CN110628698B - 一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将非悬浮BHK‑21细胞系驯化为悬浮BHK‑21‑S细胞系；(2)使用步骤(1)得到的悬浮BHK‑21‑S细胞系培养制备塞内卡病毒。本发明通过采用驯化得到的悬浮BHK‑21‑S细胞系进行塞内卡病毒的培养，有效提高了所得病毒的产能，为规模化大量生产塞内卡疫苗奠定了基础。

Description

一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法，特别涉及一种利用悬浮培养传代细胞系制备塞内卡病毒的方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)，也称塞内卡病毒(Seneca valley virus,SVV)，是全球新发和新传入我国的病毒，是小RNA病毒科新增的塞内卡病毒属的唯一成员，临床症状与口蹄疫难以区分。2014年之前，SVA仅在美国和加拿大零星发生，但自2015年以来，巴西、美国、泰国、中国等陆续出现SVA疫情，并不断蔓延，危害加重。自从2015年SVA传入我国以来，先后在广东、湖北、黑龙江、福建、广西、河南、河北、山东、辽宁、安徽、浙江、江西、四川和陕西等多省发生疫情，不断流行和蔓延，致病性增强，危害加重，且严重干扰口蹄疫防控。因其暂没有商品化的疫苗，一旦发生SVA疫情，很难进行有效的控制，成为全球急需解决的难题。
发明内容
本发明提供了一种利用悬浮培养传代细胞系制备塞内卡病毒的方法。采用该方法制备塞内卡病毒实现了悬浮培养塞内卡病毒和产业化生产塞内卡疫苗的技术突破，采用该方法培养塞内卡病毒有效提高了所得病毒的产能、病毒滴度和质量稳定均一性，减少了批次间差异，为加速规模化生产悬浮制备塞内卡疫苗奠定了基础。
在一个方面，本发明提供了一种使用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法，其中所述方法包括如下步骤：
(1)将非悬浮BHK-21细胞系驯化为悬浮BHK-21-S细胞系；
(2)使用步骤(1)得到的所述悬浮BHK-21-S细胞系制备塞内卡病毒。
在某些实施方式中，“非悬浮BHK-21细胞系”指的是贴壁BHK-21细胞系。在某些实施方式中，所述非悬浮BHK-21细胞系可以通过市售购得。在某些实施方式中，所述非悬浮BHK-21细胞系购自美国模式培养物集存库(ATCC)，ATCC编号为CCL-10。
本发明所述的塞内卡病毒可以是从田间分离纯化获得的塞内卡病毒，也可以是通过基因工程方法获得的重组塞内卡病毒株，还可以是其它表达系统(工程菌、昆虫、植物)制备的类病毒颗粒、重组抗原。本领域技术人员可以通过本领域公知的基因工程方法获得重组塞内卡病毒株或者塞内卡病毒片段，参见，例如，http://www.science.gov/topicpages/v/virus+vaccine+development.html中所描述的。
在某些实施方式中，本发明所述的塞内卡病毒为塞内卡病毒SVV/FJ/001株，其微生物保藏号为：CCTCC NO:V201802。在某些实施方式中，本发明所述的塞内卡病毒选自下组：SVV CH-HN株、SVV CH-HNSL株、SVV CH-GD株、SVV CH-01-2015株、SVV CH-04-2015株、SVV CH-DB-11-2015株、SVV CH-DL-01-2016株、SVV CH-ZW-01-2016株、SVV HB-CH-2016株、SVV KS15-01株、SVV-001株和SVV Colombia/2016株。
在某些实施方式中，所述步骤(1)中的驯化包括如下步骤：
(a)将所述非悬浮BHK-21细胞系与含有第一浓度胎牛血清的MEM培养基一起进行培养直至长满培养容器；
(b)将步骤(a)中得到的细胞传代培养，然后用胰蛋白酶消化，得到的细胞用低血清悬浮培养基和含有第二浓度胎牛血清的MEM培养基混合稀释至细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml，在培养瓶中培养2～5代；
(c)将步骤(b)中得到的悬浮细胞用低血清培养基传代培养2～5代。
在某些实施方式中，步骤(a)中所述的第一浓度的胎牛血清(FBS)为5％～15％胎牛血清，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值浓度的胎牛血清。在某些实施方式中，步骤(a)中所述的第一浓度的胎牛血清为10％胎牛血清。
在某些实施方式中，步骤(a)中所述的非悬浮BHK-21细胞系在进行培养之前先进行消化，然后转移至离心管离心后弃上清。在某些实施方式中，离心转速为1000rpm～2000rpm，例如1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm、1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000rpm或以上任意两个数值范围之间的任意数值。
在某些实施方式中，步骤(a)中所述的培养容器为培养瓶，例如Corning T25培养瓶。在某些实施方式中，步骤(a)中的培养温度为35～37℃，例如，35℃、36℃、37℃或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，步骤(a)中的培养温度为37℃。在某些实施方式中，步骤(a)中所述培养箱的CO2浓度为5％～10％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，步骤(a)中所述培养箱的CO2浓度为5％。
在某些实施方式中，步骤(b)中所述的胰蛋白酶是胰蛋白酶-EDTA(0.25％)、胰蛋白酶-EDTA(0.05％)、0.25％胰蛋白酶等。在某些实施方式中，步骤(b)中所述的胰蛋白酶是可以通过市售购得的，例如购自Gibco、Hyclone、Sigma等。在某些实施方式中，步骤(b)中所述的低血清悬浮培养基是可以通过市售购得的，例如购自甘肃健顺生物科技有限公司、无锡市赛尔百灵生物技术有限公司、Gibco、常州艾米能斯生物科技有限公司等。
在某些实施方式中，步骤(b)中所述的第二浓度的胎牛血清为3％～10％胎牛血清，例如3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值浓度的胎牛血清。在某些实施方式中，步骤(b)中所述的第二浓度的胎牛血清为5％胎牛血清。在某些实施方式中，所述第二浓度小于所述第一浓度。
在某些实施方式中，步骤(b)中的培养温度为35～37℃，例如，35℃、36℃、37℃或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，培养转速为100～150rpm，例如100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，培养转速为100～110rpm。在某些实施方式中，pH值为6.9～7.1，例如6.9、7.0、7.1或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，CO2浓度为5％～10％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，CO2浓度为5％。
在某些实施方式中，所述低血清悬浮培养基和所述含有第二浓度胎牛血清的MEM培养基的混合体积比例为1:1～1:2，例如混合比例为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。
在某些实施方式中，在步骤(b)之后、步骤(c)之前进一步用低血清悬浮培养基和含有第三浓度胎牛血清的MEM培养基混合稀释步骤(b)中得到的悬浮细胞，使得初始细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml，在培养瓶中培养2～5代，其中所述第三浓度小于所述第二浓度。在某些实施方式中，所述第三浓度的胎牛血清为1％～5％胎牛血清，例如1％、2％、3％、4％、5％或以上任意两个数值范围之间的任意数值浓度的胎牛血清。在某些实施方式中，所述的第三浓度的胎牛血清为3％胎牛血清。在某些实施方式中，该步骤中的培养温度为35～37℃，例如，35℃、36℃、37℃或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，培养转速为100～150rpm，例如100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，培养转速为100～110rpm。在某些实施方式中，CO2浓度为5％～10％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，CO2浓度为5％。
在某些实施方式中，所述步骤(2)中的制备包括如下步骤：待细胞密度生长至3.0～3.5×106cell/ml后，调节细胞液的pH值，接种塞内卡病毒，待细胞活率低于20％后，收获病毒。
在某些实施方式中，步骤(2)中的悬浮BHK-21-S细胞系的培养温度为35～37℃，例如，35℃、36℃、37℃或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，培养转速为100～150rpm，例如100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，培养转速为100～110rpm。在某些实施方式中，CO2浓度为5％～10％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，CO2浓度为5％。
在某些实施方式中，步骤(2)中将待接毒的细胞液的pH值调至7.4～7.8，例如7.4、7.5、7.6、7.7、7.8或者以上任意两个数值范围之间的任意数值，然后按体积比0.5～1％的接毒剂量接种塞内卡病毒。
在某些实施方式中，可以使用各种碱性试剂调节待接毒的细胞液的pH值，例如NaOH溶液、KOH溶液、氨水溶液、NaHCO3溶液、Na2CO3溶液。在某些实施方式中，使用NaHCO3溶液调节待接毒的细胞液的pH值。在某些实施方式中，NaHCO3溶液的浓度为0.5％～2％(w/v)，例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％(w/v)或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，NaHCO3溶液的浓度为0.8％(w/v)。
在某些实施方式中，本发明所述方法的步骤(1)中的具体驯化步骤如下：
1、从液氮罐中取出保存的贴壁BHK-21[C-13]细胞1支，并迅速置于37℃水浴锅中进行融化，然后转移至15ml离心管并加5～10ml培养基，1000rpm，离心5min后弃上清，细胞沉淀用10ml含10％FBS MEM的完全培养基反复轻轻吹打均匀后，置于Corning T25培养瓶中并放置于37℃，含5％CO2的培养箱中进行培养；
2、待细胞长满后传代至Corning T75培养瓶中放大培养，待细胞瓶长满后用0.25％EDTA-胰蛋白酶消化，离心得到的细胞用低血清悬浮培养基和含5％胎牛血清的MEM培养基1:1混合稀释至细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml，在Coring 125透气三角摇瓶中培养2～3代，培养温度为35～37℃、培养转速为100～150rpm、CO2浓度为5％，培养摇床优选阿道夫科耐ISF1-X型箱式温控摇床；
3、为了进一步使细胞完全失去粘附瓶壁的能力及减少细胞间的结团，用低血清培养基和含3％胎牛血清的MEM培养基1:1混合稀释至细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml培养2～3代，培养条件同2；
4、用低血清培养基传代，初始细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml，培养3～5代后细胞活率维持在97％以上，说明得到性能稳定的低血清悬浮培养的细胞株；进一步地，为了消除低血清培养基中血清对后续病毒培养的影响，同时为产业化生产降低成本，筛选多种无血清培养基培养BHK-21-S细胞，优选常州艾米能斯生物科技有限公司培养基，细胞培养初始密度为1.0～1.5×106cell/ml，72h细胞密度达到6.0～8.0×106cell/ml，培养温度为35～37℃、培养转速为100～150rpm、CO2浓度为5％，培养摇床优选阿道夫科耐ISF1-X型箱式温控摇床。
在某些实施方式中，本发明所述方法的步骤(2)中的具体制备步骤如下：
1、待悬浮BHK-21-S细胞密度生长至3.0～3.5×106cell/ml后，细胞活率＞97％，用0.8％(w/v)NaHCO3将细胞液的pH值调至7.4～7.6，同时补加TPCK胰酶(sigma公司货号：9002-07-7)，补加量为4mg/L，按体积比2～4％的接毒剂量接塞内卡病毒。
2、培养温度为35～37℃、培养转速为100～150rpm、CO2浓度为5％、培养摇床优选阿道夫科耐ISF1-X型箱式温控摇床。待细胞活率＜20％～30％后，收获病毒收获病毒按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行纯净检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。并测定病毒的TCID50，1ml病毒的滴度≥106.5TCID50后分装冻存，完成塞内卡病毒的培养。
在另一方面，本发明提供了根据本发明所述的方法制备得到的塞内卡病毒。
本发明具有如下积极效果：
1、本发明前期利用分离的塞内卡流行毒株，初步建立了攻毒模型，完成了疫苗种毒筛选和驯化，并利用非悬浮培养收获的病毒研制出抗体应答强、免疫保护力高的灭活疫苗，为防控塞内卡病毒提供了有力保障；
2、本发明通过从非悬浮BHK-21细胞系驯化得到悬浮BHK-21-S细胞系，单位体积内细胞密度显著提高，进行塞内卡病毒培养所得病毒的滴度高、产能显著提高；
3、通过悬浮培养所得塞内卡病毒各批间质量差异小，解决了塞内卡病毒悬浮工业化生产的瓶颈问题，大大的节约了生产成本，同时培养环境可控，生产工艺简便易操作，具有极高的应用前景和经济效益。
附图说明
图1显示了实施例1中贴壁BHK-21细胞系和感染塞内卡病毒后引起的细胞病变效应(CPE)，其中图1中的A表示正常贴壁BHK-21细胞；图1中的B表示出现CPE的BHK-21细胞。
图2显示了实施例1中悬浮BHK-21-S细胞系和感染塞内卡病毒后的悬浮BHK-21-S细胞，其中图2中的A表示悬浮培养48h的BHK-21-S细胞系；图2中的B表示感染塞内卡病毒后的悬浮BHK-21-S细胞系。
图3显示了实施例1中悬浮BHK-21-S细胞系的一步生长曲线。
图4显示了不同细胞系接种SVV/FJ/001株、SVV-HN株和SVV-GD株之后的病毒滴度。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行进一步的详细描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1非悬浮BHK-21细胞系的驯化
本实施例中所用材料：贴壁BHK-21细胞系，ATCC编号为：CCL-10；基础培养基：Gibco MEM basic，无血清培养基：常州艾米能斯生物科技有限公司；病毒：塞内卡病毒FJ/001株(SVV/FJ/001株)，为本实验室分离保藏，其微生物保藏号为：CCTCC NO:V201802。
首先将贴壁BHK-21细胞系驯化为悬浮BHK-21-S细胞系，具体步骤如下：
1、从液氮罐中取出保存的非悬浮BHK-21[C-13]细胞株1支，并迅速置于37℃水浴锅中进行融化，然后转移至15ml离心管并加入5～10ml 10％FBS MEM培养基，1000rpm，离心5min后弃上清，细胞沉淀用10ml含10％FBS MEM的完全培养基轻轻反复吹打均匀后，置于Corning T25培养瓶中并放置于37℃，含5％CO2的培养箱中进行培养；
2、待细胞长满后，传代至Corning T75培养瓶中放大培养，待细胞瓶长满后用0.25％EDTA-胰蛋白酶消化，离心得到的细胞用低血清悬浮培养基和含5％胎牛血清的MEM培养基1:1混合稀释至细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml，在Coring 125透气三角摇瓶中置40ml培养2～3代，培养温度为35～37℃，培养转速为100～150rpm，CO2浓度为5％，培养摇床优选阿道夫科耐ISF1-X型箱式温控摇床；
3、为了进一步使细胞完全失去粘附瓶壁的能力及减少细胞间的结团，用低血清悬浮培养基与含3％胎牛血清的MEM完全培养基1:1混合稀释上述悬浮细胞，初始细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml培养2～3代，培养条件同2；
4、用低血清培养基传代，初始细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml，培养3～5代后细胞活率维持在97％以上，说明得到了性能稳定的低血清悬浮培养的悬浮BHK-21-S细胞系；
5、按照上述驯化方法，本实验室已经对BHK-21细胞、PK-15细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞和293T细胞等实现了悬浮驯化。
实施例2悬浮培养BHK-21-S细胞培养条件的确定
2.1悬浮培养摇床转速确定
悬浮BHK-21-S细胞系的初始密度为0.5×106cell/ml，在温度为37℃、pH为7.0时，摇床转速分别设定为90r/min、100r/min、110r/min和120r/min，观察不同摇床转速对该细胞系的倍增时间及生长状态的影响。结果显示摇床转速为100～110r/min时细胞生长最快(表1)。
表1不同摇床转速下细胞生长倍增时间
Figure BDA0002221396060000081
2.2培养pH的确定
悬浮BHK-21-S细胞系的初始密度为0.5×106cell/ml，在温度为37℃、摇床转速为100r/min条件下，pH分别设定为6.8、6.9、7.0、7.1和7.2，观察不同pH值对该细胞系的倍增时间及生长状态的影响。结果显示pH为6.9～7.1时细胞生长最优(表2)。
表2不同pH值下细胞生长状态
Figure BDA0002221396060000082
Figure BDA0002221396060000091
最后确定悬浮BHK-21-S细胞系的培养条件为温度35～37℃、培养转速为100～110rpm、pH为6.9～7.1、CO2浓度为5％，培养摇床优选阿道夫科耐ISF1-X型箱式温控摇床。在此条件下悬浮BHK-21-S细胞系的一步生长曲线如图3所示。
实施例3悬浮BHK-21-S细胞系无血清培养基的确定
为了消除低血清培养基中血清对后续病毒培养的影响，同时为产业化生产降低成本，本发明筛选了多种无血清培养基来培养悬浮BHK-21-S细胞系。培养基筛选比对如下。
Figure BDA0002221396060000092
最后优选常州艾米能斯生物科技有限公司的培养基，细胞培养初始密度为0.8～1.5×106cell/ml，72h细胞密度达到7.0×106cell/ml，培养温度为35～37℃，培养转速为100～110rpm，CO2浓度为5％，培养摇床优选阿道夫科耐ISF1-X型箱式温控摇床。
实施例4使用悬浮BHK-21-S细胞系制备塞内卡病毒
本实施例中所用材料：无血清培养基：购自常州艾米能斯生物科技有限公司；病毒：塞内卡病毒为FJ/001株(SVV/FJ/001株)，为本实验室分离保藏，其微生物保藏号为：CCTCC N0:V201802；TPCK胰酶Trypsin from bovine pancreas，购自sigma公司，货号：9002-07-7；透气三角摇瓶：Corning 125ml。
4.1最适接毒pH的确定
待悬浮BHK-21-S细胞系密度生长至3.0～3.5×106cell/ml后，细胞活率＞97％，用0.8％NaHCO3将细胞液的pH值调至7.4、7.6、7.8和8.0，同时补加TPCK胰蛋白酶，补加量为4mg/L，按体积比1％的接毒剂量接塞内卡病毒。培养温度为35～37℃、培养转速为100rpm、CO2浓度为5％、培养摇床优选阿道夫科耐ISF1-X型箱式温控摇床。待细胞活率＜20％～30％后，收获病毒并测定病毒的TCID50。测定方法如下所述：
按照常规方法对贴壁BHK-21细胞系进行消化，加入含10％胎牛血清的MEM细胞培养基，分散于12孔板中，于37℃含有5％CO2的培养箱中培养，待细胞单层长到90％时备用。用MEM以10倍倍比稀释病毒液，将各稀释度(10-4.0～10-9.0)的病毒液分别加入细胞板中，每个稀释度4孔，放入37℃含有5％CO2的培养箱中进行培养，观察3天，用Reed-Muench氏法测定对贴壁BHK-21细胞系的半数感染量(TCID50)。按照该法测定塞内卡病毒的滴度。Reed-Muench计算方法是本领域的已有技术，现有文献“Reed,L.J.and Muench,H.(1938)."ASimple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints".The American Journal ofHygiene 27:493-497”中对此已经进行了详细地描述，该文献在此通过引用方式并入本申请用作参考。
结果显示pH为7.6～7.8时毒价最高(表4)。
表4不同pH下接毒收获病毒的TCID50
Figure BDA0002221396060000101
4.2最适接毒剂量的确定
待悬浮BHK-21-S细胞系密度生长至3.0～3.5×106cell/ml后，细胞活率＞98％，用0.8％NaHCO3将细胞液的pH值调至7.8，同时补加TPCK胰蛋白酶，补加量为4mg/L，按体积比0.1％、0.5％、1％、1.5％和2％的接毒剂量接塞内卡病毒。培养温度为37℃、培养转速为120rpm、CO2浓度为5％、培养摇床优选阿道夫科耐ISF1-X型箱式温控摇床。待细胞活率＜20％～30％后，收获病毒并测定病毒的TCID50。测定方法如上所述：结果显示接毒剂量为0.5％～1％时TCID50最高(表5)。
表5不同接毒剂量下接毒收获病毒的TCID50
Figure BDA0002221396060000102
Figure BDA0002221396060000111
实施例5悬浮培养塞内卡病毒细胞系的确定
为了优选一种适合塞内卡病毒悬浮培养的细胞系，用本实验室驯化得到的悬浮BHK-21-S细胞系、悬浮PK-15细胞系、悬浮SK-RST细胞系、悬浮IBRS-2细胞系、悬浮H1299细胞系和悬浮293T细胞系对病毒进行适应筛选。待悬浮的上述细胞系密度生长至3.0～3.5×106cell/ml后，细胞活率＞95％，用0.8％NaHCO3将细胞液的pH值调至7.8，同时补加TPCK胰蛋白酶(sigma公司货号：9002-07-7)，补加量为4mg/L，按体积比1％的接毒剂量分别接种塞内卡病毒福建株(SVV/FJ/001株)、塞内卡病毒河南株(SVV-HN株)和塞内卡病毒广东株(SVV-GD株)。收获病毒并测定病毒的TCID50，结果显示SVV/FJ/001株、SVV-HN株和SVV-GD株在悬浮BHK-21-S细胞系接毒适应后产毒均最高(如图4所示)，说明经驯化得到的悬浮BHK-21-S细胞系在优化细胞培养条件及优化病毒培养条件后，能够获得较高滴度的塞内卡病毒。
上述实施例仅示例性说明本发明的优选实施例，而非用于限制本发明。任何熟悉相关技术的人员皆可在不违背本发明的范畴下，对上述实施例进行修改。因此，所属技术领域中具有通常知识技术人员在未脱离本发明所揭示的技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (15)

1.一种使用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将非悬浮BHK-21细胞系驯化为悬浮BHK-21-S细胞系；
所述步骤(1)中的驯化包括如下步骤：
(a)将所述非悬浮BHK-21细胞系与含有第一浓度胎牛血清的MEM培养基一起进行培养直至长满培养容器，所述第一浓度胎牛血清为5％～15％胎牛血清；
(b)将步骤(a)中得到的细胞传代培养，然后用胰蛋白酶消化，得到的细胞用低血清悬浮培养基和含有第二浓度胎牛血清的MEM培养基混合稀释至细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml，在培养容器中培养2～5代；所述第二浓度胎牛血清为3％～10％胎牛血清，并且所述第二浓度小于所述第一浓度；
(c)将步骤(b)中得到的悬浮细胞用低血清培养基传代培养2～5代；
在步骤(b)之后、步骤(c)之前进一步用低血清悬浮培养基和含有第三浓度胎牛血清的MEM培养基混合稀释步骤(b)中得到的悬浮细胞，使得初始细胞密度为0.5～1.0×106cell/ml，在培养瓶中培养2～5代，其中所述第三浓度小于所述第二浓度；
(2)使用步骤(1)得到的所述悬浮BHK-21-S细胞系制备塞内卡病毒；
所述步骤(2)中的制备包括如下步骤：待细胞密度生长至3.0～3.5×106cell/ml后，调节细胞液的pH值至7.4～7.8，然后按体积比0.5～1％的接毒剂量接种塞内卡病毒，待细胞活率低于20％后，收获病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非悬浮BHK-21细胞系购自美国模式培养物集存库(ATCC)，ATCC编号为CCL-10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述塞内卡病毒为塞内卡病毒SVV/FJ/001株，其微生物保藏号为：CCTCC NO:V201802。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述塞内卡病毒选自下组：SVV CH-HN株、SVV CH-HNSL株、SVV CH-GD株、SVV CH-01-2015株、SVV CH-04-2015株、SVV CH-DB-11-2015株、SVV CH-DL-01-2016株、SVV CH-ZW-01-2016株、SVV HB-CH-2016株、SVV KS15-01株、SVV-001株和SVV Colombia/2016株。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一浓度的胎牛血清为10％胎牛血清，所述第二浓度的胎牛血清为5％胎牛血清。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的培养温度为35～37℃，培养转速为100～150rpm，pH为6.9～7.1，CO2浓度为5％～10％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低血清悬浮培养基和所述含有第二浓度胎牛血清的MEM培养基的混合比例为1:1～1:2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第三浓度的胎牛血清为1％～5％胎牛血清。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的第三浓度的胎牛血清为3％胎牛血清。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养温度为35～37℃，培养转速为100～150rpm，pH为6.9～7.1，CO2浓度为5％～10％。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述悬浮BHK-21-S细胞系的培养温度为35～37℃，培养转速为100～150rpm，CO2浓度为5％～10％。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用NaHCO3溶液调节待接毒的细胞液的pH值。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述NaHCO3溶液的浓度为0.5％～2％(w/v)。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述NaHCO3溶液的浓度为0.8％(w/v)。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法制备得到的塞内卡病毒。
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