CN110066735B - 一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物信息学和生物技术领域，具体涉及一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法。该方法通过将不同抗生素组合应用，提高传统微生物分离计数的准确性微生物分离，利用高通量测序对微生物进行种属变化分析，根据结果确定出清香型白酒酿造过程中主体微生物，随之建立参考基因组，根据宏转录组测序数据比对参考基因组确定清香型白酒中活体微生物变化规律。本发明方法的有益效果在于：有效的抑制了培养基中杂菌的生长，大大提高了传统微生物分离计数的准确性，并有效获得活体菌株；同时结合高通量测序分析及宏转录测序分析，有效地弥补各方法之间的不足，能够准确全貌地解析清香型白酒发酵过程微生物的群落结构。

Description

一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法
技术领域
本发明涉及生物信息学和生物技术领域，具体涉及一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法。
背景技术
清香型白酒是我国最古老的酒种之一，具有清香纯正，醇甜柔和，自然谐调，余味爽净的特点。二锅头酒属于清香型白酒，因掐头去尾只取第二锅酒而得名，拥有悠久的酿造历史。二锅头酒以高粱为原料，大曲为糖化发酵剂，属多微共效的酿造过程。因此微生物在二锅头白酒发酵过程中起着关键作用，由于二锅头酒的酿造过程网罗了自然界多种微生物，形成了复杂的优势菌群，所以认识酿造微生物的群落结构是解析二锅头酿造机理的重要前题。
目前，对于白酒酿造微生物的研究主要包括微生物传统分离技术和非培养技术两种。近几年来，随着两种技术手段在白酒微生物群落研究中的应用，在取得一定成果的同时，也暴露出不足之处，如传统微生物分离虽然简单易行，可有效的获得白酒中可培养微生物数量关系及活体菌株，但由于白酒酿造属于开放式操作，环境中大量微生物在固、气、液三相界面里进行复杂的物质代谢，经长期驯化适应了缺氧、高渗透压、低PH等特殊环境，因此在人工培养模式下，往往会造成微生物之间共同协作的自然生存方式崩溃，无法全面系统分离发酵中的微生物；非培养方法，目前主要以高通量测序和变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）为主。其中，高通量测序技术可以对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析，可以快捷方便的读取样品中复杂的微生物结构，具有明显的先进性和优势。该类方法虽然不需要对样品微生物进行分离、纯化及培养，可以直接对样品微生物群落结构进行准确分析，但其检测到的是样品中所有DNA序列，无法剔除微生物死亡后存留的DNA片段，这些DNA片段将会对结果的实时性及准确性造成一定影响。而宏转录组测序分析则是一种可实时反映微生物群落基因表达情况的手段之一，其得到的信息包括样品中哪些生物在当前是活跃的，以及它们在做什么，与PCR-DGGE和高通量测序等非培养技术相比，它可以较为准确的反应当前活体菌的多样性，有效的避免死亡微生物残留DNA所带来的影响，解决了发酵过程死亡或休眠状态微生物对发酵真实结果的影响。因此，需要一种将二者优缺点结合来分析微生物群落结构的方法。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法。
通过将不同抗生素组合应用，提高传统微生物分离计数的准确性微生物分离，利用高通量测序对微生物进行种属变化分析，根据结果确定出清香型白酒酿造过程中主体微生物，随之建立参考基因组，根据宏转录组测序数据比对参考基因组确定清香型白酒中活体微生物变化规律。该方法系统真实的解析出清香型白酒酿造过程中微生物的群落结构及演替规律，从而提供一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法。
一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法。包括如下步骤：
步骤1：将样品与无菌水混合，稀释涂布不同培养基分离培养微生物发酵菌群：
（1）酵母分离培养基：酵母浸粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、琼脂20g、营养液10mL、蒸馏水1000mL、115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，28～30℃培养24～48h计数挑菌；
（2）常温丝状真菌分离培养基：KH2PO4 1g、酵母浸粉5g、蔗糖30g、琼脂20g、营养液10mL、NaNO3 3g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4.7H2O 10 mg、CuSO4.5H2O 5mg、ZnSO4.7H2O 10mg、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，30～35℃培养24～48h计数挑菌；
（3）高温丝状真菌分离培养基：土豆浸提液200mL、葡萄糖20g、琼脂20g、水600mL、营养液200mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，50℃培养24～72h计数挑菌；
（4）芽孢杆菌分离培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NACL10g、琼脂20g、营养液10mL、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板，分离样品预先经80℃水浴20min处理，30～35℃培养24～48h计数挑菌；
（5）乳酸菌分离培养基①：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液100mL、蒸馏水900mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a后倾倒平板；
（6）乳酸菌分离培养基②：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液300mL、蒸馏水700mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、5%无水乙醇后倾倒平板；
（7）放线菌分离培养基：酵母浸粉4g、麦芽膏5g、葡萄糖4g、琼脂20g、营养液100mL、水900毫升、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，15～25℃暗处培养5～30d计数挑菌；
（8）高温放线菌培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、胰蛋白胨3g、NaCl 5g、营养液400mL、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g、琼脂20g、水600mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板；分离样品预先经80℃水浴20min处理，50℃培养1～8d计数挑菌；
（9）LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、营养液100mL、蒸馏水900mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板；
步骤2：利用步骤1中不同分离培养基将样品中微生物分为酵母菌、细菌、丝状真菌三类，根据平板菌落数对样品中微生物进行定量分析，同时在每一类分离培养平板中，选取菌落数量在20～100以内的平板，挑取其上所有菌落，采用分子方法进行种属鉴定，鉴定片段为：酵母菌26srDNA序列，细菌16srDNA序列，丝状真菌18srDNA，将鉴定结果结合菌落数定量分析获得样品中微生物数量变化规律；
步骤3：提取步骤2样品中微生物总DNA，利用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序分析，获得样品中微生物的种属变化规律；
步骤4：根据步骤2的微生物分离及鉴定结果和步骤3的微生物高通量种属测序结果，确定样品中主体微生物种类，构建主体微生物参考基因组数据库；
步骤5：提取步骤2样品中微生物总RNA，利用Hiseq2000进行宏转录组测序分析，将宏转录组测序数据与步骤4构建的参考基因组数据进行比对，获得样品微生物表达量，从而确定样品活体微生物变化规律；
步骤6：将步骤2的微生物分离、步骤3的高通量测序分析及步骤5宏转录组测序数据相结合，利用宏转录组测序结果反馈微生物分离及高通量测序结果，从而分析出样品中微生物数演替规律。
进一步的，所述样品为大茬发酵酒醅或者二茬发酵酒醅。
进一步的，所述的方法可适用于食品酿造发酵系统中微生物结构分析及演替规律。
进一步的，所述的抗生素、营养液和维生素，其活性成分如下述所示：
抗生素a：50mg萘啶酮酸溶解于1ml 浓度为1mol/ L NaOH中，0.22μm微孔滤膜过滤；
抗生素b：20mg两性霉素溶解于1mL二甲基亚砜中，0.22μm微孔滤膜过滤；
抗生素c：60mg氯霉素溶解于1mL无水乙醇中；
抗生素d：50mg放线菌酮溶解于1mL二甲基亚砜中，0.22μm微孔滤膜过滤；
营养液：取清香型白酒发酵5天、15天、25天发酵酒醅共200g，加水500mL，煮沸20min，双层纱布过滤，滤液121℃灭菌30min；
维生素：维生素B1 2～5g、核黄素2～5g、维生素B3 5～10g、维生素B6 2～5g、肌醇2～5g、维生素B5 2～5g、4-氨基苯甲酸 2～5g、微生物H2～3g、钴胺素2～5g、无菌水100mL、4℃保存。
进一步的，所述的高通量测序分析方法为：
a、取50～100g样品溶解于200～400mL无菌水中，震荡混匀后，吸取5～10mL样品混合溶液10000rpm，4℃离心5min， 收集沉淀置于预冷研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末级；
b、将步骤a得到的研磨好的粉末3～5g移入灭菌后的50mL抽提管中，加入10μL月桂酸钠抽提缓冲液，反复缓慢的摇匀10～15min；按照酚：氯仿：异戊醇=25:24:1比例加入10mL混合液，反复缓慢的摇匀；12000 rpm，4℃离心20min后取出，吸取上清10～18mL于新灭菌的20mL试管中；加入12mL异丙醇，上下缓慢颠倒1～2min，-20℃沉淀30min，4℃，12000 rpm，高速离心15min，弃上清，加入1.8mL70%乙醇，反复轻轻震荡洗涤，吸取液体至2ml EP管，4℃，12000 rpm，高速离心15～20min，弃上清，重复此步骤2次；沉淀再次4℃，12000 rpm短暂离心30s，用移液器吸干残留乙醇；置于37℃干燥箱中或室温中，待白色沉淀变透明后，向其中加入0.9mLTE缓冲液（pH8.0），放置于60℃恒温箱中，期间轻微弹匀，使DNA充分溶解；加入1/100体积浓度为10mg/mLRNase，置于37℃中干燥箱消化RNA，30min后-80℃保存。
c、以步骤b中提取的总DNA为模板，扩增3次真核特异性片段ITS1区和原核特异性片段16s rDNA 的V3/V4区，ITS1区引物序列是5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'（F）和5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3'（R）；16s rDNA V3/V4区引物序列是5'-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'（F）和5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'（R）；PCR反应体系：30μL体系：15 μL Taq PCRMaster Mix（2×）、1μL引物F(10μM)、1μL引物R(10μM)、1.5μL DNA模板、11.5μL H2O；PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火1min，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，每个样品的每个区域的3次PCR扩增产物混合；
d、对步骤c中所获得的PCR产物进行磁珠纯化，浓度合格后，用KAPA Hyper PrepKit PCR-free的方法构建文库，库检合格后用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序；
e、将步骤d中获得的原始图像数据文件以FASTQ格式存储并进行质量检测，去除低质量reads；根据Paired End Reads之间的overlap关系将reads拼接成tags，利用内部编写程序去除tags两端的barcode 序列及引物序列得到raw tags，按照长度过滤掉200bp以下的tags及嵌合体等得到clean tags，利用Mothur软件以平均邻近聚类算法在0.03（或97%的相似度）水平下对Clean Tags进行OTU的聚类分析，提取每个OUT的代表序列，对全部代表序列进行注释和统计进行菌群组成分析。
进一步的，所述的宏转录组测序分析为：
a、取10～50g样品溶解于40～200mL无菌水中，震荡混匀，双层灭菌纱布过滤，吸取过滤混合液4～8mL，12000rpm，4℃离心2min，收集沉淀置于预冷研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末级；
b、取pH 8.0 的Tris-Hcl 100mmol/L、NaCl 100mmol/L、pH 8.0 的EDTA 20mmol/L及月桂酸钠 1%制备成月桂酸钠溶液备用；然后取Trizol 2mL、上述制备好的月桂酸钠溶液2mL、巯基乙醇100uL制备Trizol混合液；最后将步骤a研磨好的粉末1~3g移入到准备好的液氮预冷的Trizol混合液中，在冰上反复缓慢的摇匀10～15min；12000rpm，4℃离心15min后取出，吸取上清液；加入等体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，冰上放置1min，12000 rpm，4℃离心10min后取出，吸取上清液；加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置20～30min，12000rpm，4℃离心10min，收集沉淀；加入1mL 75%乙醇洗涤，12000 rpm，4℃离心3min，余下液体用枪头吸出；收集沉淀在无菌台上风干，风干后加入DEPC水溶解，混合液即为清香型白酒酿造微生物高质量RNA；
c、电泳检测合格后，利用磁珠纯化去除rRNA，构建转录组文库，Hiseq2000测序，测序长度每端150bp，每个样品5G数据；
d、对测序RNA数据进行质控处理，去掉adaptor、低质量reads和rRNA，将得到的转录组数据比对到参考基因组上，对参考基因组进行GO、KEGG、CAZy等相关数据的全基因组注释，通过软件Tophat将宏转录组测序数据比对到基因组数据库中，使用软件Cufflinks进行基因表达的分析，计算所有唯一匹配到各个物种基因上的read数量，并根据计数结果计算各编码基因的FPKM值。
相比于现有技术，本发明方法的有益效果在于：通过不同抗生素组合应用，有效的抑制了培养基中杂菌的生长，较为方便的获得目的菌株，大大提高了传统微生物分离计数的准确性，并有效获得活体菌株；同时结合高通量测序分析及宏转录测序分析，有效地弥补各方法之间的不足，解决了发酵环境中死亡菌体、休眠菌株对分析结果的干扰，能够准确全貌地解析清香型白酒发酵过程微生物的群落结构；加之高通量宏基因组测序的引物扩增产片段长度能很好的反应出微生物的菌群结构的信息量，且表现出很好的丰富度，为清香型白酒酿造微生物提供了一套系统科学的研究方法。
附图说明
图1为未添加抗生素和添加抗生素真菌微生物分离效果图；
图2为未添加抗生素和添加抗生素细菌微生物分离效果图；
图3为未添加抗生素和添加抗生素细菌微生物分离效果图；
图4为高酸MRS培养基分离耐酸耐酒精乳酸菌效果图；
图5为采用分离方法获得大茬发酵过程中真菌类微生物数量变化规律；
图6为采用分离方法获得大茬发酵过程中细菌类微生物数量变化规律；
图7为采用高通量测序获得大茬发酵过程中真菌演替规律；
图8为采用高通量测序获得大茬发酵过程中细菌演替规律；
图9为采用宏转录组测序获得大茬发酵过程中微生物演替规律；图10为宏转录组测序结果与传统微生物分离结果相结合，确定发酵过程中微生物演替规律。
图中：YPD培养基为酵母分离培养基；CYA培养基为常温丝状真菌分离培养基；PDA培养基为高温丝状真菌分离培养基；高酸MRS培养基为乳酸菌分离培养基②；ISP2培养基为放线菌分离培养基；改良高氏2培养基为高温放线菌培养基；肉汁培养基为芽孢杆菌分离培养基：MRS培养基为乳酸菌分离培养基①。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，对比例中将传统微生物的分离培养步骤中去除抗生素后对大茬发酵酒醅样品培养分离微生物；实施例1和2中加入抗生素组合后对大茬发酵酒醅和二茬发酵酒醅样品培养分离微生物，结合高通量测序分析及宏转录侧序分析方法解析清香型白酒发酵过程微生物的群落结构及其演替规律。
对比例
本方法建立过程中，预先进行预试验，根据牛栏山二锅头发酵过程，取样位置为地缸上、中、下的中心位置和边缘位置，取第0、3、5、7、9、13、19、23、28时大茬发酵酒醅样品300g，取样位置为发酵地缸中心距缸底50cm处，大茬发酵酒醅样品置于无菌密封袋内混匀，10min内送往实验室备用。
步骤1：称取100g大茬发酵酒醅样品溶解于400ml无菌水中，振荡器震荡混匀，进行微生物分离培养，稀释涂布不同培养基分离培养微生物发酵菌群如下（详见附图1、附图2、附图3）：
（1）酵母分离培养基：酵母浸粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、琼脂20g、营养液10mL、蒸馏水1000mL、115℃灭菌30min，室温冷却60℃，后倾倒平板，30℃培养48h计数挑菌；
（2）常温丝状真菌分离培养基：KH2PO4 1g、酵母浸粉5g、蔗糖30g、琼脂20g、营养液10mL、NaNO3 3g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4.7H2O 10 mg、CuSO4.5H2O 5mg、ZnSO4.7H2O 10mg、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，后倾倒平板，35℃培养48h计数挑菌；
（3）高温丝状真菌分离培养基：土豆浸提液200mL、葡萄糖20g、琼脂20g、水600mL、营养液200mL，115℃灭菌30min，室温冷却60℃，后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，50℃培养72h计数挑菌；
（4）芽孢杆菌分离培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NACL10g、琼脂20g、营养液10mL、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，后倾倒平板，分离样品预先经80℃水浴20min处理，35℃培养48h计数挑菌；
（5）乳酸菌分离培养基①：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液100mL、蒸馏水900mL，115℃灭菌30min，室温冷却60℃，后倾倒平板；
（6）乳酸菌分离培养基②：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液300mL、蒸馏水700mL，115℃灭菌30min，室温冷却60℃，加入5%无水乙醇后倾倒平板；
（7）放线菌分离培养基：酵母浸粉4g、麦芽膏5g、葡萄糖4g、琼脂20g、营养液100mL、水900毫升、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，25℃暗处培养30d计数挑菌；
（8）高温放线菌培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、胰蛋白胨3g、NaCl 5g、营养液400mL、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g、琼脂20g、水600mL，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，后倾倒平板；分离样品预先经80℃水浴20min处理，50℃培养8d计数挑菌；
（9）LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、营养液100mL、蒸馏水900mL，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，后倾倒平板；
步骤2：利用步骤1中不同分离培养基将样品中微生物分为酵母菌、细菌、丝状真菌三类，根据平板菌落数对样品中微生物进行定量分析，同时在每一类分离培养平板中，选取菌落数量在100以内的平板，挑取其上所有菌落，采用分子方法进行种属鉴定，鉴定片段为：酵母菌26srDNA序列，细菌16srDNA序列，丝状真菌18srDNA，将鉴定结果结合菌落数定量分析获得大茬发酵酒醅样品中微生物数量变化规律；由于培养基中未添加抗生素无法准确获得样品中微生物数量演替规律，即后续步骤未作研究。
实施例1
利用本发明方法解析牛栏山二锅头发酵微生物群落结构及其演替规律。本方法建立过程中，预先进行预试验，根据牛栏山二锅头发酵过程，取样位置为地缸上、中、下的中心位置和边缘位置，取第0、3、5、7、9、13、19、23、28时大茬发酵酒醅样品300g，取样位置为发酵地缸中心距缸底50cm处，大茬发酵酒醅样品置于无菌密封袋内混匀，10min内送往实验室备用。
步骤1：称取100g大茬发酵酒醅样品溶解于400ml无菌水中，振荡器震荡混匀，进行微生物分离培养，稀释涂布不同培养基分离培养微生物发酵菌群如下（详见附图1、附图2、附图3、附图4）：
（1）酵母分离培养基：酵母浸粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、琼脂20g、营养液10mL、蒸馏水1000mL、115℃灭菌30min，室温冷却60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，30℃培养48h计数挑菌；
（2）常温丝状真菌分离培养基：KH2PO4 1g、酵母浸粉5g、蔗糖30g、琼脂20g、营养液10mL、NaNO3 3g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4.7H2O 10 mg、CuSO4.5H2O 5mg、ZnSO4.7H2O 10mg、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，35℃培养48h计数挑菌；
（3）高温丝状真菌分离培养基：土豆浸提液200mL、葡萄糖20g、琼脂20g、水600mL、营养液200mL，115℃灭菌30min，室温冷却60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，50℃培养72h计数挑菌；
（4）芽孢杆菌分离培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NACL10g、琼脂20g、营养液10mL、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板，分离样品预先经80℃水浴20min处理，35℃培养48h计数挑菌；
（5）乳酸菌分离培养基①：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液100mL、蒸馏水900mL，115℃灭菌30min，室温冷却60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a后倾倒平板；
（6）乳酸菌分离培养基②：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液300mL、蒸馏水700mL，115℃灭菌30min，室温冷却60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、5%无水乙醇后倾倒平板；
（7）放线菌分离培养基：酵母浸粉4g、麦芽膏5g、葡萄糖4g、琼脂20g、营养液100mL、水900毫升、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，25℃暗处培养30d计数挑菌；
（8）高温放线菌培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、胰蛋白胨3g、NaCl 5g、营养液400mL、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g、琼脂20g、水600mL，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板；分离样品预先经80℃水浴20min处理，50℃培养8d计数挑菌；
（9）LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、营养液100mL、蒸馏水900mL，121℃灭菌20min，室温冷却60℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板；
步骤2：利用步骤1中不同分离培养基将样品中微生物分为酵母菌、细菌、丝状真菌三类，根据平板菌落数对样品中微生物进行定量分析，同时在每一类分离培养平板中，选取菌落数量在100以内的平板，挑取其上所有菌落，采用分子方法进行种属鉴定，鉴定片段为：酵母菌26srDNA序列，细菌16srDNA序列，丝状真菌18srDNA，将鉴定结果（详见附见表1）结合菌落数定量分析获得样品中微生物数量变化规律（详见附图5、附图6）；
表1 微生物分离鉴定结果
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步骤3：提取步骤2样品中微生物总DNA，利用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序分析，获得大茬发酵酒醅样品中微生物的种属变化规律（详见附图7、附图8）；
其中，所述的高通量测序步骤为：
a、取50～100g大茬发酵酒醅样品溶解于400mL无菌水中，震荡混匀后，吸取10mL样品混合溶液10000rpm，4℃离心5min, 收集沉淀置于预冷研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末级；
b、将步骤a得到的研磨好的粉末5g移入灭菌后的50mL抽提管中，加入10μL月桂酸钠抽提缓冲液，反复缓慢的摇匀15min；按照酚：氯仿：异戊醇=25:24:1比例加入10mL混合液，反复缓慢的摇匀；12000 rpm，4℃离心20min后取出，吸取上清18mL于新灭菌的20mL试管中；加入12mL异丙醇，上下缓慢颠倒2min，-20℃沉淀30min，4℃，12000 rpm，高速离心15min，弃上清，加入1.8mL70%乙醇，反复轻轻震荡洗涤，吸取液体至2ml EP管，4℃，12000rpm，高速离心20min，弃上清，重复此步骤两次；沉淀再次4℃，12000 rpm短暂离心30s，用移液器吸干残留乙醇；置于37℃干燥箱中，待白色沉淀变透明后，向其中加入0.9mLTE缓冲液（pH8.0），放置于60℃恒温箱中，期间轻微弹匀，使DNA充分溶解；加入1/100体积浓度为10mg/mLRNase，置于37℃中干燥箱消化RNA，30min后-80℃保存。
c、以步骤b中提取的总DNA为模板，扩增3次真核特异性片段ITS1区和原核特异性片段16s rDNA 的V3/V4区，ITS1区引物序列是5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'（F）和5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3'（R）；16s rDNA V3/V4区引物序列是5'-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'（F）和5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'（R）；PCR反应体系：30μL体系：15 μL Taq PCRMaster Mix（2×）、1μL引物F(10μM)、1μL引物R(10μM)、1.5μL DNA模板、11.5μL H2O；PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火1min，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，每个样品的每个区域的3次PCR扩增产物混合；
d、对步骤c中所获得的PCR产物进行磁珠纯化，浓度合格后，用KAPA Hyper PrepKit PCR-free的方法构建文库，库检合格后用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序；
e、将步骤d中获得的原始图像数据文件以FASTQ格式存储并进行质量检测，去除低质量reads；根据Paired End Reads之间的overlap关系将reads拼接成tags，利用内部编写程序去除tags两端的barcode 序列及引物序列得到raw tags，按照长度过滤掉200bp以下的tags及嵌合体等得到clean tags，利用Mothur软件以平均邻近聚类算法在0.03（或97%的相似度）水平下对Clean Tags进行OTU的聚类分析，提取每个OUT的代表序列，对全部代表序列进行注释和统计进行菌群组成分析。
步骤4：根据步骤2的微生物分离及鉴定结果和步骤3的微生物高通量种属测序结果，确定大茬发酵酒醅样品中主体微生物种类，构建主体微生物参考基因组数据库；
步骤5：提取步骤2样品中微生物总RNA，利用Hiseq2000进行宏转录组测序分析，将宏转录组测序数据与步骤4构建的参考基因组数据进行比对，获得大茬发酵酒醅样品微生物表达量，从而确定大茬发酵酒醅样品活体微生物变化规律（详见附图9）；
其中，宏转录组测序分析为：
a、取50g大茬发酵酒醅样品溶解于200mL无菌水中，震荡混匀，双层灭菌纱布过滤，吸取过滤混合液8mL，12000rpm，4℃离心2min，收集沉淀置于预冷研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末级；
b、取pH 8.0 的Tris-Hcl 100mmol/L、NaCl 100mmol/L、pH 8.0 的EDTA 20mmol/L及月桂酸钠 1%制备成月桂酸钠溶液备用；然后取Trizol 2mL、上述制备好的月桂酸钠溶液2mL、巯基乙醇100uL制备Trizol混合液；最后将步骤a研磨好的粉末3g移入到准备好的液氮预冷的Trizol混合液中，在冰上反复缓慢的摇匀15min；12000rpm，4℃离心15min后取出，吸取上清液；加入等体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，冰上放置1min，12000 rpm，4℃离心10min后取出，吸取上清液；加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置30min，12000 rpm，4℃离心10min，收集沉淀；加入1mL 75%乙醇洗涤，12000 rpm，4℃离心3min，余下液体用枪头吸出；收集沉淀在无菌台上风干，风干后加入DEPC水溶解，混合液即为清香型白酒酿造微生物高质量RNA；
c、电泳检测合格后，利用磁珠纯化去除rRNA，构建转录组文库，Hiseq2000测序，测序长度每端150bp，每个样品5G数据；
d、对测序RNA数据进行质控处理，去掉adaptor、低质量reads和rRNA，将得到的转录组数据比对到参考基因组上，对参考基因组进行GO、KEGG、CAZy等相关数据的全基因组注释，通过软件Tophat将宏转录组测序数据比对到基因组数据库中，使用软件Cufflinks进行基因表达的分析，计算所有唯一匹配到各个物种基因上的read数量，并根据计数结果计算各编码基因的FPKM值（详见表2）。
表2 参考基因组比对宏转录组结果
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参考基因组比对宏转录组结果，比对值在79.20~50.50%，平均值为68.19%，能够较为全面的反映出宏转录组测序结果。
步骤6：将步骤2的微生物分离、步骤3的高通量测序分析及步骤5宏转录组测序数据相结合，利用宏转录组测序结果反馈微生物分离及高通量测序结果，从而分析出样品中微生物数演替规律（详见附图10）。
实施例2
利用本发明方法解析牛栏山二锅头发酵微生物群落结构及其演替规律。本方法建立过程中，预先进行预试验，根据牛栏山二锅头发酵过程，取样位置为地缸上、中、下的中心位置和边缘位置，取第0、3、5、7、9、13、19、23、28时二茬发酵酒醅样品300g，取样位置为发酵地缸中心距缸底50cm处，二茬发酵酒醅样品置于无菌密封袋内混匀，10min内送往实验室备用。
步骤1：称取100g溶解于400ml无菌水中，振荡器震荡混匀，进行微生物分离培养，稀释涂布不同培养基分离培养微生物发酵菌群如下：
（1）酵母分离培养基：酵母浸粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、琼脂20g、营养液10mL、蒸馏水1000mL、115℃灭菌30min，室温冷却50℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，28℃培养24h计数挑菌；
（2）常温丝状真菌分离培养基：KH2PO4 1g、酵母浸粉5g、蔗糖30g、琼脂20g、营养液10mL、NaNO3 3g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4.7H2O 10 mg、CuSO4.5H2O 5mg、ZnSO4.7H2O 10mg、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却50℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，30℃培养24h计数挑菌；
（3）高温丝状真菌分离培养基：土豆浸提液200mL、葡萄糖20g、琼脂20g、水600mL、营养液200mL，115℃灭菌30min，室温冷却50℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，50℃培养24h计数挑菌；
（4）芽孢杆菌分离培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NACL10g、琼脂20g、营养液10mL、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却50℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板，分离样品预先经80℃水浴20min处理，30℃培养24h计数挑菌；
（5）乳酸菌分离培养基①：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液100mL、蒸馏水900mL，115℃灭菌30min，室温冷却50℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a后倾倒平板；
（6）乳酸菌分离培养基②：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液300mL、蒸馏水700mL，115℃灭菌30min，室温冷却50℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、5%无水乙醇后倾倒平板；
（7）放线菌分离培养基：酵母浸粉4g、麦芽膏5g、葡萄糖4g、琼脂20g、营养液100mL、水900毫升、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g，121℃灭菌20min，室温冷却50℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，15℃暗处培养5d计数挑菌；
（8）高温放线菌培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、胰蛋白胨3g、NaCl 5g、营养液400mL、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g、琼脂20g、水600mL，121℃灭菌20min，室温冷却50℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板；分离样品预先经80℃水浴20min处理，50℃培养1d计数挑菌；
（9）LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、营养液100mL、蒸馏水900mL，121℃灭菌20min，室温冷却50℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板；
步骤2：利用步骤1中不同分离培养基将二茬发酵酒醅样品中微生物分为酵母菌、细菌、丝状真菌三类，根据平板菌落数对二茬发酵酒醅样品中微生物进行定量分析，同时在每一类分离培养平板中，选取菌落数量在20以内的平板，挑取其上所有菌落，采用分子方法进行种属鉴定，鉴定片段为：酵母菌26srDNA序列，细菌16srDNA序列，丝状真菌18srDNA，将鉴定结果结合菌落数定量分析获得二茬发酵酒醅样品中微生物数量变化规律；
步骤3：提取步骤2样品中微生物总DNA，利用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序分析，获得二茬发酵酒醅样品中微生物的种属变化规律；
其中，所述的高通量测序步骤为：
a、取50g二茬发酵酒醅样品溶解于200mL无菌水中，震荡混匀后，吸取5mL样品混合溶液10000rpm，4℃离心5min, 收集沉淀置于预冷研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末级；
b、将步骤a得到的研磨好的粉末3g移入灭菌后的50mL抽提管中，加入10μL月桂酸钠抽提缓冲液，反复缓慢的摇匀10min；按照酚：氯仿：异戊醇=25:24:1比例加入10mL混合液，反复缓慢的摇匀；12000 rpm，4℃离心20min后取出，吸取上清10mL于新灭菌的20mL试管中；加入12mL异丙醇，上下缓慢颠倒1min，-20℃沉淀30min，4℃，12000 rpm，高速离心15min，弃上清，加入1.8mL70%乙醇，反复轻轻震荡洗涤，吸取液体至2ml EP管，4℃，12000rpm，高速离心15min，弃上清，重复此步骤2次；沉淀再次4℃，12000 rpm短暂离心30s，用移液器吸干残留乙醇；置于37℃室温中，待白色沉淀变透明后，向其中加入0.9mLTE缓冲液（pH8.0），放置于60℃恒温箱中，期间轻微弹匀，使DNA充分溶解；加入1/100体积浓度为10mg/mLRNase，置于37℃中干燥箱消化RNA，30min后-80℃保存。
c、以步骤b中提取的总DNA为模板，扩增3次真核特异性片段ITS1区和原核特异性片段16s rDNA 的V3/V4区，ITS1区引物序列是5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'（F）和5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3'（R）；16s rDNA V3/V4区引物序列是5'-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'（F）和5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'（R）；PCR反应体系：30μL体系：15 μL Taq PCRMaster Mix（2×）、1μL引物F(10μM)、1μL引物R(10μM)、1.5μL DNA模板、11.5μL H2O；PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火1min，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，每个样品的每个区域的3次PCR扩增产物混合；
d、对步骤c中所获得的PCR产物进行磁珠纯化，浓度合格后，用KAPA Hyper PrepKit PCR-free的方法构建文库，库检合格后用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序；
e、将步骤d中获得的原始图像数据文件以FASTQ格式存储并进行质量检测，去除低质量reads；根据Paired End Reads之间的overlap关系将reads拼接成tags，利用内部编写程序去除tags两端的barcode 序列及引物序列得到raw tags，按照长度过滤掉200bp以下的tags及嵌合体等得到clean tags，利用Mothur软件以平均邻近聚类算法在0.03（或97%的相似度）水平下对Clean Tags进行OTU的聚类分析，提取每个OUT的代表序列，对全部代表序列进行注释和统计进行菌群组成分析。
步骤4：根据步骤2的微生物分离及鉴定结果和步骤3的微生物高通量种属测序结果，确定二茬发酵酒醅样品中主体微生物种类，构建主体微生物参考基因组数据库；
步骤5：提取步骤2样品中微生物总RNA，利用Hiseq2000进行宏转录组测序分析，将宏转录组测序数据与步骤4构建的参考基因组数据进行比对，获得二茬发酵酒醅样品微生物表达量，从而确定二茬发酵酒醅样品活体微生物变化规律；
其中，宏转录组测序分析为：
a、取10g二茬发酵酒醅样品溶解于40mL无菌水中，震荡混匀，双层灭菌纱布过滤，吸取过滤混合液4mL，12000rpm，4℃离心2min，收集沉淀置于预冷研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末级；
b、取pH 8.0 的Tris-Hcl 100mmol/L、NaCl 100mmol/L、pH 8.0的EDTA 20mmol/L及月桂酸钠1%制备成月桂酸钠溶液备用；然后取Trizol 2mL、上述制备好的月桂酸钠溶液2mL、巯基乙醇100uL制备Trizol混合液；最后将步骤a研磨好的粉末1g移入到准备好的液氮预冷的Trizol混合液中，在冰上反复缓慢的摇匀10min；12000rpm，4℃离心15min后取出，吸取上清液；加入等体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，冰上放置1min，12000 rpm，4℃离心10min后取出，吸取上清液；加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置20min，12000 rpm，4℃离心10min，收集沉淀；加入1mL 75%乙醇洗涤，12000 rpm，4℃离心3min，余下液体用枪头吸出；收集沉淀在无菌台上风干，风干后加入DEPC水溶解，混合液即为清香型白酒酿造微生物高质量RNA；
c、电泳检测合格后，利用磁珠纯化去除rRNA，构建转录组文库，Hiseq2000测序，测序长度每端150bp，每个样品5G数据；
d、对测序RNA数据进行质控处理，去掉adaptor、低质量reads和rRNA，将得到的转录组数据比对到参考基因组上，对参考基因组进行GO、KEGG、CAZy等相关数据的全基因组注释，通过软件Tophat将宏转录组测序数据比对到基因组数据库中，使用软件Cufflinks进行基因表达的分析，计算所有唯一匹配到各个物种基因上的read数量，并根据计数结果计算各编码基因的FPKM值。
步骤6：将步骤2的微生物分离、步骤3的高通量测序分析及步骤5宏转录组测序数据相结合，利用宏转录组测序结果反馈微生物分离及高通量测序结果，从而分析出二茬发酵酒醅样品中微生物数演替规律。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的原理之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1：将样品与无菌水混合，稀释涂布不同培养基分离培养微生物发酵菌群：
（1）酵母分离培养基：酵母浸粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、琼脂20g、营养液10mL、蒸馏水1000mL、115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，28～30℃培养24～48h计数挑菌；
（2）常温丝状真菌分离培养基：KH2PO4 1g、酵母浸粉5g、蔗糖30g、琼脂20g、营养液10mL、NaNO3 3g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4.7H2O 10 mg、CuSO4.5H2O 5mg、ZnSO4.7H2O10mg、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，30～35℃培养24～48h计数挑菌；
（3）高温丝状真菌分离培养基：土豆浸提液200mL、葡萄糖20g、琼脂20g、水600mL、营养液200mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，50℃培养24～72h计数挑菌；
（4）芽孢杆菌分离培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NACL10g、琼脂20g、营养液10mL、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板，分离样品预先经80℃水浴20min处理，30～35℃培养24～48h计数挑菌；
（5）乳酸菌分离培养基①：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液100mL、蒸馏水900mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a后倾倒平板；
（6）乳酸菌分离培养基②：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.58g、MnSO4.H2O 0.25g、营养液300mL、蒸馏水700mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、5%无水乙醇后倾倒平板；
（7）放线菌分离培养基：酵母浸粉4g、麦芽膏5g、葡萄糖4g、琼脂20g、营养液100mL、水900毫升、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O1.5g，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，15～25℃暗处培养5～30d计数挑菌；
（8）高温放线菌培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、胰蛋白胨3g、NaCl 5g、营养液400mL、维生素1mL、CuSO4.5H2O 6.4g、FeSO4.7H2O 1.1g、MnCL2.4H2O 7.9g、ZnSO4.7H2O 1.5g、琼脂20g、水600mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板；分离样品预先经80℃水浴20min处理，50℃培养1～8d计数挑菌；
（9）LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、营养液100mL、蒸馏水900mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板；
其中，上述所述的抗生素、营养液和维生素，其活性成分如下述所示：
抗生素a：50mg萘啶酮酸溶解于1ml 浓度为1mol/ L NaOH中，0.22μm微孔滤膜过滤；
抗生素b：20mg两性霉素溶解于1mL二甲基亚砜中，0.22μm微孔滤膜过滤；
抗生素c：60mg氯霉素溶解于1mL无水乙醇中；
抗生素d：50mg放线菌酮溶解于1mL二甲基亚砜中，0.22μm微孔滤膜过滤；
营养液： 取清香型白酒发酵5天、15天、25天发酵酒醅共200g，加水500mL，煮沸20min，双层纱布过滤，滤液121℃灭菌30min；
维生素：维生素B1 2～5g、核黄素2～5g、维生素B3 5～10g、维生素B6 2～5g、肌醇2～5g、维生素B5 2～5g、4-氨基苯甲酸 2～5g、维生素H 2～3g、钴胺素2～5g、无菌水100mL、4℃保存；
步骤2：利用步骤1中不同分离培养基将样品中微生物分为酵母菌、细菌、丝状真菌三类，根据平板菌落数对样品中微生物进行定量分析，同时在每一类分离培养平板中，选取菌落数量在20～100以内的平板，挑取其上所有菌落，采用分子方法进行种属鉴定，鉴定片段为：酵母菌26srDNA序列，细菌16srDNA序列，丝状真菌18srDNA，将鉴定结果结合菌落数定量分析获得样品中微生物数量变化规律；
步骤3： 提取步骤2样品中微生物总DNA，利用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序分析，获得样品中微生物的种属变化规律；
步骤4：根据步骤2的微生物分离及鉴定结果和步骤3的微生物高通量种属测序结果，确定样品中主体微生物种类，构建主体微生物参考基因组数据库；
步骤5：提取步骤2样品中微生物总RNA，利用Hiseq2000进行宏转录组测序分析，将宏转录组测序数据与步骤4构建的参考基因组数据进行比对，获得样品微生物表达量，从而确定样品活体微生物变化规律；
步骤6：将步骤2的微生物分离、步骤3的高通量测序分析及步骤5宏转录组测序数据相结合，利用宏转录组测序结果反馈微生物分离及高通量测序结果，从而分析出样品中微生物数演替规律。
2.根据权利要求1所述的一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法，其特征在于：所述的样品为大茬发酵酒醅或者二茬发酵酒醅。
3.根据权利要求1或2所述的一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法，其特征在于：所述的分析方法可适用于食品酿造发酵系统中微生物结构分析及演替规律。
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