CN107801711A - 一种以白术内酯ⅱ为保护成分的cik细胞冻存液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以白术内酯Ⅱ为保护成分的CIK细胞冻存液，包括无血清培养基、血清和二甲基亚砜，还含有白术内酯Ⅱ，无血清培养基为RPMI 1640，血清为胎牛血清或所述CIK细胞供体的自体血清，优选CIK细胞供体的自体血清，无血清培养基、血清和二甲基亚砜按照体积比5:4:1混合。本发明发现白术内酯Ⅱ可以提高CIK细胞的冻存复苏率，且不影响CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，可以制备成CIK细胞冻存液用于CIK细胞的冻存，以保证患者在放射治疗和化学治疗后能够回输足量的CIK细胞。

Description

一种以白术内酯Ⅱ为保护成分的CIK细胞冻存液
技术领域
本发明属于细胞冻存保护领域，涉及CIK细胞冻存液，具体涉及一种以白术内酯Ⅱ为保护成分的CIK细胞冻存液。
背景技术
冻存是最常用的细胞贮藏手段，大多数肿瘤细胞经冻存复苏后仍然保持原有特性。而CIK 这一类人工诱导培养的异质性细胞，冻存时间和体系都会对其免疫表型及杀伤活性产生一定影响(参考文献：不同冻存时间对CIK细胞免疫表型及杀伤活性的影响，现代肿瘤医学，2016；不同方式冻存的外周血干细胞复苏培养CIK细胞的实验研究，现代诊断与治疗，2014；冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞内因子表达的影响，郑州大学学报，2014)。
为保证患者在放射治疗和化学治疗后能够回输足量的CIK细胞，有必要开发一种既能降低冻存对CIK细胞损伤又不影响其杀瘤活性的细胞冻存液。
白术内酯Ⅱ为白术中的一种化合物，与白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ为白术中的主要内酯成分。其化学结构式如下，生源上白术内酯Ⅲ为白术内酯Ⅰ的氧化产物，白术内酯Ⅱ为白术内酯Ⅲ的脱水产物。通常认为，白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ为白术的主要活性成分，是其抗炎和抗癌有效成分(参考文献：白术内酯类成分及其药理作用研究进展，中国药房2012年第23卷第39期)。
经研究发现白术内酯Ⅱ有诸多特别的、不同于白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以白术内酯Ⅱ为保护成分的CIK细胞冻存液。
实现本发明上述目的技术方案如下：
一种以白术内酯Ⅱ为保护成分的CIK细胞冻存液，包括无血清培养基、血清和二甲基亚砜，还含有白术内酯Ⅱ。
优选地，所述无血清培养基为RPMI 1640。
优选地，所述血清为胎牛血清或所述CIK细胞供体的自体血清，优选CIK细胞供体的自体血清。
优选地，所述无血清培养基、血清和二甲基亚砜按照体积比5:4:1混合。
优选地，所述白术内酯Ⅱ在无血清培养基、血清和二甲基亚砜混合液中的浓度为30-50μM。
白术内酯Ⅱ用于制备CIK细胞冻存液提高CIK细胞复苏率的用途。
本发明的突出优点：
本发明发现白术内酯Ⅱ可以提高CIK细胞的冻存复苏率，且不影响CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，可以制备成CIK细胞冻存液用于CIK细胞的冻存，以保证患者在放射治疗和化学治疗后能够回输足量的CIK细胞。
附图说明
图1为CIK细胞活率检测结果；
图2为CIK细胞肿瘤杀伤活性测定结果。
具体实施方式
下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。
一、实验材料
白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ自制，纯度大于98％。
二、实验方法
1、外周血单个核细胞(PBMC)的分离
采集健康志愿者外周抗凝全血，加入Ficoll-Plaque淋巴细胞分离液并进行密度梯度离心(2500r/min，25min)，提取白膜层，PBS洗涤3遍。
2、CIK细胞的培养及扩增
将PBMC悬浮于RPMI 1640完全培养液(含10％FBS)中，调整至1×106/ml，接种至培养皿中。第0天加入IFN-γ1000IU/ml，置37℃、5％CO2培养箱培养。24小时后，加入IL-21000IU/ml，抗人CD3单克隆抗体(CD3McAb)50ng/ml。此后每隔3天根据情况添加CD3 单抗、IL-2及新鲜培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养连续培养14天。取新鲜CIK细胞进行活率检测，然后直接进行杀伤实验，其余细胞经冻存、复苏后再进行检测和杀伤实验。
3、CIK细胞冻存和复苏
冻存：取诱导成熟的CIK细胞，1000r/min离心10min，弃上清液，按照如下分组加入不同组成的冻存液，分别调整细胞浓度至2×107/ml，首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置2个月。
分组及冻存液组成：
常规对照组：RPMI 1640培养基、胎牛血清和二甲基亚砜体积比5:4:1；
白术内酯Ⅱ组：在常规对照组基础上添加40μM白术内酯Ⅱ；
白术内酯Ⅰ组：在常规对照组基础上添加40μM白术内酯Ⅰ；
白术内酯Ⅲ组：在常规对照组基础上添加40μM白术内酯Ⅲ。
复苏：从-80℃低温冰箱中取出冻存的CIK细胞，迅速放入37℃水浴锅内融化，用RPMI 1640洗涤，重悬于RPMI 1640培养基中，取样测定活率，加入胎牛血清培养4h。
4、细胞活率测定
2g/L锥虫蓝染液分别与冻存前和复苏后的CIK细胞悬液1:1混匀，染色2min后，采用全自动细胞计数仪进行细胞活率测定，每个样本计数3次，取平均值。
5、肿瘤杀伤活性测定
采用实时无标记细胞分析系统(real time cellular analysis，RTCA)评估CIK细胞的杀伤活性。其原理为加入靶细胞后，靶细胞通过细胞和微电极之间的相互作用产生电信号。加入 CIK细胞后，CIK细胞作用于靶细胞导致细胞形态、黏附能力等状态发生综合变化。RTCA 系统监测实时变化，以电信号的形式反映出来。如果CIK细胞最终导致靶细胞死亡，信号降低至零；反之，对信号没有影响。具体操作过程：加入CIK细胞前1d，靶细胞(乳腺癌细胞) 按照1×105/ml的密度接种于6孔培养板；按效靶比20:1，将CIK细胞加入培养孔。基线扫描、设定细胞检测程序、设定实验孔靶细胞和效应细胞名称及数目，共培养1d后，收集实验数据，计算细胞杀伤活率。CIK细胞杀伤活率＝[靶细胞对照组吸光度值－(靶细胞实验组吸光度值－效应细胞对照组吸光度值)]/靶细胞对照组吸光度值×100％。
6、统计学处理
用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，数据采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
三、实验结果
1、CIK细胞活率
检测结果如图1所示，冻存前细胞活率为(98.7±1.1)％；与冻存前相比，常规对照组、白术内酯Ⅰ组和白术内酯Ⅲ组复苏后细胞碎片增多，细胞活率明显降低，分别为(75.1±1.9)％、(73.2±1.8)％、(77.4±1.3)％，差异有统计学意义(P＜0.05)；与常规对照组、白术内酯Ⅰ组和白术内酯Ⅲ组相比，白术内酯Ⅱ组复苏后细胞碎片明显较少，细胞活率明显升高，为(95.3± 1.5)％，比冻存前略低，但是差异不是很明显。
2、肿瘤杀伤活性
测定结果如图2所示，冻存前细胞对乳腺癌细胞的杀伤率为(63.1±5.9)％，复苏后常规对照组、白术内酯Ⅰ组和白术内酯Ⅱ组细胞对乳腺癌细胞的杀伤率分别为(60.1±6.4)％、(61.4± 7.2)％、(60.5±6.9)％，与冻存前相比无显著性差异(P＞0.05)；而复苏后白术内酯Ⅲ组细胞对乳腺癌细胞的杀伤率降低至(51.3±6.2)％。该结果证明，白术内酯Ⅱ不会影响CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
上述实施例中，冻存液中的胎牛血清可以换成CIK细胞供体的自体血清。
上述实施例证明，白术内酯Ⅱ可以提高CIK细胞的冻存复苏率，且不影响CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，可以制备成CIK细胞冻存液用于CIK细胞的冻存，以保证患者在放射治疗和化学治疗后能够回输足量的CIK细胞。
上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。

Claims (6)

1.一种以白术内酯Ⅱ为保护成分的CIK细胞冻存液，包括无血清培养基、血清和二甲基亚砜，其特征在于：还含有白术内酯Ⅱ。
2.根据权利要求1所述的CIK细胞冻存液，其特征在于：无血清培养基为RPMI 1640。
3.根据权利要求1所述的CIK细胞冻存液，其特征在于：所述血清为胎牛血清或所述CIK细胞供体的自体血清，优选CIK细胞供体的自体血清。
4.根据权利要求1所述的CIK细胞冻存液，其特征在于：所述无血清培养基、血清和二甲基亚砜按照体积比5:4:1混合。
5.根据权利要求4所述的CIK细胞冻存液，其特征在于：所述白术内酯Ⅱ在无血清培养基、血清和二甲基亚砜混合液中的浓度为30-50μM。
6.白术内酯Ⅱ用于制备CIK细胞冻存液提高CIK细胞复苏率的用途。
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