CN116497083A - 一种用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，包括如下步骤：步骤1，粪便样品的筛选与预处理；步骤2，肠道菌群的膜富集：以培养器内部作为内室，另一培养器作为外室，不同孔径的扩散膜将内室与外室分隔开，通过移液器将步骤1中的粪便混悬液接种到外室中进行厌氧富集培养；步骤3，膜的优化：扩散膜孔径选用0.4um和0.2um大小；步骤4，培养位置的优化；步骤5，高通量筛选；步骤6，菌种鉴定及保藏。本发明能够为活菌药物开发和构建专门的噬菌体提供丰富的菌种资源。
Description
技术领域
本发明涉及肠道菌群的分离和筛选技术领域，主要涉及低丰度肠道菌群的高效分离培养和高通量筛选方法。
背景技术
肠道微生物群是一个复杂的微生物群落之一，生活在人类和动物的消化道内，而肠道是人体中拥有最多数量和最多种群微生物的消化道之一。肠道中的微生物多达1000多种，然而我们筛选肠道菌群的技术方法有限，难以筛选获得到低丰度的肠道菌群。
常规的涂布平板筛选和高通量筛选方法主要是通过模拟肠道内的营养环境，如调节培养基的营养成分、孵育时间、温度和pH值等来筛选肠道菌株，但是这些培养环境大多数只适合生长较快的肠道菌种，如Enterococcus faecalis、Escherichia fergusonii和Shigella flexneri等均为较易培养的菌种，对于生存环境要求严格的菌株难以筛选培养出来，如Lactobacillus pentosus、Parabacteroides distasonis、Streptococcussalivariusi、Bacteroides uniformis和Streptococcus parasanguinis等均为较难培养的肠道菌株，因此开发一种可以用来筛选低丰度肠道菌种的方法是必要的。如专利申请202210917227.7公开的一种肠道菌群的高通量分离培养与筛选方法，包括以下步骤：步骤1，粪便样筛选与预处理：对获取的粪便样本进行16S扩增子测序，分析粪便样本的菌群丰富度；步骤2，活菌检测：利用活菌检测技术测定步骤1中的粪便样稀释液中活菌总量；步骤3，极限稀释培养：计算稀释倍数，将稀释后的混合细菌培养基转移到96细菌培养板中进行培养；步骤4，转移培养：挑选生长孔数合适的96孔细菌培养板，全部转移至新的96孔中间板；步骤5，菌种鉴定：提取上一骤中的取出的菌液DNA，电泳检测扩增条带并送样测序；检查测序的峰图质量，并进行序列比对；步骤6，菌种保藏。
相关文献报道利用扩散生物反应器进行富集培养不可培养或难培养的微生物是一种有前途的策略，它有助于通过创造肠道自然环境来丰富微生物物种，为细菌之间相互作用提供了环境。然而，上述方法只能筛选到普通优势菌群而筛选不到低丰度肠道菌群，存在筛选上的缺点，为此亟需改进。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，该方法是在膜扩散反应器的基础上优化出来的一个简易高效筛选方法，弥补了常规涂布平板筛选和高通量筛选方法大部分只能筛选到普通优势菌群而筛选不到低丰度肠道菌群的短板，为活菌药物开发和构建专门的噬菌体提供丰富的菌种资源。
本发明的另一个目的是提供一种用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，该方法通过较低的成本筛选到低丰度肠道菌群，可以通过膜的隔离间接减少培养基，便于那些对营养物质需求较低的肠道菌群的生长。
为达到此目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，包括如下步骤：
步骤1，粪便样品的筛选与预处理：对获取的粪便样本进行16S扩增子高通量测序，通过生物信息分析粪便样本的菌群的丰富度，将菌种多样性高或者丰度低的菌种较多的样本进行厌氧血清瓶法富集；
步骤2，肠道菌群的膜富集：以培养器内部作为内室，另一培养器作为外室，不同孔径的扩散膜将内室与外室分隔开，通过移液器将步骤1中的粪便混悬液接种到外室中进行厌氧富集培养；
其中，以带扩散膜的50mL培养器内部作为内室，1L大烧杯作为外室。
步骤3，膜的优化：扩散膜孔径选用0.4um和0.2um大小，将膜内和膜外所获得菌株进行对比，分析不同孔径大小膜的富集效果；
步骤4，培养位置的优化：肠道菌群可在内室及外室中培养，将培养位置进行调换，根据获得肠道菌群的多样性确认哪一个位置的富集筛选效果较好。
步骤5，高通量筛选：利用流式细胞仪活菌检测技术测定步骤2中粪便样品稀释液中的总菌量和活菌率，计算总活菌量，根据总活菌量进行极限稀释，将稀释后的细菌培养液转移至灭菌96孔深孔板中，用封口膜进行密封，放置于37℃的厌氧箱培养中，5-7天后，选取生长数量合适的板进行菌株挑选，转移至无菌96孔深孔板中培养，每孔再转移50-100ul菌液用于进行DNA裂解，同时向96孔深孔板中加入适量液体培养基继续培养剩余菌液；
步骤6，菌种鉴定及保藏：裂解出步骤5中菌液的DNA，PCR扩增16S基因序列，琼脂糖电泳检测扩增条带并送样测序；测序结果返回后，通过软件检查测序峰图质量，并通过NCBI网站进行序列比对，将比对结果进行汇总整理。
根据比对鉴定结果进行菌株的保藏，按照对应编号保藏步骤5中所述96孔深孔板中培养的剩余菌液。
同时为确保菌液无环境污染和菌株活性，使用1ul一次性接种环蘸取部分保藏菌液进行平板3区划线进行验证。
现有技术对菌种的培养是极限稀释培养和转移培养，这种培养方式只能筛选到普通优势菌群而筛选不到低丰度肠道菌群，筛选的菌群范围相对比较狭窄；特别是不能筛选到低丰度肠道菌群，本发明则通过膜的隔离间接减少培养基，便于那些对营养物质需求较低的肠道菌群的生长；同时，能够通过膜的孔径大小筛选到不同大小的菌株，研究细菌大小和肠道菌株的相关性，为活菌药物开发和构建专门的噬菌体提供丰富的菌种资源。
进一步的，步骤1中新鲜粪便样品先用无菌生理盐水按照1g:1-2mL进行震荡混匀。
进一步的，为减少步骤1中大肠杆菌对样本的干扰，可向其中添加氨苄西林、硫酸庆大霉素和阿米卡星等抗生素，最后向血清瓶中加入无菌澄清瘤胃液和无菌脱纤维羊血进行富集。
进一步的，为防止步骤2中的内外室与空气中的细菌直接接触，在烧杯口覆盖无菌保鲜膜。
进一步的，在步骤4中要将粪便混悬液接种到内室中时需要将灭菌过后的内室打开，全程要求无菌操作，否则很容易引入杂菌导致实验失败。
进一步的，步骤5中对富集后的细菌混悬液仍旧存在其它不可培养的微生物，除此之外，为减少极限稀释造成的误差，设置多个不同的稀释梯度以保证96孔板里的菌株正常生长。
进一步的，在步骤6中，不同稀释梯度生长的孔数不同，如在稀释浓度为1.25-1.75CFU/mL时，96孔深孔板的生长孔数应为20-30个为最佳，在稀释浓度为2-4CFU/mL时，96孔深孔板的生长孔数应为30-70个为最佳。
进一步的，步骤6中保藏菌株应按照50％甘油和菌液1：1的比列进行菌株低温冷冻保藏。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明通过较低的成本筛选到低丰度肠道菌群，不像涂布平板筛选和高通量筛选方法进行盲目的筛选、耗时长和成本高等；
同时，本发明可以通过膜的隔离间接减少培养基，便于那些对营养物质需求较低的肠道菌群的生长；
另一方面，本发明可以通过膜的孔径大小筛选到不同大小的菌株，研究细菌大小和肠道菌株的相关性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施膜扩散富集流程示意图。
图2为普通高通量筛选获得肠道菌株统计图。
图3为本发明膜扩散富集后筛选获得肠道菌株统计图。
图4为普通高通量及膜扩散富集筛选获得难培养菌株及有益菌株统计图。
图5为本发明0.4um膜扩散富集后筛选获得肠道菌株统计图。
图6为本发明0.2um膜扩散富集后筛选获得肠道菌株统计图。
图7为本发明膜扩散富集的内膜筛选获得菌株统计图。
图8为本发明膜扩散富集的外膜筛选获得菌株统计图。
图9为本发明实施例2筛选获得菌株平板验证情况示意图。
图10为本发明细菌混悬液接种于外室获得肠道菌株统计图。
图11为本发明细菌混悬液接种于内室获得肠道菌株统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明所实现的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，包括如下步骤：
步骤1，粪便样品的筛选与预处理：对获取的粪便样本进行16S扩增子高通量测序，通过生物信息分析粪便样本的菌群的丰富度，将菌种多样性高或者丰度低的菌种较多的样本进行厌氧血清瓶法富集；
步骤2，肠道菌群的膜富集：以带扩散膜的50mL培养器内部作为内室，1L大烧杯作为外室，不同孔径的扩散膜将内室与外室分隔开，通过移液器将步骤1中的粪便混悬液接种到外室中进行厌氧富集培养；
步骤3，膜的优化：扩散膜孔径选用0.4um和0.2um大小，因为大部分微生物的大小均在这个范围附近，将膜内和膜外所获得菌株进行对比，分析不同孔径大小膜的富集效果；
步骤4，培养位置的优化：在本实验过程中肠道菌群可在内室及外室中培养，但并不清楚粪便混悬液接种到内室还是外室的富集效果更好，因此将培养位置进行调换，根据获得肠道菌群的多样性确认哪一个位置的富集筛选效果较好；
步骤5，高通量筛选：利用流式细胞仪活菌检测技术测定步骤2中粪便样品稀释液中的总菌量和活菌率，计算总活菌量，根据总活菌量进行极限稀释，将稀释后的细菌培养液转移至灭菌96孔深孔板中，用封口膜进行密封，放置于37℃的厌氧箱培养中，5-7天后，选取生长数量合适的板进行菌株挑选，转移至无菌96孔深孔板中培养，每孔再转移50-100ul菌液用于进行DNA裂解，同时向96孔深孔板中加入适量液体培养基继续培养剩余菌液；
步骤6，菌种鉴定及保藏：裂解出步骤5中菌液的DNA，PCR扩增16S基因序列，琼脂糖电泳检测扩增条带并送样测序；测序结果返回后，通过软件检查测序峰图质量，并通过NCBI网站进行序列比对，将比对结果进行汇总整理；
根据比对鉴定结果进行菌株的保藏，按照对应编号保藏步骤5中所述96孔深孔板中培养的剩余菌液。
下面结合具体实施的情况进行说明如下：
实施例1。
按照本发明步骤进行膜扩散富集的肠道菌群筛选及普通高通量的肠道菌株筛选，具体步骤如下：
将供体粪便样本按照1g:1-2mL的比例加入无菌生理盐水利用涡旋仪振荡混匀加入厌氧血清瓶中进行富集厌氧培养48-72h后，普通的高通量筛选直接将厌氧血清瓶中的细菌混悬液进行活菌检测，而膜扩散富集法需要在1L烧杯中加入500mL的BHIS培养基和5mL粪便菌液作为外室，50mL培养器内室加入40mLBHIS培养基，将0.2um孔径大小的膜作为细菌的扩散膜，37℃厌氧培养48h。
其中BHIS改良培养基具体配方：BHI预制粉末37g，酵母提取物5-10g，L-半胱氨酸0.5-0.9g，刃天青0.1-0.2mg，血晶素2.5 -3.5μg，维生素K10.001-0.003mg，加水定容至1L，利用玻璃棒搅拌均匀，使用HCl或NaOH溶液调节pH值至6.3-6.8，121℃高压灭菌20min，冷却至55℃左右备用。
利用流式细胞仪对培养后的0.2um膜内的稀释液和血清瓶中的稀释液进行活菌量检测，分别计算出培养原液的总活菌及稀释倍数，用BHIS液体培养基进行准确稀释，通过移液器分装到无菌的96孔板中37℃厌氧培养。
培养5-7天后观察96孔深孔板中细菌的生长情况，将生长情况不同的细菌转移至新的无菌96孔深孔板中培养，每孔约650-700μl菌液加入800-900μlBHIS液体培养基，剩余的50-100μl菌液用于菌株DNA提取。
使用一步裂解法将DNA裂解出来，将裂解液滴在石英板上进行DNA浓度测试，并使用无菌水将DNA浓度调整至50-150ng/μl浓度左右为最佳。配置PCR反应体系扩增菌种的16SDNA序列,MIX 15μl,上游引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3')1.2μl，下游引物1492R(5’TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3')1.2μl，菌株DNA模板2μl，加水补足30μl。在PCR仪器中进行反应，98℃预变性3min，38个循环(98℃变性10s，65℃复性10s，72℃延伸20s)，72℃彻底延伸3min后在12℃下保存。
取1-2μl的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测条带是否符合预期大小。PCR产物进行一代测序，将所得的测序结果在National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)网站的16S ribosomal RNA sequences(Bacteria and Archaea)数据库进行序列比对。将比对所得的菌株和潜在益生菌株进行选择性保藏。
利用本发明的富集筛选方法(具体方法如图1所示)和普通高通量筛选方法进行肠道菌株筛选，其中普通高通量筛选方法筛选获得6种不同的肠道菌种(具体结果如图2所示)，其中比较难筛选到的肠道菌株及对人体有益的肠道菌株占比22.72％，如Bacillustropicus、Bifidobacterium pseudocatenulatum和Parabacteroides distasonis均为较难获得的菌株，而利用本富集方法共筛选得到16种不同的肠道菌株(具体结果如图3所示)，其中比较难筛选到的肠道菌株及对人体有益的肠道菌株占比74.64％(具体结果如图4所示)，如Bacteroides uniformis、Bacteroides caccae、Bacteroides xylanisolvens、Bacteroides thetaiotaomicron和Fusobacterium varium均为较难获得的菌株，除此此外还筛选得到Streptococcus salivarius、Bacteroides vulgatus和Bacteroidesuniformis等多种相关文献报道具有有益功能的肠道菌株。本次实验结果表明通过该富集筛选方法可以筛选得到肠道中低丰度的肠道菌株，且更容易筛选出对人体健康有益的肠道菌种。
实施例2。
按照本发明的步骤进行不同孔径大小的膜富集及筛选，具体步骤如下所示：
将供体粪便样本按照1g:1-2mL的比例加入无菌生理盐水利用涡旋仪振荡混匀加入厌氧血清瓶中进行37℃厌氧富集培养48h。在2个1L烧杯中分别加入500mL的BHIS液体培养基和5mL粪便菌液作为外室，2个50mL培养器分别加入40mLBHIS液体培养基，将孔径大小0.2um和0.4um的膜作为细菌的培养器扩散膜，37℃厌氧培养48h。按照实例1中的高通量筛选步骤进行肠道菌株筛选、鉴定及保藏。
利用本富集筛选方法对2个月内的7个样本进行肠道菌群的富集筛选培养，分离获得的肠道菌株所图示，其中0.4um孔径大小的膜共分离获得肠道菌株217株，不同菌种31种(具体结果如图5所示)，0.2um的膜共分离获得肠道菌株239株，不同菌种40种(具体结果如图6所示)，其中包含有相关文献报道具有有益功能的菌种,如：Lactobacillus pentosus、Enterococcus lactis、Streptococcus salivarius、Bacteroides vulgatus、Bacteroidesuniformis、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium pseudocatenulatum和Parabacteroides distasonis等。为了验证本富集方法是否成功，将不同孔径的内膜与外膜看成一个整体进行对比，内膜共筛选获得不同菌种37种(具体结果如图7所示)，外膜获得不同菌种21种(具体结果如图8所示)，其中在内膜中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)仅占15.2％，而在外膜中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)占比达34.31％，且在埃希菌属(Escherichia)和志贺氏菌属(Shigella)等常见菌属均出现减少的现象，所以通过膜扩散富集可以减少常见肠道菌株的筛选，更容易获得低丰度肠道菌株。
对筛选获得的肠道菌种进行活化，通过在平板上生长的菌落形态验证所得菌种的准确性、活性及污染情况。进行验证的菌种包括：粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、迪氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、乳肠球菌(Enterococcus lactis)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)和单形类杆菌(Bacteroides uniformis)，其平板表型结果如图9所示，平板上菌落形态与预期相符，筛选获得菌株活性较好，且菌落形态单一，未见杂菌污染。
实施例3。
按照本发明的步骤进行不同培养位置的富集及筛选，具体步骤如下所示：
将供体新鲜粪便样本按照1g:1-2mL的比例加入无菌生理盐水利用涡旋仪振荡混匀后加入厌氧血清瓶中进行富集，37℃厌氧培养48h。在其中一个1L烧杯中加入500mL的BHIS液体培养基和5mL细菌混悬液作为外室，50mL培养器中加入40mLBHIS液体培养基作为内室37℃厌氧培养48h；另一个1L烧杯中只加入500mL的BHIS液体培养基作为外室，50mL培养器中加入40mLBHIS液体培养基和4mL细菌混悬液作为内室37℃厌氧培养48h。按照实例1中的高通量步骤进行肠道菌株筛选、鉴定及保藏。
在外室接种菌液时筛选得到不同菌种12种(具体结果如图10所示)，而在内室接种菌液只筛选得到6种不同菌种(具体结果如图11所示)，本次实验结果表明在内室接种细菌混悬液时筛选得到的肠道菌株种类较少，且粪肠球菌(Enterococcus faecalis)占比高达68％，而在外室接种细菌混悬液时得到的肠道菌种多样性较多，且筛选获得的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)比例仅占34％，说明该富集筛选方法将细菌混悬液接种于外室中的效果更佳。
综上所述，通过多次实验得出选用孔径0.2um作为扩散膜，将细菌混悬液接种于内室中在膜扩散富集可筛选获得更多种类的肠道菌株。膜扩散富集筛选与常规平板筛选和高通量筛选相比，更容易筛选获得低丰度肠道菌株及难培养菌株，且通过膜扩散富集筛选可以降低肠球菌属、志贺氏菌属和埃希菌属等常见菌株的筛选，还通过不同孔径的膜筛选获得不同大小的肠道菌种。本富集方法为国家人体肠道菌株资源库建设提供强有力的支持，为活菌药物开发和构建专门的噬菌体提供丰富的菌种资源，具有重要的社会意义。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1，粪便样品的筛选与预处理：对获取的粪便样本进行16S扩增子高通量测序，通过生物信息分析粪便样本的菌群的丰富度，将菌种多样性高或者丰度低的菌种较多的样本进行厌氧血清瓶法富集；
步骤2，肠道菌群的膜富集：以培养器内部作为内室，另一培养器作为外室，不同孔径的扩散膜将内室与外室分隔开，通过移液器将步骤1中的粪便混悬液接种到外室中进行厌氧富集培养；
步骤3，膜的优化：扩散膜孔径选用0.4um和0.2um大小，将膜内和膜外所获得菌株进行对比，分析不同孔径大小膜的富集效果；
步骤4，培养位置的优化：将培养位置进行调换，根据获得肠道菌群的多样性确认富集筛选效果；
步骤5，高通量筛选：利用流式细胞仪活菌检测技术测定步骤2中粪便样品稀释液中的总菌量和活菌率，计算总活菌量，根据总活菌量进行极限稀释，将稀释后的细菌培养液转移至灭菌96孔深孔板中，用封口膜进行密封，放置于37℃的厌氧箱培养中，5-7天后，选取生长数量合适的板进行菌株挑选，转移至无菌96孔深孔板中培养，每孔再转移50-100ul菌液用于进行DNA裂解，同时向96孔深孔板中加入适量液体培养基继续培养剩余菌液；
步骤6，菌种鉴定及保藏：裂解出步骤5中菌液的DNA，PCR扩增16S基因序列，琼脂糖电泳检测扩增条带并送样测序；
根据比对测序结果进行菌株的保藏。
2.根据权利要求1所述的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于步骤1中新鲜粪便样品先用无菌生理盐水按照1g:1-2mL进行震荡混匀。
3.根据权利要求2所述的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于步骤1中，为减少大肠杆菌对样本的干扰，向粪便样本中添加氨苄西林、硫酸庆大霉素和阿米卡星等抗生素，最后向血清瓶中加入无菌澄清瘤胃液和无菌脱纤维羊血进行富集。
4.根据权利要求1所述的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于步骤2中，以带扩散膜的50mL培养器内部作为内室，1L大烧杯作为外室。
5.根据权利要求4所述的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于为防止内室、外室与空气中的细菌直接接触，在烧杯口覆盖无菌保鲜膜。
6.根据权利要求1所述的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于在步骤4中要将粪便混悬液接种到内室中时需要将灭菌过后的内室打开，全程要求无菌操作。
7.根据权利要求1所述的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于为减少极限稀释造成的误差，设置多个不同的稀释梯度以保证96孔板里的菌株正常生长。
8.根据权利要求7所述的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于在步骤6中，不同稀释梯度生长的孔数不同，在稀释浓度为1.25-1.75CFU/mL时，96孔深孔板的生长孔数应为20-30个，在稀释浓度为2-4CFU/mL时，96孔深孔板的生长孔数应为30-70个。
9.根据权利要求1所述的用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法，其特征在于步骤6中保藏菌株应按照50％甘油和菌液1：1的比列进行菌株低温冷冻保藏。
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|---|---|---|---|
| CN202310277250.9A CN116497083A (zh) | 2023-03-21 | 2023-03-21 | 一种用于肠道低丰度菌株的膜富集筛选方法 |
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| CN (1) | CN116497083A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116948939A (zh) * | 2023-09-18 | 2023-10-27 | 四川厌氧生物科技有限责任公司 | 一种提高粪便样本挑菌多样性的方法和培养基及其用途 |
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2023
- 2023-03-21 CN CN202310277250.9A patent/CN116497083A/zh active Pending
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN116948939A (zh) * | 2023-09-18 | 2023-10-27 | 四川厌氧生物科技有限责任公司 | 一种提高粪便样本挑菌多样性的方法和培养基及其用途 |
| CN116948939B (zh) * | 2023-09-18 | 2023-12-12 | 四川厌氧生物科技有限责任公司 | 一种提高粪便样本挑菌多样性的方法和培养基及其用途 |
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