JP7279983B1 - 腸内細菌培養組培地、及び腸内細菌培養方法。 - Google Patents
腸内細菌培養組培地、及び腸内細菌培養方法。 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】腸内細菌のより多くの種を培養可能な培養培地、及び培養方法を提供する。【解決手段】本培養培地を用いてヒトの腸内細菌の本培養を行う前の前培養に使用可能な腸内細菌前培養培地であって、ＧＡＭ系培地に哺乳動物の血液を添加してなる腸内細菌前培養培地とする。前記哺乳動物の血液は、ヒト、ウマ、及びヒツジからなる群より選ばれる少なくとも１種の哺乳動物の血液であってよい。前記哺乳動物の血液の体積濃度は２．０％以上、６．０％（ｖ／ｖ）以下であってよい。【選択図】図１
Description
この発明は、多種の腸内細菌の培養に共通して使用可能な培養技術に関し、特に前培養に用いる培地に工夫を加えることで、多種の腸内細菌を同時に培養可能とする培養技術に関する。
近年、腸内細菌がヒトの健康状態に大きな影響を与えることが明らかになり、その機能を解明するために糞便中の腸内細菌のＤＮＡを直接解読する菌叢解析（培養を介さない解析）が盛んに行われている。しかし、菌叢解析によって得られるＤＮＡの塩基配列の半分が機能未知であるため、菌叢によってすべての腸内細菌の機能を解明することは困難であり、腸内細菌を培養して直接その機能を研究・解明することが求められている。
多くの腸内細菌について、等しい条件で表現型を比較するためには、一度に多種の細菌を培養できる培地が必要である。ところが、欧米人の腸内常在菌叢最優勢種５６種（表１参照）のうち、現在までにヒトによる培養に成功し、菌株を保存・配布している機関から入手可能な４５種、同様に、日本人の腸内常在菌叢最優勢種５０種（表２参照）のうち入手可能な４１種については、配布機関が種ごとに指定する培養液（表１、表２参照）が推奨されるという問題がある。
つまり、マルチウェルプレート等で多種の腸内細菌を同時に培養する場合、菌ごとに異なる推奨培地を用いるとすると、ウェルごとに異なる培地を用意する必要があり、これに多大な時間、労力、費用がかかるという問題が生じる。また、ウェルごとに培地が異なると、沈殿物の有無などにより、各ウェルの培養液が不均一になり、すべてのウェルで同時に菌の増殖を測定し、比較することができなくなるという問題がある。
そこで、本発明者らは、沈殿物を生成せず、かつ多数の腸内細菌種を培養できる培地の開発に着手し、前培養と本培養の両方を岐阜大学処方嫌気性培地（以下、「ＧＡＭ培地」という。）で培養する方法で、欧米人腸内常在細菌叢最優勢５６種のうち入手可能な４５種を培養し、その３２種について培養に成功している。（非特許文献１参照）。
また、非特許文献２では、ＧＡＭ培地に改良を加え、色が薄く透明度の高いｍＧＡＭ培地を用いて欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種を培養し、３４種（７６％）が増殖したことが報告されている。
また、化学的に定義されたＧＭＭなる培地により、非特許文献３では、糞便サンプルから検出される属の７０％が、非特許文献４では、その科の７１％が分離培養可能であると報告されており、また、非特許文献２では、同培地により、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種のうち３３種（７３%）が培養可能であるという報告がなされている。
Gotoh A, Nara M, Sugiyama Y, Sakanaka M, Yachi H, Kitakata A, et al. Use of Gifu Anaerobic Medium for culturing 32 dominant species of human gut microbes and its evaluation based on short-chain fatty acids fermentation profiles. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2017) 81:2009-17. doi: 10.1080/09168451.2017.1359486
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しかし、非特許文献１、乃至非特許文献４で開示された培養方法では、未だ十分な種の腸内細菌を共通して培養することができないという問題がある。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、腸内細菌のより多くの種を培養可能な培養培地、及び培養方法の提供を目的とする。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、腸内細菌のより多くの種を培養可能な培養培地、及び培養方法の提供を目的とする。
上記課題を解決するためになされた発明は、ヒトの腸内細菌の培養を行うために用いる、前培養培地と本培養培地とからなる腸内細菌培養組培地であって、前培養培地がＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地に、ウマ、ヒツジ、又はヒトの血液を加えた培地からなり、前記血液の体積濃度が２．０％以上、６．０％（ｖ／ｖ）以下であり、本培養培地がＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地からなり、
Bacteroides uniformis、Parabacteroides merdae、Dorea longicatena、Ruminococcus bromii、Bacteroides caccae、Bacteroides thetaiotaomicron、Ruminococcus torques、Ruminococcus lactaris、Collinsella aerofaciens、Dorea formicigenerans、Roseburia intestinalis、Parabacteroides distasonis、Bacteroides ovatus、Eubacterium rectale、Bacteroides xylanisolvens、Coprococcus comes、Eubacterium ventriosum、Bacteroide dorei、Ruminococcus obeum、Subdoligranulum variabile、Pseudoflavonifractor capillosus、Holdemania filiformis、Bacteroides stercoris、Bacteroides eggerthii、Butyrivibrio crossotus、Bacteroides finegoldii、Parabacteroides johnsonii、Clostridium nexile、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus gnavus、Bacteroides intestinalis、Bacteroides fragilis、Clostridium asparagiforme、Enterococcus Faecalis、Clostridium scindens、及びBlautia hanseniiからなる群のうち、Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Subdoligranulum variabile、Holdemania filiformis、及びButyrivibrio crossotusからなる群から選ばれた少なくとも一種の菌を含む複数の菌を同時に培養可能であることを特徴とする。
Bacteroides uniformis、Parabacteroides merdae、Dorea longicatena、Ruminococcus bromii、Bacteroides caccae、Bacteroides thetaiotaomicron、Ruminococcus torques、Ruminococcus lactaris、Collinsella aerofaciens、Dorea formicigenerans、Roseburia intestinalis、Parabacteroides distasonis、Bacteroides ovatus、Eubacterium rectale、Bacteroides xylanisolvens、Coprococcus comes、Eubacterium ventriosum、Bacteroide dorei、Ruminococcus obeum、Subdoligranulum variabile、Pseudoflavonifractor capillosus、Holdemania filiformis、Bacteroides stercoris、Bacteroides eggerthii、Butyrivibrio crossotus、Bacteroides finegoldii、Parabacteroides johnsonii、Clostridium nexile、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus gnavus、Bacteroides intestinalis、Bacteroides fragilis、Clostridium asparagiforme、Enterococcus Faecalis、Clostridium scindens、及びBlautia hanseniiからなる群のうち、Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Subdoligranulum variabile、Holdemania filiformis、及びButyrivibrio crossotusからなる群から選ばれた少なくとも一種の菌を含む複数の菌を同時に培養可能であることを特徴とする。
本発明の腸内細菌前培養組培地は、このようにＧＡＭ系培地にウマ、ヒツジ、又はヒトの血液を２．０％以上、６．０％（ｖ／ｖ）以下の体積濃度で添加した前培養培地を用いたので、多くの種類の腸内細菌を同時に培養することができる。
本発明の腸内細菌培養組培地は、Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Subdoligranulum variabile、Holdemania filiformis、及びButyrivibrio crossotusを同時に培養可能なことが好ましい。
本発明の腸内細菌培養組培地は、Bacteroides uniformis、Parabacteroides merdae、Dorea longicatena、Ruminococcus bromii、Bacteroides caccae、Bacteroides thetaiotaomicron、Ruminococcus torques、Ruminococcus lactaris、Collinsella aerofaciens、Dorea formicigenerans、Roseburia intestinalis、Parabacteroides distasonis、Bacteroides ovatus、Eubacterium rectale、Bacteroides xylanisolvens、Coprococcus comes、Eubacterium ventriosum、Bacteroide dorei、Ruminococcus obeum、Subdoligranulum variabile、Pseudoflavonifractor capillosus、Holdemania filiformis、Bacteroides stercoris、Bacteroides eggerthii、Butyrivibrio crossotus、Bacteroides finegoldii、Parabacteroides johnsonii、Clostridium nexile、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus gnavus、Bacteroides intestinalis、Bacteroides fragilis、Clostridium asparagiforme、Enterococcus Faecalis、Clostridium scindens、及びBlautia hanseniiを全て同時に培養可能なことが好ましい。
本発明は、ヒトの腸内細菌の培養を行うために用いる、前培養培地と本培養培地とからなる腸内細菌培養組培地を用いて、腸内細菌の培養を行う腸内細菌培養方法であって、 前培養培地がＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地に、ウマ、ヒツジ、又はヒトの血液を加えた培地からなり、前記血液の体積濃度が２．０％以上、６．０％（ｖ／ｖ）以下であり、本培養培地がＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地からなり、
Bacteroides uniformis、Parabacteroides merdae、Dorea longicatena、Ruminococcus bromii、Bacteroides caccae、Bacteroides thetaiotaomicron、Ruminococcus torques、Ruminococcus lactaris、Collinsella aerofaciens、Dorea formicigenerans、Roseburia intestinalis、Parabacteroides distasonis、Bacteroides ovatus、Eubacterium rectale、Bacteroides xylanisolvens、Coprococcus comes、Eubacterium ventriosum、Bacteroide dorei、Ruminococcus obeum、Subdoligranulum variabile、Pseudoflavonifractor capillosus、Holdemania filiformis、Bacteroides stercoris、Bacteroides eggerthii、Butyrivibrio crossotus、Bacteroides finegoldii、Parabacteroides johnsonii、Clostridium nexile、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus gnavus、Bacteroides intestinalis、Bacteroides fragilis、Clostridium asparagiforme、Enterococcus Faecalis、Clostridium scindens、及びBlautia hanseniiからなる群のうち、Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Subdoligranulum variabile、Holdemania filiformis、及びButyrivibrio crossotusからなる群から選ばれた少なくとも一種の菌を含む複数の菌を同時に培養することを特徴とする腸内細菌培養方法を含む。
Bacteroides uniformis、Parabacteroides merdae、Dorea longicatena、Ruminococcus bromii、Bacteroides caccae、Bacteroides thetaiotaomicron、Ruminococcus torques、Ruminococcus lactaris、Collinsella aerofaciens、Dorea formicigenerans、Roseburia intestinalis、Parabacteroides distasonis、Bacteroides ovatus、Eubacterium rectale、Bacteroides xylanisolvens、Coprococcus comes、Eubacterium ventriosum、Bacteroide dorei、Ruminococcus obeum、Subdoligranulum variabile、Pseudoflavonifractor capillosus、Holdemania filiformis、Bacteroides stercoris、Bacteroides eggerthii、Butyrivibrio crossotus、Bacteroides finegoldii、Parabacteroides johnsonii、Clostridium nexile、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus gnavus、Bacteroides intestinalis、Bacteroides fragilis、Clostridium asparagiforme、Enterococcus Faecalis、Clostridium scindens、及びBlautia hanseniiからなる群のうち、Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Subdoligranulum variabile、Holdemania filiformis、及びButyrivibrio crossotusからなる群から選ばれた少なくとも一種の菌を含む複数の菌を同時に培養することを特徴とする腸内細菌培養方法を含む。
本発明の腸内細菌培養方法は、Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Subdoligranulum variabile、Holdemania filiformis、及びButyrivibrio crossotusを同時に培養することが好ましい。
本発明の腸内細菌培養方法は、Bacteroides uniformis、Parabacteroides merdae、Dorea longicatena、Ruminococcus bromii、Bacteroides caccae、Bacteroides thetaiotaomicron、Ruminococcus torques、Ruminococcus lactaris、Collinsella aerofaciens、Dorea formicigenerans、Roseburia intestinalis、Parabacteroides distasonis、Bacteroides ovatus、Eubacterium rectale、Bacteroides xylanisolvens、Coprococcus comes、Eubacterium ventriosum、Bacteroide dorei、Ruminococcus obeum、Subdoligranulum variabile、Pseudoflavonifractor capillosus、Holdemania filiformis、Bacteroides stercoris、Bacteroides eggerthii、Butyrivibrio crossotus、Bacteroides finegoldii、Parabacteroides johnsonii、Clostridium nexile、Anaerotruncus colihominis、Ruminococcus gnavus、Bacteroides intestinalis、Bacteroides fragilis、Clostridium asparagiforme、Enterococcus Faecalis、Clostridium scindens、及びBlautia hanseniiを全て同時に培養することが好ましい。
本発明の腸内細菌培養方法は、前培養工程において、前培養時間の異なる腸内細菌を、本培養工程が開始する時刻からそれぞれの培養時間だけ前にマルチウェルに植菌するようにして、培養時間の長い腸内細菌から順に前記マルチウェルに植菌することが好ましい。
こうすることで、培養時間の異なる腸内細菌を培養する際に前培養時間を節約できる。
尚、ここで「マルチウェル」とは、１枚のプレートに多数のウェルを設けたマルチウェルプレートに限らず、バイアル瓶をマルチウェルプレート状に多数並べたものを含むものとする。
こうすることで、培養時間の異なる腸内細菌を培養する際に前培養時間を節約できる。
尚、ここで「マルチウェル」とは、１枚のプレートに多数のウェルを設けたマルチウェルプレートに限らず、バイアル瓶をマルチウェルプレート状に多数並べたものを含むものとする。
また、これに続く本培養工程では、前培養工程で用いた前記マルチウェルから別のマルチウェルに菌を一斉に移植したのち、当該マルチウェルに移植された細菌を同じ培養時間で本培養することが好ましい。こうすることで、多数の腸内細菌をさらに効率よく培養できる。
このように、本発明の腸内細菌培養組培地、及び腸内細菌培養方法によれば、多くの種の腸内細菌を同時に培養することができる。
以下、本発明の一の実施形態について詳述する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限られるものではない。
（腸内細菌前培養培地）
本実施形態に係る腸内細菌前培養培地（以下、単に「前培養培地」ともいう。）は、ヒトの腸内細菌を培養する際の本培養に先がけて実施される前培養に用いるもので、ＧＡＭ系培地に哺乳動物の血液を添加して形成される。
本実施形態に係る腸内細菌前培養培地（以下、単に「前培養培地」ともいう。）は、ヒトの腸内細菌を培養する際の本培養に先がけて実施される前培養に用いるもので、ＧＡＭ系培地に哺乳動物の血液を添加して形成される。
（ＧＡＭ系培地）
前培養培地の形成に用いるＧＡＭ系培地としては、ＧＡＭブイヨン、又は変法ＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地の他、ＧＡＭ寒天培地、変法ＧＡＭ寒天培地、ＧＡＭ半流動高層培地（いずれも日水製薬株式会社製を用いることができる。）を適宜に用いることができる。ＧＡＭ系培地としては、ＧＡＭブイヨン、又は変法ＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地がマルチウェルプレート上で操作しやすい点で好ましく、ＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地が、多くの腸内細菌の培養を可能とする点で、特に好ましい。
前培養培地の形成に用いるＧＡＭ系培地としては、ＧＡＭブイヨン、又は変法ＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地の他、ＧＡＭ寒天培地、変法ＧＡＭ寒天培地、ＧＡＭ半流動高層培地（いずれも日水製薬株式会社製を用いることができる。）を適宜に用いることができる。ＧＡＭ系培地としては、ＧＡＭブイヨン、又は変法ＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地がマルチウェルプレート上で操作しやすい点で好ましく、ＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地が、多くの腸内細菌の培養を可能とする点で、特に好ましい。
（混合培地）
ＧＡＭ系培地に哺乳動物の血液を添加する方法として、哺乳類の血液を含む培地をＧＡＭ系培地に混合する方法がある。ＧＡＭ系培地に混合することにより哺乳動物の血液を添加することとなる培地としては、ＥＧ培地、馬血液寒天培地（日水製薬株式会社製を用いることができる）、馬脱繊維血液添加Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｇａｒ平板培地（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製を用いることができる）が挙げられ、ＥＧ培地が、ウマの血液を含みＧＡＭ系培地に対するウマの血液の添加を容易にする点で好ましく、かつＧＡＭ系培地と混合することで多種の腸内細菌を培養可能な点で好ましい。ＧＡＭ系培地と、ＥＧ培地の体積混合比（ＧＡＭ系培地／ＥＧ培地）は、０．５以上２．０以下が好ましく、０．９以上１．１以下が特に好ましい。以下、ＧＡＭ培地とＥＧ培地の混合培地をＧＥ培地という。「ＧＡＭ系培地」と「ＥＧ培地」の混合培地は、「ＧＥ系培地」と称するものとする。
ＧＡＭ系培地に哺乳動物の血液を添加する方法として、哺乳類の血液を含む培地をＧＡＭ系培地に混合する方法がある。ＧＡＭ系培地に混合することにより哺乳動物の血液を添加することとなる培地としては、ＥＧ培地、馬血液寒天培地（日水製薬株式会社製を用いることができる）、馬脱繊維血液添加Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｇａｒ平板培地（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製を用いることができる）が挙げられ、ＥＧ培地が、ウマの血液を含みＧＡＭ系培地に対するウマの血液の添加を容易にする点で好ましく、かつＧＡＭ系培地と混合することで多種の腸内細菌を培養可能な点で好ましい。ＧＡＭ系培地と、ＥＧ培地の体積混合比（ＧＡＭ系培地／ＥＧ培地）は、０．５以上２．０以下が好ましく、０．９以上１．１以下が特に好ましい。以下、ＧＡＭ培地とＥＧ培地の混合培地をＧＥ培地という。「ＧＡＭ系培地」と「ＥＧ培地」の混合培地は、「ＧＥ系培地」と称するものとする。
（哺乳動物の血液）
ＧＡＭ系培地に添加する哺乳動物の血液としては、特に限定されず、ヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、ウサギ、ヤギ、ロバ、イヌ、ネコ等公知の哺乳動物の血液を適宜に用いることができ、ヒト、ウマ、ヒツジが、多くのヒトの腸内常在細菌を培養できる点で好ましく、ウマの血液が、より多くの腸内常在細菌を培養できる点で、特に好ましい。以下、ＧＡＭ培地にウマ血液を添加した培地をＧＢ培地といい、ヒツジの血液を添加した培地をＧＢ（ｓｈｅｅｐ）培地といい、ヒトの血液を添加した培地をＧＢ（ｈｕｍａｎ）培地という。
ＧＡＭ系培地に添加する哺乳動物の血液としては、特に限定されず、ヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、ウサギ、ヤギ、ロバ、イヌ、ネコ等公知の哺乳動物の血液を適宜に用いることができ、ヒト、ウマ、ヒツジが、多くのヒトの腸内常在細菌を培養できる点で好ましく、ウマの血液が、より多くの腸内常在細菌を培養できる点で、特に好ましい。以下、ＧＡＭ培地にウマ血液を添加した培地をＧＢ培地といい、ヒツジの血液を添加した培地をＧＢ（ｓｈｅｅｐ）培地といい、ヒトの血液を添加した培地をＧＢ（ｈｕｍａｎ）培地という。
（腸内細菌本培養培地（以下、単に「本培養培地」といいう。））
本培地用培地として用いる培地は、特に限定されないが、ＧＡＭ系培地、ＥＧ培地から馬無菌脱繊血を除去したＥＧＭＢ培地、又はＧＡＭ系培地とＥＧＭＢ培地を混合した培地を用いることができ、ＧＡＭ系培地、ＥＧ培地から馬無菌脱繊血を除去したＥＧＭＢ培地、又はＧＡＭ系培地とＥＧＭＢ培地を混合した培地が、より多種の腸内細菌を共通して培養できる点で好ましい。
また、作製が容易で、かつ透明度が高く吸光度（ＯＤ600）が測定しやすい点で、本培養にＧＡＭ液体培地を用いることが好ましい。
本培地用培地として用いる培地は、特に限定されないが、ＧＡＭ系培地、ＥＧ培地から馬無菌脱繊血を除去したＥＧＭＢ培地、又はＧＡＭ系培地とＥＧＭＢ培地を混合した培地を用いることができ、ＧＡＭ系培地、ＥＧ培地から馬無菌脱繊血を除去したＥＧＭＢ培地、又はＧＡＭ系培地とＥＧＭＢ培地を混合した培地が、より多種の腸内細菌を共通して培養できる点で好ましい。
また、作製が容易で、かつ透明度が高く吸光度（ＯＤ600）が測定しやすい点で、本培養にＧＡＭ液体培地を用いることが好ましい。
（組培地）
組培地は、前培養培地と本培養培地とからなる。上述した前培養培地と本培養培地を適宜に組み合わせて組培地とすることができるが、前培養培地と本培養培地の組合せが、ＧＥ培地とＧＡＭ系培地、ＧＢ培地とＧＡＭ系培地、ＧＥ培地とＥＧＭＢ培地、ＧＥ培地と（ＧＡＭ系培地＋ＥＧＭＢ培地）のいずれかの組合せが好ましく、ＧＢ培地とＧＡＭ系培地の組合せが特に好ましい。
組培地は、前培養培地と本培養培地とからなる。上述した前培養培地と本培養培地を適宜に組み合わせて組培地とすることができるが、前培養培地と本培養培地の組合せが、ＧＥ培地とＧＡＭ系培地、ＧＢ培地とＧＡＭ系培地、ＧＥ培地とＥＧＭＢ培地、ＧＥ培地と（ＧＡＭ系培地＋ＥＧＭＢ培地）のいずれかの組合せが好ましく、ＧＢ培地とＧＡＭ系培地の組合せが特に好ましい。
（腸内細菌培養方法）
本実施形態に係る腸内細菌培養方法は、前培養工程Ｓ１と、本培養工程Ｓ２とを備えている。本実施形態では、多種の腸内細菌について同時に培養を行う。
本実施形態に係る腸内細菌培養方法は、前培養工程Ｓ１と、本培養工程Ｓ２とを備えている。本実施形態では、多種の腸内細菌について同時に培養を行う。
（前培養工程Ｓ１）
前培養工程Ｓ１は、腸内細菌を培養するにあたり、本培養工程Ｓ２に先がけて行われる培養工程である。前培養工程Ｓ１では、前培養培地として哺乳動物の血液を添加したＧＡＭ系培地が用いられる。
前培養工程Ｓ１は、腸内細菌を培養するにあたり、本培養工程Ｓ２に先がけて行われる培養工程である。前培養工程Ｓ１では、前培養培地として哺乳動物の血液を添加したＧＡＭ系培地が用いられる。
前培養工程Ｓ１では、まず培養対象の腸内細菌を、これを保管したグリセロールストックから滅菌済みつまようじ等適宜の方法により、予め前培養培地が分注されたバイアル瓶やマルチウェルプレートに、嫌気状態で移植する。前培養培地は、前培養工程Ｓ１の開始前に作製され、嫌気状態に形成しておく。
前培養時間は、腸内細菌の種類によって異なり、培養する腸内細菌は、例えば、２４時間、４８時間、又は９６時間前培養するグループに分類され、９６時間培養するものは、本培養開始９６時間前に前培養を開始し、４８時間前培養するもの、２４時間培養するものは、それぞれ本培養を開始する４８時間、２４時間前に培養を開始する。各腸内細菌は、予め分譲機関が推奨する培地や前培養に用いる培地を、寒天培地にしたもの等の増殖が視認しやすい培地により培養を行い、一定時間ごとに増殖の度合いを目視で観察して、培養時間を決定する。培養時間は２４時間ごとに限らず、適宜の時間ごとに分けることができ、３つのグループに限らず、２以下、又は４以上のグループに分けてもよい。
ここで、培養時間の異なる腸内細菌を同じマルチウェルプレート上に順に移植することが好ましい。あるいは、バイアル瓶等で前培養した前培養時間の腸内細菌を、１枚のマルチウェルプレート上に分注してもよい。こうすることで、前培養時間の異なる腸内細菌を前培養後、コピープレートで一度に本培養用のマルチウェルプレートに移植できる。
（本培養工程Ｓ２）
本培養工程Ｓ２は、前培養工程Ｓ１で培養した腸内細菌を、本培養培地で培養を行う工程である。予め嫌気条件で保管した培地をマルチウェルプレート等に分注し、これに、前培養工程Ｓ１で培養した腸内細菌を移植して培養を行う。
本培養工程Ｓ２は、前培養工程Ｓ１で培養した腸内細菌を、本培養培地で培養を行う工程である。予め嫌気条件で保管した培地をマルチウェルプレート等に分注し、これに、前培養工程Ｓ１で培養した腸内細菌を移植して培養を行う。
腸内細菌の生育度は、例えば、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標）ＧＯマイクロプレートスペクトロフォトメータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｎｔｉｆｉｃ；製品番号５１１１９３５０）等の吸光度計によりＯＤ600を測定することにより求められる。
また、培養対象の腸内細菌が正しく培養されているかは、１６ＳｒＤＮＡのシーケンス解析を公知の方法により行うことにより確認できる。
また、培養対象の腸内細菌が正しく培養されているかは、１６ＳｒＤＮＡのシーケンス解析を公知の方法により行うことにより確認できる。
次に、本発明の実施例に係る培地を用いた試験を通じて本発明をさらに詳述する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
以下、実施例１、実施例８、実施例９は、それぞれ参考例１、参考例８、参考例９と読み替える。
（実施例１）
前培養培地としてＧＡＭ液体培地とＥＧ培地を体積比で１：１に混合したＧＥ培地を用
い、本培養培地としてＧＡＭ液体培地を用い、入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢４
５種（表１参照）を培養した。
前培養に用いるＧＥ培地を形成するＧＡＭ液体培地、及び本培養に用いるＧＡＭ液体培
地は、共に日水製薬株式会社製のＧＡＭブイヨンを用いて指示書に従い調整した。
ＥＧ培地は、ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｓ）の指示書に従い作製した。ＥＧ培地のｐＨは、ＮａＯＨによりｐＨ７．６か
ら７．８の間に調整した。ＥＧ培地の組成を表３に示す。
ＧＥ培地は、嫌気チャンバー内でＧＡＭ液体培地とＥＧ培地を１００ｍＬずつ混合して
形成し、三菱ガス化学株式会社製アネロパックと共に密閉容器に入れ、４℃で保管した。
（実施例１）
前培養培地としてＧＡＭ液体培地とＥＧ培地を体積比で１：１に混合したＧＥ培地を用
い、本培養培地としてＧＡＭ液体培地を用い、入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢４
５種（表１参照）を培養した。
前培養に用いるＧＥ培地を形成するＧＡＭ液体培地、及び本培養に用いるＧＡＭ液体培
地は、共に日水製薬株式会社製のＧＡＭブイヨンを用いて指示書に従い調整した。
ＥＧ培地は、ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｓ）の指示書に従い作製した。ＥＧ培地のｐＨは、ＮａＯＨによりｐＨ７．６か
ら７．８の間に調整した。ＥＧ培地の組成を表３に示す。
ＧＥ培地は、嫌気チャンバー内でＧＡＭ液体培地とＥＧ培地を１００ｍＬずつ混合して
形成し、三菱ガス化学株式会社製アネロパックと共に密閉容器に入れ、４℃で保管した。
欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の菌株は、表１に示した分譲機関から購入した。尚、表１の「占有順位」は欧米人人の腸内における占有順位である。
（前培養工程Ｓ１）
腸内細菌によって前培養に必要な時間が異なるため、予めＥＧ寒天培地に欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の各腸内細菌を培養し、２４時間ごとに生育度を観察して、各腸内細菌の前培養時間を求めた（表４参照）。これに基づき、腸内細菌ごとに本培養開始の２４時間前、４８時間前、９６時間前に前培養を開始した。
まず、－８０℃で保管された９６時間で生育する細菌のグリセロールストックを、本培養開始時刻の９６時間前に嫌気チャンバー内に移し、滅菌済みつまようじで当該グリセロースストックをかきとり、４ｍＬバイアル瓶に予め分注しておいたＧＥ培地３．５ ｍＬに植菌した。
バイアル瓶中のＧＥ培地と加えた菌体のグリセロールストックを、バイアル瓶を転倒することで混和し、アネロパックと共に密閉容器に入れ３７℃で９６時間培養した。
本培養開始４８時間前と２４時間前にも同様に細菌を植菌して培養した。
腸内細菌によって前培養に必要な時間が異なるため、予めＥＧ寒天培地に欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の各腸内細菌を培養し、２４時間ごとに生育度を観察して、各腸内細菌の前培養時間を求めた（表４参照）。これに基づき、腸内細菌ごとに本培養開始の２４時間前、４８時間前、９６時間前に前培養を開始した。
まず、－８０℃で保管された９６時間で生育する細菌のグリセロールストックを、本培養開始時刻の９６時間前に嫌気チャンバー内に移し、滅菌済みつまようじで当該グリセロースストックをかきとり、４ｍＬバイアル瓶に予め分注しておいたＧＥ培地３．５ ｍＬに植菌した。
バイアル瓶中のＧＥ培地と加えた菌体のグリセロールストックを、バイアル瓶を転倒することで混和し、アネロパックと共に密閉容器に入れ３７℃で９６時間培養した。
本培養開始４８時間前と２４時間前にも同様に細菌を植菌して培養した。
（本培養工程の準備）
嫌気条件下で保存した本培養のＧＡＭ培地を５００μＬずつ９６穴ディープウェルプレート（丸穴丸底, １．０ｍＬ; ＷＡＴＳＯＮ； 製品番号３７６－９６Ｒ－１０）のウェルにマルチチャンネルピペットマンを用いてリバースピペッティングで分注した。同時に１×ＰＢＳ(－)を９６穴ディープウェルプレート１枚に分注し、コピープレート９６（株式会社トッケン; 製品番号ＴＫ－ＣＰＳＴ）のピン先洗浄用プレートとした。これらの操作は嫌気チャンバー内で行った。
嫌気条件下で保存した本培養のＧＡＭ培地を５００μＬずつ９６穴ディープウェルプレート（丸穴丸底, １．０ｍＬ; ＷＡＴＳＯＮ； 製品番号３７６－９６Ｒ－１０）のウェルにマルチチャンネルピペットマンを用いてリバースピペッティングで分注した。同時に１×ＰＢＳ(－)を９６穴ディープウェルプレート１枚に分注し、コピープレート９６（株式会社トッケン; 製品番号ＴＫ－ＣＰＳＴ）のピン先洗浄用プレートとした。これらの操作は嫌気チャンバー内で行った。
（本培養工程Ｓ２）
前培養工程により培養された腸内細菌を含む前培養液５００μＬを一旦９６穴ディープウェルプレートに移した。９６ウェルプレートに入った前培養液をマルチチャンネルピペットマンで１０回ピペッティングすることで懸濁し、コピープレート９６を前培養液のプレートに３秒押しこみ、これを本培養用プレートに３秒押しこんで接種した。コピープレート９６をピン先洗浄用プレートで洗浄しながら、前培養液を３枚の本培養用の９６ウェルプレートに接種した。接種済みの９６ウェルプレートにＧａｓ Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｍｏｉｓｔｕｒｅ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｓｅａｌ（４ｔｉｔｕｄｅ； 製品番号，４ｔｉ－０５１６／９６）を貼付し、アネロパックと共に密閉容器に入れ、３７℃で９６時間培養した。
前培養工程により培養された腸内細菌を含む前培養液５００μＬを一旦９６穴ディープウェルプレートに移した。９６ウェルプレートに入った前培養液をマルチチャンネルピペットマンで１０回ピペッティングすることで懸濁し、コピープレート９６を前培養液のプレートに３秒押しこみ、これを本培養用プレートに３秒押しこんで接種した。コピープレート９６をピン先洗浄用プレートで洗浄しながら、前培養液を３枚の本培養用の９６ウェルプレートに接種した。接種済みの９６ウェルプレートにＧａｓ Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｍｏｉｓｔｕｒｅ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｓｅａｌ（４ｔｉｔｕｄｅ； 製品番号，４ｔｉ－０５１６／９６）を貼付し、アネロパックと共に密閉容器に入れ、３７℃で９６時間培養した。
（生育度の測定）
本培養工程の完了後、各腸内細菌の生育度は、ＯＤ600を指標に解析した。図１にその結果を示す。図中、生育度は３枚の９６ウェルプレートから得られた平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
尚、生育度（ＯＤ600）は、光路長が１０ｍｍのキュベットを用いて測定した６００ ｎｍにおける吸光の測定値であるところ、本実施例では、９６ウェルプレートを使用して培養液の６００ｎｍにおける吸光の測定値を測定しており、この９６ウェルプレートの光路長は１０ｍｍとは異なるため、培養液をキュベット（ザルスタッド株式会社; 製品番号, ６７．７４２Ｊ）に入れて吸光度を測定し、キュベットの吸光度 の値／プレートの吸光度の値（以下、「ファクタ」と呼ぶ。）を腸内細菌ごとに算出し、培養液をプレートで測定した際に出た値をファクタとかけることで、プレートで測定した値をキュベットで測定した値に換算した。
本培養工程の完了後、各腸内細菌の生育度は、ＯＤ600を指標に解析した。図１にその結果を示す。図中、生育度は３枚の９６ウェルプレートから得られた平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
尚、生育度（ＯＤ600）は、光路長が１０ｍｍのキュベットを用いて測定した６００ ｎｍにおける吸光の測定値であるところ、本実施例では、９６ウェルプレートを使用して培養液の６００ｎｍにおける吸光の測定値を測定しており、この９６ウェルプレートの光路長は１０ｍｍとは異なるため、培養液をキュベット（ザルスタッド株式会社; 製品番号, ６７．７４２Ｊ）に入れて吸光度を測定し、キュベットの吸光度 の値／プレートの吸光度の値（以下、「ファクタ」と呼ぶ。）を腸内細菌ごとに算出し、培養液をプレートで測定した際に出た値をファクタとかけることで、プレートで測定した値をキュベットで測定した値に換算した。
（実施例２）
前培養培地としてＧＡＭ培地にウマの血液を混合したＧＢ培地を用いた他は、実施例１と同様に、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種を培養し、培養した腸内細胞の生育度（ＯＤ600）を測定した。その結果を図１に示す。
ＧＢ培地に用いるＧＡＭ液体培地は、５００ｍＬ容メディウム瓶に、ＧＡＭブイヨン１１．８ｇとＥｌｉｘ水を入れて１９０ｍＬとし、スターラーバーとともに攪拌して完全に溶解させたのち、オートクレーブ（１１５℃、１５分）して作製し、オートクレーブ内の温度が９７℃まで下がるとすぐにアネロパック（三菱ガス化学株式会社；製品番号Ａ－０３）と共に密封容器に入れ、脱気処理しつつ常温で保存した。馬脱繊維血液（ジャパンバイオシーラム）は、予めファルコンチューブ（ＣＯＲＮＮＧ； 製品番号４３０７９１）に分注し、アネロパックと共に密封容器に入れ、１日以上嫌気処理しておいた。嫌気処理後のウマの血液を嫌気チャンバー内でＧＡＭ培地に混合してＧＢ培地を完成し、これをアネロパックと共に密封容器に入れて、使用直前まで４℃で保存した。表５にＧＢ培地の組成を示す。
前培養培地としてＧＡＭ培地にウマの血液を混合したＧＢ培地を用いた他は、実施例１と同様に、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種を培養し、培養した腸内細胞の生育度（ＯＤ600）を測定した。その結果を図１に示す。
ＧＢ培地に用いるＧＡＭ液体培地は、５００ｍＬ容メディウム瓶に、ＧＡＭブイヨン１１．８ｇとＥｌｉｘ水を入れて１９０ｍＬとし、スターラーバーとともに攪拌して完全に溶解させたのち、オートクレーブ（１１５℃、１５分）して作製し、オートクレーブ内の温度が９７℃まで下がるとすぐにアネロパック（三菱ガス化学株式会社；製品番号Ａ－０３）と共に密封容器に入れ、脱気処理しつつ常温で保存した。馬脱繊維血液（ジャパンバイオシーラム）は、予めファルコンチューブ（ＣＯＲＮＮＧ； 製品番号４３０７９１）に分注し、アネロパックと共に密封容器に入れ、１日以上嫌気処理しておいた。嫌気処理後のウマの血液を嫌気チャンバー内でＧＡＭ培地に混合してＧＢ培地を完成し、これをアネロパックと共に密封容器に入れて、使用直前まで４℃で保存した。表５にＧＢ培地の組成を示す。
また、実施例２においては、前培養液から得られた菌体からｇＤＮＡを抽出し、１６ＳｒＤＮＡのシーケンス解析を行い、結果をＢＬＡＳＴ解析した。その結果、それぞれデータベース上の目的の細菌の１６ＳｒＤＮＡ配列と一致したことから、これらの生育がコンタミネーションの結果ではないことが確認できた。
（比較例１）
前培養培地、本培養培地ともにＧＡＭ液体培地を用いた他は、実施例１と同様に、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種を培養し、培養した腸内細胞の生育度（ＯＤ600）を測定した。その結果を図１に示す。
前培養培地、本培養培地ともにＧＡＭ液体培地を用いた他は、実施例１と同様に、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種を培養し、培養した腸内細胞の生育度（ＯＤ600）を測定した。その結果を図１に示す。
（実施例３）
実施例２と同様に、前培養にＧＢ培地、本培養にＧＡＭ液体培地を用いて欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行い、本培養開始後２４時間ごとに生育度（ＯＤ600）を測定し、本培養工程における生育度の経時変化を調べた。その結果を図２－１、図２－２に示す。（１図にまとめると各グラフが小さくなるため、２図に分割して表示した。）
また、前培養完了時に得られた前培養液を用いて、１６ＳｒＤＮＡ解析を行った。
実施例２と同様に、前培養にＧＢ培地、本培養にＧＡＭ液体培地を用いて欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行い、本培養開始後２４時間ごとに生育度（ＯＤ600）を測定し、本培養工程における生育度の経時変化を調べた。その結果を図２－１、図２－２に示す。（１図にまとめると各グラフが小さくなるため、２図に分割して表示した。）
また、前培養完了時に得られた前培養液を用いて、１６ＳｒＤＮＡ解析を行った。
（実施例４）
実施例２同様、前培養にＧＢ培地を用い、本培養にＧＡＭ液体培地を用いて、入手可能な日本人腸内常在細菌叢最優勢１５種（表６参照）を培養した。当該１５種は、腸内常在細菌叢最優勢４１種のうち、入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種と重複する２６種を除いたものである。各腸内細菌の前培養時間は、予めＧＢ平板培地に各細菌を植菌して、２４時間ごとに形成されるコロニーを視認することで決定した（表６参照）。本培養時間は、実施例２では９６時間であったが、本実施例ではEggerthella lentaを除き、４８時間とし、Eggerthella lentaは、９６時間とした。培養した各腸内細菌の生育度（ＯＤ600）を測定し、１６ＳｒＤＮＡ解析を行った。その結果を図３に示す。
実施例２同様、前培養にＧＢ培地を用い、本培養にＧＡＭ液体培地を用いて、入手可能な日本人腸内常在細菌叢最優勢１５種（表６参照）を培養した。当該１５種は、腸内常在細菌叢最優勢４１種のうち、入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種と重複する２６種を除いたものである。各腸内細菌の前培養時間は、予めＧＢ平板培地に各細菌を植菌して、２４時間ごとに形成されるコロニーを視認することで決定した（表６参照）。本培養時間は、実施例２では９６時間であったが、本実施例ではEggerthella lentaを除き、４８時間とし、Eggerthella lentaは、９６時間とした。培養した各腸内細菌の生育度（ＯＤ600）を測定し、１６ＳｒＤＮＡ解析を行った。その結果を図３に示す。
（実施例５）
実施例２と同様に、前培養にＧＢ培地を用い、本培養にＧＡＭ液体培地を用いて、表７に示した重要腸内細菌（プロバイオティクス細菌、酪酸酸性菌、悪玉菌が含まれる。）を培養した。培養時間は、以下の３通りとした。
（１）ＧＢ培地を用いた前培養２４時間→ＧＡＭ培地を用いた本培養２４時間
（２）ＧＢ培地を用いた前培養２４時間→ＧＡＭ培地を用いた本培養４８時間
（３）ＧＢ培地を用いた前培養４８時間→ＧＡＭ培地を用いた本培養２４時間
（実施例６）
前培地として、ＧＡＭ培地にヒツジの血液を５％（ｖ／ｖ）添加したＧＢ（ｓｈｅｅｐ）培地を用いて、入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢種と、入手可能な日本人腸内常在細菌について、培養試験を行った。本培養時間は、４８時間とした。測定した各腸内細菌の生育度（ＯＤ６００）を図５に示す。
（実施例７）
前培地として、ＧＡＭ培地にヒトの血液を５％（ｖ／ｖ）添加したＧＢ（ｈｕｍａｎ）培地を用いて、実施例６と同じ腸内細菌について実施例６と同様に培養試験を行って、培養した各腸内細菌の生育度（ＯＤ６００）を測定した。その結果を、図６に示す。
（実施例８）
前培養培地として実施例１で用いたＥＧ培地を用い、本培養培地としてＥＧ培地から馬無菌脱繊血を除去した表８に記載のＥＧＭＢ培地を用い、入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行った。
実施例２と同様に、前培養にＧＢ培地を用い、本培養にＧＡＭ液体培地を用いて、表７に示した重要腸内細菌（プロバイオティクス細菌、酪酸酸性菌、悪玉菌が含まれる。）を培養した。培養時間は、以下の３通りとした。
（１）ＧＢ培地を用いた前培養２４時間→ＧＡＭ培地を用いた本培養２４時間
（２）ＧＢ培地を用いた前培養２４時間→ＧＡＭ培地を用いた本培養４８時間
（３）ＧＢ培地を用いた前培養４８時間→ＧＡＭ培地を用いた本培養２４時間
前培地として、ＧＡＭ培地にヒツジの血液を５％（ｖ／ｖ）添加したＧＢ（ｓｈｅｅｐ）培地を用いて、入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢種と、入手可能な日本人腸内常在細菌について、培養試験を行った。本培養時間は、４８時間とした。測定した各腸内細菌の生育度（ＯＤ６００）を図５に示す。
（実施例７）
前培地として、ＧＡＭ培地にヒトの血液を５％（ｖ／ｖ）添加したＧＢ（ｈｕｍａｎ）培地を用いて、実施例６と同じ腸内細菌について実施例６と同様に培養試験を行って、培養した各腸内細菌の生育度（ＯＤ６００）を測定した。その結果を、図６に示す。
（実施例８）
前培養培地として実施例１で用いたＥＧ培地を用い、本培養培地としてＥＧ培地から馬無菌脱繊血を除去した表８に記載のＥＧＭＢ培地を用い、入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行った。
（実施例９）
本培養培地として、ＧＡＭ液体培地とＥＧＭＢ培地を混合した（ＧＡＭ+ＥＧＭＢ）培地を用いた他は、実施例８と同様にして欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行って生育度を測定した。
（ＧＡＭ+ＥＧＭＢ）培地は、ＧＡＭ培地（実施例１参照）と、ＥＧＭＢ培地（実施例８参照）を１００ｍＬずつ嫌気チャンバー内で混合し、アネロパックと共に密閉容器に入れ常温で保存した。
本培養培地として、ＧＡＭ液体培地とＥＧＭＢ培地を混合した（ＧＡＭ+ＥＧＭＢ）培地を用いた他は、実施例８と同様にして欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行って生育度を測定した。
（ＧＡＭ+ＥＧＭＢ）培地は、ＧＡＭ培地（実施例１参照）と、ＥＧＭＢ培地（実施例８参照）を１００ｍＬずつ嫌気チャンバー内で混合し、アネロパックと共に密閉容器に入れ常温で保存した。
（結果）
（実施例１、実施例２、比較例１の結果）
図１に示すように、前培養、本培養ともにＧＡＭ培地を用いた比較例１では、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種のうち３６種（図１中の符号Ｂを付した白丸参照）のみが生育したのに対し、前培養にＧＥ培地を用いた実施例１は、当該４５種中４０種、前培養にＧＢ培地を用いた実施例２の場合は、当該４５種中３９種が十分に生育することが分かった（図１中の符号Ｃ、Ｄを付した灰色、及び黒丸参照）。
（実施例１、実施例２、比較例１の結果）
図１に示すように、前培養、本培養ともにＧＡＭ培地を用いた比較例１では、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種のうち３６種（図１中の符号Ｂを付した白丸参照）のみが生育したのに対し、前培養にＧＥ培地を用いた実施例１は、当該４５種中４０種、前培養にＧＢ培地を用いた実施例２の場合は、当該４５種中３９種が十分に生育することが分かった（図１中の符号Ｃ、Ｄを付した灰色、及び黒丸参照）。
（実施例３の結果）
実施例２同様、前培養培地にＧＢ培地を用い、本培養培地にＧＡＭ液体培地を用いて、本培養時の菌の生育度を２４時間ごとに測定したところ、図２－１、図２－２に示すように、入手可能な欧米人常在腸内細菌４５種のうち、実施例２で飼育した菌のうち２種が生育しなかった一方で、実施例２で生育しなかった１種について安定した増殖が確認され、都合３９菌種が継続的増殖を示すことが分かった。培養した菌の１６ＳｒＤＮＡ解析により、増殖した３９種すべての菌について、確実に増殖していることが確認できた。
実施例２同様、前培養培地にＧＢ培地を用い、本培養培地にＧＡＭ液体培地を用いて、本培養時の菌の生育度を２４時間ごとに測定したところ、図２－１、図２－２に示すように、入手可能な欧米人常在腸内細菌４５種のうち、実施例２で飼育した菌のうち２種が生育しなかった一方で、実施例２で生育しなかった１種について安定した増殖が確認され、都合３９菌種が継続的増殖を示すことが分かった。培養した菌の１６ＳｒＤＮＡ解析により、増殖した３９種すべての菌について、確実に増殖していることが確認できた。
（実施例４の結果）
前培養培地にＧＢ培地を用い、本培養培地にＧＡＭ液体培地を用いて、入手可能な日本人腸内常在細菌叢最優勢１５種について培養を行ったところ、図３に示すように、１４種について十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られたが、このうち２種は、１６ＳｒＤＮＡ解析により正しい菌が培養されたことが確認できなかった。従って、当該１５種のうち、１２種が培養可能であることが分かった。
前培養培地にＧＢ培地を用い、本培養培地にＧＡＭ液体培地を用いて、入手可能な日本人腸内常在細菌叢最優勢１５種について培養を行ったところ、図３に示すように、１４種について十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られたが、このうち２種は、１６ＳｒＤＮＡ解析により正しい菌が培養されたことが確認できなかった。従って、当該１５種のうち、１２種が培養可能であることが分かった。
（実施例５の結果）
前培養にＧＢ培地を用い、本培養にＧＡＭ液体培地を用いて、表９に示した重要腸内細菌２５種について培養を行ったところ２５種すべてについて、十分な生育度が得られ（ＯＤ600が０．１５以上）培養に成功した。前培養をＧＡＭ培地で行った場合と比較して培養可能な菌種数に変化はなかったが、３菌種について前培養時間が４８時間から２４時間に短縮された（表９参照）。
前培養にＧＢ培地を用い、本培養にＧＡＭ液体培地を用いて、表９に示した重要腸内細菌２５種について培養を行ったところ２５種すべてについて、十分な生育度が得られ（ＯＤ600が０．１５以上）培養に成功した。前培養をＧＡＭ培地で行った場合と比較して培養可能な菌種数に変化はなかったが、３菌種について前培養時間が４８時間から２４時間に短縮された（表９参照）。
（実施例６の結果）
前培養培地として、ヒツジの血液を５％（ｖ／ｖ）添加したＧＢ（ｓｈｅｅｐ）培地を用い、本培養培地としてＧＡＭ培地を用い、実施例３で培養可能であった入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種のうちの３９種と、実施例４で培養可能であった入手可能な日本人腸内常在細菌のうちの１２種を合わせた５１種について培養試験を行ったところ、図５に示すように、４８種について十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られた。
前培養培地として、ヒツジの血液を５％（ｖ／ｖ）添加したＧＢ（ｓｈｅｅｐ）培地を用い、本培養培地としてＧＡＭ培地を用い、実施例３で培養可能であった入手可能な欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種のうちの３９種と、実施例４で培養可能であった入手可能な日本人腸内常在細菌のうちの１２種を合わせた５１種について培養試験を行ったところ、図５に示すように、４８種について十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られた。
（実施例７の結果）
前培養培地として、ヒトの血液を５％（ｖ／ｖ）添加したＧＢ（ｈｕｍａｎ）培地を用いた他は実施例６と同様にして実施例６と同じ５１種の腸内細菌について培養試験を行ったところ、図６に示すように、４５種について十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られた。
前培養培地として、ヒトの血液を５％（ｖ／ｖ）添加したＧＢ（ｈｕｍａｎ）培地を用いた他は実施例６と同様にして実施例６と同じ５１種の腸内細菌について培養試験を行ったところ、図６に示すように、４５種について十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られた。
（実施例８、実施例９の結果）
前培養にＥＧ培地を用い、本培養にＥＧＭＢを用いて、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行ったところ、図７に示すように３９種について、十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られ、前培養にＥＧ培地を用い、本培養に（ＥＧＭＢ+ＧＡＭ）培地を用いて、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行ったところ、図６に示すように４０種について、十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られた。
前培養にＥＧ培地を用い、本培養にＥＧＭＢを用いて、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行ったところ、図７に示すように３９種について、十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られ、前培養にＥＧ培地を用い、本培養に（ＥＧＭＢ+ＧＡＭ）培地を用いて、欧米人腸内常在細菌叢最優勢４５種の培養を行ったところ、図６に示すように４０種について、十分な生育度（ＯＤ600が０．１５以上）が得られた。
Claims (6)
- ヒトの腸内細菌の培養を行うために用いる、前培養培地と本培養培地とからなる腸内細
菌培養組培地であって、
前培養培地がＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地に、ウマ、ヒツジ、又はヒト
の血液を加えた培地からなり、
前記血液の体積濃度が２．０％以上、６．０％（ｖ／ｖ）以下であり、
本培養培地がＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地からなり、
バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、パラバクテロイデス・メルダエ（Parabacteroides merdae）、ドレア・ロンジカテナ（Dorea longicatena）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、ルミノコッカス・トルクエス（Ruminococcus torques）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ruminococcus lactaris）、コリンゼラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、ドレア・フォルミシゲネランス（Dorea formicigenerans）、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Parabacteroides distasonis）、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、ユーバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、バクテロイデス・キシランソルベンス（Bacteroides xylanisolvens）、コプロコッカス・コメス（Coprococcus comes）、ユーバクテリウム・ベントリオサム（Eubacterium ventriosum）、バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）、ルミノコッカス・オベウム（Ruminococcus obeum）、サブドリグラナラム・バリアバイル（Subdoligranulum variabile）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）、ホルデマニア・フィリフォルミス（Holdemania filiformis）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroides stercoris）、バクテロイデス・エガーシー（Bacteroides eggerthii）、ブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）、バクテロイデス・ファインゴルディ（Bacteroides finegoldii）、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）、クロストリジウム・ネキシレ（Clostridium nexile）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、ルミノコッカス・グナバス（Ruminococcus gnavus）、バクテロイデス・インテスチナリス（Bacteroides intestinalis）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus Faecalis)、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、及びブラウティア・ハンセニイ（Blautia hansenii）からなる群のうち、
ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ユーバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、サブドリグラナラム・バリアバイル（Subdoligranulum variabile）、ホルデマニア・フィリフォルミス（Holdemania filiformis）、及びブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）からなる群から選ばれた少なくとも一種の菌を含む複数の菌を同時に培養可能なことを特徴とする腸内細菌培養組培地。 - 請求項1に記載の腸内細菌培養組培地であって、
ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ユーバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、サブドリグラナラム・バリアバイル（Subdoligranulum variabile）、ホルデマニア・フィリフォルミス（Holdemania filiformis）、及びブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）を同時に培養可能な腸内細菌培養組培地。 - 請求項1に記載の腸内細菌培養組培地であって、
バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、パラバクテロイデス・メルダエ（Parabacteroides merdae）、ドレア・ロンジカテナ（Dorea longicatena）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、ルミノコッカス・トルクエス（Ruminococcus torques）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ruminococcus lactaris）、コリンゼラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、ドレア・フォルミシゲネランス（Dorea formicigenerans）、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Parabacteroides distasonis）、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、ユーバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、バクテロイデス・キシランソルベンス（Bacteroides xylanisolvens）、コプロコッカス・コメス（Coprococcus comes）、ユーバクテリウム・ベントリオサム（Eubacterium ventriosum）、バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）、ルミノコッカス・オベウム（Ruminococcus obeum）、サブドリグラナラム・バリアバイル（Subdoligranulum variabile）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）、ホルデマニア・フィリフォルミス（Holdemania filiformis）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroides stercoris）、バクテロイデス・エガーシー（Bacteroides eggerthii）、ブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）、バクテロイデス・ファインゴルディ（Bacteroides finegoldii）、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）、クロストリジウム・ネキシレ（Clostridium nexile）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、ルミノコッカス・グナバス（Ruminococcus gnavus）、バクテロイデス・インテスチナリス（Bacteroides intestinalis）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus Faecalis)、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、及びブラウティア・ハンセニイ（Blautia hansenii）を全て同時に培養可能な腸内細菌培養組培地。 - ヒトの腸内細菌の培養を行うために用いる、前培養培地と本培養培地とからなる腸内細菌培養組培地を用いて、腸内細菌の培養を行う腸内細菌培養方法であって、
前培養培地がＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地に、ウマ、ヒツジ、又はヒトの血液を加えた培地からなり、
前記血液の体積濃度が２．０％以上、６．０％（ｖ／ｖ）以下であり、
本培養培地がＧＡＭブイヨンから形成したＧＡＭ液体培地からなり、
バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、パラバクテロイデス・メルダエ（Parabacteroides merdae）、ドレア・ロンジカテナ（Dorea longicatena）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、ルミノコッカス・トルクエス（Ruminococcus torques）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ruminococcus lactaris）、コリンゼラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、ドレア・フォルミシゲネランス（Dorea formicigenerans）、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Parabacteroides distasonis）、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、ユーバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、バクテロイデス・キシランソルベンス（Bacteroides xylanisolvens）、コプロコッカス・コメス（Coprococcus comes）、ユーバクテリウム・ベントリオサム（Eubacterium ventriosum）、バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）、ルミノコッカス・オベウム（Ruminococcus obeum）、サブドリグラナラム・バリアバイル（Subdoligranulum variabile）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）、ホルデマニア・フィリフォルミス（Holdemania filiformis）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroides stercoris）、バクテロイデス・エガーシー（Bacteroides eggerthii）、ブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）、バクテロイデス・ファインゴルディ（Bacteroides finegoldii）、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）、クロストリジウム・ネキシレ（Clostridium nexile）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、ルミノコッカス・グナバス（Ruminococcus gnavus）、バクテロイデス・インテスチナリス（Bacteroides intestinalis）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus Faecalis)、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、及びブラウティア・ハンセニイ（Blautia hansenii）からなる群のうち、
ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ユーバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、サブドリグラナラム・バリアバイル（Subdoligranulum variabile）、ホルデマニア・フィリフォルミス（Holdemania filiformis）、及びブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）からなる群から選ばれた少なくとも一種の菌を含む複数の菌を同時に培養することを特徴とする腸内細菌培養方法。 - 請求項４に記載の腸内細菌培養方法であって、
ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ユーバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、サブドリグラナラム・バリアバイル（Subdoligranulum variabile）、ホルデマニア・フィリフォルミス（Holdemania filiformis）、及びブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）を同時に培養する腸内細菌培養方法。 - 請求項４に記載の腸内細菌培養方法であって、
バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、パラバクテロイデス・メルダエ（Parabacteroides merdae）、ドレア・ロンジカテナ（Dorea longicatena）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、バクテロイデス・カカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、ルミノコッカス・トルクエス（Ruminococcus torques）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ruminococcus lactaris）、コリンゼラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、ドレア・フォルミシゲネランス（Dorea formicigenerans）、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Parabacteroides distasonis）、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、ユーバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、バクテロイデス・キシランソルベンス（Bacteroides xylanisolvens）、コプロコッカス・コメス（Coprococcus comes）、ユーバクテリウム・ベントリオサム（Eubacterium ventriosum）、バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）、ルミノコッカス・オベウム（Ruminococcus obeum）、サブドリグラナラム・バリアバイル（Subdoligranulum variabile）、シュードフラボニフラクター・カピローサス（Pseudoflavonifractor capillosus）、ホルデマニア・フィリフォルミス（Holdemania filiformis）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroides stercoris）、バクテロイデス・エガーシー（Bacteroides eggerthii）、ブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）、バクテロイデス・ファインゴルディ（Bacteroides finegoldii）、パラバクテロイデス・ジョンソニイ（Parabacteroides johnsonii）、クロストリジウム・ネキシレ（Clostridium nexile）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncus colihominis）、ルミノコッカス・グナバス（Ruminococcus gnavus）、バクテロイデス・インテスチナリス（Bacteroides intestinalis）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、クロストリジウム・アスパラギホルメ（Clostridium asparagiforme）、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus Faecalis)、クロストリジウム・シンデンス（Clostridium scindens）、及びブラウティア・ハンセニイ（Blautia hansenii）を全て同時に培養する腸内細菌培養方法。
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Citations (6)
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-
2022
- 2022-09-21 JP JP2022150537A patent/JP7279983B1/ja active Active
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| Title |
|---|
| NATURE MICROBIOLOGY, 2018, Vol.3, pp.514-522 |
| 感染症学会雑誌, 1971, Vol.45, No.9, pp.406-419 |
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| JP2024044791A (ja) | 2024-04-02 |
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