ES2234771T3 - Conservacion de celulas. - Google Patents

Abstract

Método para conservar células aisladas, que comprende unir las células a un gel que comprende gelatina hidrolizada y cultivar las células a una temperatura de entre 0 y 15ºC, en el que el gel es suficientemente débil para dispersarse por la adición de una disolución acuosa.

Description

Conservación de células.

La presente invención se refiere a métodos para conservar células, en particular, células primarias, tal como hepatocitos. La presente invención también se refiere a un gel que contiene gelatina hidrolizada.

La introducción de técnicas de perfusión con colagenasa del órgano completo (Krebs et al., Regulation of Hepatic Metabolism, 726-75, 1974; y Seglen, Meth. Cell Biol., 13, 29-83, 1976) ha conducido al aislamiento generalizado de hepatocitos viables. Los métodos de aislamiento utilizados son suaves con el resultado de que las células conservan in vitro propiedades similares a las que tienen in vivo. Sin embargo, se obtienen altos rendimientos celulares a partir de un único hígado y generalmente el número de células producidas excede enormemente de las necesidades experimentales.

Los hepatocitos aislados son una mejor aproximación a la situación in vivo que las líneas celulares establecidas o las células de hepatoma (Sirica y Pitot, Pharmacol. Rev., 31, 205-227, 1980), pero tienen la desventaja de una viabilidad limitada en el cultivo en suspensión.

Los hepatocitos tienen muchas características que los hacen un sistema modelo in vitro particularmente adecuado. Tienen una alta tasa de metabolismo y son el principal tipo celular implicado en la desintoxicación. Sin embargo, en cultivo, las células se dividen escasamente, si lo hacen, y experimentan cambios fenotípicos por los que se pierden muchos de sus procesos hepáticos específicos. Generalmente, las células se utilizan inmediatamente después del aislamiento y la viabilidad sostenida depende de la formación de una monocapa. El mantenimiento de un gran número de placas requiere mucha mano de obra ya que el medio requiere que se cambie cada 24 horas.

Una complicación adicional durante el cultivo de hepatocitos es su periodo de vida limitado y la aparición de cambios fenotípicos (Bissell, Ann. N.Y. Acad. Sci., 349. 85-98, 1980). Estos cambios hacen que los resultados obtenidos utilizando cultivos a largo plazo no sean más aplicables para el órgano intacto que los obtenidos con líneas celulares establecidas.

Se ha descrito la conservación hipotérmica de hepatocitos en geles de gelatina (Evans, Cell Biology International, 18, 999-1008, 1994; Evans, Cell Biology International, 19, 855-860, 1995; Evans, Cell Biology International, 23, 117-124, 1999; y Griffiths & Evans, Cryobiology, 40, 176-181, 2000). El método requiere la preparación de geles obtenidos a partir de un medio de cultivo que contiene gelatina no tratada (no hidrolizada) y la unión de los hepatocitos a la superficie del gel. Los hepatocitos se recubren entonces con medio de cultivo y se cultivan a una temperatura de 10ºC. Tal conservación de hepatocitos en geles que contienen gelatina permite almacenar los hepatocitos durante al menos 7 días sin ningún deterioro sustancial en la función de las células. Con el fin de separar las células de la superficie del gel, es necesario fundir el gel calentándolo hasta 37ºC. El calentamiento del gel hasta 37ºC puede producir lesión en las células. Un problema adicional con este método de la técnica anterior es que es necesario cambiar el medio de cultivo que recubre las células unidas. Dado que las células están unidas a una superficie expuesta del gel, las células pueden desplazarse o dañarse cuando se cambia el medio. Además, al transportar una placa de cultivo, el medio de cultivo puede derramarse fácilmente.

Los documentos US-A-5.635.344 y US-A-5.736.397 describen un método de conservación de células que comprende cultivar las células a una temperatura de entre 0 y 5ºC, en el que las células están en un gel que no comprende gelatina hidrolizada. No se describe el cultivo de células entre capas de gelatina no hidrolizada. La presente invención supera al menos algunos de los problemas asociados con los métodos de la técnica anterior para conservar células.

La presente invención proporciona un método para conservar células aisladas que comprende unir las células a un gel que comprende gelatina hidrolizada y cultivar las células a una temperatura de entre 0ºC y 5ºC.

El uso de gelatina hidrolizada produce un gel que es lo suficientemente fuerte como para actuar como un soporte al que pueden unirse las células, pero lo suficientemente débil como para dispersarse por la adición de una disolución acuosa tal como un medio de cultivo frío en exceso. También puede utilizarse "rimming" (es decir, uso de una aguja o dispositivo similar para facilitar la separación del gel de su recipiente) para ayudar con la dispersión.

Por tanto, el uso de gelatina hidrolizada en el gel evita la necesidad de calentar el gel hasta 37ºC con el fin de separar las células y evita cualquier lesión a las células producido por tal calentamiento. También puede hacerse una distinción entre lesión hipotérmica y lesión producida por el calentamiento hasta 37ºC utilizando el gel que comprende gelatina hidrolizada.

Además, utilizando gelatina hidrolizada en un gel, se inhibe la unión de las células a un soporte sólido (es decir, un soporte de plástico tratado de cultivo tisular habitual, tal como un pocillo o placa de cultivo, por ejemplo Primaria® y Corning) siempre que el gel no contenga suero. El soporte sólido se ha tratado de manera que tenga una carga neta en su superficie con el fin de ayudar en la unión de las células al soporte. Se ha encontrado que la hidrólisis de la gelatina da como resultado la pérdida de factores que estimulan la unión de las células a un soporte sólido y/o genera factores que inhiben la unión celular. En consecuencia, el método de la presente invención permite que un experto en la técnica evite la unión de las células a un soporte sólido y, por tanto, permite recoger más fácilmente las células cultivadas y, en particular, facilita el aislamiento de esferoides. Los esferoides son células que forman un agregado multicelular. El agregado normalmente es esférico. Los esferoides pueden reconstruir complejos funcionales y muestran funciones específicas de tejido (véase, Hamamoto et al., J. Biochem., 124, 972-979, 1998).

Puesto que la presencia de gelatina hidrolizada inhibe la unión de las células a los soportes sólidos cuando el suero no está presente, le da a un experto en la técnica más tiempo para recuperar células sin la complicación de la unión celular a un soporte sólido. La ausencia de suero ayuda a evitar que las células se unan a un soporte sólido. La ausencia de suero del medio conduce a una disminución del periodo en el que las células pueden conservarse desde aproximadamente 7 días hasta 3 días. También se prefiere que el soporte sólido no tenga un recubrimiento de un factor de matriz extracelular, tal como colágeno, fibronectina y Matrigel. Tales factores de matriz extracelular ayudan a que las células se unan al soporte sólido y deben evitarse si las células no van a unirse a la superficie del soporte sólido.

Además, utilizando gelatina hidrolizada en un gel se ha encontrado que el gel se funde uniformemente a aproximadamente 37ºC. Al calentar un gel que contiene gelatina hidrolizada, el gel se funde más uniformemente que un gel que contiene gelatina no hidrolizada. El término "uniformemente", tal como se usa en el presente documento, significa que el centro del gel se funde sustancialmente a la misma velocidad que los bordes del gel. Esta fusión uniforme del gel tiene la ventaja de que todas las células pueden aislarse del gel sustancialmente al mismo tiempo.

El término "conservación", tal como se usa en el presente documento, se define como el mantenimiento de la viabilidad y/o la función similar a in vivo de las células. La viabilidad puede evaluarse por la conservación de enzimas marcadoras citosólicas, tal como la lactato deshidrogenasa (LDH) y por el mantenimiento de la capacidad de las células para unirse posteriormente a un soporte sólido en condiciones de cultivo no inhibitorias. La conservación de la función similar a in vivo puede evaluarse por las células que mantienen las tasas de síntesis de proteínas, por las células que demuestran respuestas a hormonas similares a in vivo, por las células que mantienen el nivel de citocromo P_{450} y sus isoenzimas específicas y por la ausencia de características enzimáticas atípicas o cambios fenotípicos. Puede utilizarse más de uno de estos métodos para determinar la función celular similar a in vivo.

Preferiblemente, la función celular similar a in vivo se mide determinando que se mantienen los niveles de citocromo P_{450}. Métodos para determinar la viabilidad y la función celular similar a in vivo de las células se describen en Evans, 1994 (citado anteriormente), Evans, 1995 (citado anteriormente), Griffiths y Evans, 2000 (citado anteriormente) y Evans, 1999 (citado anteriormente).

El término "unión", tal como se usa en el presente documento, se refiere a las células que están inmovilizadas en una superficie del gel o inmovilizadas dentro del gel.

El término "célula aislada", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier célula, excepto las bacterias que producen gelatinasa. Preferiblemente, la célula aislada es una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, una célula vegetal (incluyendo los protoplastos), células de insecto, etc. Se prefiere particularmente que el término se refiera a células primarias, tal como los hepatocitos, células del túbulo proximal del riñón, células epiteliales de mamífero y células pancreáticas primarias. La célula aislada también puede ser una célula modificada por ingeniería genética que contenga uno o más genes heterólogos o genes modificados. Preferiblemente, la célula aislada es un hepatocito obtenido tras la perfusión con colagenasa del órgano completo o un método equivalente. Métodos para obtener hepatocitos aislados son bien conocidos por los expertos en la técnica. En particular, métodos adecuados se describen en Evans (Biochim. Biophys. Acta, 677, 433-444, 1981) y Evans y Mayer (Biochim. Biophys. Res. Comm., 107, 51-58, 1982).

Métodos para obtener células del túbulo proximal del riñón se describen en Evans (Biochem. Biophys. Acta, 1133, 255-260, 1992) y Evans (Biochem. Biophys. Acta, 1221, 243-249, 1994). Se ha demostrado que en la conservación de las células del túbulo proximal del riñón utilizando el método de la presente invención, además de mantener los perfiles enzimáticos similares a in vivo, las células del túbulo proximal del riñón se dividen normalmente cuando se liberan del gel. Las condiciones de conservación no tienen efectos citostáticos.

Por tanto, el método de la presente invención es apropiado para tipos celulares que se dividen y que no se dividen. Además, las células del túbulo proximal del riñón dependen casi exclusivamente de respiración aerobia para su generación de energía, mientras que los hepatocitos tienen una capacidad significativa de respiración anaerobia. La conservación satisfactoria de este tipo de célula primaria, que tiene características muy diferentes, muestra que el método de la presente invención se puede aplicar a una amplia variedad de tipos celulares. El método de la presente invención es un procedimiento de mantenimiento muy valioso para células primarias y también es apropiado para su uso con líneas celulares establecidas. En particular, evita la necesidad de "hacer crecer las células" inmediatamente antes de su utilización. También pueden facilitarse experimentos que requieren monocapas de células confluentes, por ejemplo, células Caco 2.

El término "cultivar", tal como se usa en el presente documento, se refiere al mantenimiento y/o crecimiento de las células.

Puede usarse cualquier gel que contenga gelatina hidrolizada en el método de la presente invención, siempre que sea adecuado para el cultivo de células. El gel comprende preferiblemente un medio de cultivo celular y gelatina hidrolizada. El medio de cultivo celular puede ser cualquier medio de cultivo capaz de cultivar las células que han de conservarse. Un medio de cultivo adecuado es el medio Leibovitz (L-15), tamponado preferiblemente con Hepes en lugar de con bicarbonato, lo que permite que se exponga a la atmósfera. Otros medios adecuados incluyen el medio de Waymouth, Williams, Dulbecco o Ham, que están tamponados con bicarbonato y requieren una fase gaseosa con un 95% de aire y un 5% de CO_{2}. Cuando sea necesario, los medios pueden complementarse. Aportes complementarios adecuados incluyen fuentes de carbono tales como la glucosa, hormonas de crecimiento tales como la insulina, suero tal como el suero de ternero recién nacido inactivado por calor y antibióticos tales como la gentamicina. Preferiblemente, el gel comprende el 1,5% (p/v) de gelatina hidrolizada en medio Leibovitz (L-15) (pH 7,4) que contiene glucosa (8,3 mM) y Hepes (25 mM).

El medio de cultivo celular puede comprender además un citoprotector, tal como el glutatión, para proteger las células frente a lesión por recalentamiento. Se sabe que el glutatión entra en las células a bajas temperaturas.

Preferiblemente, el método de la presente invención comprende cultivar las células a una temperatura de entre 4 y 14ºC, más preferiblemente a una temperatura de entre 8 y 12ºC, lo más preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 10ºC.

El término "gelatina hidrolizada", tal como se usa en el presente documento, significa gelatina que se ha hidrolizado al menos parcialmente para reducir la resistencia del gel. La gelatina que no se ha hidrolizado produce un gel relativamente fuerte. Cuando se usa gelatina hidrolizada, se forma un gel más débil que puede dispersarse por la adición de una disolución acuosa. El término "gelatina hidrolizada", tal como se usa en el presente documento, se refiere a gelatina que se ha hidrolizado hasta un grado tal que producirá un gel que es lo suficientemente fuerte para proporcionar un soporte sólido al que pueden unirse las células a una temperatura de entre 0 y 15ºC, pero que es lo suficientemente débil para dispersarse al añadir una disolución acuosa. Preferiblemente, la gelatina hidrolizada es gelatina hidrolizada de tipo A con valor bloom (medida de la resistencia de la gelatina) de 300 a partir de piel de cerdo.

La gelatina puede hidrolizarse mediante cualquier método conocido, incluyendo hidrólisis térmica, digestión proteolítica con gelatinasa o tripsina y métodos químicos, incluyendo hidrólisis alcalina y ácida. Preferiblemente, la gelatina se hidroliza mediante hidrólisis térmica. En particular se prefiere que la gelatina hidrolizada se produzca calentando la gelatina hasta una temperatura de entre 85 y 121ºC durante entre 0,2 y 3 horas. Más preferiblemente, la gelatina se calienta hasta una temperatura de entre 90 y 100ºC durante de 1 a 2,5 horas. Lo más preferiblemente, la gelatina se hidroliza calentándola hasta aproximadamente 95ºC durante aproximadamente 2 horas o calentándola hasta aproximadamente 121ºC durante aproximadamente 20 minutos.

El gel comprende suficiente gelatina hidrolizada para producir un gel que sea lo suficientemente fuerte para producir un gel sólido sobre, o en, el que las células puedan conservarse a una temperatura de entre 0 y 15ºC, pero que sea suficientemente débil para dispersarse con la adición de una disolución acuosa. Preferiblemente, el gel comprende entre el 0,5% y el 5,0% (p/v) de gelatina hidrolizada. Se prefiere adicionalmente que el gel comprenda entre el 1% y el 2% (p/v) de gelatina hidrolizada, más preferiblemente el 1,5% (p/v) de gelatina.

El gel puede comprender, además de gelatina hidrolizada, gelatina no hidrolizada, siempre que el gel formado sea suficientemente débil como para dispersarse por la adición de una disolución acuosa a una temperatura de entre 0 y 15ºC.

En una realización preferida de la presente invención, las células se unen a una superficie del gel que comprende gelatina hidrolizada y preferiblemente se recubren con un medio de cultivo celular líquido. Generalmente, el medio de cultivo celular líquido es idéntico al utilizado para formar el gel, excepto que no comprende gelatina ni gelatina hidrolizada y puede comprender aportes complementarios no presentes en el gel. Se prefiere particularmente que el medio de cultivo celular líquido comprenda un citoprotector, tal como el glutatión. En una realización adicional de la presente invención, las células se unen a una primera capa de gel que comprende gelatina hidrolizada y después se recubren con una segunda capa de gel de gelatina hidrolizada, de manera que las células se mantengan entre las dos capas de gel. En una realización alternativa de la presente invención, las células se mezclan con el gel que comprende gelatina hidrolizada antes de que solidifique (es decir, a una temperatura de aproximadamente 37ºC). Cuando el gel solidifica (es decir, a una temperatura de aproximadamente 10ºC), las células se inmovilizan con el gel. Si es necesario, puede añadirse un medio de cultivo celular líquido con el fin de evitar que el gel se seque y para suministrar cualquier nutriente requerido. Al tener las células entre dos capas de gel o inmovilizadas dentro del gel, las células están protegidas de lesión durante el transporte y también es más fácil cambiar el medio de cultivo líquido sin alterar las células. Al dispersar el gel, las células pueden unirse a la superficie del soporte sólido, en el que se forma el gel, siempre que el gel contenga suero y/o la superficie del soporte sólido esté recubierta con un factor de matriz extracelular. Alternativamente, puede evitarse que las células se unan al soporte sólido utilizando un gel que no contenga suero y, preferiblemente, utilizando un soporte sólido que no se haya recubierto con un factor de matriz extracelular.

En una realización preferida adicional de la presente invención, las células pueden unirse directamente a un soporte sólido, tal como un pocillo o placa de cultivo y después recubrirse con una capa de gel que comprende gelatina hidrolizada. Las células se recubrirán entonces con el gel. Si es necesario, el gel puede recubrirse entonces con el medio de cultivo celular con el fin de evitar que el gel se seque y para suministrar cualquier nutriente requerido. De nuevo, esto protege a las células de lesión durante el transporte o al cambiar el medio de cultivo celular. Además, si se desea utilizar las células cuando están unidas a una superficie, este método permitirá que las células se utilicen directamente después de que el gel de haya dispersado sin esperar a la unión celular. Preferiblemente, la superficie del soporte sólido tiene un recubrimiento de un factor de matriz extracelular. Además, la capa de gel de gelatina hidrolizada puede recubrirse con una capa de gel no hidrolizado. Preferiblemente la capa de gel no hidrolizado es fina, es decir, de aproximadamente entre 0,5 y 2 mm de espesor. La capa de gel de gelatina no hidrolizada superior puede actuar como una capa superior más robusta para la protección durante la distribución. El término "gelatina no hidrolizada" se define más adelante.

El método de la presente invención puede llevarse a cabo utilizando cualquier soporte sólido adecuado para soportar el gel. Los soportes sólidos adecuados incluyen placas de cultivo, pocillos tales como placas con formato de 96 pocillos, y columnas. Por ejemplo, el método puede utilizarse para producir soportes sólidos que tienen células fijas en su superficie listas para utilizarse en procedimientos de ensayo bioquímico o selección habituales, bien conocidos por los expertos en la técnica, tal como se indica anteriormente.

Resulta sorprendente que sea posible recubrir las células con el gel, ya que se sabe que las células pueden lesionarse fácilmente por esfuerzos cortantes. Los esfuerzos cortantes se utilizan para romper las células de una manera controlada mediante homogeneización, sonicación y cavitación por nitrógeno. Se habría esperado que la gelificación de la gelatina ejerciera grandes fuerzas sobre las células en su entorno y posiblemente que eliminara el agua de las células. Por tanto, fue sorprendente encontrar que al recubrir e inmovilizar las células dentro del gel no se produjera ningún efecto citotóxico.

La presente invención también proporciona un gel que comprende gelatina hidrolizada para su uso en el método de la presente invención. Tal como se indicó anteriormente, puede utilizarse cualquier medio de cultivo en combinación con gelatina hidrolizada para formar el gel de la presente invención.

Tal como se indicó anteriormente, el gel de la presente invención tiene la ventaja de permitir la conservación de las células a temperaturas de entre 0 y 15ºC, en la que las células pueden separarse del gel mediante la dispersión del gel con la adición de una disolución acuosa.

La presente invención también proporciona un soporte sólido que tiene el gel de la presente invención formado sobre el mismo.

El soporte sólido puede ser cualquier soporte en el que puede formarse el gel. En particular, el soporte sólido puede ser una placa de cultivo, un pocillo o una columna. El soporte sólido puede tener un recubrimiento de un factor de matriz extracelular.

Se prefiere adicionalmente que las células se unan al gel formado sobre el soporte sólido de la presente invención. Tal como se indicó anteriormente, las células pueden:

1. unirse a una superficie del gel;

2. mantenerse entre dos capas de gel;

3. inmovilizarse dentro del gel; o

4. unirse al soporte sólido y recubrirse con el gel.

La presente invención también proporciona un gel que comprende gelatina hidrolizada y una o más células aisladas.

La presente invención también proporciona un método para conservar células aisladas que comprende unir las células a una primera capa de un gel y después recubrir con una segunda capa de un gel, de manera que las células se mantengan entre las dos capas de gel y cultivar las células a una temperatura de entre 0 y 15ºC, en el que al menos una de las capas de gel comprende gelatina no hidrolizada.

El término "gelatina no hidrolizada" se refiere a gelatina que no se ha hidrolizado. Preferiblemente, el término "gelatina no hidrolizada" significa gelatina que no se ha hidrolizado in vitro. Se prefiere adicionalmente que la gelatina no se haya hidrolizado mediante hidrólisis térmica, digestión proteolítica con gelatinasa o tripsina, o métodos químicos incluyendo hidrólisis alcalina o ácida.

Preferiblemente, la gelatina es gelatina de tipo A con valor bloom de 300 procedente de piel de cerdo que no se ha hidrolizado.

En una realización preferida, ambas capas de gel comprenden gelatina no hidrolizada.

En una realización preferida alternativa, la primera capa de gel comprende gelatina hidrolizada y la segunda capa comprende gelatina no hidrolizada.

En una realización alternativa preferida adicional, la primera capa de gel comprende gelatina no hidrolizada y la segunda capa comprende gelatina hidrolizada. Cuando se requieran las células, la segunda capa puede eliminarse mediante dispersión acuosa, dejando las células todavía unidas a la primera capa. Tales células inmovilizadas son particularmente adecuadas para estudios de microinyección. Pueden inyectarse directamente diversas sustancias (por ejemplo, ADN, ARN y proteínas) en las células inmovilizadas. En vista de la baja tasa de metabolismo de las células, la microinyección progresiva de las células inmovilizadas dará esencialmente un tiempo de partida uniforme para los experimentos metabólicos posteriores.

El gel que comprende la gelatina no hidrolizada también puede comprender además gelatina hidrolizada; sin embargo, preferiblemente, el gel que comprende gelatina no hidrolizada no contiene sustancialmente gelatina hidrolizada. No contener sustancialmente gelatina hidrolizada significa que el gel no contiene más que el nivel endógeno de gelatina hidroliza presente en una muestra de gelatina no hidrolizada. Preferiblemente, el nivel de gelatina hidrolizada es inferior al 10% (p/p) de la gelatina. Se considera que la gelatina hidrolizada es proteína de gelatina que es soluble en ácido tricloroacético. En consecuencia, se prefiere que la gelatina no hidrolizada contenga menos del 10% (p/p) de proteínas solubles en ácido tricloroacético. Preferiblemente, el gel que comprende gelatina no hidrolizada forma un gel fuerte sobre el que pueden conservarse las células a una temperatura de entre 0 y 15ºC, pero que no puede dispersarse con la adición de una disolución acuosa. Los geles de gelatina no hidrolizada adecuados se han descrito anteriormente (véase Evans, Cell Biology International, 18, 999-1008, 1994; Evans, Cell Biology International, 19, 855-860, 1995; Evans, Cell Biology International, 23, 117-124, 1999; y Griffiths & Evans Cryobiology, 40, 176-181, 200). Además, se encuentra generalmente que la gelatina hidrolizada comprende un fragmento de proteína de 30 kDa, mientras que la gelatina no hidrolizada no comprende un fragmento de proteína de 30 kDa (tal como se detecta utilizando SDS-PAGE).

Las características preferidas del gel que comprende gelatina no hidrolizada que incluye los diversos componentes del gel son las mismas que las indicadas anteriormente para el gel que comprende gelatina hidrolizada, excepto que el gel debe comprender gelatina no hidrolizada. La presente invención también proporciona un soporte sólido que tiene una primera capa de gel de gelatina formada sobre el mismo y una segunda capa de gel de gelatina formada sobre la primera capa de gel de gelatina, en el que las células se mantienen entre las dos capas de gel de gelatina. El gel de gelatina utilizado para formar la primera y segunda capas puede seleccionarse independientemente de un gel de gelatina hidrolizada o un gel de gelatina no hidrolizada.

El soporte sólido y las células son tal como se definieron anteriormente.

Esta configuración de dos capas no se había utilizado nunca anteriormente con éxito para conservar células hipotérmicamente. De hecho, el único caso en el que se ha intentado (Stevanovich et al., Cryobiology, 32, 389-403, 1995), conduce a un rápido burbujeo ("blebbing") de la membrana y a la muerte celular.

La configuración de dos capas de la presente invención tiene varias ventajas. La primera es que la configuración de dos capas permite que se forme una monocapa uniforme de células sobre la capa de gelatina inferior antes de añadir la capa de gelatina superior. Por el contrario, el almacenamiento en una suspensión celular no será uniforme y puede producir altas densidades celulares locales en el fondo del recipiente o posiblemente en el cuerpo de la gelatina que se está solidificando. La rápida tasa de sedimentación celular sugiere que el efecto será más marcado cerca y en el fondo del recipiente. Es probable que el amontonamiento de células sea también un problema cuando las células sedimentan. Una ventaja adicional se refiere a la difusión a través de los geles de gelatina. Debe recordarse que el metabolismo continúa bajo condiciones hipotérmicas, es decir, las células no están en animación suspendida. Todavía se requiere energía para propósitos de mantenimiento (por ejemplo, bombas de iones y degradación de proteínas). La configuración de dos capas permite la difusión a través de la totalidad de la superficie celular, a diferencia de cuando las células están o bien en la superficie del gel de gelatina o están unidas a un soporte sólido y después se recubren con el gel de gelatina.

Además, la profundidad de los geles de gelatina por encima de las células generalmente es inferior a la que hay cuando las células están inmovilizadas sobre un soporte sólido y recubiertas con el gel, permitiendo de nuevo una mejor difusión de los nutrientes a las células.

Además, mediante la conservación de las células entre dos capas, las células tendrán fuerzas uniformes sobre la totalidad de su área superficial. Por tanto, las células se deforman menos y es menos probable que experimenten cambios fenotípicos. Además, los inventores han encontrado que las células sobreviven más tiempo en una configuración de dos capas de gel de gelatina no hidrolizada que cuando las células unidas a un soporte sólido se recubren con una capa de gel de gelatina no hidrolizada o cuando las células están inmovilizadas dentro de un gel de gelatina no hidrolizada.

En consecuencia, hay numerosas ventajas asociadas con la configuración de dos capas para la inmovilización de las células.

Tal como se indicó anteriormente, es deseable, aunque no necesario, tener las capas de gelatina recubiertas con un medio de cultivo líquido. Esto se prefiere particularmente cuando la duración de la conservación es durante un periodo de tiempo prolongado.

Los inventores de la presente invención también han encontrado que tras el almacenamiento a largo plazo de las células a temperaturas de entre 0 y 15ºC, los orgánulos tal como la mitocondria, se agregan al centro de las células (Griffiths et al., Cryobiology, 40, 176-181, 2000). Esto se debe al plegamiento del citoesqueleto en la célula. Se ha encontrado que al someter a las células a breves periodos a temperaturas de entre 20 y 37ºC, es suficiente con restablecer las estructuras del citoesqueleto mientras que son demasiado cortas para iniciar los cambios fenotípicos en las células.

Preferiblemente, los métodos de la presente invención comprenden adicionalmente someter a las células a temperaturas de entre aproximadamente 20 y 37ºC durante aproximadamente de 1 a 16 horas (preferiblemente, aproximadamente 5 horas) al menos una vez cada pocos días (es decir, aproximadamente cada 2 a 5 días). Sin embargo, si el aumento de temperatura da como resultado que el gel de gelatina se funda (por ejemplo, cuando un gel de gelatina hidrolizada se somete a una temperatura de aproximadamente 25ºC o cuando un gel de gelatina no hidrolizada se somete a una temperatura de aproximadamente 37ºC) se prefiere que las células se transfieran a un cultivo en suspensión durante la duración del aumento de temperatura y luego se unan a un gel que contiene gelatina para continuar la conservación. Los cultivos en suspensión son bien conocidos por los expertos en la técnica. En particular, un cultivo en suspensión para hepatocitos se describe en Evans, Biochim. Biophys, Acta., 677. 433-444, 1981.

La presente invención también proporciona un método de conservación de células aisladas que comprende unir las células a un gel que comprende gelatina no hidrolizada y/o gelatina hidrolizada y cultivar las células a una temperatura de entre 0 y 15ºC, y comprende además someter las células a temperaturas de entre aproximadamente 20 y 37ºC durante aproximadamente 1 a 16 horas (preferiblemente, aproximadamente 5 horas) al menos una vez cada pocos días (es decir, aproximadamente cada 2 a 5 días). Las células pueden unirse a una superficie del gel, mantenerse entre dos capas de gel, inmovilizarse dentro del gel o unirse a un soporte sólido y cubrirse con el gel.

Los métodos de la presente invención permiten que se obtengan "bancos de células" de células primarias a partir de un animal. Las células pueden utilizarse posteriormente durante un periodo de días, evitando las complicaciones de la variación genética. Los métodos permiten utilizar las células inmediatamente sin esperar a que las células se multipliquen. Los métodos permiten la conservación de tipos celulares que son sensibles a la crioconservación y permiten que las células modificadas genéticamente se transporten a localizaciones distantes con pérdidas mínimas.

La presente invención también proporciona un método para conservar fragmentos u órganos aislados de tejido que comprende perfundir el órgano o tejido con un gel licuado que comprende gelatina hidrolizada y/o no hidrolizada, en el que posteriormente a la perfusión, el órgano o tejido se almacena a una temperatura de entre 0 y 15ºC.

Una dificultad principal con el transplante de órganos es el corto periodo de tiempo disponible antes de que el órgano se deteriore (por ejemplo, 36 - 48 h para un hígado). Muchos sugieren que esto no se debe inicialmente a la escasa conservación de las células específicas del órgano, sino a la mayor sensibilidad de las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos (T. Ebert et al., Modern Trends in BioThermoKinetics, 3, 288-293, 1994). Estas células "abandonan" las paredes, cuando se intenta la reperfusión, lo que conduce a oclusión de los vasos sanguíneos y a la posterior lesión del órgano debido a la circulación afectada. La perfusión de un órgano recientemente aislado con un medio conservante de gelatina evita estos cambios. Tras la perfusión completa, el órgano se almacena a entre 0 y 15ºC con el resultado de que la gelatina solidifica dentro de los vasos sanguíneos, etc., y las células endoteliales se mantienen en sus posiciones correctas. El gel de gelatina combina las características de una matriz de soporte sólida, una buena tasa de difusión con los tejidos y una baja temperatura de fusión. Cuando se requiere el órgano, puede perfundirse con un medio (por ejemplo, solución salina) a 37ºC. El gel de gelatina conservante se lava rápidamente. El uso de la gelatina tiene el beneficio adicional de que la gelatina es un material normal del cuerpo y es improbable que sea inmunogénica.

El órgano puede ser cualquier órgano, tal como un corazón, hígado, riñón, etc. El tejido puede ser cualquier tejido que tenga vasculatura capaz de perfundirse. Preferiblemente, un órgano se perfunde y después se toman muestras de tejido del órgano perfundido. Alternativamente, una muestra de tejido puede perfundirse directamente siempre que tenga suficiente vasculatura para permitir la perfusión.

El gel licuado es un gel de gelatina que se licua manteniéndolo a una temperatura suficientemente alta (por ejemplo, de 25 a 37ºC) para garantizar que no solidifique. Preferiblemente, el gel de gelatina comprende gelatina hidrolizada o gelatina no hidrolizada y es tal como se definió anteriormente. Más preferiblemente, el gel de gelatina comprende gelatina hidrolizada tal como se definió anteriormente.

La presente invención se describirá ahora a modo de ejemplo con referencia a lo siguiente:

La figura 1 muestra esquemáticamente células conservadas sobre una capa de gel que comprende gelatina hidrolizada.

La figura 2 muestra esquemáticamente células conservadas entre dos capas de gel que comprenden gelatina hidrolizada.

La figura 3 muestra esquemáticamente células conservadas dentro de una capa de gel que comprende gelatina hidrolizada.

La figura 4 muestra esquemáticamente células inmovilizadas sobre un soporte sólido y recubiertas con una capa de gel que comprende gelatina hidrolizada.

La figura 5 muestra la recuperación de hepatocitos de rata tras conservación hipotérmica a 10ºC. Los valores se refieren a la actividad enzimática encontrada posteriormente en las células que se adhieren tras 2 horas.

La figura 6 muestra el efecto de la conservación hipotérmica sobre las tasas de síntesis de proteínas.

La figura 7 muestra la actividad de la tirosina aminotransferasa \pm adiciones hormonales, tras la conservación. (\blacksquare) medio de cultivo basal, (\oblong) medio de cultivo basal con dexametasona y dibutiril-AMPc.

La figura 8 muestra la actividad de la \gamma-glutamil transpeptidasa durante el cultivo de hepatocitos. Los hepatocitos se conservaron continuamente (\bullet) o, tras 96 h de conservación, se volvieron a cultivar a 37ºC (\circ). El perfil de inducción de \gamma-GT es idéntico a cuando los hepatocitos aislados recientemente se cultivan sin conservación anterior.

La figura 9a muestra el efecto del cultivo (37ºC) sobre los niveles en hepatocitos del cromosoma P_{450} y el citocromo b5 y la figura 9b muestra el efecto de la conservación sobre los niveles en hepatocitos del citocromo P_{450} y el citocromo b5.

La figura 10 muestra el mantenimiento del citocromo P_{450}1A1 en hepatocitos conservados.

La figura 11a muestra la degradación de proteínas intracelular en hepatocitos cultivados a 37ºC y la figura 11b muestra la degradación de proteínas intracelular en hepatocitos conservados. Radiactividad insoluble en ácido tricloroacético (\blacksquare) y radiactividad soluble en ácido tricloroacético (\oblong).

La figura 12 muestra la morfología de los hepatocitos in vitro. Las células recién aisladas (a) poseen una forma redondeada. En el cultivo convencional, los hepatocitos se extienden rápidamente hasta el punto en que, en un plazo de 24 h, el núcleo llega a deformarse y la célula es muy plana (b). Utilizando el gel de gelatina de conservación y bajo hipotermia, se conserva la morfología redondeada (c), aproximadamente hasta la situación in vivo. Las células conservan su forma durante toda la conservación.

La figura 13 muestra la viabilidad celular durante la conservación en ausencia de suero (\blacksquare), nutrientes (\bullet) u hormonas (\oblong).

La figura 14 muestra el contenido soluble en ATC de gelatina natural, natural térmicamente hidrolizada y con valor bloom de 75. Las disoluciones de gelatina se calentaron a 37ºC y 40ºC (\bullet), 50ºC (\blacktriangle), 60ºC (\blacklozenge), 70ºC (\oblong), 80ºC (\blacksquare) y 95ºC (X) para el periodo mostrado. También se muestra el contenido en proteína soluble en ATC de gelatina natural sometida a autoclave (- - -) (línea superior) y gelatina con un valor bloom de 75 (- - -) (línea inferior).

La figura 15 muestra la unión de los hepatocitos a placas Primaria® a 37ºC tras 2 h después de liberarse del gel de conservación que contiene gelatina hidrolizada y no hidrolizada. La primera columna muestra las células que se liberaron por calentamiento (37ºC) y a las que se dio 2 h para unirse. La segunda columna muestra la viabilidad de las células que se recubrieron a partir del gel de conservación hidrolizado añadiendo cantidades en exceso de medio L-15 a 10ºC y después se separaron de la suspensión por centrifugación / sedimentación. El suero, o bien estaba presente (suero positivo) u omitido (suero negativo) del gel.

La figura 16 muestra SDS-PAGE de gelatina natural (a); gelatina tratada térmicamente a 80ºC (2,5 h) (b); gelatina tratada térmicamente a 95ºC (2,5 h) (c); y gelatina natural sometida a autoclave (d)

Gel a: (i) PM: 95 kDa

Gel b: (i) PM: 95 kDa; (ii) PM: 30 kDa

Gel c: (i) PM: 30 kDa

Gel d: (i) PM: 30 kDa

La figura 17 muestra la viabilidad de los hepatocitos conservados en diferentes configuraciones (en relación con el gel) y/o en geles compuestos de gelatina hidrolizada o no hidrolizada. Los datos se expresan como un porcentaje del número de células viables (tal como se determina por la actividad LDH) en la estructura intercalada de gelatina en cada punto de tiempo. Suspensión de gel natural / células (-\blacklozenge-) en la que los hepatocitos están suspendidos en un gel de gelatina no hidrolizada; hepatocitos previamente adheridos con revestimiento de gel natural (-\blacksquare-) en los que se permite que los hepatocitos se adhieran al sustrato antes de cubrirse mediante el gel de gelatina no hidrolizada; suspensión de gelatina hidrolizada (-x-) en la que los hepatocitos suspendidos en un gel de gelatina no hidrolizada se hidrolizan a 95ºC, suspensión con valor bloom de 75 (-\bullet-) en la que los hepatocitos se suspenden en un gel compuesto de gelatina con valor bloom de 75 (comercialmente disponible de Sigma); hepatocitos previamente unidos con revestimiento de gel hidrolizado (-\circ-) en los que se permite que los hepatocitos se adhieran al sustrato antes de recubrirse por un gel de gelatina hidrolizada.

La figura 18 muestra el perfil de calentamiento y enfriamiento de un gel de conservación que contiene gelatina no hidrolizada dentro de una placa Corning de 60 mm.

La figura 19a muestra el perfil de temperatura dentro de pocillos diferentes de una microplaca de 96 pocillos durante la fase de enfriamiento (10ºC). Véase la figura 19b para comprobar la posición relativa de cada pocillo.

Ejemplo 1 Materiales y método

La colagenasa se adquirió de Boehringer Mannheim, Opti Phase X de LKB, Croydon, Surrey, R.U. El medio de cultivo Leibovitz (L-15), el suero de ternero recién nacido y la gentamicina se suministraron por ICN Biomedicals LTD, High Wycombe, Bucks, R.U., y la insulina se obtuvo de Boots, Nottingham, R.U. Todos los compuestos químicos restantes se obtuvieron de Sigma, Poole, Dorset, R.U.

Se prepararon los hepatocitos tal como se describió anteriormente (Evans 1981 (citado anteriormente), Evans y Mayer, 1982 (citados anteriormente)). El gel de la presente invención comprende medio de cultivo celular que consiste en medio Leibovitz (L-15) (pH 7,4) que contiene glucosa (8,3 mM) y Hepes (25 mM) y gelatina hidrolizada. La gelatina hidrolizada se obtuvo calentando la gelatina (3%, tipo I de Sigma de piel de cerdo) en agua estéril hasta 95ºC durante 2 horas. Se añadió un volumen de la disolución de gelatina hidrolizada al 3% a 1 volumen de disolución del medio de cultivo celular 2 x para formar una disolución que contenía el 1,5% (p/v) de gelatina hidrolizada. El gel que contenía la gelatina hidrolizada se dejó enfriar hasta 10ºC en una placa de cultivo de 60 mm. Se añadieron 2,5 x 10^{6} hepatocitos en 3 ml de medio Leibovitz (L-15) (pH 7,4) complementado con glucosa (8,3 mM), Hepes (25 mM), insulina (0,8 \mug.ml^{-1}), gentamicina (50 \mug.ml^{-1}) y suero de ternero recién nacido inactivado por calor (10% v/v). Se dejó una hora para permitir la unión de las células al gel a 10ºC. Las células se unieron firmemente al gel pero no pudieron extenderse ni migrar a través del sustrato. Las placas se colocaron en una incubadora humidificada a 10ºC. La figura 1 muestra esquemáticamente los hepatocitos unidos a la capa del gel.

Se tomaron muestras de las placas a intervalos diarios y se encontró que mantenían alta viabilidad tal como se evaluó por su retención de la enzima marcadora citosólica lactato deshidrogenasa (LDH) y su posterior capacidad para unirse a un soporte sólido. También se encontró que las células mantenían sus tasas de síntesis de proteínas y que mostraban respuestas similares a in vivo a las hormonas. Se encontró que se mantenían los niveles del citocromo P_{450} y sus isoenzimas específicas. Además, no aparecían las características enzimáticas atípicas de los cambios fenotípicos.

Los hepatocitos conservados mantenían las propiedades mencionadas anteriormente durante al menos siete días.

Los hepatocitos se separaron del gel por la adición de medio de cultivo frío en exceso con "rimming".

Los hepatocitos separados del gel se recogieron y pudieron utilizarse en ensayos y otros experimentos.

Ejemplo 2

Se repitió el experimento descrito en el ejemplo 1, excepto en que tras la unión de los hepatocitos a la capa de gel, se eliminó el medio de cultivo y se sustituyó con 1 ml de medio de cultivo celular L-15 que comprendía gelatina hidrolizada, 1,5% (p/v). Se permitió que la capa de gel superior se uniera a la capa de gel inferior durante 1 hora a temperatura ambiente. Las capas de gel y las células se colocaron entonces a 10ºC para permitir que el gel solidificara. Se añadió 1 ml adicional de medio de cultivo celular a la parte de arriba de la capa de gel superior. Véase la figura 2.

Se encontró que los hepatocitos conservados se conservaban de manera idéntica a los hepatocitos del ejemplo 1.

De nuevo las células se separaron del gel por la adición de medio de cultivo frío en exceso (con "rimming").

Ejemplo 3

El medio de cultivo L-15 que comprende el 1,5% de gelatina hidrolizada tal como se describió en el ejemplo 1 anterior, se funde a 37ºC y se añaden los hepatocitos. El gel que contiene los hepatocitos se coloca entonces a 10ºC, de manera que el gel solidifique y que los hepatocitos se inmovilicen dentro del gel (véase la figura 3).

Se encontró que los hepatocitos conservados se conservaban de manera idéntica a los hepatocitos del ejemplo 1.

De nuevo las células se separaron del gel por la adición de medio de cultivo frío en exceso con "rimming".

Ejemplo 4

Los hepatocitos se cultivan en una placa Petri en el medio L-15 descrito en el ejemplo 1, que no comprende el 1,5% de gelatina hidrolizada, a 37ºC durante 2 horas. Los hepatocitos se unen a la superficie de la placa. El medio L-15 se elimina y se sustituye por el medio L-15 que comprende el 1,5% de gelatina hidrolizada descrito en el ejemplo 1. La placa se coloca a 10ºC y el gel solidifica recubriendo las células unidas a la superficie de la placa. Véase la figura 4.

Se encontró que los hepatocitos conservados se conservaban de manera idéntica a los hepatocitos del ejemplo 1.

El gel se eliminó por calentamiento o por la adición de medio de cultivo frío en exceso con "rimming" y las células se mantuvieron unidas a la superficie de la placa listas para utilizarse en ensayos o en otros experimentos.

Tal como será evidente para un experto en la técnica, la cantidad de gelatina, el soporte sólido al que pueden unirse las células y el tipo de medio de cultivo utilizado para formar el gen pueden variar dependiendo de los requisitos exactos del estudio. Los ejemplos 2 a 4 también se han realizado utilizando gelatina no hidrolizada en lugar de gelatina hidrolizada y las células se separan del gel por el calentamiento del gel a 37ºC.

Ejemplo 5 Medida de la integridad funcional de las células conservadas

La integridad funcional de las células conservadas se examinó utilizando los criterios siguientes:

1.

Durante un periodo de 7 días, el 90 - 95% de las células liberadas de los geles de gelatina (tanto de geles de gelatina hidrolizada como no hidrolizada) excluyeron el colorante azul de tripano. Esta cifra es esencialmente la misma que la viabilidad de las células recientemente aisladas.

2.

La exclusión de colorantes vitales o la retención en enzimas solubles indica que las células están vivas en ese instante. Sin embargo, la viabilidad sostenida no se indica necesariamente mediante estas técnicas. Poullain et al. (Hepatology 15, 97-106, 1992) informaron de que la actividad lactato deshidrogenasa tras el almacenamiento en frío en la disolución de la Universidad de Wisconsin es relativamente alta, aun cuando las células no podían unirse al plástico y sobrevivir. De manera similar, las células crioconservadas también muestran a menudo estas propiedades "contradictorias". Debido a esta incertidumbre, las células conservadas utilizando los geles de gelatina de la presente invención se seleccionaron para determinar su capacidad para unirse a soportes durante un periodo de 2 horas a 37ºC y para expresar los marcadores bioquímicos lactato deshidrogenasa (LDH). Se encontró que las células conservadas se unían a los soportes de una manera idéntica a las células recientemente aisladas (no conservadas). Véase la figura 5.

3.

La unión a un soporte no es una prueba concluyente de que los hepatocitos mantendrán posteriormente su función a 37ºC. Además, las células pueden requerir un periodo de recuperación y tener una función metabólica deteriorada, tal como se ha observado para las células crioconservadas, (De Loecker et al., Cryobiology, 30, 12-18, 1993; Chesne et al., Hepatology 18, 406-414, 1993). En consecuencia, las tasas de la síntesis de proteínas se utilizaron como un criterio de comportamiento normal. La síntesis de proteínas requiere un alto grado de integración metabólica. Las respuestas habituales dadas por las células tras la conservación en los geles de gelatina de la presente invención se muestran en la figura 6. Las tasas de síntesis de proteínas se midieron por la incorporación de L-[4,5-^{3}H]leucina en una forma insoluble en ácido tricloroacético. Las tasas fueron lineales durante al menos 7 horas y no fueron precedidas por una fase de retardo.

4.

Las medidas de síntesis de proteínas muestran una función celular general, pero no indican si esta última es específica de tejido. Tras la conservación utilizando los geles de gelatina de la presente invención, las células se probaron para determinar su inducción hormonal de la enzima tirosina aminotransferasa. Ésta es una propiedad específica del hígado. Supone la unión al receptor hormonal, la translocación, la transcripción y la traducción del receptor ocupado. Los resultados habituales se muestran en la figura 7, en la que las células conservadas cultivadas en presencia de los inductores dexametaxona y dibutiril-AMPc tienen niveles aumentados de tirosina aminotransferasa, mientras que las células conservadas en ausencia de los inductores (medio de cultivo basal) no tienen niveles aumentados. De particular interés es que las células conservadas inducidas mantengan niveles enzimáticos similares a in vivo en oposición con las células no conservadas cultivadas in vitro a 37ºC.

5.

Además de mantener funciones específicas del hígado, si las células conservadas han de aproximarse a las células recientemente aisladas, no deben experimentar cambios fenotípicos durante la conservación. La aparición de la enzima gamma glutamil transpeptidasa es un marcador temprano del cáncer de hígado y se induce cuando se cultivan hepatocitos a 37ºC (Edwards, Cancer Res., 42, 1107-1115, 1982). La figura 8 muestra que el marcador fenotípico no aumenta durante la conservación, pero lo hace claramente tras 48 h de cultivo a 37ºC. Es interesante que tras la conservación, el cultivo de las células da como resultado la inducción de \gamma-glutamil transpeptidasas durante el mismo periodo de tiempo que para las células recientemente aisladas. Esto demuestra que su función se ha mantenido mediante la conservación, pero que las células se comportan finalmente de la misma forma que las células recientemente aisladas cuando se cultivan posteriormente a 37ºC.

6.

Claramente se evitan los cambios fenotípicos a "largo plazo" (tal como la inducción de \gamma-glutamil transpeptidasa). Sin embargo, se producen cambios fenotípicos a diferentes tasas. Fue posible que se produjeran todavía cambios rápidos en los sistemas de conservación. Posiblemente, el cambio fenotípico inicial es la disminución del citocromo P_{450} que finalmente reduce el valor de los cultivos de hepatocitos a largo plazo en las pruebas de toxicidad. Se comparó el efecto de las diversas formas de cultivo sobre los niveles de citocromo P_{450} y el citocromo b_{5} más estable. Tal como se esperaba, el cultivo convencional condujo a una rápida disminución en el nivel del citocromo P_{450} (figura 9a). Sin embargo, los modelos de conservación mantuvieron altos niveles de citocromo P_{450} casi equivalentes a los del citocromo b_{5} (figura 9b).

7.

Como una prueba adicional de la relación con la situación in vivo, el perfil de isoenzimas del citocromo P_{450} no debe cambiar por el procedimiento de conservación. La figura 10 ilustra el mantenimiento de la isoenzima 1A1 específica del citocromo P_{450} por los procedimientos de conservación.

Ejemplo 6 El metabolismo continúa bajos las condiciones de conservación

A diferencia de la crioconservación, las células no están en un estado de animación suspendida durante la conservación en los geles de gelatina de la presente invención. Continúa cierto metabolismo, aunque a una tasa muy baja. Para demostrar que este era el caso, se requirió un procedimiento que podría monitorizarse durante un largo periodo de tiempo. Las medidas de la síntesis de proteínas sólo pueden medirse durante un periodo de tiempo relativamente corto debido al agotamiento del radioisótopo de marcaje y/o al recambio de las proteínas recientemente sintetizadas. Sin embargo, las medidas de la degradación de proteínas, en presencia de los niveles elevados de la sustancia no marcada originalmente incorporada en la proteína (para evitar la reutilización) pueden realizarse durante un tiempo prolongado. Las medidas pueden realizarse tanto en lo que se refiere a la pérdida de material insoluble en ácido tricloroacético en las células, como en cuanto a la aparición de material soluble en ácido tricloroacético en el medio. La figura 11a y la figura 11b muestran las tasas de degradación de proteínas, de proteínas idénticas de "larga duración" a 37ºC en un cultivo normal y en el sistema de conservación. Las células conservadas se recogieron directamente de la matriz de conservación, en lugar de dejar que se unieran a la placa durante 2 horas. Esto se llevó a cabo calentando el gel hasta 37ºC durante 20 minutos (no hidrolizado) o por dispersión acuosa (hidrolizado). Las suspensiones celulares resultantes se centrifugaron y los sobrenadantes y sedimentos de células se analizaron por separado para determinar su contenido en radiactividad.

La conservación utilizando los geles de gelatina de la presente invención aumentó la semivida de las proteínas en 20 veces. En ambas condiciones, la radiactividad liberada de las formas insolubles en ácido tricloroacético pudo explicarse completamente por la radiactividad recuperada en la fracción soluble en ácido tricloroacético. Por tanto, la muerte celular fue mínima bajo ambos conjuntos de condiciones. Esto se verificó por las medidas de proteínas totales, que demostraron que las células estaban en un estado estacionario del metabolismo de proteínas a 37ºC con sólo una disminución mínima en el contenido de proteínas durante la conservación. La degradación de proteínas es un proceso dependiente de la energía. Durante la conservación, la tasa de degradación de proteínas se mantiene sin cambios, demostrando que no se producen efectos perjudiciales durante el periodo de tiempo medido.

Ejemplo 7 Se mantiene la morfología celular

La morfología celular está asociada intrínsecamente a la función celular. Los inventores han llevado a cabo estudios que han demostrado que los cambios en el fenotipo durante el cultivo a 37ºC están asociados con cambios en la forma de la célula. Muchos otros estudios también han observado la importancia de mantener la forma celular in vivo si ha de conservarse la función celular. Véase la figura 12 que muestra que las células cultivadas utilizando el gel de gelatina de la presente invención mantienen la morfología redondeada.

Ejemplo 8 Viabilidad celular durante la conservación en ausencia de suero, nutrientes u hormonas

Con objeto de la investigación, puede ser deseable exponer las células a factores con el fin de estudiar su efecto sobre la función celular, por ejemplo, las células se exponen a hormonas para estudiar los perfiles de inducción. Si las células se exponen antes del estudio, entonces el efecto del agente de prueba podría carecer de validez. Teniendo esto en cuenta, se llevó a cabo la determinación del efecto de los diversos componentes del gel de gelatina, sobre su potencial de conservación, con el objetivo potencial de simplificar su composición. La figura 13 muestra el efecto sobre la viabilidad celular de omitir uno de los tres componentes clave: suero, nutrientes u hormonas. La viabilidad celular se compara con la viabilidad celular, en el punto de tiempo relevante, si el gel de gelatina contenía el complemento completo de componentes.

Este estudio revela la estabilidad del sistema, permitiendo que se desarrolle un gel con una composición muy definida.

Ejemplo 9 Conservación de las células primarias del túbulo proximal del riñón

Los hepatocitos tienen muchas propiedades ventajosas, aunque al menos una diferencia que salta la vista con respecto a muchas células en cultivo. In vitro, los hepatocitos tienen un potencial de crecimiento escaso y las células aisladas inicialmente no pueden mantenerse mediante subcultivos. Para evaluar el efecto de los sistemas de conservación sobre el crecimiento de las células, se han preparado células primarias del túbulo proximal del riñón. Los resultados muestran que las células del túbulo proximal pueden conservarse utilizando los geles de gelatina de la presente invención, mediante la utilización de los mismos procedimientos. Las enzimas marcadoras de este tipo celular, tal como los fosfatos alcalinos y la \gamma-glutamil transpeptidasa se mantienen en el nivel de la preparación recientemente aislada durante al menos una semana. Las células se mantienen en medio de conservación que carece de bicarbonato. La viabilidad de las células aisladas se muestra mediante exclusión con azul de tripano. La viabilidad del túbulo se demuestra colocándolo en un medio hipotónico. Inicialmente se observa la formación de burbujas en los extremos de los túbulos, pero más tarde se produce a lo largo de su longitud. Tras la aparición de burbujas, las células en los túbulos comienzan a captar azul de tripano. La preparación de túbulo proximal conservado muestra una diferencia con respecto a los hepatocitos. Las células del túbulo proximal no se unen a un soporte a menos que se elimine la gelatina mediante el lavado de las células. Tras la unión celular, a 37ºC, las células crecen normalmente en medio complementado con bicarbonato para formar una monocapa confluente a la misma tasa que las células del túbulo proximal recientemente aisladas. Los procedimientos de conservación no tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento celular. Datos no mostrados.

Ejemplo 10 Naturaleza fisicomecánica de los geles que contienen gelatina

La naturaleza fisicomecánica del gel de gelatina hidrolizada difiere de la del gel de gelatina no hidrolizada. El gel de gelatina hidrolizada se funde a una temperatura inferior a la del gel de gelatina no hidrolizada. Además, el gel de gelatina hidrolizada puede dispersarse mediante la adición de un exceso de medio acuoso (por ejemplo, medio de cultivo celular). El gel de gelatina no hidrolizada sólo puede dispersarse utilizando una etapa de calentamiento.

El gel de gelatina hidrolizada se forma por el tratamiento térmico, bajo condiciones controladas, de la gelatina natural. Los cambios en la naturaleza molecular de la gelatina resultante se revelan por los cambios en la resistencia de la gelatina a la precipitación por ATC (figura 14).

A través de la experimentación se encontró que la gelatina hidrolizada inhibe la unión de los hepatocitos a los sustratos sintéticos de cultivo celular (en este caso Primaria®). La figura 15 revela que el nivel de inhibición es próximo al 100%. La recogida acuosa (es decir, la recuperación de las células utilizando medios acuosos para dispersar el gel) y las pruebas de exclusión de colorante revelaron que las células son viables (obsérvese que la recogida acuosa no es posible para los geles de gelatina no hidrolizada). La inhibición se pierde si las células se cultivan en presencia de suero. Las células cuya unión estaba inhibida también pudieron unirse rápidamente si se volvían a cultivar en medio completo que contenía suero.

El análisis por SDS-PAGE de la gelatina, hidrolizada en diversos grados (véase la figura 16), permitió un estudio más detallado de su composición. Se observa que la distribución de los polipéptidos de gelatina cambia, ampliándose y, de acuerdo con los estudios de ATC, fragmentándose, de manera que hay una frecuencia creciente de polipéptidos con pesos moleculares (PM) más pequeños. Además, los PM predominantes también han cambiado, desde un fragmento mayor de 95 kDa en la gelatina no hidrolizada hasta un fragmento menor de 30 kDa en el equivalente hidrolizado.

Estos polipéptidos más pequeños pueden explicar que el gel sea más débil, haciendo que se funda a una temperatura inferior. También explica la sensibilidad del gel a la dispersión en medios acuosos. Sin embargo, y lo que es más importante, también puede explicar por qué un gel que emplea gelatina hidrolizada es mejor para conservar la viabilidad y la función celulares con respecto a un gel de conservación que contiene gelatina no hidrolizada.

Ejemplo 11 Viabilidad de los hepatocitos conservados en diferentes configuraciones

Los hepatocitos se han conservado utilizando geles de gelatina no sólo de diversas composiciones (véase el ejemplo 8), sino también de diferentes configuraciones (es decir, la relación entre las células y el gel de gelatina de conservación) tal como se muestra en la figura 17.

La gelatina con valor bloom de 75 comercialmente disponible no puede utilizarse para la conservación de los hepatocitos, puesto que es citotóxica y produce grandes anomalías morfológicas.

El uso de gelatina sometida al autoclave para conservar las células proporcionó resultados idénticos a los de la conservación en gelatina tratada a 95ºC (2 h).

Una conclusión a partir de la figura 17 es que una estructura intercalada de gelatina no hidrolizada es superior en la conservación de las células con respecto a una suspensión no hidrolizada o a un revestimiento de gelatina no hidrolizada. Esto puede deberse a la capacidad para crear una monocapa uniforme (evitando el amontonamiento de las células) o a sus propiedades de difusión mejoradas. La aparente limitación en la suspensión no hidrolizada o en el revestimiento no está presente en sus homólogos hidrolizados. Aunque ambas formas de gel hidrolizado tienen propiedades similares, sólo la gelatina tratada con calor a 95ºC (2 h) formará un gel que es suficientemente estable para soportar una monocapa de células. El gel de gelatina sometido a autoclave se disipa demasiado fácilmente por el medio acuoso. La ventaja del soporte a 95ºC es que puede permitir que el medio de cultivo se modifique durante la conservación (añadiendo potencialmente estabilizadores celulares frescos). Esto permite estudiar la causa de la lesión hipotérmica en la conservación a largo plazo.

Hay un debilitamiento progresivo de la resistencia del gel observada en los tratamiento externos térmicos. Los geles de gelatina no hidrolizada y los tratados a 80ºC requieren una etapa de calentamiento para liberar las células. Por el contrario, el gel tratado a 95ºC y la gelatina sometida a autoclave pueden disiparse mediante medio acuoso o calentamiento. De la misma forma que la gelatina tratada a 80ºC requiere una etapa de calentamiento más corta que la gelatina no hidrolizada para solubilizarse, el gel de gelatina sometido a autoclave se dispersa más fácilmente mediante disoluciones acuosas, mientras que el gel a 95ºC (2 H) es más robusto y requiere "rimming" antes de la dispersión en medio acuoso.

Ejemplo 12 Velocidad de calentamiento y enfriamiento de un gel de gelatina

La figura 18 muestra la velocidad de calentamiento / enfriamiento de los geles de gelatina no hidrolizada desde 10ºC - 37ºC y viceversa. El experimento se llevó a cabo colocando un termopar en la periferia de una placa de 60 mm que contenía gelatina no hidrolizada. Es evidente que la transición de temperatura tarda al menos 14 minutos en producirse. Esto es mucho más corto que el tiempo permitido para sembrar en placa (2 h). Es probable que haya un gradiente de temperatura a través de la placa y que esto tendría un efecto sustancial sobre la distribución de las células antes de que solidifique la gelatina.

Para demostrar que existe tal gradiente temperatura, se utilizó una microplaca de 96 pocillos. Se añadió gelatina no hidrolizada a cada uno de los pocillos y el termopar pudo localizarse ahora precisamente en un pocillo individual. Las figuras 19a y 19b muestran la velocidad de enfriamiento de la gelatina en los diferentes pocillos. Está claro que los pocillos centrales se enfrían menos rápidamente que los pocillos externos y este gradiente de temperatura significaría que se produce una distribución no uniforme de las células en una suspensión de gel no hidrolizado, lo que conduce a un efecto de amontonamiento. La menor temperatura de fusión de la gelatina hidrolizada significa que se minimiza el efecto de la diferencia de temperatura.

Las figuras 18 y 19 sugieren que las mejores propiedades de conservación celular de los revestimientos y las suspensiones de gelatina hidrolizada, en relación con sus homólogos no hidrolizados, se deben a las mejores propiedades de difusión y/o a que se evita el amontonamiento celular. Para tratar adicionalmente los importantes efectos de la difusión en la conservación de los hepatocitos es de interés que cuando se incluye glicerol (0,5 M) en el sistema (para investigar su capacidad para proteger a las células como en la crioconservación) es citotóxico. Reduce sustancialmente la viabilidad de las células (permaneciendo el 10% tras 7 días). Aunque no puede descartarse un efecto citotóxico manifiesto del glicerol, su naturaleza viscosa limitaría ciertamente la difusión a las células.

Claims (32)

1. Método para conservar células aisladas, que comprende unir las células a un gel que comprende gelatina hidrolizada y cultivar las células a una temperatura de entre 0 y 15ºC, en el que el gel es suficientemente débil para dispersarse por la adición de una disolución acuosa.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el gel comprende un medio de cultivo celular y gelatina hidrolizada.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células se cultivan a una temperatura de entre 4 y 14ºC.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las células se cultivan a una temperatura de aproximadamente 10ºC.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la gelatina hidrolizada se produce por la hidrólisis térmica de la gelatina.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la gelatina hidrolizada se produce calentando la gelatina hasta una temperatura de 85 a 121ºC durante entre 0,3 y 3 horas.

7. Método según la reivindicación 5, en el que la gelatina hidrolizada se produce calentando la gelatina hasta una temperatura de aproximadamente 95ºC durante aproximadamente 2 horas.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el gel comprende entre el 0,5% y el 5,0% (p/v) de gelatina hidrolizada.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el gel comprende entre el 1 y el 2% (p/v) de gelatina hidrolizada.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el gel comprende aproximadamente el 1,5% (p/v) de gelatina hidrolizada.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el gel comprende el 1,5% (p/v) de gelatina hidrolizada en medio Leibovitz que comprende glucosa y Hepes.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células son células primarias.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que las células son hepatocitos.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células se unen a la superficie del gel y se recubren con un medio de cultivo líquido.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que las células se unen a la superficie de una primera capa de gel y después se recubren con una segunda capa de gel, de manera que las células se mantengan entre las dos capas de gel.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que las células se mezclan con el gel antes de que solidifique, dando como resultado células que están inmovilizadas en el gel cuando el gel solidifica.

17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que las células se unen a un soporte sólido y después se recubren con una capa del gel.

18. Método según la reivindicación 17, en el que el soporte sólido es una placa de cultivo, un pocillo o una columna.

19. Gel que comprende gelatina hidrolizada para su uso en el método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el gel es suficientemente débil como para dispersarse por la adición de una disolución acuosa.

20. Gel que comprende gelatina hidrolizada y una o más células aisladas, en el que el gel es suficientemente débil como para dispersarse por la adición de una disolución acuosa.

21. Soporte sólido que tiene el gel de la reivindicación 19 o la reivindicación 20 formado sobre el mismo.

22. Soporte sólido según la reivindicación 21, que es una placa de cultivo, pocillo o columna.

23. Soporte sólido según la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que las células se unen al gel formado sobre el soporte sólido.

24. Método para conservar células aisladas que comprende unir las células a la superficie de una primera capa de un gel y después recubrir con una segunda capa de un gel, de manera que las células se mantengan entre las dos capas de gel, y cultivar las células a una temperatura de entre 4 y 14ºC, en el que al menos una de las capas de gel, comprende gelatina no hidrolizada.

25. Método según la reivindicación 24, en el que ambas capas de gel comprenden gelatina no hidrolizada.

26. Método según la reivindicación 24, en el que la primera capa de gel comprende gelatina hidrolizada y la segunda capa comprende gelatina no hidrolizada.

27. Método según la reivindicación 24, en el que la primera capa de gel comprende gelatina no hidrolizada y la segunda capa comprende gelatina hidrolizada.

28. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente someter a las células a temperaturas de entre aproximadamente 20 y 37ºC durante aproximadamente 1 a 16 horas al menos una vez cada pocos días.

29. Método según la reivindicación 28, en el que el aumento de temperatura da como resultado que el gel de gelatina se funda, que comprende además transferir las células a un cultivo en suspensión durante la duración del aumento de temperatura y luego unirlas a un gel que contiene gelatina para continuar con la conservación.

30. Soporte sólido que tiene una primera capa de gel de gelatina formada sobre el mismo, una segunda capa de gel de gelatina formado sobre la primera capa de gel de gelatina y en el que las células se mantienen entre las dos capas de gelatina.

31. Soporte sólido según la reivindicación 28, en el que las capas de gel de gelatina se seleccionan independientemente de gel de gelatina hidrolizada y gel de gelatina no hidrolizada.

32. Método para conservar órganos aislados o fragmentos de tejido que comprende perfundir el órgano o el tejido con un gel licuado que comprende gelatina hidrolizada y/o no hidrolizada, en el que posteriormente a la perfusión, el órgano o tejido se almacena a una temperatura de entre 0 y 15ºC y el gel licuado solidifica.