CN117511880B - 肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用 - Google Patents
肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117511880B CN117511880B CN202410022261.7A CN202410022261A CN117511880B CN 117511880 B CN117511880 B CN 117511880B CN 202410022261 A CN202410022261 A CN 202410022261A CN 117511880 B CN117511880 B CN 117511880B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tumor
- vitro
- cells
- tissue
- model
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 183
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 127
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 29
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 54
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 34
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 21
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 18
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 17
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 103
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 46
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 46
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 46
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 23
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 23
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 206010025066 Lung carcinoma cell type unspecified stage 0 Diseases 0.000 description 9
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 7
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 6
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 4
- 102100031250 Disks large-associated protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 101000731000 Homo sapiens Membrane-associated progesterone receptor component 1 Proteins 0.000 description 4
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 4
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 4
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- -1 ki67 Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010073073 Hepatobiliary cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010052399 Neuroendocrine tumour Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000016065 neuroendocrine neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请涉及生物组织工程技术领域，公开一种肿瘤体外原位模型的构建方法，包括：将肿瘤组织清洗物理破碎获得微米级粒径的肿瘤组织破碎样本；将破碎样本洗涤并离心处理获得肿瘤组织破碎样本沉淀物，再向肿瘤组织破碎样本沉淀物中加入肿瘤基质胶混匀得待接种组织混合物；将混合物接种至孔板上，固胶培养后加入培养基培养。采用微米级破碎样本进行培养，构建的肿瘤体外原位模型能保留肿瘤组织内原本驻留的各种间质细胞、免疫细胞，仿生性更高，更能反映肿瘤患者真实的肿瘤微环境。构建周期短，在至少一周内保持较高的间质细胞、免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，满足下游药敏检测以及临床的实际需求。本申请还公开肿瘤体外原位模型及体外应用。
Description
技术领域
本申请涉及生物组织工程技术领域，例如涉及一种肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基和肿瘤体外原位模型体外应用。
背景技术
肿瘤的发生和发展过程中，免疫系统扮演着关键的角色。肿瘤微环境中间质细胞、免疫细胞和肿瘤细胞相互作用在很大程度上反映了肿瘤的进展和药物响应。因此在体外构建仿生的肿瘤模型将有助于药物研发及个体化精准治疗。免疫系统由多种不同类型的细胞组成，包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK) 细胞、巨噬细胞等。每种细胞类型都有其特定的功能和在抗肿瘤免疫应答中的角色。另外，不同的免疫细胞在体外培养的条件不同，甚至有些细胞在体外难以长时间存活。
在实现本公开实施例的过程中，发现相关技术中至少存在如下问题：现有的肿瘤体外模型大都是重构混合的共培养模型，这些模型都无法保留肿瘤组织内原本驻留的各种类型的间质细胞、免疫细胞、仿真的细胞比例、空间位置关系、与肿瘤互作时的细胞状态等，因此，重构混合的共培养模型的仿生性差，无法反映肿瘤患者真实的免疫微环境。
发明内容
为了对披露的实施例的一些方面有基本的理解，下面给出了简单的概括。所述概括不是泛泛评述，也不是要确定关键／重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围，而是作为后面的详细说明的序言。
本公开实施例提供一种肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基和体外应用，以解决现有的体外重构的共培养模型的仿生性差，无法反映肿瘤患者真实的免疫微环境的问题。
在一些实施例中，所述肿瘤体外原位模型的构建方法，包括：将肿瘤组织进行清洗，然后物理破碎，获得肿瘤组织破碎样本；其中，肿瘤组织破碎样本的粒径为微米级；将肿瘤组织破碎样本进行洗涤，并离心处理获得肿瘤组织破碎样本沉淀物；向肿瘤组织破碎样本沉淀物中加入肿瘤免疫基质胶，在低于10℃的温度下混匀，获得待接种组织混合物；将待接种组织混合物接种至孔板上，固胶培养，固胶完成后，加入培养基，培养。
在一些实施例中，所述用于前述任一项肿瘤体外原位模型的构建方法的培养基；培养基包括复合DMEM培养基和50～500 UI/mL 的IL2，其中，按体积百分比，复合DMEM培养基包括88%～96% 的DMEM培养基、2%～12% 的FBS（或其他血清替代物）和0.5%～2% 的PS。
在一些实施例中，所述肿瘤体外原位模型，通过前述的肿瘤体外原位模型的构建方法构建获得。
在一些实施例中，前述构建的肿瘤体外原位模型在肿瘤微环境分析、体外免疫细胞提取扩增、临床肿瘤化靶、免疫药物敏感性检测上的体外应用。
本公开实施例提供的肿瘤体外原位模型的构建方法和肿瘤体外原位模型及应用，可以实现以下技术效果：
本公开实施例提供的瘤体外原位模型的构建方法中，通过将肿瘤组织物理破碎为粒径为微米级的肿瘤组织破碎样本，该肿瘤组织破碎样本中粒径为微米级的颗粒样本保留了肿瘤组织内原本驻留的各种免疫细胞，且该微米级的颗粒样本的体积大小能保证在培养过程每一颗粒样本内部的细胞也能够获取到培养基，从而能够维持活性。因此，通过该构建方法构建获得的肿瘤体外原位模型能够保留肿瘤组织内原本驻留的各种免疫细胞，与原始肿瘤组织具有高度的相似性，仿生性更高，更能反映肿瘤患者真实的免疫微环境。而且构建周期短，且可在至少7天内保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，满足下游药敏检测，更能满足临床的实际需求。
以上的总体描述和下文中的描述仅是示例性和解释性的，不用于限制本申请。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图进行示例性说明，这些示例性说明和附图并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件示为类似的元件，附图不构成比例限制，并且其中：
图1是本公开实施例提供的一种肿瘤体外原位模型的构建方法的流程框图；
图2是实施例1构建的肺癌体外原位模型和原始组织的合并、肿瘤细胞（panCK）、间质细胞（Vimentin）、PDL1、Ki67、免疫细胞（CD3）和DAP1的荧光染色图；
图3是实施例1构建的肺癌体外原位模型和原始组织的肿瘤细胞（panCK+）/间质细胞（Vimentin+）的流式检测结果柱状图；
图4是实施例1构建的肺癌体外原位模型和原始组织的肿瘤区T细胞占比的流式检测结果柱状图；
图5是实施例1构建的肺癌体外原位模型和原始组织的肿瘤细胞PD-L1表达比例的流式检测结果柱状图；
图6是实施例1构建的肺癌体外原位模型和原始组织的肿瘤细胞Ki67比例的流式检测结果柱状图；
图7是实施例1构建的肺癌体外原位模型中培养7天与原始组织的T细胞（CD3+）的活细胞性占比的流式检测结果柱状图；
图8是实施例1构建的肺癌体外原位模型中培养7天与原始组织的各类免疫细胞在总免疫细胞的占比的流式检测结果柱状图；
图9是实施例5构建的肠癌体外原位模型和原始组织的合并、肿瘤细胞（panCK）、间质细胞（Vimentin）、PDL1、Ki67、免疫细胞（CD3）和DAP1的荧光染色图；
图10是实施例7构建的肠癌体外原位模型和原始组织的肿瘤细胞（panCK）/间质细胞（Vimentin）的流式检测结果柱状图；
图11是实施例7构建的肠癌体外原位模型和原始组织的肿瘤区T细胞占比的流式检测结果柱状图；
图12是实施例7构建的肠癌体外原位模型和原始组织的肿瘤细胞PD-L1表达比例的流式检测结果柱状图；
图13是实施例7构建的肠癌体外原位模型和原始组织的肿瘤细胞Ki67比例的流式检测结果柱状图；
图14是实施例7构建的肠癌体外原位模型中不同培养时间的T细胞（CD3+）的活细胞性占比的流式检测结果柱状图；
图15是实施例7构建的肠癌体外原位模型中不同培养时间的各类免疫细胞在总免疫细胞的占比的流式检测结果柱状图。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本公开实施例的特点与技术内容，下面结合附图对本公开实施例的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本公开实施例。在以下的技术描述中，为方便解释起见，通过多个细节以提供对所披露实施例的充分理解。然而，在没有这些细节的情况下，一个或多个实施例仍然可以实施。在其它情况下，为简化附图，熟知的结构和装置可以简化展示。
本公开实施例的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本公开实施例的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
本公开实施例中，术语“上”、“下”、“内”、“中”、“外”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本公开实施例及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本公开实施例中的具体含义。
另外，术语“设置”、“连接”、“固定”应做广义理解。例如，“连接”可以是固定连接，可拆卸连接，或整体式构造；可以是机械连接，或电连接；可以是直接相连，或者是通过中间媒介间接相连，又或者是两个装置、元件或组成部分之间内部的连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本公开实施例中的具体含义。
除非另有说明，术语“多个”表示两个或两个以上。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开实施例中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
结合图1所示，本公开实施例提供一种肿瘤体外原位模型的构建方法，包括以下步骤：
S10、将肿瘤组织进行清洗，然后物理破碎，获得肿瘤组织破碎样本；其中，肿瘤组织破碎样本的粒径为微米级。
S20、将肿瘤组织破碎样本进行洗涤，并离心处理获得肿瘤组织破碎样本沉淀物。
S30、向肿瘤组织破碎样本沉淀物中加入肿瘤免疫基质胶，在低于10℃的温度下混匀，获得待接种组织混合物。
S40、将待接种组织混合物接种至孔板上，固胶培养，固胶完成后，加入培养基，培养。
本公开实施例的肿瘤体外原位模型的构建方法中，通过将肿瘤组织物理破碎为粒径为微米级的肿瘤组织破碎样本，该肿瘤组织破碎样本中粒径为微米级的颗粒样本保留了肿瘤组织内原本驻留的各种免疫细胞，且该微米级的颗粒样本的体积大小能保证在培养过程每一颗粒样本内部的细胞也能够获取到培养基，从而能够保持活性，原位生长。因此，通过该构建方法构建获得的肿瘤体外原位模型能够保留肿瘤组织内原本驻留的各种免疫细胞，与原始肿瘤组织具有高度的相似性，仿生性更高，更能反映肿瘤患者真实的免疫微环境。而且构建周期短，且可在至少7天内保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，满足下游药敏检测，更能满足临床的实际需求。
本公开实施例的肿瘤体外原位模型的构建方法是一种泛肿瘤体外原位模型的构建，适用于肺癌、肠癌、胃癌、胆囊癌、乳腺癌、宫颈癌、肝胆癌、神经内分泌瘤、骨肉瘤、胰腺癌等等。
本公开实施例的构建方法所需的肿瘤组织样本量要求少，穿刺样本（低至0.005g）就可满足。对于手术等大样本，可以进行更加通量的构建。
可选地，步骤S10中，将肿瘤组织进行清洗，包括：将肿瘤组织放入容器中，加入磷酸盐缓冲液（DPBS），震荡洗涤，然后弃去上清；重复洗涤至上清无明显浑浊。本实施例中，一般重复洗涤5～10次。容器的选择不限，以适配于肿瘤组织大小即可。例如，容器选择为离心管。
具体地，步骤S10中，将肿瘤组织进行清洗，包括：将肿瘤组织放入15mL离心管中，加入5mL磷酸盐缓冲液（DPBS），震荡洗涤，然后弃去上清；重复洗涤至上清无明显浑浊。
可选地，步骤S10中，物理破碎，包括：采用手术刀切碎或者剪刀剪碎。
肿瘤组织破碎样本的粒径在微米级范围，最小粒径不限，保证最大粒径即可。
可选地，肿瘤组织破碎样本的粒径为小于或等于800μm。
可选地，肿瘤组织破碎样本的粒径为大于或等于20μm且小于或等于800μm
可选地，肿瘤组织破碎样本的粒径为小于或等于500μm。
可选地，肿瘤组织破碎样本的粒径为大于或等于20μm且小于或等于500μm。
步骤S10中经物理破碎的肿瘤组织破碎样本中组织颗粒的粒径是在一定范围内，且在该粒径范围内呈现近似正态分布。
可选地，肿瘤组织破碎样本中，粒径为大于或等于200μm且小于或等于300μm的组织颗粒占60%以上。
可选地，肿瘤组织破碎样本中，粒径为大于或等于200μm且小于或等于300μm的组织颗粒占80%以上。
可选地，肿瘤组织破碎样本中，粒径为大于或等于200μm且小于或等于300μm的组织颗粒占90%以上。
可选地，步骤S20中，在离心处理获得肿瘤组织破碎样本沉淀物中，离心处理包括：在4℃下，以1200 rpm～1600 rpm的速率离心3 min～6min。
可选地，离心处理包括：在4℃下，以1400 rpm～1600 rpm的速率离心4 min～6min。
可选地，离心处理包括：在4℃下，以1500 rpm的速率离心5min。
可选地，步骤S20中，将肿瘤组织破碎样本采用DPBS进行洗涤，并洗涤多次。例如，洗涤3次。
可选地，步骤S30中，向肿瘤组织破碎样本沉淀物中加入的肿瘤免疫基质胶的体积与肿瘤组织的质量的比例为180μL﹕0.03g～0.06g。本实施例的用量比例有利于基质胶将肿瘤组织破碎样本中组织颗粒包裹均匀。
可选地，步骤S30中，肿瘤免疫基质胶包括1640培养基和Matrigel基质胶，且两者的比例为1.5～2.5:1。本实施例中，肿瘤免疫基质胶的复配和储存均需在低于10℃的温度条件下。可选地，两者的比例包括体积比。
可选地，步骤S40中，将待接种组织混合物接种至孔板上，包括：以每孔接种5-30μL的方式，将待接种组织混合物接种至孔板接种至孔板的培养孔内。
本实施例中，孔板采用现有的孔板即可。
可选地，步骤S40中，固胶培养条件包括：在37℃培养箱内培养固胶。固胶培养时间不限，以达到固胶目的为准。
可选地，步骤S40中，固胶培养时间为15min～25min。可选地，固胶培养时间为20min。
可选地，步骤S40中，培养基包括下述任一实施例的培养基。
本公开实施例还公开了一种用于前述任一项肿瘤体外原位模型的构建方法的培养试剂盒，包括培养基和肿瘤免疫基质胶。培养基包括复合DMEM培养基和50～500 UI/mL的IL2，其中，复合DMEM培养基，按体积百分比，包括88%～96% 的DMEM培养基、2%～12% 的FBS或其他血清替代物和0.6%～2% 的PS。
本公开实施例的培养基中，DMEM培养基和FBS提供必需的营养， IL2为免疫激活剂以维持免疫细胞活性。从而使得采用其作为培养基培养获得的肿瘤体外原位模型构建周期短，且可在至少7天内保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，满足下游药敏检测，更能满足临床的实际需求。
可选地，培养基中，IL2的浓度为200～500 UI/mL。
可选地，培养基中，IL2的浓度为500 UI/mL。
在一些实施例中，复合DMEM培养基，按体积百分比，还包括0.2%～1% 的αCD3/CD28。本实施例中，复合DMEM培养基增加了免疫激活剂αCD3/CD28，其与IL2能够相互协同以更好地维持免疫细胞活性。
可选地，培养基中，αCD3/CD28的浓度为0.5%。
在一些实施例中，复合DMEM培养基，按体积百分比，包括88%～96% 的DMEM培养基、2%～12% 的FBS、0.5%～2% 的PS和0.2%～1% 的αCD3/CD28。
可选地，复合DMEM培养基，按体积百分比，包括88%～90% 的DMEM培养基、8%～10%的FBS、0.8%～1.5% 的PS和0.3%～0.8% αCD3/CD28
可选地，复合DMEM培养基，按体积百分比，包括88.5% 的DMEM培养基、10% 的FBS、1% 的PS和0.5% 的αCD3/CD28。
本公开实施例公开了一种肿瘤体外原位模型，通过前述任一实施例的肿瘤体外原位模型的构建方法构建获得。
本公开实施例的肿瘤体外原位模型能够保留肿瘤组织内原本驻留的各种类型的间质细胞、免疫细胞、仿真的细胞比例、与肿瘤互作时的细胞状态等，且构建周期短，且可在至少7天内保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成。
在一些实施例中，肿瘤体外原位模型满足以下参数中的一项或多项：
（1）肿瘤细胞和间质细胞的数量比的仿生度达到80%以上；
（2）肿瘤区T细胞占比的仿生度达到80%以上；
（3）肿瘤细胞PD-L1的表达比例的仿生度达到80%以上；
（4）肿瘤细胞Ki67的表达比例的仿生度达到80%以上；
（5）培养7天的肿瘤体外原位模型中，免疫细胞中的活性T细胞的维持度达到80%以上。
（6）在肿瘤体外原位模型的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-20%～25%，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致。
本公开实施例中，仿生度是肿瘤体外原位模型的参数与原始组织的相应参数的比值。
可选地，肿瘤体外原位模型满足以下参数中的一项或多项：
（1）肿瘤细胞和间质细胞的数量比的仿生度达到90%以上；
（2）肿瘤区T细胞占比的仿生度达到95%以上；
（3）肿瘤细胞PD-L1的表达比例的仿生度达到95%以上；
（4）肿瘤细胞Ki67的表达比例的仿生度达到80%以上；
（5）培养7天的肿瘤体外原位模型中，免疫细胞中的活性T细胞的维持度达到80%以上。
（6）在肿瘤体外原位模型的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-20%～25%，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致。
可选地，肿瘤体外原位模型包括肺癌体外原位模型，肺癌体外原位模型中，肿瘤细胞和间质细胞的数量比的仿生度达到90%～100%；肿瘤区T细胞占比的仿生度达到84%～98%；肿瘤细胞PD-L1的表达比例的仿生度达到93%～108%；肿瘤细胞Ki67的表达比例的仿生度达到82%～85%；免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到80%～82%；在肿瘤体外原位模型的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度在-20%～23%范围内，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致。
可选地，肿瘤体外原位模型包括肠癌体外原位模型，肠癌体外原位模型中，肿瘤细胞和间质细胞的数量比的仿生度达到97%；肿瘤区T细胞占比的仿生度达到104%；肿瘤细胞PD-L1的表达比例的仿生度达到110%；肿瘤细胞Ki67的表达比例的仿生度达到95%；免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到84%；在肿瘤体外原位模型的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-7%～5%，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致。
本公开实施例提供一种前述任一实施例的肿瘤体外原位模型的构建方法构建获得的肿瘤体外原位模型在体外免疫细胞提取扩增、临床肿瘤化靶、免疫药物敏感性检测上的体外应用。
下面给出具体的肿瘤体外原位模型的构建方法和肿瘤体外原位模型及应用的实施例，以进一步本公开实施例，但对本公开不形成限制。
实施例1
一种培养基，用于构建肿瘤体外原位模型，包括复合DMEM培养基和50～500 UI/mL的IL2，其中，按体积百分比，复合DMEM培养基包括83%～92% 的DMEM培养基、6%～15% 的FBS、0.5%～2% 的PS和0.2%～1% 的αCD3/CD28。
具体给出了以下具体组成的培养基和对比培养基，如表1所示。
表1
实施例2
一种肺癌体外原位模型的构建方法，包括以下步骤：
S11、将肺癌肿瘤组织（手术组织）放入15mL离心管中，加入5mL磷酸盐缓冲液（DPBS），震荡洗涤，然后弃去上清；重复洗涤至上清无明显浑浊；然后称取0.03g清洗后的肺癌肿瘤组织，将其物理破碎至粒径为小于或等于500μm的肿瘤组织破碎样本。
S21、将肿瘤组织破碎样本收集到15mL离心管内，使用DPBS洗涤，将洗涤的溶液与前面收集的组织液合并以充分收集破碎好的破碎样本；然后在4℃下，以1500 rpm的速率离心5min，获得肿瘤组织破碎样本沉淀物。
S31、向肿瘤组织破碎样本沉淀物中加入180μL肿瘤免疫基质胶，在低于10℃的温度下（例如，冰浴下）混匀，获得待接种组织混合物。其中，肿瘤免疫基质胶包括1640培养基和Matrigel基质胶，且两者的体积比为7:3；其中，两者在复配过程中保持在低于10℃的温度下复配，且Matrigel基质胶的温度也控制在10℃的以下。
S41、以每孔接种5-30μL 的方式，将待接种组织混合物接种至孔板上，在37℃培养箱内固胶培养20min，固胶完成，然后加入培养基，培养。其中，孔板采用常规培养板即可，培养基采用实施例1中的培养基Ⅰ。
本实施例2构建获得肺癌体外原位模型Ⅰ-1。
本实施例2对培养3天获得的肺癌体外原位模型Ⅰ-1进行ATP检测，计算复孔间的变异系数CV值，计算得到CV值为0.14。适合进行后续的体外应用。
本实施例2中对培养3天获得的肺癌体外原位模型Ⅰ-1和步骤S11中采用的肺癌肿瘤原始组织分别经固定、包埋和多重免疫荧光染色并扫描，获得了肿瘤细胞（panCK）、间质细胞（Vimentin）、PDL1、Ki67、CD3和DAP1的荧光染色图，以及合并（Merge）荧光染色图，参见图2所示一处视野内的荧光染色图。本实施例2中还采用HALO软件对3个不同视野（随机选取）内的荧光染色图进行定量分析，可以获得如下表1-1所示的四个参数的数据，其中一行中的数据为由一个视野内的荧光染色图获取的数据。
表1-1
其中，将表1-1中各参数的3个数据取平均值后，分别获得图3至图6的免疫模型和原始组织的各参数的柱状对比图。表1中的仿生度是平均值2与平均值1的比值，仿生度数值越大，说明仿生性越好。其中，肿瘤细胞PD-L1表达比例的仿生度超过了100%，这属于允许范围内的测量误差，也能够正向反映仿生情况。
可见，本实施例2构建的肺癌体外原位模型与肺癌原始肿瘤组织具有高度的仿生性，各项参数的仿生度都很高，肺癌体外原位模型仿生性高，能更好地反映肿瘤患者真实的免疫微环境。
本实施例2中，在构建培养过程中，分别将培养0天、3天、7天构建的原位模型消化成单细胞后，进行流式细胞检测。其中，培养0天即为接种当天。
获得的T细胞（CD3+）的活性细胞占比如下表1-2中的定量数据，对应的图7所示。图7的柱状图中，从左到右，每个柱体对应代表的是培养0天、3天和7天。其中，培养0天即为接种当天。
表1-2
同时，还分析获得了各类免疫活性细胞在总免疫细胞的占比，如下表1-3中定量数据以及对应的图8所示。图8的柱状图中，每个柱体从下到上的4个柱段分别对应T细胞、巨噬细胞（Macrophage）、NK细胞和其他细胞。
表1-3
由表1-2可知，培养7天的肿瘤体外原位模型中，免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到81.62%。其中，维持度是第7天的CD3+Live+的数值（81.25%）与第0天的CD3+Live+的数值（99.54%）的比值。
由表1-3可知，在肺癌体外原位模型的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为7%～23%，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致，占比顺序保持为T细胞＞其他细胞＞巨噬细胞＞NK细胞。
可见，本实施例2的肺癌体外原位模型的构建周期更短，且可在7天内保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成（见图2），满足下游药敏检测，更能满足临床的实际需求。
本实施例2构建的肺癌体外原位模型能够在肿瘤微环境分析、体外免疫细胞提取扩增、临床肿瘤化靶、免疫药物敏感性检测上进行体外应用。
实施例3
本实施例3与实施例2不同的是，步骤S11中，将将清洗后的肺癌组织物理破碎（手术刀切碎）至粒径为小于或等于800μm的肿瘤组织破碎样本。其余步骤及参数均与实施例2相同。
本实施例3构建获得肺癌体外原位模型Ⅰ-2。
本实施例3对培养3天获得的肺癌体外原位模型Ⅰ-2进行ATP检测，计算复孔间的变异系数CV值，计算得到CV值为0.25。适合进行后续的体外应用。
本实施例3采用同实施例2相同的手段对肺癌体外原位模型Ⅰ-2进行了测定和分析，分别获得了如下表1-4、表1-5和表1-6的数据。
表1-4
表1-5
表1-6
由表1-4可知，本实施例3构建获得肺癌体外原位模型Ⅰ-2的各项参数的仿生度都比较高，仿生度高，能更好地反映肿瘤患者真实的免疫微环境。
由表1-5可知，培养7天的肿瘤体外原位模型中，免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到81.04%。其中，维持度是第7天的CD3+Live+的数值（79.25%）与第0天的CD3+Live+的数值（97.79%）的比值。
由表1-6可知，在肺癌体外原位模型Ⅰ-2的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-15%～-20%，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致，占比顺序保持为T细胞＞其他细胞＞巨噬细胞＞NK细胞。
可见，本实施例3的肺癌体外原位模型Ⅰ-2的构建周期更短，且可在7天内保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，满足下游药敏检测，更能满足临床的实际需求。
实施例4
本实施例4与实施例2不同的是，步骤S41中培养基采用实施例1中的培养基Ⅱ进行培养。其余步骤及参数均与实施例2相同。
本实施例4构建获得肺癌体外原位模型Ⅱ。
本实施例4对培养3天获得的肺癌体外原位模型Ⅱ进行ATP检测，计算复孔间的变异系数CV值，计算得到CV值为0.17。适合进行后续的体外应用。
本实施例4采用同实施例2相同的手段对肺癌体外原位模型Ⅱ进行了测定和分析，分别获得了如下表1-7、表1-8和表1-9的数据。
表1-7
表1-8
表1-9
由表1-7可知，本实施例4构建获得肺癌体外原位模型Ⅱ的各项参数的仿生度都比较高，仿生度高，能更好地反映肿瘤患者真实的免疫微环境。
由表1-8可知，培养7天的肿瘤体外原位模型中，免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到80.19%。其中，维持度是第7天的CD3+Live+的数值（73.25%）与第0天的CD3+Live+的数值（91.34%）的比值。
由表1-9可知，在肺癌体外原位模型Ⅱ的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-17%～-20%，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致，占比顺序保持为T细胞＞其他细胞＞巨噬细胞＞NK细胞。
可见，本实施例3的肺癌体外原位模型Ⅱ的构建周期更短，且可在7天内保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，满足下游药敏检测，更能满足临床的实际需求。
对比例1
对比例1与实施例2不同的是，步骤S41中培养基采用实施例1中的对比培养基Ⅰ进行培养。其余步骤及参数均与实施例2相同。
本对比例1构建获得肺癌体外原位模型对比Ⅰ。
本对比例1对培养3天获得的肺癌体外原位模型对比Ⅰ进行ATP检测，计算复孔间的变异系数CV值，计算得到CV值为0.22。
本对比例1采用同实施例2相同的手段对肺癌体外原位模型对比Ⅰ进行了测定和分析，分别获得了如下表1-10、表1-11和表1-12的数据。
表1-10
表1-11
表1-12
由表1-10可知，本对比例1构建获得肺癌体外原位模型对比Ⅰ的T细胞活性明显降低，仿生度降低，无法反映肿瘤患者真实的免疫微环境。
由表1-11可知，培养7天的肿瘤体外原位模型对比Ⅰ中，免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到65.18%。其中，维持度是第7天的CD3+Live+的数值（63.74%）与第0天的CD3+Live+的数值（97.79%）的比值。
由表1-12可知，在肺癌体外原位模型对比Ⅰ的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-20%～-34%，且培养7天的肺癌体外原位模型对比Ⅰ中，其他细胞的占比显著增加且高于了T细胞的占比，各细胞的占比趋势改变。
可见，本对比例1的肺癌体外原位模型对比Ⅰ在7天内无法保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，无法满足下游药敏检测，进而无法满足临床的实际需求。
对比例2
本对比例2与实施例2不同的是，步骤S11中，将将清洗后的肺癌组织物理破碎（手术刀切碎）至粒径为1mm的肿瘤组织破碎样本（1mm × 1mm × 1mm）。其余步骤及参数均与实施例2相同。
对比例2培养获得对比肺癌体外模型对比Ⅱ。
对培养3天获得的对比肺癌体外模型对比Ⅱ进行ATP检测，计算复孔间的变异系数CV值，计算得到CV值为0.38，明显比实施例1至实施例6的微米级组织颗粒培养获得的肺癌体外原位模型的CV值高，一致性差，不适于进行后续的体外应用。
对比例2采用同实施例2相同的手段对对比肺癌体外模型Ⅲ进行测定和分析，分别获得了如下表1-13、表1-14和表1-15的数据。
表1-13
表1-14
表1-15
由表1-13可知，本对比例2构建获得肺癌体外原位模型对比Ⅱ的各项参数的仿生度都较差，仿生度低，无法反映肿瘤患者真实的免疫微环境。
由表1-14可知，培养7天的肿瘤体外原位模型对比Ⅱ中，免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到60.37%。其中，维持度是第7天的CD3+Live+的数值（58.95%）与第0天的CD3+Live+的数值（97.64%）的比值。
由表1-15可知，在肺癌体外原位模型对比Ⅱ的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-4%～-18%，且培养7天的肺癌体外原位模型对比Ⅱ中，虽然T细胞占比仍最高，但是其他细胞的占比显著增加且接近了T细胞的占比，各细胞的占比趋势改变。
可见，本对比例2的肺癌体外原位模型对比Ⅱ在7天内无法保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，无法满足下游药敏检测，进而无法满足临床的实际需求。
实施例5
一种肠癌体外原位模型的构建方法，包括以下步骤：
S12、将肠癌肿瘤组织（手术组织）放入15mL离心管中，加入5mL磷酸盐缓冲液（DPBS），震荡洗涤，然后弃去上清；重复洗涤至上清无明显浑浊；然后称取0.03g清洗后的肺癌肿瘤组织，将其物理破碎（手术刀切碎）至粒径为小于或等于500μm的肿瘤组织破碎样本。
S22、将肿瘤组织破碎样本收集到15mL离心管内，使用DPBS洗涤，将洗涤的溶液与前面收集的组织液合并以充分收集破碎好的破碎样本；然后在4℃下，以1500 rpm的速率离心5min，获得肿瘤组织破碎样本沉淀物。
S32、向肿瘤组织破碎样本沉淀物中加入90μL肿瘤免疫基质胶，在低于10℃的温度下（例如，冰浴下）混匀，获得待接种组织混合物。其中，肿瘤免疫基质胶包括1640培养基和Matrigel基质胶，且两者的体积比为7:3；其中，两者在复配过程中保持在低于10℃的温度下复配，且Matrigel基质胶的温度也控制在10℃的以下。
S42、以每孔接种5-30μL 的方式，将待接种组织混合物接种至孔板上，在37℃培养箱内固胶培养20min，固胶完成，然后加入培养基，培养。其中，孔板采用常规孔板，培养基采用实施例1中的培养基Ⅰ。
本实施例5构建获得肠癌体外原位模型Ⅰ。
本实施例5对培养3天获得的肠癌体外原位模型Ⅰ-1进行ATP检测，计算复孔间的变异系数CV值，计算得到CV值为0.11。适合进行后续的体外应用。
本实施例5中对培养3天获得的肠癌体外原位模型Ⅰ-1和步骤S12中采用的肺癌肿瘤原始组织分别经固定、包埋和多重免疫荧光染色并扫描，获得了肿瘤细胞（panCK）、间质细胞（Vimentin）、PDL1、Ki67、CD3和DAP1的荧光染色图，以及合并（Merge）荧光染色图，参见图9所示一处视野内的荧光染色图。本实施例5中还采用HALO软件对3个不同视野（随机选取）内的荧光染色图进行定量分析，可以获得如下表2-1所示的四个参数的数据，其中一行中的数据为由一个视野内的荧光染色图获取的数据。
表2-1
其中，将表2-1中各参数的3个数据取平均值后，分别获得图10至图13的免疫模型和原始组织的各参数的柱状对比图。表2-1中的仿生度是平均值2与平均值1的比值，仿生度数值越大，说明仿生性越好。其中，肿瘤区T细胞占比和肿瘤细胞PD-L1表达比例的仿生度超过了100%，这属于允许范围内的测量误差，也能够正向反映仿生情况。
可见，本实施例5构建的肠癌体外原位模型与肠癌原始肿瘤组织具有高度的相似性，肠癌体外原位模型仿生性更高，更能反映肿瘤患者真实的免疫微环境。
本实施例5中，在构建培养过程中，分别将培养0天、3天和7天构建的原位模型消化成单细胞后，进行流式细胞检测。其中，培养0天即为接种当天内。
获得的T细胞（CD3+）的活性细胞占比如下表2-2中定量数据，对应的图14所示。图14所示的柱状图中，从左到右，每个柱体对应代表的是培养0天、3天和7天。其中，培养0天即为接种当天内。
表2-2
同时，还分析获得了各类免疫细胞在总免疫细胞的占比，如下表2-3中定量数据以及对应的图15所示。图15的柱状图中，每个柱体从下到上的4个柱段分别对应T细胞、巨噬细胞（Macrophage）、NK细胞和其他细胞。
表2-3
由表2-2可知，培养7天的肠癌体外原位模型中，免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到81.62%。其中，维持度是第7天的CD3+Live+的数值（81.25%）与第0天的CD3+Live+的数值（99.54%）的比值。
由表2-3可知，在肠癌体外原位模型的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-6.6%～5.2%，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致，占比顺序保持为T细胞＞其他细胞＞巨噬细胞＞NK细胞。
可见，本实施例5的肠癌体外原位模型的构建周期更短，且可在7天内保持较高的免疫细胞活性以及稳定的免疫细胞组成，满足下游药敏检测，更能满足临床的实际需求。
本实施例5构建的肠癌体外原位模型能够在肿瘤微环境分析、体外免疫细胞提取扩增、临床肿瘤化靶、免疫药物敏感性检测上进行体外应用。
本公开实施例中，对于肠癌体外原位模型的构建，与肺癌体外原位模型的构建具有相同的趋势和变化。
以上描述和附图充分地示出了本公开的实施例，以使本领域的技术人员能够实践它们。其他实施例可以包括结构的以及其他的改变。实施例仅代表可能的变化。除非明确要求，否则单独的部件和功能是可选的，并且操作的顺序可以变化。一些实施例的部分和特征可以被包括在或替换其他实施例的部分和特征。本公开的实施例并不局限于上面已经描述并在附图中示出的结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (10)
1.一种肿瘤体外原位模型的构建方法，其特征在于，包括：
将人源肿瘤组织进行清洗，然后物理破碎，获得肿瘤组织破碎样本；其中，肿瘤组织破碎样本的粒径为小于或等于800μm，在肿瘤组织破碎样本中，粒径为大于或等于200μm且小于或等于300μm的组织颗粒占60%以上；
将肿瘤组织破碎样本进行洗涤，并离心处理获得肿瘤组织破碎样本沉淀物；
向肿瘤组织破碎样本沉淀物中加入肿瘤免疫基质胶，在低于10℃的温度下混匀，获得待接种组织混合物；其中，向肿瘤组织破碎样本沉淀物中加入的肿瘤免疫基质胶的体积与肿瘤组织的质量的比例为180μL﹕0.03g～0.06g；肿瘤免疫基质胶包括1640培养基和Matrigel基质胶；
将待接种组织混合物接种至孔板上，固胶培养，固胶完成后，加入培养基，培养；
其中，培养基由复合DMEM培养基和50～500 UI/mL 的IL2组成，其中，复合DMEM培养基，按体积百分比，由88%～96% 的DMEM培养基、0.2%～1% 的 αCD3/CD28、2%～12% 的FBS或其他血清替代物和0.5%～2% 的PS组成。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
肿瘤组织破碎样本的粒径为大于或等于20μm且小于或等于800μm。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，肿瘤组织破碎样本的粒径为小于或等于500μm。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，肿瘤组织破碎样本的粒径为大于或等于20μm且小于或等于500μm。
5.根据权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，在离心处理获得肿瘤组织破碎样本沉淀物中，离心处理包括：在4℃下，以1200 rpm～1600 rpm的速率离心3 min～6min。
6.根据权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，
在肿瘤组织破碎样本中，粒径为大于或等于200μm且小于或等于300μm的组织颗粒占80%以上。
7.根据权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，在肿瘤组织破碎样本中，粒径为大于或等于200μm且小于或等于300μm的组织颗粒占90%以上。
8.根据权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，肿瘤免疫基质胶中，1640培养基和Matrigel基质胶的比例为1.5～2.5:1。
9.根据权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，构建获得的肿瘤体外原位模型满足以下参数中的一项或多项：
肿瘤细胞和间质细胞的数量比的仿生度达到80%以上；
肿瘤区T细胞占比的仿生度达到80%以上；
肿瘤细胞PD-L1的表达比例的仿生度达到80%以上；
肿瘤细胞Ki67的表达比例的仿生度达到80%以上；
培养7天的肿瘤体外原位模型中，免疫细胞中的活性T细胞占比的维持度达到80%以上；
在肿瘤体外原位模型的培养期间，免疫细胞的活性细胞中，T细胞的变化幅度为-20%～25%，且T细胞、巨噬细胞、NK细胞和其他细胞的占比趋势一致。
10.如权利要求1至9任一项所述的肿瘤体外原位模型的构建方法在肿瘤微环境分析或体外免疫细胞提取扩增上的体外应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410022261.7A CN117511880B (zh) | 2024-01-08 | 2024-01-08 | 肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410022261.7A CN117511880B (zh) | 2024-01-08 | 2024-01-08 | 肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117511880A CN117511880A (zh) | 2024-02-06 |
| CN117511880B true CN117511880B (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=89763042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410022261.7A Active CN117511880B (zh) | 2024-01-08 | 2024-01-08 | 肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117511880B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118028239A (zh) * | 2024-04-15 | 2024-05-14 | 北京基石京准诊断科技有限公司 | 一种用于培养泌尿系统肿瘤的微肿瘤模型的培养基及培养方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106967672A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-07-21 | 四川大学华西医院 | 一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法 |
| CN110934107A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-03-31 | 中山大学附属第八医院（深圳福田） | 一种构建人源化鼠肿瘤模型及其制备方法和应用 |
| CN111040997A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-21 | 北京科途医学科技有限公司 | 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法 |
| CN112143699A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-29 | 上海市第十人民医院 | 一种结直肠癌类器官免疫微环境重构的方法 |
| CN114317444A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-04-12 | 北京大橡科技有限公司 | 肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 |
| WO2022111571A1 (zh) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | 上海君赛生物科技有限公司 | 肿瘤浸润淋巴细胞培养基及其应用 |
| CN115418353A (zh) * | 2022-08-17 | 2022-12-02 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种结直肠腹膜转移癌类器官移瘤模型构建及其应用 |
| CN116376833A (zh) * | 2022-12-12 | 2023-07-04 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种保留免疫细胞的结肠癌类器官构建方法 |
| CN116694570A (zh) * | 2023-06-09 | 2023-09-05 | 成都诺医德医学检验实验室有限公司 | 一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用 |
| CN117004572A (zh) * | 2023-08-11 | 2023-11-07 | 上海美迪西生物医药股份有限公司 | 病人来源的移植瘤类器官模型pdxo的构建方法与应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2019215096A1 (en) * | 2018-02-02 | 2020-08-06 | Wake Forest University Health Sciences | Organoids related to immunotherapy and methods of preparing and using the same |
| EP3914266A4 (en) * | 2019-01-24 | 2022-12-07 | University of Cincinnati | AUTOLOGOUS TUMORORGANOID AND IMMUNE CELL COCULTURES AND METHODS FOR USE AS PREDICTIVE MODELS FOR TREATMENT OF PANCREA CANCER |
| EP4227401A1 (en) * | 2022-02-11 | 2023-08-16 | UPM-Kymmene Corporation | An ex vivo tumour immune microenvironment model, a method for preserving a tumour-specific immune cell profile in an ex vivo tumour immune microenvironment model and use of nanofibrillar cellulose |
-
2024
- 2024-01-08 CN CN202410022261.7A patent/CN117511880B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106967672A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-07-21 | 四川大学华西医院 | 一种肺及肺癌组织培养方法以及用其构建肺癌小鼠动物模型方法 |
| CN110934107A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-03-31 | 中山大学附属第八医院（深圳福田） | 一种构建人源化鼠肿瘤模型及其制备方法和应用 |
| CN111040997A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-21 | 北京科途医学科技有限公司 | 一种具有肿瘤免疫微环境的前列腺癌类器官培养及冻存方法 |
| CN112143699A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-29 | 上海市第十人民医院 | 一种结直肠癌类器官免疫微环境重构的方法 |
| WO2022111571A1 (zh) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | 上海君赛生物科技有限公司 | 肿瘤浸润淋巴细胞培养基及其应用 |
| CN116490607A (zh) * | 2020-11-25 | 2023-07-25 | 上海君赛生物科技有限公司 | 肿瘤浸润淋巴细胞培养基及其应用 |
| CN114317444A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-04-12 | 北京大橡科技有限公司 | 肠癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 |
| CN115418353A (zh) * | 2022-08-17 | 2022-12-02 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种结直肠腹膜转移癌类器官移瘤模型构建及其应用 |
| CN116376833A (zh) * | 2022-12-12 | 2023-07-04 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种保留免疫细胞的结肠癌类器官构建方法 |
| CN116694570A (zh) * | 2023-06-09 | 2023-09-05 | 成都诺医德医学检验实验室有限公司 | 一种利用自体肿瘤细胞及培养物来快速扩增培养TILs的方法及应用 |
| CN117004572A (zh) * | 2023-08-11 | 2023-11-07 | 上海美迪西生物医药股份有限公司 | 病人来源的移植瘤类器官模型pdxo的构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 人源性肿瘤组织原位异种移植模型的特征及研究策略;陈薛等;中国比较医学杂志;20180131;第28卷(第1期);第118-122页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117511880A (zh) | 2024-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mitra et al. | Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy | |
| CN103865876B (zh) | 一种肿瘤细胞原代培养的方法 | |
| CN117511880B (zh) | 肿瘤体外原位模型的构建方法、培养基及体外应用 | |
| CN103620022B (zh) | Nk细胞的扩增方法 | |
| Koninckx et al. | Mesenchymal stem cells or cardiac progenitors for cardiac repair? A comparative study | |
| Titorencu et al. | Proliferation, differentiation and characterization of osteoblasts from human BM mesenchymal cells | |
| Ebner-Peking et al. | Self-assembly of differentiated progenitor cells facilitates spheroid human skin organoid formation and planar skin regeneration | |
| Alstrup et al. | Isolation of adipose tissue–derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue–derived stem cell yield from human aspirated fat | |
| CN113025575B (zh) | 一种人胰腺癌组织类器官模型的构建方法 | |
| Dvořánková et al. | Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research | |
| CN111334469A (zh) | Pbmc体外3d甲基纤维素琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法 | |
| Krešić et al. | Canine adipose derived mesenchymal stem cells transcriptome composition alterations: a step towards standardizing therapeutic | |
| CN111088222B (zh) | 一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法 | |
| EP2723850B1 (en) | Method for cultivating cells in platelet-lysate-containing medium | |
| DeComas et al. | Derivation and characterization of an extra-axial chordoma cell line (EACH-1) from a scapular tumor | |
| CN111073858A (zh) | 一种yap1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法 | |
| CN105343894A (zh) | 高效分泌前列腺素e2（pge2）的重组间充质干细胞及其应用 | |
| CN111040996A (zh) | 一种制备卵巢癌类器官的方法 | |
| EP0259183A2 (en) | Process for controlling the accuracy and precision of sensitivity assays | |
| CA2767970C (en) | Method for using directing cells for specific stem/progenitor cell activation and differentiation | |
| Yang et al. | An improved method for the isolation and culture of rat epidermal stem cells | |
| Sayo et al. | Fabrication of bone marrow-like tissue in vitro from dispersed-state bone marrow cells | |
| Yamaoka et al. | Cell rolling column in purification and differentiation analysis of stem cells | |
| Riparini et al. | FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle | |
| Zayed et al. | Production of endothelial progenitor cells obtained from human Wharton's jelly using different culture conditions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |