CN110093276B - 一种定向选择性分离肠道细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种定向选择性分离肠道细菌的方法，属于微生物分离技术领域。本发明中提供了一种定向选择性分离肠道细菌的方法，在分离样品前，先对样品及在不同培养基生长的样品进行高通量测序，然后通过生物信息学标准化分析，选择所需求菌种丰度含量高的样品，并掌握其营养成分需求及细菌间的相互作用关系继而增加或减少相应的营养物质和细菌发酵液，从而定向分离获得所需求的菌种。
Description
技术领域
本发明涉及一种定向选择性分离肠道细菌的方法，属于微生物分离技术领域。
背景技术
肠道菌群是目前人类健康领域研究中的一个热点。肠道细菌是在人体中数量最大与人体健康关系最密切的微生物。据现有研究数据，人体肠道细菌超过1000种，总重量约1.5kg，细菌总数达约1014个，为自身组织细胞总数的10-20倍，人体肠道中存在多达300万个微生物基因，是自身基因的150倍(Byrd,A.L.,Belkaid,Y.&Segre,J.A.The human skinmicrobiome.Nat.Rev.Microbiol.16,143-155(2018))。肠道菌群是肠道微生态系统的重要组成部分，通常一个协调平衡的肠道菌群生态系统具有重要的生理作用，其中包括生物屏障、营养代谢、免疫、抗衰老及抗肿瘤作用等。近年来随着包括高通量测序等组学技术的发展，基于系统发育基因(如16S rRNA基因)、宏基因组、单细胞基因组来研究环境中的微生物，使我们能够更加全面和深刻地理解肠道菌群与人类健康间的关系。尤其在其中发现了很多与疾病密切相关的细菌类群，但是基因组学技术很难检测到肠道中一些占比较小的微生物群落，在肠道中仍有大量的微生物我们尚未培养出来，这就给我们进一步研究细菌与疾病的相互关系带来了困难。
一般认为，99％的微生物使用传统的方法仍然是“不可培养的”，微生物学家们分析了不可培养的原因，并改进了培养方法。有些研究改进了培养基成分，在培养基中添加腐殖酸、信号分子、处理活性氧的酶类或移除某些抑制因子提高未培养微生物的培养性，如利用金属离子Fe等作为终端电子受体，加入其氧化物，分离一些未知的微生物。也有一些科研人员模拟目标微生物的自然环境进行原位培养和分离。Jung等开发了一种新技术，采用I-tip方法使微生物和自然界的化学物质混合稀释进而能够让微生物在自然环境中利用这些物质生长，利用原位培养手段培养出更具多样性的微生物群体，缩小了可培养和未培养微生物间的距离(Dawoon,J.,et al.Application of a new cultivation technology,I-tip,for studying microbial diversity in freshwater sponges of Lake Baikal,Russia.Fems Microbiology Ecology 90,417-423(2015).)。此外，由于在自然环境的微生物区系中，微生物间的相互作用对于群体生存是至关重要的，微生物间会通过代谢物和信号分子的交流进行合作。近年来，培养组学技术的发展也使研究人员分离获得了很多以前认为是不可培养的微生物。培养组学是通过增加培养条件分离微生物并进行快速大量的鉴定来获得数量及种类极多的微生物纯培养物的方法。Lagier等借助微生物培养组学，综合多重培养条件、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)及16S rRNA基因测序技术，极大地改善了培养条件，增加了可培养微生物的种类和数量(Nadell,C.D.,Xavier,J.B.&Foster,K.R.The sociobiology of biofilms.Fems Microbiology Reviews 33,206-224(2009))。
目前来看，由于单纯的基因测序无法解答微生物群落的功能和代谢问题，也就更加无法阐明与人类关系密切的微生物尤其是肠道菌群在人体内所发挥的功能，因此分离未培养微生物的方法越来越受到科研人员的重视。尽管原位培养技术、共培养技术及培养组学技术的发展和应用已经分离获得了以往认为是不可培养的微生物，但是这些方法往往需要很长时间、耗费大量人力、盲目的从大量样品中分离未知微生物，而且可能获得的90％的菌株都是已经分离获得过得重复菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种定向选择性分离肠道细菌的方法，能够高效的分离出特定属的新的微生物。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种定向选择性分离肠道细菌的方法，包括如下步骤：
1)在不同的培养基上培养待分离样品，获得特定培养菌群；
2)分别提取不同培养基培养获得的菌群样品和未培养的待分离样品的DNA，进行16S rRNA扩增子测序；
3)根据目标菌属在不同培养基上丰度的变化，选择目标菌属丰度含量高的培养基，作为富集培养基；
4)分析细菌属间的相互作用关系，如有与目标菌属相互促进的细菌，将此类细菌培养物作为营养物质添加于富集培养基中；分析各培养基中的营养成分对肠道各菌生长的影响，根据分析结果增加对于目标菌属富集具有促进作用的营养成分，减少对于目标菌属富集具有抑制作用的营养成分；得到定向分离培养基；
5)使用所述的定向分离培养基定向培养待分离样品，获得目标菌属肠道细菌。
本发明提供了一种定向选择性分离肠道细菌的方法，在分离样品前，先对样品及在不同培养基生长的样品进行高通量测序，然后通过生物信息学标准化分析，选择所需求菌种丰度含量高的样品，并掌握其营养成分需求及细菌间的相互作用关系继而增加或减少相应的营养物质和细菌发酵液，从而定向分离获得所需求的菌种。
优选的，步骤3)中通过绘制热图显示目标菌属在不同培养基上丰度的变化，选择目标菌属丰度含量高的培养基，作为富集培养基。
具体的是：热图绘制使用R语言的gplots包，颜色表示菌属在样品中的相对丰度，颜色越深说明相对丰度越大，选择目标菌属丰度含量最高的培养基，确定可富集目标菌属的培养基。通过上述的方法能够初步确定可富集目标菌属的培养基。
优选的，步骤4)中通过共现网络分析显示细菌属间的相互作用关系。
共现网络分析采用Cytoscape软件中的CoNet插件，基于Spearman相关系数进行相关性分析。通过上述的方法能够显示细菌属间的相互作用关系，进而选出与目标菌属相互促进的细菌。
优选的，步骤4)中通过CCA典范对应分析和显著性分析显示各培养基中的营养成分对肠道各菌生长的影响。
培养基营养成分与肠道菌群的CCA典范对应分析使用R语言的vegan包，显著性分析在R语言的vegan包中使用以下语句：
####env significance test####
ef<-envfit(spe.cca,env,permu＝999)
sink(\"envfit.cca.txt\",append＝FALSE)
ef
sink(file＝NULL)。
通过上述的方法能够确定促进目标菌属丰度增加的营养物质。
优选的，当同一背景的待分离样品有多个时，在步骤2)中，确定目标菌属在哪个样品中丰度最大，定向培养时选择此样品。
具体的，步骤2)中采用QIIME软件及Silva数据库对代表序列进行注释；获得具有分类学信息的OTU表，拆分获取各样品在属水平相对丰度表格，并绘制分类柱形图，确定目标菌属在哪个样品中丰度最大，定向培养时可选择此样品。在实验时，一般同时采集多个样品，可以先确定不同样品中哪个样品中目标菌属丰度最大，进而在分离时，着重对该样品进行分离。
步骤1)中，所述不同的培养基为GAM培养基、RCM培养基(强化梭菌培养基)、BH培养基(脑心培养基)、NA培养基(营养肉汤培养基)、CM培养基(庖肉培养基)、TSA培养基(大豆酪蛋白琼脂培养基)、BL培养基(血液培养基)和/或MH培养基(水解酪蛋白培养基)。
上述培养基的主要营养成分不同，侧重培养的微生物也不同，在实际的试验中更可以根据需要进行选择。
步骤1)中所述培养是在厌氧条件下培养，氧气浓度小于0.1％。
由于肠道是厌氧环境，肠道菌群绝大部分为厌氧细菌，因此本发明中使用厌氧环境进行培养。
步骤1)中所述培养基为固体平板培养基；步骤2)中在提取DNA前去除生长有直径大于1cm菌落的平板。
由于Ilumina Hiseq测序平台获得的原始数据存在一定比例的低质量数据，会影响分析结果的准确性和可靠性，因此需要在分析数据前对原始数据进行适当的过滤和质量控制以去除低质量部分。
步骤1)中，将待分离样品稀释为不同的浓度，然后进行培养；然后根据不同稀释浓度培养所得到的目标菌属丰度的变化，选择目标菌属丰度含量高的稀释倍数；在定向分离培养基定向培养待分离样品时，选用该稀释倍数。
本发明中通过实验发现，对于相同的样品来说，不同的稀释浓度培养出的样品中细菌的丰度是存在差异的。因此，通过稀释浓度的选择，获得更为丰富的目标菌属。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同样品属水平细菌相对丰度柱形图；
图2为本发明实施例1中Heatmap分析显示优势菌属在不同培养基上的变化图；
图3为本发明实施例1中共现网络分析显示细菌属间的相互作用关系图；
图4为本发明实施例1中CCA分析显示培养基营养成分对肠道菌生长的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例中定向选择性分离肠道细菌(拟杆菌属)的方法，包括如下步骤：
1、在不同的培养基上培养待分离样品，获得特定培养菌群。
1)取三只同样背景的动物(编号：37、39、52)粪便若干(约0.1g)分别放入2mL离心管中，按每0.1g粪便加1mL生理盐水，搅拌后在涡旋仪震荡5min，分别用生理盐水稀释至粪便的10-6和10-7倍。
2)制备8种常用的肠道菌群培养基固体平板培养基，改良的GAM培养基(GAM)、脑心培养基(BH)、庖肉培养基(CM)、营养肉汤培养基(NA)、大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)、强化梭菌培养基(RCM)、Mueller-Hinton培养基(MH)购自青岛海博生物公司，血液培养基(BL)购自广东环凯生物公司，各培养基(1000mL)详细成分见表1。
表1培养基成分表(表中除特殊标注的外，单位均为g)
3)每个平板培养基加入100微升稀释后的粪便液体(加样前先震荡稀释液2min)，用灭菌的涂布棒在平板培养基上涂布均匀。每个样品每种培养基涂布10个平板固体培养基作为重复。
4)将涂好粪便液体的平板培养基放入厌氧工作站中，37℃培养，每天测定厌氧工作站中的氧气浓度，保证氧气浓度小于0.1％。
5)厌氧培养72小时后，取出平板培养基，计数菌落数(Colony-Forming Units，CFU)并观察平板上的菌落形态。
2、分别提取不同培养基培养获得的菌群样品和未培养待分离样品的DNA，进行高通量测序；然后进行生物信息学标准化分析。
1)去除生长有直径大于1cm菌落的平板，防止异常长大的细菌菌落影响正常结果。
2)采用适量生理盐水将每个稀释度涂布的每种培养基所有重复平板上的菌落收集至一个2mL离心管中，8000rpm离心10min，去上清。
3)使用Biomiga Stool gDNA Miniprep kit试剂盒提取沉淀中的细菌DNA(提取未培养待分离样品的DNA作为对照)，将DNA送至北京诺禾致源公司进行16S rRNA扩增子测序。
4)高通量测序数据的处理主要采用QIIME平台(version 1.9.1)(Caporaso,J.G.,et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencingdata.Nature Methods 7,335-336(2010))，由于Ilumina Hiseq测序平台获得的原始数据存在一定比例的低质量数据，会影响分析结果的准确性和可靠性，因此需要在分析数据前对原始数据进行适当的过滤和质量控制以去除低质量部分。
数据质控及优化：Hiseq 2500测序得到的是双端序列数据，首先根据单条序列之间的重叠关系，将成对的序列拼接成一条序列，同时对序列的质量和拼接的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向。数据质量控制及去杂采用Trimmomatic v0.36(Bolger,A.M.,Marc,L.&Bjoern,U.Trimmomatic:a flexible trimmer for Illumina sequence data.Bioinformatics30,2114-2120(2014).)和FLASH v1.2.11(Tanja,M.&Salzberg,S.L.FLASH:fast lengthadjustment of short reads to improve genome assemblies.Bioinformatics 27,2957-2963(2011))软件，具体方法如下：
a、过滤序列尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的序列；
b、根据单条序列之间的重叠关系，将成对序列拼接成一条序列，最小重叠长度为10bp；
c、拼接序列的重叠区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合条件的序列；
d、根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
OTU聚类：使用软件unoise3对优化序列去躁，得到OTU的代表序列。将所有优化序列定位至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97％以上的序列，生成OTU表格。OTU表格经过抽平保证相同的测序深度用于进一步分析。
采用QIIME软件(version 1.9.1)及Silva数据库(Release132，http://www.arb-silva.de)(Christian,Q.,et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project:improved data processing and web-based tools.Nucleic Acids Research 41,590-596(2013).)对代表序列进行注释。获得具有分类学信息的OTU表，拆分获取各样品在属水平相对丰度表格，并绘制分类柱形图(如图1所示)，确定目标菌属在哪个粪便样品中丰度最大，选择培养时可选择此样品。
OTU表格用于α多样性和β多样性的分析，α多样性分析包括：分类学注释、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数、Good’s Coverage；β多样性分析包括：Bray-curtis距离、PCoA分析、ANOSIM分析。16S rRNA基因的分类使用Silva数据库(Release132，http://www.arb-silva.de)。多样性和丰富度指数Shannon、Chao1的分析采用QIIME软件(version1.9.1)，不同样品间丰富度和多样性指数的差异性比较采用SPSS(version 23.0，Statistical Package for the Social Sciences)软件中的单因子方差分析模块(One-way analysis of variance，ANOVA)。
3、确定哪个粪便样品及哪个稀释度中目标菌属的相对丰度最大
在本次分析的粪便样品中，葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、气球菌属(Aerococcus)等为优势菌属，发现了不同的小鼠粪便菌群组成有差异以及不同的稀释度可引起培养后的菌群组成也存在差异，因此在选择培养时应根据不同的结果选择不同的小鼠粪便及稀释度，如小鼠37培养前拟杆菌属的相对丰度较大(培养前：5.3％；培养后：11.5％)，采用10-6稀释培养后相对丰度显著多于10-7稀释(10-6稀释后：14.2％；10-7稀释后：8.8％)，因此选择性培养拟杆菌属时可选用小鼠37粪便样品并采用10-6倍进行稀释(如图1所示，B：BH培养基；C：CM培养基；G：GAM培养基；L：血液培养基；M：MH培养基；N：NA培养基；R：RCM培养基；T：TSA培养基；37、39、52分别为小鼠编号)。
4、通过绘制热图显示目标菌属在不同培养基上丰度的变化，选择目标菌属丰度含量高的培养基，作为富集培养基。
1)确定哪种培养基可富集目标菌属
绘制热图显示目标菌属(如图2所示)在不同培养基上丰度的变化，热图绘制使用R语言的gplots包(https://cran.r-project.org/web/packages/gplots/)的heatmap.2函数。图2中颜色表示菌属在样品中的相对丰度，颜色越深说明相对丰度越大，选择目标菌属丰度含量最高的培养基，确定可富集目标菌属的培养基。
通过高通量测序后对原始数据的质控，共获得有效序列1,885,526条(平均每个样品获得35576条序列)，去噪后获得606个OTU，进一步多样性分析发现，经血液培养基培养后的细菌Shannon、PD whole tree多样性指数最高，说明血液培养基培养条件下能分离到更丰富的肠道菌类群，此外，脑心培养基和疱肉培养基也可获得较多种类的肠道菌。但是从丰富度指数来看，各种培养基的差别不大(如图1中所示)。
Heatmap分析显示优势菌属在不同培养基上的变化，如图2所示，如血液培养基降低了益生菌乳酸杆菌的丰度，GAM和脑心培养基增加了潜在益生菌Akkermansia的丰度，BH培养基和血液培养基培养后增加了潜在益生菌拟杆菌属(Bacteroides)的丰度等(BH培养基：25.3％；血液培养基：29.3％)。因此如培养拟杆菌属时可选择血液培养基或BH培养基。
5、通过共现网络分析显示细菌属间的相互作用关系，如有与目标菌属相互促进的细菌，将此类细菌培养物作为营养物质添加于富集培养基中；通过CCA典范对应分析和显著性分析显示各培养基中的营养成分对肠道各菌生长的影响，选择促进目标菌属丰度增加的营养物质添加于富集培养基中；得到定向分离培养基。
1)通过共现网络分析显示细菌间相互作用关系，分析哪些细菌可促进目标菌属的生长。
共现网络分析采用Cytoscape(version 3.6.0)软件中的CoNet插件(version1.0b7)，基于Spearman相关系数进行相关性分析(Spearman相关系数>0.6并且Bonferroni指数校正后的p值<0.05说明两个菌属具有显著的相关性采用连线表示)(Saito,R.,etal.A travel guide to Cytoscape plugins.Nat Methods 9,1069-1076(2012))。共现网络分析可显示细菌属间的相互作用关系，如发现与目标菌属相互促进的细菌，可将此类细菌发酵液作为营养物质添加于培养基，富集目标菌属。
共现网络分析可显示细菌属间的相互作用关系，如图3所示，其中细菌属简称：CS:Candidatus Saccharimonas；Ma:Marvinbryantia；P1:Prevotellaceae UCG_001；P31:Prevotellaceae NK3B31；CA:Candidatus Arthromitus；R14:Ruminococcaceae-UCG-014；Lu:Lachnospiraceae uncultured；Cv:Clostridiales vadinBB60group_unculturedbacterium；B24-7Bacteroidales S24_7group_uncultured bacterium；LN:Lachnospiraceae-NK4A136；R9:Ruminiclostridium 9。培养基营养物质简称：B：脱纤维羊血；BP：牛肉粉；Glu：葡萄糖；LTB：消化血清粉；Ph：磷酸盐；Pr：蛋白胨；Ye：酵母浸粉。网络具有52个节点，214个边(正相关202个、负相关12个)，节点间大多为正相关关系，提示大多数菌属间是互利共生关系。网络平均距离为2.758，平均聚集系数为0.552，节点的平均度为8.231，在可培养的细菌中，Marvinbryantia(20个边)、Prevotellaceae-NK3B31-group(20个边)、分节丝状菌(Candidatus-Arthromitus，19个边)有较多的边，说明它们是可培养细菌中的核心菌属，在群落的构成中起重要作用。通过研究菌属之间的互作关系，可通过添加相应细菌的培养物来促进或抑制与其相关细菌的生长，但并未发现与拟杆菌属显著相关的菌属(如图3所示)。
2)通过CCA典范对应分析(Canonical correspondence analysis，简称CCA分析)显示各营养成分对肠道菌生长的影响，分析哪些营养成分可促进目标菌属的生长。
培养基营养成分与肠道菌群的CCA分析使用R语言的vegan包(https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)，显著性分析(蒙特卡洛检验，MonteCarlo permutation test)在R语言的vegan包中使用以下语句：
####env significance test####
ef<-envfit(spe.cca,env,permu＝999)
sink(\"envfit.cca.txt\",append＝FALSE)
ef
sink(file＝NULL)。
(p<0.05为显著性差异，p<0.01为极显著性差异)分析可显著影响菌群的营养物质，CCA分析图中箭头表示某营养物质，箭头连线的长度代表着某个营养物质与菌群相关程度的大小，连线越长，代表这个营养物质对菌群的分布影响越大。CCA分析图中的物种垂直投影于箭头连线上，投影距离越长代表与该营养物质相关性越大，投影在箭头连线的正向上为正相关，即为该营养物质促进物种丰度增加，投影于反向延长线上为负相关，即为抑制物种丰度增加。根据此图关注促进目标菌属丰度增加的营养物质，可将其添加于培养基，富集目标菌属。
CCA分析及蒙特卡洛检验发现消化血清粉(LTB)、脱纤维羊血(B)和酵母浸粉(Ye)含量对可培养菌群组成具有显著的影响(如表2所示)。提示不同营养成分的添加可选择培养不同的细菌，如LTB的添加可富集梭菌属(Clostridium)等、脱纤维羊血的添加可富集Pelomonas、Alistipes等，而分离拟杆菌属可增加脱纤维羊血、牛肉粉含量，减少消化血清粉、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、磷酸盐(如图4所示)。
表2蒙特卡洛检验结果表
注：r2为相关性系数；p值为显著性。*表示p<0.05，营养物质对菌群组成有显著性影响；*表示p<0.01营养物质对菌群组成有显著性影响。培养基营养物质简称：B：脱纤维羊血；BP：牛肉粉；Glu：葡萄糖；LTB：消化血清粉；Ph：磷酸盐；Pr：蛋白胨；Ye：酵母浸粉。
高通量测序指导下的选择性培养策略：基于上述高通量测序分析结果，根据不同类样品菌群组成及差异菌属分析选择合适的粪便样品、稀释倍数、基础培养基定向分离细菌，再根据营养成分的添加或减少、或者添加与目标菌相关的细菌发酵液从而调整培养基成分，获得目标细菌。
6、根据上述生物信息学分析结果(上述使用的生物信息学软件均为开源)，确定所使用粪便样品、并添加细菌发酵液、培养基营养成分从而定向分离所需的目标肠道菌属(拟杆菌属)。
拟杆菌属(Bacteroides)为肠道中与疾病密切相关的菌属，也有报道其为潜在的益生菌，研究它的特性具有重要作用。
本实施例中根据上述方法，选择血液培养基(原培养基成分：1L培养基中含有蛋白胨10g，牛肉粉10g，氯化钠5g，80mL脱纤维羊血)作为基础培养基分离培养拟杆菌属，并根据CCA分析每升培养基增加5g牛肉粉、40mL脱纤维羊血，将蛋白胨含量调整至5g，使用小鼠37的粪便样品(拟杆菌属相对丰度较高)并稀释至10-6倍，将其涂布于平板上进行分离培养。
结果显示，从未调整配方的血液培养基中挑出测序的50株细菌中，发现10株拟杆菌属，序列排重后为Bacteroides thetaiotaomicron(2株)；而从调整配方后的血液培养基中挑出测序的50株细菌中，发现了26株拟杆菌属细菌，序列排重后保藏4株，近缘菌分别为Bacteroides thetaiotaomicron(2株)、Bacteroides xylanisolvens(1株)和Bacteroideseggerthii(1株)，详见表3，因此根据上述的分析结果调整后的培养基提高了分离出拟杆菌属的概率。
表3分离获得的拟杆菌属信息表
Claims (7)
1.一种定向选择性分离肠道细菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)在不同的培养基上培养待分离样品，获得特定培养菌群；
2)分别提取不同培养基培养获得的菌群样品和未培养的待分离样品的DNA，进行16SrRNA扩增子测序，获得高通量测序数据，然后进行生物信息学标准化分析；
3)根据数据分析获得目标菌属在不同培养基上丰度的变化，选择目标菌属丰度含量高的培养基，作为富集培养基；
4)通过共现网络分析细菌属间的相互作用关系，如有与目标菌属相互促进的细菌，将此类细菌培养物作为营养物质添加于富集培养基中；通过CCA典范对应分析和显著性分析各培养基中的营养成分对肠道各菌生长的影响，根据分析结果增加对于目标菌属富集具有促进作用的营养成分的量，减少对于目标菌属富集具有抑制作用的营养成分的量；得到定向分离培养基；
5)使用所述的定向分离培养基定向培养待分离样品，获得目标菌属肠道细菌。
2.根据权利要求1所述的定向选择性分离肠道细菌的方法，其特征在于：步骤3)中所述数据分析为绘制热图显示目标菌属在不同培养基上丰度的变化，选择目标菌属丰度含量高的培养基，作为富集培养基。
3.根据权利要求1所述的定向选择性分离肠道细菌的方法，其特征在于：当同一背景的待分离样品有多个时，在步骤2)中，确定目标菌属在哪个样品中丰度最大，定向培养时选择该样品。
4.根据权利要求1所述的定向选择性分离肠道细菌的方法，其特征在于：步骤1)中，所述不同的培养基为GAM培养基、RCM培养基、BH培养基、NA培养基、CM培养基、TSA培养基、BL培养基和/或MH培养基。
5.根据权利要求4所述的定向选择性分离肠道细菌的方法，其特征在于：步骤1)中所述培养是在厌氧条件下培养，氧气浓度小于0.1％。
6.根据权利要求1所述的定向选择性分离肠道细菌的方法，其特征在于：步骤1)中所述培养基为固体平板培养基；步骤2)中在提取DNA前去除生长有直径大于1cm菌落的平板。
7.根据权利要求1所述的定向选择性分离肠道细菌的方法，其特征在于：步骤1)中，将待分离样品稀释为不同的浓度，然后进行培养；然后根据不同稀释浓度培养所得到的目标菌属丰度的变化，选择目标菌属丰度含量高的稀释倍数；在定向分离培养基定向培养待分离样品时，选用该稀释倍数。
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| Jihyang Park et al..Microdroplet-Enabled Highly Parallel Co-Cultivation of Microbial Communities.《PLoS One》.2011,第6卷(第2期),第1-7页. * |
| 刘敏敏等.酸马奶中具有潜在共生性乳酸菌和酵母菌的筛选.《食品科学》.《食品科学》编辑部,2011,第32卷(第11期),第255-259页. * |
| 夏冬亮等.毛竹内生细菌分离培养基的选择.《北京农学院学报》.《北京农学院学报》编辑部,2009,第24卷(第1期),第15-19页. * |
| 柏建玲等.乳酸菌增菌培养基的营养因子优化.《食品与发酵工业》.《食品与发酵工业》编辑部,2007,第33卷(第2期),第79-81页. * |
| 邵建宁等.功能性双歧杆菌培养基的筛选与优化.《食品科学》.食品科学编辑部,2008,第29卷(第3期),第318-321页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110093276A (zh) | 2019-08-06 |
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