CN110229785A - 一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法 - Google Patents
一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110229785A CN110229785A CN201910523336.9A CN201910523336A CN110229785A CN 110229785 A CN110229785 A CN 110229785A CN 201910523336 A CN201910523336 A CN 201910523336A CN 110229785 A CN110229785 A CN 110229785A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- endothelial progenitor
- fat
- culture
- success rate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
- C12N5/0692—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，所述的方法包括，血管内皮祖细胞的分离培养，移植用脂肪细胞的分离，联合自体血管内皮细胞的脂肪移植物的制备，该发明首创性地将血管内皮祖细胞应用于脂肪移植，通过重建移植脂肪组织的血管系统提升移植脂肪细胞存活，并在动物模型上得到了验证，证明了该发明的有效性，本发明提升了自体脂肪移植的成功率，且相比较利用血管基质（SVF）或自体脂肪干细胞等提升自体脂肪移植成功率的方法，不需要通过抽取大量脂肪来分离需要的血管基质（SVF）或自体脂肪干细胞以提升脂肪移植成功率，因而应用于自体脂肪移植临床上，更具有操作的可行性。
Description
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法。
背景技术
皮肤衰老是一个漫长而复杂的演变过程，皮肤衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。生物体的衰老过程是机体的组织细胞不断产生自由基积累的结果，过多的自由基可以引起DNA损伤从而导致突变，可使细胞中的多种物质发生氧化，损害生物膜，还能够使蛋白质、核酸等大分子交联，影响其正常功能，导致胶原蛋白的交联聚合，会使胶原蛋白溶解性下降、弹性降低及水合成能力减退，导致皮肤失去张力而皱纹增多，皮肤抵抗力下降，产生色斑等皮肤衰老现象。
提高皮肤中的脂肪细胞含量是常见的皮肤抗衰老的方法，自体脂肪注射移植技术经过了20多年的临床研究及10多年的实际应用逐步发展成熟，然而在具体实践中，经严谨的科学测试，单纯的自体脂肪移植在6个月后移植的脂肪细胞大部分会发生凋亡，仅剩30%（15%-45%）左右的移植脂肪细胞会存活下来，更令人担忧的是这些凋亡的脂肪细胞有2.5%-11.1%的几率会钙化并形成结节，导致自体脂肪移植整体效果不尽人意且客户投诉率偏高，单纯的自体脂肪移植所产生的上述问题，主要原因在于移植的自体脂肪细胞得不到足够的营养，同时缺乏新生的自体脂肪细胞，进而造成移植脂肪细胞凋亡并最终造成移植的脂肪组织萎缩。鉴于此，人们后续又分别开发了PRP+自体脂肪移植方法与SVF或自体脂肪干细胞+自体脂肪移植的方法。
PRP技术原先是应用于烧伤治疗的方法，该技术方法主要通过提取患者自身的富含血小板的血浆并激活后，利用血浆提供的营养物质维持细胞存活，同时血小板分泌的细胞因子（PDGF 、EGF 、IGFs 、TGF-β、VEGF 等）促进细胞的生长、迁移与分化，进而在创面形成新血管和表皮细胞，达到皮肤修复的目的。PRP+自体脂肪细胞移植的方法可以通过提供细胞所需营养，改造移植区微环境，促进自体脂肪干细胞分化来提升移植自体脂肪细胞的存活，在移植6个月后自体脂肪存活率提升到55%左右。但由于移植的自体脂肪内自体脂肪干细胞数量少，不能分化出足够多的微血管为移植的自体脂肪细胞后期生长提供足够的营养，同时分化出的自体脂肪细胞数量也偏少，因而该技术在短期内有效，在更长的跟踪期中其效果会逐步下降。自体脂肪干细胞用于自体脂肪移植是最近15年发展起来的一项新技术，其主要原理为在移植的自体脂肪细胞中添加分离到的自体脂肪组织中血管基质（SVF）或脂肪干细胞。通过添加的自体脂肪组织中的血管基质（SVF）或自体脂肪干细胞分化成微血管为移植的脂肪细胞提供营养通道进而减少因营养缺乏而导致的移植细胞凋亡，同时自体脂肪干细胞也能分化成新生的脂肪细胞。该技术可以将自体脂肪移植的成功率提升到56%左右，但是这与自体脂肪移植混合物中的SVFs的细胞数量与脂肪细胞的比例直接相关（0.5:1以上才能有效，比例越高效果越显著）。该项技术在短期效果上没有完全超越PRP的主要原因在于两个方面：首先，短期内不能提供足够的营养导致早期移植的自体脂肪细胞凋亡；其次，脂肪干细胞没有相应的细胞因子直接诱导，其分化成微血管组织和自体脂肪细胞完全属于自发性，不能进行有效控制。
随着后期技术的不断改进，通过将PRP或细胞因子组合物与SVF或自体脂肪干细胞技术结合应用于自体脂肪移植的方法，显著提高了自体脂肪移植的成功率，达到了80%左右，但是受限于自体脂肪移植客体本身的脂肪总量的限制，很难提高分离获得的SVF或自体脂肪干细胞的数量，因而在大剂量的脂肪移植中难以大量应用。同时通过体外培养自体脂肪干细胞的时间周期长，且需要进行两次较为痛苦的吸脂手术，客户的接受度较低也是造成这些技术在现实的自体脂肪移植中难以大范围应用的原因。因此有必要开发新型的自体脂肪移植技术，保证移植脂肪细胞的长期存活且减轻痛苦。
发明内容
为了解决通过将PRP或细胞因子组合物与SVF或自体脂肪干细胞技术结合应用于自体脂肪移植的方法，尽管显著提高了自体脂肪移植的成功率，但是受限于自体脂肪移植客体本身的脂肪总量的限制，很难提高分离获得的SVF或自体脂肪干细胞的数量，因而在大剂量的脂肪移植中难以大量应用的问题，本发明提供一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其技术方案如下：一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，包括如下步骤：
S1、血管内皮祖细胞的分离培养：
S1.1、PRP与单核细胞分离：采用BD Vacutainer CPT 采血管（BD 362761），取血液，然后分离出PRP（高浓度血小板血浆）和单核细胞白膜层，将PRP冻存于-20°C的环境下备用，而后，将单核细胞白膜层转移到离心管中，用PBS（PH 7.4）洗涤（500g 5分钟），收集单核细胞；
S1.2、纤维连接蛋白包被的制取：取纤维连接蛋白，PBS重悬（PH 7.4），加入T25细胞培养瓶中，在37 ℃的环境下平放，倒出液体，并用PBS清洗，备用；
S1.3、血管内皮祖细胞培养：将单核细胞重悬于内皮细胞培养基（Lonza EGM-2-MVBulletKit，lonza CC-3202），接种于预先包被好纤维连接蛋白的T25 细胞培养瓶中，置于37 ℃的环境下，体积分数5%CO2培养箱中培养，3天后换液除去未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，以后每3天换液1次。待细胞融合后传代培养。将单核细胞贴壁培养的细胞标记为P0代细胞，第一次传代培养的细胞标记为P1代，依次类推；
S1.4、血管内皮祖细胞表面抗原标记分析：P4代人血管内皮祖细胞经胰酶消化后用内皮细胞培养基终止消化，离心（500g 5分钟）。细胞经PBS（PH 7.4）洗涤后，取细胞在4℃环境下与荧光标记单克隆抗体CD31-PE、CD144-FITC孵育，以同种型免疫球蛋白作为对照以FACSCalibur型流式细胞仪进行流式细胞仪分析；
S 1.5、血管内皮祖细胞的收获：将P4代的血管内皮祖细胞全部用胰酶消化，洗涤后用解冻后的PRP将其重悬备用，经用血球计数板进行细胞计数培养至P4代收获血管内皮组细胞。
、移植用脂肪细胞的分离：当血管内皮祖细胞培养到P4代后，取脂肪组织，采用添加庆大霉素的生理盐水（10ng/ml）反复冲洗，而后采用1200g离心3分钟，分成三层，弃去油脂层与水层，收集中间的细胞层；
S3、联合自体血管内皮细胞的脂肪移植物的制备：将上述S2步骤中获得的脂肪组织分成均等三份，一份加入S1.5步骤制备的血管内皮祖细胞混匀（A组），一份加入PRP混匀（B组），一份加入生理盐水混匀（C组），A组即为联合体外培养自体血管内皮祖细胞的自体脂肪移植填充物。
进一步的，上述S1.1中，采用BD Vacutainer CPT 采血管（BD 362761），分6管共取血液48ml，然后分别分离出PRP（高浓度血小板血浆）和单核细胞白膜层。PRP共获取40ml，冻存于-20°C的环境下备用，而后，将单核细胞白膜层转移到两支50ml的离心管中，分别用50ml的PBS（PH 7.4）洗涤两次（500g 5分钟），收集单核细胞；
进一步的，上述S1.2中，取200ug纤维连接蛋白，1mlPBS重悬（PH 7.4），加入T25细胞培养瓶中，在37 ℃的环境下平放2小时，倒出液体，并用PBS清洗两遍，备用；
进一步的，上述S1.3中，将单核细胞重悬于内皮细胞培养基（Lonza EGM-2-MVBulletKit，lonza CC-3202），以1×106/ml细胞密度接种5ml于预先包被好纤维连接蛋白的T25 细胞培养瓶中，置于37 ℃的环境下，体积分数5%CO2培养箱中培养，3天后换液除去未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，以后每3天换液1次。待细胞80%左右融合后以1∶3比例传代培养。将单核细胞贴壁培养的细胞标记为P0代细胞，第一次传代培养的细胞标记为P1代，依次类推；
进一步的，上述S1.4中，P4代人血管内皮祖细胞经0.25%胰酶消化3（分钟后，用2ml的内皮细胞培养基终止消化，离心（500g 5分钟）。细胞经PBS（PH 7.4）洗涤两次后，取4×106个细胞，细胞在4℃环境下与荧光标记单克隆抗体CD31-PE、CD144-FITC孵育30 分钟，以同种型免疫球蛋白作为对照以FACSCalibur型流式细胞仪进行流式细胞仪分析；
结果：
进一步的，上述S1.5中，将P4代的血管内皮祖细胞全部用胰酶消化，洗涤后用解冻后的PRP20ml将其重悬备用，经用血球计数板进行细胞计数培养至P4代共收获5*107的血管内皮组细胞；
进一步的，上述S2中，当血管内皮祖细胞培养到P4代后，取200ml的脂肪组织，取到的脂肪组织采用200ml添加庆大霉素的生理盐水（10ng/ml）反复冲洗3遍。而后采用1200g离心3分钟，分成三层，弃去油脂层与水层，收集细胞层；
进一步的，上述S3中，将上述S2步骤中获得的脂肪组织分成均等三份，一份加入1.5步骤制备的血管内皮祖细胞混匀（A组），一份加入20ml的PRP混匀（B组），一份加入20ml的生理盐水混匀（C组），A组即为联合体外培养自体血管内皮祖细胞的自体脂肪移植填充物。
本发明的有益效果为：该发明首创性地将血管内皮祖细胞应用于脂肪移植，通过重建移植脂肪组织的血管系统提升移植脂肪细胞存活，并在动物模型上得到了验证，证明了该发明的有效性，本发明解决了通过将PRP或细胞因子组合物与SVF或自体脂肪干细胞技术结合应用于自体脂肪移植的方法，尽管显著提高了自体脂肪移植的成功率，但是受限于自体脂肪移植客体本身的脂肪总量的限制，很难提高分离获得的SVF或自体脂肪干细胞的数量，因而在大剂量的脂肪移植中难以大量应用的问题，而且，本发明工艺简单，适合规模化生产，满足了人们的使用需求，具有巨大的应用价值，综上，本发明提升了自体脂肪移植的成功率，且相比较利用血管基质（SVF）或自体脂肪干细胞等提升自体脂肪移植成功率的方法，不需要通过抽取大量脂肪来分离需要的血管基质（SVF）或自体脂肪干细胞以提升脂肪移植成功率，因而应用于自体脂肪移植临床上，更具有操作的可行性。
附图说明
图1是本发明具体实施例1中的S3.3步骤中移植脂肪重量对比图。
具体实施方式
具体实施例1：为了解决通过将PRP或细胞因子组合物与SVF或自体脂肪干细胞技术结合应用于自体脂肪移植的方法，尽管显著提高了自体脂肪移植的成功率，但是受限于自体脂肪移植客体本身的脂肪总量的限制，很难提高分离获得的SVF或自体脂肪干细胞的数量，因而在大剂量的脂肪移植中难以大量应用的问题，本发明提供一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其技术方案如下：一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，包括如下步骤：
S1、血管内皮祖细胞的分离培养
S1.1、PRP与单核细胞分离：采用BD Vacutainer CPT 采血管（BD 362761），分6管共取血液48ml，然后分别分离出PRP（高浓度血小板血浆）和单核细胞白膜层。PRP共获取40ml，冻存于-20°C的环境下备用，而后，将单核细胞白膜层转移到两支50ml的离心管中，分别用50ml的PBS（PH 7.4）洗涤两次（500g 5分钟），收集单核细胞；
S1.2、纤维连接蛋白包被的制取：取200ug纤维连接蛋白，1mlPBS重悬（PH 7.4），加入T25细胞培养瓶中，在37 ℃的环境下平放2小时，倒出液体，并用PBS清洗两遍，备用；
S1.3、血管内皮祖细胞培养：将单核细胞重悬于内皮细胞培养基（Lonza EGM-2-MVBulletKit，lonza CC-3202），以1×106/ml细胞密度接种5ml于预先包被好纤维连接蛋白的T25 细胞培养瓶中，置于37 ℃的环境下，体积分数5%CO2培养箱中培养，3天后换液除去未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，以后每3天换液1次。待细胞80%左右融合后以1∶3比例传代培养。将单核细胞贴壁培养的细胞标记为P0代细胞，第一次传代培养的细胞标记为P1代，依次类推；
S1.4、血管内皮祖细胞表面抗原标记分析：P4代人血管内皮祖细胞经0.25%胰酶消化3分钟后，用2ml的内皮细胞培养基终止消化，离心（500g 5分钟）。细胞经PBS（PH 7.4）洗涤两次后，取4×106个细胞，细胞在4 ℃环境下与荧光标记单克隆抗体CD31-PE、CD144-FITC孵育30 分钟，以同种型免疫球蛋白作为对照以FACSCalibur型流式细胞仪进行流式细胞仪分析；
结果：
S1.5、血管内皮祖细胞的收获：将P4代的血管内皮祖细胞全部用胰酶消化，洗涤后用解冻后的PRP20ml将其重悬备用。
、移植用脂肪细胞的分离
当血管内皮祖细胞培养到P4代后，取200ml的脂肪组织，取到的脂肪组织采用200ml添加庆大霉素的生理盐水（10ng/ml）反复冲洗3遍。而后采用1200g离心3分钟，分成三层，弃去油脂层与水层，收集细胞层。
、联合自体血管内皮细胞的脂肪移植物的制备与效果验证
S3.1、联合自体血管内皮细胞的脂肪移植物的制备
将上述获得的脂肪组织分成均等三份，一份加入1.5步骤制备的血管内皮祖细胞混匀（A组），一份加入20ml的PRP混匀（B组），一份加入20ml的生理盐水混匀（C组），A组即为联合体外培养自体血管内皮祖细胞的自体脂肪移植填充物；
S3.2、BALB/c裸鼠动物模型试验
首先取6周龄的BALB/c裸鼠15只，分成（甲、乙、丙）3组，每组5只，将所有裸鼠尾静脉注射1%戊巴比妥钠100ul，待裸鼠完全麻醉后，在裸鼠双侧背部皮下进行脂肪移植物注射。每只裸鼠背部两侧各注射1ml，共2ml，注射方式采用扇形多点位注射方式，以中心点起始，分8个方向，进针距离为1cm，采用退针法注射，每个方向各注射0.125ml。甲组的裸鼠注射步骤3中的A组脂肪移植物，乙组注射B组脂肪移植物，丙组注射C组脂肪移植物；
S3.3、裸鼠移植后的脂肪获取与称重与分析
脂肪移植后12周，所有的裸鼠各腹腔注射400ul 1%戊巴比妥钠处死，而后每只裸鼠解剖获取两个移植部位的全部脂肪组织，进行称重并记录，记录结果如下：
将三组的脂肪重量均值进行比较分析，结果如说明书附图1中所示，甲组的脂肪重量均值为1.45g，乙组，丙组分别为1.11g与0.52g，经过12周后，甲组留存的脂肪组织重量明显高于乙组与丙组，表明采用添加有血管内皮祖细胞的脂肪移植，能够有效提升脂肪移植后脂肪细胞的存活率，该实验结果也从另一方面表明，移植脂肪细胞长期存活的关键因素是如何有效促进脂肪组织内部营养供给通道即血管系统建立是提升脂肪移植成功率的关键因素。
最后针对本发明应当指出说明的是，本发明仅仅是给出了一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其主要目的是要保护这种制备方法中所包含的提升脂肪移植成功率的脂肪移植物制备工艺。以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、血管内皮祖细胞的分离培养：
S1.1、PRP与单核细胞分离：采用BD Vacutainer CPT 采血管（BD 362761），取血液，然后分离出PRP（高浓度血小板血浆）和单核细胞白膜层，将PRP冻存于-20°C的环境下备用，而后，将单核细胞白膜层转移到离心管中，用PBS（PH 7.4）洗涤（500g 5分钟），收集单核细胞；
S1.2、纤维连接蛋白包被的制取：取纤维连接蛋白，PBS重悬（PH 7.4），加入T25细胞培养瓶中，在37 ℃的环境下平放，倒出液体，并用PBS清洗，备用；
S1.3、血管内皮祖细胞培养：将单核细胞重悬于内皮细胞培养基（Lonza EGM-2-MVBulletKit，lonza CC-3202），接种于预先包被好纤维连接蛋白的T25 细胞培养瓶中，置于37 ℃的环境下，体积分数5%CO2培养箱中培养，3天后换液除去未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，以后每3天换液1次，待细胞融合后传代培养，将单核细胞贴壁培养的细胞标记为P0代细胞，第一次传代培养的细胞标记为P1代，依次类推；
S1.4、血管内皮祖细胞表面抗原标记分析：P4代人血管内皮祖细胞经胰酶消化后用内皮细胞培养基终止消化，离心（500g 5分钟），细胞经PBS（PH 7.4）洗涤后，取细胞在4℃环境下与荧光标记单克隆抗体CD31-PE、CD144-FITC孵育，以同种型免疫球蛋白作为对照以FACSCalibur型流式细胞仪进行流式细胞仪分析；
S 1.5、血管内皮祖细胞的收获：将P4代的血管内皮祖细胞全部用胰酶消化，洗涤后用解冻后的PRP将其重悬备用，经用血球计数板进行细胞计数培养至P4代收获血管内皮组细胞；
S2、移植用脂肪细胞的分离：当血管内皮祖细胞培养到P4代后，取脂肪组织，采用添加庆大霉素的生理盐水（10ng/ml）反复冲洗，而后采用1200g离心3分钟，分成三层，弃去油脂层与水层，收集中间的细胞层；
S3、联合自体血管内皮细胞的脂肪移植物的制备：将上述S2步骤中获得的脂肪组织分成均等三份，一份加入S1.5步骤制备的血管内皮祖细胞混匀（A组），一份加入PRP混匀（B组），一份加入生理盐水混匀（C组），A组即为联合体外培养自体血管内皮祖细胞的自体脂肪移植填充物。
2.根据权利要求1所述的一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其特征在于，进一步的，上述S1.1中，采用BD Vacutainer CPT 采血管（BD 362761），分6管共取血液48ml，然后分别分离出PRP（高浓度血小板血浆）和单核细胞白膜层，PRP共获取40ml，冻存于-20°C的环境下备用，而后，将单核细胞白膜层转移到两支50ml的离心管中，分别用50ml的PBS（PH 7.4）洗涤两次（500g 5分钟），收集单核细胞。
3.根据权利要求1所述的一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其特征在于，进一步的，上述S1.2中，取200ug纤维连接蛋白，1mlPBS重悬（PH 7.4），加入T25细胞培养瓶中，在37 ℃的环境下平放2小时，倒出液体，并用PBS清洗两遍，备用。
4.根据权利要求1所述的一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其特征在于，进一步的，上述S1.3中，将单核细胞重悬于内皮细胞培养基（Lonza EGM-2-MVBulletKit，lonza CC-3202），以1×106/ml细胞密度接种5ml于预先包被好纤维连接蛋白的T25 细胞培养瓶中，置于37 ℃的环境下，体积分数5%CO2培养箱中培养，3天后换液除去未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，以后每3天换液1次，待细胞80%左右融合后以1∶3比例传代培养，将单核细胞贴壁培养的细胞标记为P0代细胞，第一次传代培养的细胞标记为P1代，依次类推。
5.根据权利要求1所述的一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其特征在于，进一步的，上述S1.4中，P4代人血管内皮祖细胞经0.25%胰酶消化3（分钟后，用2ml的内皮细胞培养基终止消化，离心（500g 5分钟），细胞经PBS（PH 7.4）洗涤两次后，取4×106个细胞，细胞在4℃环境下与荧光标记单克隆抗体CD31-PE、CD144-FITC孵育30 分钟，以同种型免疫球蛋白作为对照以FACSCalibur型流式细胞仪进行流式细胞仪分析。
6.根据权利要求1所述的一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其特征在于，进一步的，上述S1.5中，将P4代的血管内皮祖细胞全部用胰酶消化，洗涤后用解冻后的PRP20ml将其重悬备用，经用血球计数板进行细胞计数培养至P4代共收获5*107的血管内皮组细胞。
7.根据权利要求1所述的一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其特征在于，进一步的，上述S2中，当血管内皮祖细胞培养到P4代后，取200ml的脂肪组织，取到的脂肪组织采用200ml添加庆大霉素的生理盐水（10ng/ml）反复冲洗3遍，而后采用1200g离心3分钟，分成三层，弃去油脂层与水层，收集细胞层。
8.根据权利要求1所述的一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法，其特征在于，进一步的，上述S3中，将上述S2步骤中获得的脂肪组织分成均等三份，一份加入1.5步骤制备的血管内皮祖细胞混匀（A组），一份加入20ml的PRP混匀（B组），一份加入20ml的生理盐水混匀（C组），A组即为联合体外培养自体血管内皮祖细胞的自体脂肪移植填充物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910523336.9A CN110229785A (zh) | 2019-06-17 | 2019-06-17 | 一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910523336.9A CN110229785A (zh) | 2019-06-17 | 2019-06-17 | 一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110229785A true CN110229785A (zh) | 2019-09-13 |
Family
ID=67859965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910523336.9A Pending CN110229785A (zh) | 2019-06-17 | 2019-06-17 | 一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110229785A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116474172A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-07-25 | 广州市麦施缔医疗科技有限公司 | 表皮干细胞与脂肪混合注射方法和隆胸及丰臀再生方法 |
| CN117018295A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-11-10 | 苏州邦伊医疗科技有限公司 | 一种成活率高的自体脂肪移植方法 |
| CN117018295B (zh) * | 2023-08-25 | 2024-06-07 | 苏州邦伊医疗科技有限公司 | 一种成活率高的自体脂肪移植方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011104707A1 (en) * | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Remedor Biomed Ltd. | Methods and compositions for enhancing fat graft survival |
| CN104622772A (zh) * | 2015-01-13 | 2015-05-20 | 陈镇洲 | 一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品 |
| WO2015071829A1 (en) * | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Stempeutics Research Private Limited | A system and method for processing of biological tissue samples |
| CN106421910A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-02-22 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 脂肪组织制剂及其制备方法与应用 |
-
2019
- 2019-06-17 CN CN201910523336.9A patent/CN110229785A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011104707A1 (en) * | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Remedor Biomed Ltd. | Methods and compositions for enhancing fat graft survival |
| WO2015071829A1 (en) * | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Stempeutics Research Private Limited | A system and method for processing of biological tissue samples |
| CN104622772A (zh) * | 2015-01-13 | 2015-05-20 | 陈镇洲 | 一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品 |
| CN106421910A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-02-22 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 脂肪组织制剂及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 易成刚等: "血管内皮祖细胞促进游离移植脂肪颗粒组织存活的实验", 《中华医学美学美容杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116474172A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-07-25 | 广州市麦施缔医疗科技有限公司 | 表皮干细胞与脂肪混合注射方法和隆胸及丰臀再生方法 |
| CN117018295A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-11-10 | 苏州邦伊医疗科技有限公司 | 一种成活率高的自体脂肪移植方法 |
| CN117018295B (zh) * | 2023-08-25 | 2024-06-07 | 苏州邦伊医疗科技有限公司 | 一种成活率高的自体脂肪移植方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mansilla et al. | Human mesenchymal stem cells are tolerized by mice and improve skin and spinal cord injuries | |
| CN101755046B (zh) | 采用间充质干细胞制备真皮乳头组织的方法 | |
| Saxena et al. | Vascularized three‐dimensional skeletal muscle tissue‐engineering | |
| KR102426746B1 (ko) | 모낭 줄기 세포의 3d 오가노이드 시스템을 이용하여 모발을 재생시키기 위한 방법 및 시스템 | |
| CN104651300A (zh) | 一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用 | |
| CN105970300A (zh) | 一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法 | |
| CN105820998A (zh) | 临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法 | |
| CN104988110A (zh) | 脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法 | |
| CN102643784A (zh) | 一种造血干/祖细胞的体外扩增体系 | |
| CN106282100A (zh) | 一种纯化牛胎儿骨骼肌组织来源前体脂肪细胞的方法 | |
| CN114107173A (zh) | 一种血管化胰岛微器官及其构建方法 | |
| CN104490727B (zh) | 一种干细胞与玻尿酸的组合物与应用 | |
| CN107287156A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用 | |
| CN110229785A (zh) | 一种利用血管内皮祖细胞提升脂肪移植成功率的方法 | |
| CN105062953A (zh) | 三维诱导间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法 | |
| CN103421740B (zh) | 一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法 | |
| JP6482036B2 (ja) | 人工組織及びその製造方法 | |
| CN117398481A (zh) | 一种基于乳腺癌类器官及类器官移植瘤小鼠模型的药物筛选方法 | |
| CN104622772A (zh) | 一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品 | |
| CN101525596A (zh) | 一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法 | |
| CN107142243A (zh) | 一种增强人脐带间充质干细胞旁分泌能力的培养方法 | |
| WO2023058429A1 (ja) | 毛髪再生能を有する細胞凝集塊の製造方法及びこれに関連する方法 | |
| CN105326864A (zh) | 一种治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂及其制备方法 | |
| CN108865991A (zh) | 一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺 | |
| CN102399741A (zh) | 逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190913 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |