CN111040996A - 一种制备卵巢癌类器官的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种制备卵巢癌类器官的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：a、将饲养层细胞、温敏性水凝胶、卵巢癌细胞和第一培养基混合，并进行培养7‑9天，得到第一培养物；其中，所述饲养层细胞为不具备增殖功能的人子宫内膜干细胞；b、利用所述第一培养基对所述第一培养物进行换液并培养，直至卵巢癌类器官形成。本公开的方法能够利用少量卵巢癌组织或细胞培育得到与卵巢癌组织生物学信息相契合的卵巢癌类器官，而且培养成功率较高。

Description

一种制备卵巢癌类器官的方法
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种制备卵巢癌类器官的方法。
背景技术
卵巢癌是女性生殖器官常见的癌症之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。手术联合化疗是卵巢癌的主要治疗手段，多数患者首次术后化疗敏感，但随着化疗的进行，50％-70％的患者逐渐出现化疗耐药性，导致治疗效果不明显。为了进行卵巢癌的功能性测试以及药筛试验，以进一步筛选更多的特异性针对卵巢癌细胞的药物，需要获取与卵巢癌组织生物学信息相契合的卵巢癌细胞样品。
现有技术中，直接利用卵巢癌手术中获取的较大的卵巢癌组织块进行培育，并进行卵巢癌的功能性测试以及药筛试验，但是，对于复发耐药或者内脏转移的患者来说，通过手术获取较大组织块的难度较大，因此，亟需开发一种利用少量卵巢癌组织或细胞培育卵巢癌细胞样品的方法。
发明内容
本公开的目的是提供一种制备卵巢癌类器官的方法，该方法能够利用少量卵巢癌组织或细胞培育得到与卵巢癌组织生物学信息相契合的卵巢癌类器官。
为了实现上述目的，本公开提供一种制备卵巢癌类器官的方法，该方法包括如下步骤：
a、将饲养层细胞、温敏性水凝胶、卵巢癌细胞和第一培养基混合，并进行培养9-12天，得到第一培养物；其中，所述饲养层细胞为不具备增殖功能的人子宫内膜干细胞；
b、利用所述第一培养基对所述第一培养物进行换液并培养，直至卵巢癌类器官形成。
可选地，所述饲养层细胞为经辐照失去增殖功能的人子宫内膜干细胞，所述饲养层细胞的制备方法包括：
将人子宫内膜干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中，并于第二培养基中培养24-36h，然后对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照，得到所述饲养层细胞。
可选地，所述将人子宫内膜干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中时，每个培养孔中含有45-60μL所述温敏性水凝胶，每个培养孔中铺设2000-5000个所述人子宫内膜干细胞；所述第二培养基的使用量为80-100μL。
可选地，所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述第二培养基为StemediaTM WIT-ITM培养基。
可选地，所述对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照时，辐照剂量为80-100KV，辐照时间为25-30min。
可选地，步骤a中，所述将饲养层细胞、温敏性水凝胶、卵巢癌细胞和第一培养基混合时，相对于5000个所述卵巢癌细胞，所述饲养层细胞的用量为5000-15000个，所述温敏性水凝胶的用量为45-60μL，所述第一培养基的用量为80-100μL。
可选地，所述第一培养基中含有StemediaTM WIT-ITM培养基和10-15μM选择性的p160ROCK抑制剂Y-27632 dihydrochloride。
可选地，步骤b中，所述利用所述第一培养基对所述第一培养物进行换液并培养，直至卵巢癌类器官形成，包括：
b1、利用所述第一培养基对所述第一培养物进行半量换液，然后进行培养3-4天，得到第二培养物；
b2、利用所述第一培养基对所述第二培养物进行半量换液，然后进行培养3-4天，得到第三培养物；
b3、利用所述第一培养基对所述第三培养物进行全量换液，然后进行培养，每隔3-4天进行一次全量换液，直至卵巢癌类器官形成。
可选地，所述培养为恒温培养，所述恒温培养的温度为36-37℃。
可选地，所述卵巢癌细胞由卵巢癌穿刺组织经酶解后得到，所述酶解过程中使用的酶为胶原酶II型。
通过上述技术方案，本公开的方法能够利用少量卵巢癌组织或细胞培育得到与卵巢癌组织生物学信息相契合的卵巢癌类器官，而且培养成功率较高。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供一种制备卵巢癌类器官的方法，该方法包括如下步骤：a、将饲养层细胞、温敏性水凝胶、卵巢癌细胞和第一培养基混合，并进行培养9-12天，得到第一培养物；其中，所述饲养层细胞为不具备增殖功能的人子宫内膜干细胞；b、利用所述第一培养基对所述第一培养物进行换液并培养，直至卵巢癌类器官形成。
本公开的发明人发现，利用体积较小的卵巢癌组织培养卵巢癌类器官的难点可能在于：体积较小的卵巢癌组织含有的细胞数量较少，在体外培养环境与体内差异较大的情况下，卵巢癌细胞大量死亡，导致卵巢癌类器官培育失败。本公开的发明人尝试使用不具备增殖功能的人子宫内膜干细胞作为卵巢癌类器官培育的饲养层细胞，出乎意料的发现其能大幅提高卵巢癌类器官培育的成功率，由此得到了本公开。
通过上述技术方案，本公开的方法利用不具备增殖功能的人子宫内膜干细胞作为卵巢癌类器官培育的饲养层细胞，能够提供适合卵巢癌细胞生长增殖的细胞因子以及与体内环境更加类似的胞外生长环境，少量的卵巢癌细胞即能在饲养层细胞中良好生长和增殖，因此，本公开的方法能够利用少量卵巢癌组织或细胞培育得到与卵巢癌组织生物学信息相契合的卵巢癌类器官，而且培养成功率较高。
根据本公开，不具备增殖功能的人子宫内膜干细胞均可用作本公开的饲养层细胞，优选地，本公开所采用的饲养层细胞为经辐照失去增殖功能的人子宫内膜干细胞，可以通过如下方法制备得到：将人子宫内膜干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中，并于第二培养基中培养24-36h，然后对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照，得到所述饲养层细胞。利用上述方法制备得到的不具备增殖功能的人子宫内膜干细胞的细胞活性较好，能更好地提供适合卵巢癌细胞生长增殖的细胞因子以及与体内环境更加类似的胞外生长环境。
优选地，所述将人子宫内膜干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中时，每个培养孔中含有46-60μL所述温敏性水凝胶，每个培养孔中铺设2000-5000个所述人子宫内膜干细胞；所述第二培养基的使用量为80-100μL。
优选地，所述细胞培养板可以为96孔细胞培养板，所述第二培养基可以为StemediaTM WIT-ITM培养基。
优选地，所述对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照时，辐照剂量可以为80-100KV，辐照时间可以为25-30min。
根据本公开，步骤a中，饲养层细胞、温敏性水凝胶、卵巢癌细胞和第一培养基的相对用量可以在较大的范围内变化，例如，所述将饲养层细胞、温敏性水凝胶、卵巢癌细胞和第一培养基混合时，相对于5000个所述卵巢癌细胞，所述饲养层细胞的用量可以为5000-15000个，所述温敏性水凝胶的用量可以为45-60μL，所述第一培养基的用量可以为80-100μL。
优选地，所述第一培养基中含有StemediaTM WIT-ITM培养基和10-15μM选择性的p160ROCK抑制剂Y-27632 dihydrochloride。
根据本公开，为了保证卵巢癌细胞充分生长以得到卵巢癌类器官，优选情况下，步骤b中，所述利用所述第一培养基对所述第一培养物进行换液并培养，直至卵巢癌类器官形成，包括：b1、利用所述第一培养基对所述第一培养物进行半量换液，然后进行培养3-4天，得到第二培养物；b2、利用所述第一培养基对所述第二培养物进行半量换液，然后进行培养3-4天，得到第三培养物；b3、利用所述第一培养基对所述第三培养物进行全量换液，然后进行培养，每隔3-4天进行一次全量换液，直至卵巢癌类器官形成。
优选地，所述培养为恒温培养，所述恒温培养的温度为36-37℃。
优选地，所述卵巢癌细胞由卵巢癌穿刺组织经酶解后得到，所述酶解过程中使用的酶为胶原酶II型。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。本公开实施例所涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
在本公开实施例中未注明具体实验温度时，实验温度均为室温(20-25℃)。本公开实施例中使用的试剂来源如下：
StemediaTM WIT-ITM培养基(catalog no.00-0045-500)购于美国Stemgent公司；Cosmo温敏性水凝胶购于Cosmo Bio公司；胎牛血清蛋白(fetal bovine serum FBS)购于内蒙古金源康生物工程有限公司；青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)购于上海生工生物工程股份有限公司；p160ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride、collagenasetype II购于美国Invitrogen公司；胶原蛋白水解酶(Collagenase)购于美国Sigma--Aldrich公司。
实施例
1、饲养层细胞制备
将人子宫内膜干细胞(北京科瑞思搏，CE20016)按每孔约5000个细胞的密度铺板于每孔含有50μl Cosmo温敏性水凝胶的96孔板中，并于StemediaTM WIT-ITM培养基中在37℃条件下培养24h。培养结束后，将铺有人子宫内膜干细胞的96孔板整板置于X射线辐照仪中进行辐照，辐照的射线剂量为80KV，辐照时间为30min，辐照结束后的人子宫内膜干细胞作为饲养层细胞备用。
2、穿刺组织的保存
将新鲜卵巢癌穿刺组织样本保存于含有青霉素150U/ml、链霉素150ug/ml的StemediaTM WIT-ITM培养基中，并于48小时内4℃冷链运输至实验室。
3、卵巢癌细胞获取
将卵巢癌穿刺组织样本剪碎，并加入5ml含有5mg/ml胶原酶II型的StemediaTMWIT-ITM培养基，然后置于37℃恒温培养箱中酶解0.5-2小时；酶解后的物料利用70μm细胞筛研磨过筛，然后用含有10％FBS的StemediaTM WIT-ITM培养基终止其消化，并于300g离心条件下离心3min，弃上清，所得沉淀即为卵巢癌细胞。
4、卵巢癌类器官制备
利用含有10μM选择性的p160ROCK抑制剂Y-27632dihydrochloride的StemediaTMWIT-ITM培养基稀释卵巢癌细胞并计数，以5000个卵巢癌细胞每孔的密度将稀释后的卵巢癌细胞种植于经辐照后的铺有人子宫内膜干细胞的96孔板上，其中，每孔含有100ml含有10μM选择性的p160ROCK抑制剂Y-27632 dihydrochloride的StemediaTM WIT-ITM培养基，将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养，培养第3天、第6天进行培养基半数换液，后面每3天更换培养基，直至类器官形成。
对比例
按照实施例中的方法进行操作，不同的是，采用2D培养方法培养人子宫内膜干细胞，并且收集人子宫内膜干细胞培养时的上清液作为培养基组分，进行类器官培养。
测试例
分别进行实施例和对比例的操作各36次，进行形态学及免疫荧光染色检测肿瘤标记物鉴定样本是否培养成功，分别统计实施例和对比例方法的类器官培养成功率(成功率＝成功次数/36×100％)，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002306919180000071
从表1可以看出，本公开的方法能够利用少量卵巢癌组织或细胞培育得到与卵巢癌组织生物学信息相契合的卵巢癌类器官，而且培养成功率较高。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种制备卵巢癌类器官的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
a、将饲养层细胞、温敏性水凝胶、卵巢癌细胞和第一培养基混合，并进行培养9-12天，得到第一培养物；其中，所述饲养层细胞为不具备增殖功能的人子宫内膜干细胞；
b、利用所述第一培养基对所述第一培养物进行换液并培养，直至卵巢癌类器官形成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述饲养层细胞为经辐照失去增殖功能的人子宫内膜干细胞，所述饲养层细胞的制备方法包括：
将人子宫内膜干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中，并于第二培养基中培养24-36h，然后对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照，得到所述饲养层细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将人子宫内膜干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中时，每个培养孔中含有45-60μL所述温敏性水凝胶，每个培养孔中铺设2000-5000个所述人子宫内膜干细胞；所述第二培养基的使用量为80-100μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述第二培养基为StemediaTM WIT-ITM培养基。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照时，辐照剂量为80-100KV，辐照时间为25-30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述将饲养层细胞、温敏性水凝胶、卵巢癌细胞和第一培养基混合时，相对于5000个所述卵巢癌细胞，所述饲养层细胞的用量为5000-15000个，所述温敏性水凝胶的用量为45-60μL，所述第一培养基的用量为80-100μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养基中含有StemediaTM WIT-ITM培养基和10-15μM选择性的p160ROCK抑制剂Y-27632dihydrochloride。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，所述利用所述第一培养基对所述第一培养物进行换液并培养，直至卵巢癌类器官形成，包括：
b1、利用所述第一培养基对所述第一培养物进行半量换液，然后进行培养3-4天，得到第二培养物；
b2、利用所述第一培养基对所述第二培养物进行半量换液，然后进行培养3-4天，得到第三培养物；
b3、利用所述第一培养基对所述第三培养物进行全量换液，然后进行培养，每隔3-4天进行一次全量换液，直至卵巢癌类器官形成。
9.根据权利要求1或权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养为恒温培养，所述恒温培养的温度为36-37℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述卵巢癌细胞由卵巢癌穿刺组织经酶解后得到，所述酶解过程中使用的酶为胶原酶II型。
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