CN113637635B - 微载体细胞培养体系中微载体聚团状态的解散方法 - Google Patents

微载体细胞培养体系中微载体聚团状态的解散方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微载体细胞培养体系中微载体聚团状态的解散方法。该方法包括向微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中加入细胞消化液，进行酶解反应，反应结束后加入培养基和微载体，解除微载体聚团状态；所述细胞消化液为TrypLE™ Express或Trypzyme®重组胰蛋白酶。通过该方法解散微载体聚团，细胞传代后的微载体聚团现象明显降低，细胞生长速度和细胞活性无明显变化。

Description

微载体细胞培养体系中微载体聚团状态的解散方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种微载体细胞培养体系中微载体聚团状态的解散方法。
背景技术
动物细胞的大规模工业化培养技术对于生物制药、疫苗生产、细胞治疗等生物行业至关重要。传统的二维细胞培养方法难以实现工业化细胞生产需求。微载体细胞培养技术使大规模工业化生产动物细胞的过程成为可能。在整个大规模培养过程中，细胞球转球是放大培养的关键。北京华龛生物科技有限公司根据市场需求，研发出可降解的三维微载体聚集体（CN201910079680.3，商品名为3D TableTrix微载片）。目前细胞传代常用的胰蛋白酶对3D TableTrix系列微载体有损伤，胰酶的加入会导致微载体结构逐渐破坏最后崩解，不能用于球转球传代。但是不经过消化直接进行球转球技术则会使得微载体伴随细胞增殖出现粘连并逐渐进入聚集状态。微载体聚集会阻断聚团中心的细胞获得足够养分进而影响细胞质量和数量，并且一旦细胞聚团就无法通过简单地调整细胞接种密度和反应器搅拌速度将聚团打开，影响后续的连续传代。因此在使用微载体扩增细胞过程中，开发一种不损伤3D TableTrix微载片（即微载体聚集体）的情况下，能够打开长满细胞且连接聚团的微载体，并将细胞从载体上解离下来，进而实现均匀的球转球技术非常必要。
发明内容
本发明提供了一种微载体细胞培养体系中微载体聚团状态的解散方法，包括向微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中加入细胞消化液，进行酶解反应，反应结束后加入培养基和微载体，解除微载体聚团状态。所述细胞消化液为TrypLE™ Express或Trypzyme®重组胰蛋白酶。
可选地，根据上述解散方法，所述细胞消化液为赛默飞世尔科技（中国）有限公司的TrypLE™ Express、货号为12604013的产品，所述微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中培养基与所述细胞消化液体积比例为1:1-1:2，例如为1:1。或所述细胞消化液为上海源培生物科技有限公司的Trypzyme®重组胰蛋白酶消化液，货号为S342JV，在所述微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中的体积百分比浓度为33.3%-100%。
微载体聚团可指出现3个以上微载体粘连在一起，且采用简单物理方法（例如，移液枪吹打、提高搅拌速度）无法分开。
可选地，根据上述解散方法，所述微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中，所培养的细胞密度为1-4×106细胞/ml。
可选地，根据上述解散方法，加入细胞消化液时，还包括采用反应器搅拌所述微载体细胞培养体系和加入的细胞消化液，搅拌程序为45rpm/min，所述搅拌时间为10-60min。
反应器的具体货号可为：3D FloTrix® 系列生物反应器。
可选地，根据上述解散方法，所述消化液体积（ml）与加入的所述微载体的重量（mg）比例为1：2.5-1：20，例如1：5、1：10、1:15。
可选地，根据上述解散方法，所述微载体为蛋白类多孔微载体，例如3D TableTrix® 微载片。
可选地，根据上述解散方法，在加入细胞消化液之前还包括静置所述微载体细胞培养体系以使所述微载体细胞培养体系分层，去除分层后的上清液。
可选地，根据上述解散方法，所述细胞为脐带间充质干细胞或Vero细胞。
可选地，根据上述解散方法，所述微载体细胞培养体系包括培养基、微载体和所培养的细胞。所述包含培养细胞的所述微载体的培养体系具体可为微组织，所述微组织可为采用所述微载体和培养基培养细胞所获得的。
培养基例如可为3D FloTrix® 三维细胞培养基（货号RMZ010-GY）或包含M199培养基（货号L640KJ）和优级胎牛血清（货号085-150）的培养基。微载体例如可为3DTableTrix® 微载片（货号F01-100）。
上述的解散方法在培养细胞中的应用也属于本发明的保护范围之内。
本发明实施例提供的微载体聚团状态的解散方法，针对可降解的3D TableTrix微载片，在细胞球转球连续传代过程中分散微载体聚团实现细胞高质量扩增。
本发明通过使用市售细胞消化液，在使用微载体悬浮培养细胞发生微载体聚集时，在培养体系中添加特定细胞消化液，从而解散微载体聚集，提供了一种连续动态3D培养时提高细胞质量，延长培养时间的方法。
通过本发明提供的微载体聚团状态的解散方法解散微载体聚团，可以保留微载体的完整性，细胞传代后的微载体聚团现象明显降低，细胞生长速度和细胞活性无明显变化。这将为贴壁细胞大规模工业化培养的实现提供了可靠支撑。
附图说明
图1为实施例1的步骤2处理组的外观图片和显微图片。
图2为实施例1的步骤3空白组和处理组的外观图片。
图3为实施例2的步骤2显微镜观察微载体聚团情况。
图4为实施例2的步骤2细胞活性检测结果。
图5为实施例2的步骤3对照组和实验组的外观图片和显微图片
图6为实施例2的步骤3对照组和实验组的细胞活性和细胞计数检测结果。
图7为实施例2的步骤3的细胞衰老染色图片。
图8为实施例3的对照组和胰酶组的外观图片和显微图片。
图9为实施例3的对照组和胰酶组的细胞活性检测结果。
图10为实施例4的基因工程胰酶解聚团时显微图片。
图11为实施例4的实验组1和实验组3细胞活性和细胞增殖倍数检测结果。
***表示P＜0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的微载体为北京华龛生物科技有限公司的3D TableTrix®微载片（货号F01-100）。
下述实施例中所涉及的脐带间充质干细胞培养基为北京华龛生物科技有限公司的3D FloTrix® 三维细胞培养基（货号RMZ010-GY）。
下述实施例中所涉及的Vero细胞培养基包含基础培养基为上海源培生物科技有限公司的M199培养基（货号L640KJ），血清为维森特的优级胎牛血清（货号085-150）。
下述实施例中所涉及的生物反应器为北京华龛生物科技有限公司的3D FloTrix® miniSPIN 单通道生物反应器（货号FTMS1-4）。
在本发明的具体实施方式中，所述细胞消化液为赛默飞世尔科技（中国）有限公司的TrypLE™ Express（货号12604013）。
在本发明的具体实施方式中，所述重组胰蛋白酶消化液为上海源培生物科技有限公司的Trypzyme®重组胰蛋白酶消化液（货号S342JV）。
在本发明的具体实施方式中，所述胰酶消化液为维森特的TRYPSIN/EDTA（货号325-043-EL）。
在本发明的具体实施方式中，所述微载体裂解液为北京华龛生物科技有限公司的3D FioTrixTMDigest裂解液，货号R001-500，官方网站www.cytoniche.com。
在本发明的具体实施方式中，所述活死荧光染液采购于北京华龛生物科技有限公司，货号CNR002-2，官方网站www.cytoniche.com。
下述实施例中所涉及的细胞，若无特别说明，为脐带间充质干细胞，为本领域常见细胞。
实施例1、物理方法无法解散微载体聚团
1、细胞3D培养
设置两个处理组：空白组和处理组。每组重复三次。
将脐带间充质干细胞通过培养基重悬，得到细胞悬液，细胞悬液中的细胞浓度为2.5×106个/ml。将细胞悬液接种至装有微载体和50ml培养基（微载体和培养基的比例为20mg/15mL）的生物反应器，细胞悬液与微载体的比例为200μL/20mg。将接种后的生物反应器置于37℃二氧化碳培养箱进行培养，反应器搅拌程序为35rpm/min。接种第2天补充25ml培养基。
2、观测微载体聚集
拍照观察上述步骤1中培养细胞第0-4天时的微载体聚集情况。培养第4天时微载体聚集情况参见图1。随着培养天数增加，可看到微载体聚集形成团块大小明显增加。
出现微载体聚集时，将3个以上微载体粘连在一起定义为微载体聚团，此时微组织（即上述步骤1采用微载体和培养基培养细胞所获得的培养体系）饱和度为5-9×106细胞/片微载体。
3、采用物理方法对微载体聚团进行处理
为防止微载体聚团，在细胞培养第4天时，空白组保持原培养条件培养，处理组将反应器搅拌程序设定为120rpm/min，其它培养条件不变。处理组取出转瓶，在超净台中用10ml移液管进行液体吸和吹的反复操作大概1min，之后会放到反应器上继续进行120rpm转速的搅拌1h。
结果如图2显示，35rpm为空白组反应器中微载体外观，120rpm为处理组反应器中微载体外观，提高搅拌速度后，微载体聚团并未明显减少，说明微载体聚团已经无法用物理方法解聚。
实施例2、采用细胞消化液解聚微载体聚团以及传代
1、细胞3D培养
采用实施例1步骤1培养细胞，设置四个处理组，对照组、实验组1、实验组2和实验组3。每组重复三次。
2、解散载体聚集并传代
取上述步骤1培养4天的实验组和对照组进行如下实验。
实验组按如下步骤处理：
1) 培养中停止生物反应器搅拌程序.
2) 20 min后去除培养体系中的培养基上清液55 ml。
3) 采用显微镜拍照观察上述处理组的微载体饱和度和聚团情况。观察细胞饱和度，待培养4天载体中细胞饱和以后进行消化酶处理。此时，细胞密度达到1-4×106细胞/ml。
培养4天后，实验组1、实验组2、实验组3分别添加不同体积的细胞消化液（原液为100%）。实验组1中，培养基和细胞消化液的体积比例为1:1；实验组2中，培养基和细胞消化液的体积比例为1:2；实验组3中，培养基和细胞消化液的体积比例为1:10，最终分别达到终浓度为50%，67%、91%，在37oC条件下重新启动搅拌程序，45rpm/min。
对照组不做处理，在37oC条件下重新启动搅拌程序，45rpm/min。
实验组和对照组再培养30min，通过显微镜观察细胞解离情况和微载体完整性情况。并采用活死荧光染色计数检测上述处理组的细胞活性，具体步骤为：取各组样品20微升，避光加入100微升活死荧光染液，室温避光染色10-15分钟。
显微镜观察细胞解离情况和微载体完整性情况见图3，其中，1:0为对照组，1:1为实验组1，1:2为实验组2，1:10为实验组3。对照组微载体聚团情况严重，实验组1和实验组2微载体聚团解聚，并保留单个球型微载体，实验组3微载体完全崩解，释放单个细胞。
细胞活性检测结果见图4，实验组1、实验组2和实验组3的细胞活性分别为96.4%、91.3%、84.6%。实验组1和实验组2细胞活性明显下降，因此选择使用对照组和实验组1继续传代。
4) 传代培养
实验组1进行如下操作：
停止搅拌程序，在培养体系中补充培养基95 ml，添加5片共100mg空白新微载体；启动搅拌程序，继续在37oC动态培养细胞和微载体形成的微组织。
对照组按如下步骤处理：
a) 培养中停止生物反应器搅拌程序。
b) 20 min后去除培养体系中的培养基上清液55ml。
c)在培养体系中补充培养基110 ml，添加5片共100mg空白新微载体；启动搅拌程序，继续在37oC动态培养细胞和微载体形成的微组织。
3、质量检测
实验组1和对照组在经过步骤2、4）处理后培养96小时。采用显微镜观测其聚团现象。采用台盼蓝进行细胞计数和测定细胞活性，使用1mg/ml微载体裂解液15ml和实验组1或对照组培养体系总量5ml混合在37℃水浴锅孵育30min，每10min吹打一次，获得裂解后细胞悬液，取裂解后细胞悬液50μL，加入50μL台盼蓝，混匀后在计数仪下计数并统计活率。使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒染色细胞观察细胞衰老情况，
对照组和实验组1（实验组）细胞继续原位传代后的细胞和微载体情况如图5，实验组中微载体聚团率明显下降。细胞计数和细胞活性检测结果如图6，其中，a显示细胞活力检测结果，实验组1（实验组）的细胞活性为97.18%，对照组的细胞活性为92.89%，实验组1的细胞活性明显高于对照组的细胞活性；b为细胞计数结果，实验组1（实验组）的细胞数量为837万，对照组的细胞数量为757万，实验组1的细胞数量明显高于对照组的细胞数量。细胞衰老情况如图7所示，结果显示原位传代组细胞（对照组）明显有衰老情况（图7黑色箭头指示），而消化传代组细胞（实验组1，实验组）状态良好。因此打开微载体聚团对于细胞的数量和细胞活性均有很大提升。
实施例3、采用胰酶解聚微载体聚团
按照实施例1步骤1培养细胞，设置两个处理组，对照组和胰酶组。每组重复三次。取培养4天的对照组和胰酶组的培养体系10mg分别进行如下实验。
对照组：向对照组培养体系中添加1ml微载体裂解液，混合均匀，静置10min。
胰酶组：向胰酶组培养体系中添加1ml胰酶消化液，混合均匀，静置10min。
采用显微镜观察对照组和胰酶组中微载体聚团情况。采用活死荧光染色计数检测细胞活性，检测方法同实施例2步骤2。
微载体聚团情况参见图8，其中，1:0为对照组，1:1为胰酶组，a为EP管中微载体聚团情况，0min表示刚添加微载体裂解液或胰酶消化液，10min表示静置10min后的情况，b为静置10min后显微镜下的微载体聚团情况。随着消化时间延长微载体量明显减少，显微镜下显示微载体明显出现结构崩解。
细胞活性检测结果为图9，对照组为96.8%，实验组为72.7%，显示胰酶消化10min明显降低细胞活性。
实施例4、采用重组胰蛋白酶消化液解聚微载体实现球转球连续传达
1、细胞3D培养
将Vero细胞通过培养基重悬，得到细胞悬液。将1.6×107个细胞接种至装有微载体和80ml培养基（微载体和培养基的比例为3g/L）的生物反应器，细胞密度为2×105个/ml。将接种后的生物反应器置于37℃二氧化碳培养箱进行培养，反应器搅拌程序为40rpm/min，3min；1 rpm/min，1h；循环程序24次。接种24h后程序改为恒速40rpm。细胞培养第二天、第三天分别进行一次换液处理，换液量为60ml/次。
2、解散载体聚集并传代
取上述步骤1培养4天的微组织1ml进行计数，细胞密度达到1.1×106个/ml。将微组织分为四组，离心去除上清后，每组加入18ml 不同体积比PBS和重组胰蛋白酶消化液的混合液进行消化，加入PBS:重组胰蛋白酶消化液体积比1:0为对照组，0:1为实验组1，1:1为实验组2，2:1为实验组3，即在对照组中，重组胰蛋白酶消化液在培养体系中的体积百分比浓度为0%；在实验组1中，重组胰蛋白酶消化液在培养体系中的体积百分比浓度为100%；在实验组2中，重组胰蛋白酶消化液在培养体系中的体积百分比浓度为50%；在实验组3中，重组胰蛋白酶消化液在培养体系中的体积百分比浓度为33.3%。
结果见图10，5min、10min、20min、30min和40min分别为加入混合液进行消化的时间，对照组微载体完整，且微载体聚团情况严重，实验组1随着消化时间延长微载体完全崩解，释放单个细胞。实验组2和实验组3中微载体聚团解聚，细胞从载体释放，形成单个细胞。实验组2出现部分微载体结构破坏情况，实验组3微载体完整，释放单个细胞。
选择消化时间为30min的实验组1和实验组3继续进行微载体三维连续传代。培养条件为细胞密度2×105个/ml，微载体为3g/L，培养基体系80ml。将接种后的生物反应器置于37℃二氧化碳培养箱进行培养，反应器搅拌程序为40rpm/min，3min； 1 rpm/min，1h；循环程序24次。接种24h后程序改为恒速40rpm。
细胞培养4天后对实验组1和实验组3细胞进行观察和收获，采用台盼蓝进行细胞计数和测定细胞活性，检测方法与实施例2相同。
结果如图11所示，图11中a为细胞活性检测结果，实验组1为97.8%，实验组2为97.9%，b为细胞增殖倍数检测结果，实验组1为9.7倍，对应细胞数量为1.94×106细胞/ml，实验组2为11.7倍，对应细胞数量为2.34×106细胞/ml，显示细胞未出现聚团现象，增殖情况和活率均较好。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (7)

1.微载体细胞培养体系中微载体聚团状态的解散方法，其特征在于：包括
向微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中加入细胞消化液，进行酶解反应，反应结束后加入培养基和微载体，解除微载体聚团状态；所述细胞消化液为赛默飞世尔科技（中国）有限公司的TrypLE™ Express、货号为12604013的产品，所述微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中培养基与所述细胞消化液体积比例为1:1-1:2；或所述细胞消化液为上海源培生物科技有限公司的Trypzyme®重组胰蛋白酶消化液，货号为S342JV，在所述微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中的体积百分比浓度为33.3%-50%，所述微载体为3DTableTrix® 微载片。
2.根据权利要求1所述的解散方法，其特征在于：所述微载体聚团状态的微载体细胞培养体系中，所培养的细胞密度为1-4×106细胞/ml。
3.根据权利要求1所述的解散方法，其特征在于：加入细胞消化液时，还包括采用反应器搅拌所述微载体细胞培养体系和加入的细胞消化液，搅拌程序为45rpm/min，所述搅拌时间为10-60min。
4.根据权利要求1所述的解散方法，其特征在于：所述细胞消化液体积与加入的所述微载体的重量比例为1 ml：2.5 mg -1 ml：20 mg。
5.根据权利要求1所述的解散方法，其特征在于：在加入细胞消化液之前还包括静置所述微载体细胞培养体系以使所述微载体细胞培养体系分层，去除分层后的上清液。
6.根据权利要求1所述的解散方法，其特征在于：所述细胞为脐带间充质干细胞或Vero细胞。
7.权利要求1-6中任一所述的解散方法在培养细胞中的应用。
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