre 35 y 40ºC durante un periodo de 1 a 4 horas.
9. Método según la reivindicación 7
caracterizado porque la licuación de la gelatina se efectúa
a 37ºC.
10. Método según las reivindicaciones anteriores
caracterizado porque la incubación posterior del cultivo se
efectúa entre 35 y 40ºC durante un periodo de 1 hora a 8 días.
11. Método según la reivindicación 9
caracterizado porque la incubación posterior del cultivo se
efectúa a 37ºC.
12. Kit para el almacenamiento y/o el transporte
in vitro de cultivos celulares bidimensionales organizados
según el método de cualquiera de las reivindicaciones
1-10 que comprende:
i) un soporte asimétrico, y
ii) una solución de gelatina en el medio de
cultivo a una concentración del 1 al 5%.
13. Kit según la reivindicación 11
caracterizado porque el soporte asimétrico es un soporte
tipo transwell.
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