CN111019903A - 一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法 - Google Patents

一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法，该方法包括：将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基混合，进行培养，得到乳腺癌骨转移类器官；其中，所述饲养层细胞包括不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞。通过上述技术方案，通过利用不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞作为乳腺癌骨转移类器官培养的饲养层细胞，本公开的方法培养乳腺癌骨转移类器官的成功率较高。

Description

一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，乳腺癌患者中99％是女性，男性仅占1％。乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落，乳腺癌细胞一旦脱落，游离的乳腺癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命，其中，乳腺癌细胞转移至相邻的骨骼后形成乳腺癌骨转移。乳腺癌骨转移占乳腺癌转移首发症状的27％-50％，在复发转移性乳腺癌病程中的发生率为65-70％，发生率较高。乳腺癌骨转移能引起患者骨痛、病理性骨折和脊髓压迫等相关事件，严重影响患者的生存质量和总体预后。
目前，治疗乳腺癌骨转移的方法主要有化疗、内分泌治疗和分子靶向治疗等全身治疗以及手术治疗和放疗，除此之外，还可以利用骨调节药物治疗骨转移相关事件，并且骨调节药物治疗已逐渐成为这些治疗手段中的最佳选择。然而，骨调节药物并不能预防乳腺癌骨转移的发生，同时也没有可靠证据能证实其可以延长乳腺癌骨转移患者的生存时间。因此，急需进行大量的药物实验来筛选可以监测、预防以及治疗乳腺癌骨转移的靶向药物。
3D肿瘤类器官能在较高程度上模拟肿瘤生长所需的微环境，保存了肿瘤的异质性、组织特性及基因突变信息，可以在体外模拟癌症的发生、发展过程，构建疾病模型，可以用于肿瘤治疗药物的筛选。
现有技术中，可以利用乳腺癌骨转移组织进行乳腺癌骨转移类器官的培养，但是使用常规体外培养方法培养乳腺癌骨转移类器官的成功率较低。
发明内容
为了解决现有乳腺癌骨转移类器官培养时存在的成功率较低的问题，本公开提供一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法。
为了实现上述目的，本公开提供一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法，该方法包括：
将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基混合，进行培养，得到乳腺癌骨转移类器官；其中，所述饲养层细胞包括不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞。
可选地，所述第一培养基中含有DMEM/F12培养基和生长因子，所述生长因子包括A83-01、Noggin、青链霉素、FGF7、FGF10、Y-27632、Nicotinamide、EGF和BSA。
可选地，所述生长因子中，A83-01的浓度为400-600ng/mL，Noggin的浓度为50-150ng/mL，青链霉素的浓度为50-150μg/mL，FGF7的浓度为1-15ng/mL，FGF10的浓度为1-15ng/mL，Y-27632的浓度为1-15μmol/L，Nicotinamide的浓度为1-15mmol/L，EGF的浓度为1-15ng/mL，BSA的浓度为1-10mg/mL。
可选地，所述乳腺癌骨转移细胞由乳腺癌骨转移组织酶解得到，利用乳腺癌骨转移组织酶解得到所述乳腺癌骨转移细胞的方法包括：
a、将乳腺癌骨转移组织碎块与酶解液混合并进行酶解，得到第一酶解物料；
b、将所述第一酶解物料与酶解液混合后置于细胞筛中，进行研磨，收集滤液，得到第二酶解物料；
c、将所述第二酶解物料进行离心，收集沉淀，得到乳腺癌骨转移细胞；其中，所述离心的条件包括：离心力为200-400g，离心时间为1-10min。
可选地，所述酶解液中含有DMEM/F12培养基和1-10％的FBS、1-10mg/mL的胶原蛋白水解酶。
可选地，所述饲养层细胞为经辐照处理失去增殖功能的骨髓间充质干细胞，所述饲养层细胞的制备方法包括：
将骨髓间充质干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中，并于所述第一培养基中培养12-36h，然后对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照，得到所述饲养层细胞。
可选地，所述将骨髓间充质干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中时，每个培养孔中含有20-80μL所述温敏性水凝胶，每个培养孔中铺设400-600个所述骨髓间充质干细胞；所述第一培养基的使用量为100-300μL。
可选地，所述对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照的条件包括：
辐照剂量为70-90KV，辐照时间为20-40min。
可选地，所述将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基混合时，相对于20000个所述乳腺癌骨转移细胞，所述饲养层细胞的用量为400-600个，所述温敏性水凝胶的用量为20-80μL，所述第一培养基的用量为300-500μL。
可选地，本公开制备乳腺癌骨转移类器官的方法中，所述培养包括：
将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基的混合物置于35-39℃的恒温培养箱中进行培养，在培养过程中，每1-3天更换一次第一培养基，直至观察到直径大于0.5mm的乳腺癌骨转移类器官。
通过上述技术方案，通过利用不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞作为乳腺癌骨转移类器官培养的饲养层细胞，本公开的方法培养乳腺癌骨转移类器官的成功率较高。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开实施例制备的由显微镜观察到的乳腺癌骨转移类器官。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的提供一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法，该方法包括：
将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基混合，进行培养，得到乳腺癌骨转移类器官；其中，所述饲养层细胞包括不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞。
本公开的发明人发现，利用乳腺癌骨转移组织进行乳腺癌骨转移类器官培养时，乳腺癌骨转移组织的前期处理较为困难，而且分离出的乳腺癌骨转移细胞较少，在常规的体外培养方法中，体外培养环境与患者体内差异较大，缺乏适合乳腺癌骨转移细胞生长增殖的细胞因子，乳腺癌骨转移细胞在培养过程中大量死亡，导致乳腺癌骨转移类器官培养失败。本公开的发明人尝试使用不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞作为乳腺癌骨转移类器官培养的饲养层细胞，出乎意料地发现其能大幅提高乳腺癌骨转移类器官培养的成功率，由此得到了本公开。
通过上述技术方案，本公开的方法利用不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞作为乳腺癌骨转移类器官培养的饲养层细胞，能够为乳腺癌骨转移细胞的生长增殖提供适宜的细胞因子以及与体内环境更加类似的胞外生长环境，少量的乳腺癌骨转移细胞即能在饲养层细胞中良好生长和增殖，因此，本公开的方法能够利用少量乳腺癌骨转移组织或细胞培育得到与乳腺癌骨转移组织生物学信息相契合的乳腺癌骨转移类器官，而且培养成功率较高。
根据本公开，适宜乳腺癌骨转移细胞增殖和生长的培养基均可用于本公开，优选情况下，本公开选用的所述第一培养基中可以含有DMEM/F12培养基和生长因子，所述生长因子可以包括A83-01、Noggin、青链霉素、FGF7、FGF10、Y-27632、Nicotinamide、EGF和BSA。在上述优选情况下，上述第一培养基可以充分促进乳腺癌骨转移细胞的增殖和生长，同时还能抑制上皮干细胞和间充质干细胞的增殖和生长，避免上皮干细胞和间充质干细胞在培养基中大量增殖而导致乳腺癌骨转移类器官培养失败。
根据本公开，所述生长因子中各类生长因子的浓度可以在较大的范围内变化，例如，所述生长因子中，A83-01的浓度为400-600ng/mL，Noggin的浓度为50-150ng/mL，青链霉素的浓度为50-150μg/mL，FGF7的浓度为1-15ng/mL，FGF10的浓度为1-15ng/mL，Y-27632的浓度为1-15μmol/L，Nicotinamide的浓度为1-15mmol/L，EGF的浓度为1-15ng/mL，BSA的浓度为1-10mg/mL。第一培养基中的各生长因子的浓度在上述范围内时，其促进乳腺癌骨转移细胞增殖和生长的作用更强，能进一步提高乳腺癌骨转移类器官培养的成功率。
根据本公开，所述乳腺癌骨转移细胞由乳腺癌骨转移组织酶解得到，所述乳腺癌骨转移组织可以是乳腺癌骨转移手术组织和/或乳腺癌骨转移穿刺组织。其中，利用乳腺癌骨转移组织酶解得到乳腺癌骨转移细胞的方法可以是领域内的常规方法，然而，为了增加由乳腺癌骨转移组织酶解获得的乳腺癌骨转移细胞的数量，优选情况下，本公开采用如下方法对乳腺癌骨转移组织进行酶解：
a、将乳腺癌骨转移组织碎块与酶解液混合并进行酶解，得到第一酶解物料；b、将所述第一酶解物料与酶解液混合后置于细胞筛中，进行研磨，收集滤液，得到第二酶解物料；c、将所述第二酶解物料进行离心，收集沉淀，得到乳腺癌骨转移细胞；其中，所述离心的条件包括：离心力为200-400g，离心时间为1-10min。
本公开提供的上述乳腺癌骨转移组织的酶解方法中，引入了步骤b中的二次研磨酶解操作，二次研磨酶解操作可以充分破碎乳腺癌骨转移组织中的胞膜和骨组织，进一步释放出胞膜和骨间质中的肿瘤细胞，能够增加酶解获得的乳腺癌骨转移细胞的数量。
优选地，所述酶解液中可以含有DMEM/F12培养基和1-10％的FBS、1-10mg/mL的胶原蛋白水解酶。
根据本公开，不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞均可用作本公开培养乳腺癌骨转移类器官的饲养层细胞，优选地，本公开所采用的饲养层细胞为经辐照处理失去增殖功能的骨髓间充质干细胞，其可以通过如下方法制备得到：将骨髓间充质干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中，并于所述第一培养基中培养12-36h，然后对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照，得到所述饲养层细胞。
优选地，所述将骨髓间充质干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中时，每个培养孔中含有20-80μL所述温敏性水凝胶，每个培养孔中铺设400-600个所述骨髓间充质干细胞；所述第一培养基的使用量为100-300μL。
优选地，所述对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照的条件包括：辐照剂量为70-90KV，辐照时间为20-40min。
根据本公开，上述制备乳腺癌骨转移类器官的方法中，乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基的相对用量可以在较大的范围内变化，例如，将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基混合时，相对于20000个所述乳腺癌骨转移细胞，所述饲养层细胞的用量为400-600个，所述温敏性水凝胶的用量为20-80μL，所述第一培养基的用量为300-500μL。
根据本公开，为了保证乳腺癌骨转移细胞在培养过程中充分增殖、生长以得到乳腺癌骨转移类器官，优选情况下，上述制备乳腺癌骨转移类器官的方法中，所述培养包括：将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基的混合物置于35-39℃的恒温培养箱中进行培养，在培养过程中，每1-3天更换一次第一培养基，直至观察到直径大于0.5mm的乳腺癌骨转移类器官。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。本公开实施例所涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
在本公开实施例中未注明具体实验温度时，实验温度均为室温(20-25℃)。本公开实施例中使用的试剂来源如下：
DMEM/F12培养基购于美国HyClone公司；Cosmo温敏性水凝胶购于日本Cosmo Bio公司；胎牛血清蛋白(fetal bovine serum FBS)购于内蒙古金源康生物工程有限公司；青霉素、链霉素购于上海生工生物工程股份有限公司；胶原蛋白水解酶(Collagenase)购于美国Sigma—Aldrich。
本公开实施例中使用的第一培养基为自主配置的乳腺癌骨转移专用培养基，包括：DMEM/F12培养基和500ng/mL的A83-01(Tocris，2939)、100ng/mL的Noggin(Peprotech，120-10C)、100ug/ml的青链霉素、5ng/mL的FGF7(Peprotech，100-19)、15ng/mL的FGF10(Peprotech，100-26)、5μM的Y-27632(Abmole，Y-27632)、5mM的Nicotinamide(Sigma，N0636)、5ng/mL的EGF(Peprotech，AF-100-15)和0.4g/100mL的BSA(Sigma，9048-46-8)等生长因子。
实施例
1、饲养层细胞制备
将人骨髓间充质干细胞(ATCC，FS-0008)，按每孔约500个细胞的密度铺板于每孔含有50μl Cosmo温敏性水凝胶的96孔板中，每孔加入200μl乳腺癌骨转移专用培养基，培养24h后，将铺有人骨髓间充质干细胞的96孔板整板连同培养液置于X射线辐照仪中进行辐照，辐照的射线剂量为80KV，辐照时间为30min，辐照结束后的铺有人骨髓间充质干细胞的96孔板整板置于37℃恒温培养箱中保存，作为饲养层物料备用。
2、乳腺癌骨转移组织的保存
将新鲜乳腺癌骨转移手术组织和/或穿刺组织保存于乳腺癌骨转移专用培养基中，并于48小时内4度冷链运输至实验室。
3、乳腺癌骨转移细胞获取
除去培养基，将新鲜乳腺癌骨转移组织置于6cm培养皿中；配置含有2％FBS、2mg/mL胶原蛋白水解酶的DMEM/F12培养基作为酶解液，酶解液经过滤除菌且37℃温浴后，加入放置有新鲜乳腺癌骨转移组织的培养皿中，其中，1g新鲜乳腺癌骨转移组织加入8mL酶解液；用消毒灭菌后的剪刀将新鲜乳腺癌骨转移组织块剪碎至肉糜状，并用10mL移液管将剪碎的组织块转移至24孔板中，放入37℃恒温培养箱中酶解2h，酶解过程中每隔30分钟使用移液器吹打酶解组织，促进酶解效果；之后，将酶解后的混合液放入细胞筛中，加入酶解液进行二次研磨酶解，充分研磨后收集滤液，并将滤液于300g的离心条件下离心3min，弃上清，沉淀加入10ml乳腺癌骨转移专用培养基重悬，即得乳腺癌骨转移细胞。
4、乳腺癌骨转移类器官制备
将细胞数量为20000的乳腺癌骨转移细胞种植到步骤1所得的饲养层物料中，并补加200μl乳腺癌骨转移专用培养基，放置于37℃恒温培养箱中培养，培养过程中每2天更换一次培养基，直至显微镜观察到直径大于0.5mm的乳腺癌骨转移类器官，如图1所示。
对比例1
按照实施例中的方法进行乳腺癌骨转移类器官培养，不同的是，本对比例中不使用经X射线辐照失去增殖功能的人骨髓间充质干细胞作为饲养层细胞。
对比例2
按照实施例中的方法进行乳腺癌骨转移类器官培养，不同的是，本对比例中未进行步骤2中记载的二次研磨酶解操作。
对比例3
按照实施例中的方法进行乳腺癌骨转移类器官培养，不同的是，本对比例中利用含10％FBS的DMEM/F12培养基代替实施例中的乳腺癌骨转移专用培养基。
测试例
分别进行实施例、对比例1对比例2和对比例3的操作各36次，进行形态学及免疫荧光染色检测肿瘤标记物鉴定样本是否培养成功，分别统计实施例、对比例1对比例2和对比例3方法的类器官培养成功率(成功率＝成功次数/36×100％)，结果如表1所示。
表1
测试组编号 成功率，％
实施例 49.94
对比例1 8.37
对比例2 12.13
对比例3 5.95
从表1可以看出，本公开的方法能够利用少量乳腺癌骨转移组织或细胞培育得到与乳腺癌骨转移组织生物学信息相契合的乳腺癌骨转移类器官，而且培养成功率较高。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种制备乳腺癌骨转移类器官的方法，其特征在于，该方法包括：
将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基混合，进行培养，得到乳腺癌骨转移类器官；其中，所述饲养层细胞包括不具备增殖功能的骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养基中含有DMEM/F12培养基和生长因子，所述生长因子包括A83-01、Noggin、青链霉素、FGF7、FGF10、Y-27632、Nicotinamide、EGF和BSA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生长因子中，A83-01的浓度为400-600ng/mL，Noggin的浓度为50-150ng/mL，青链霉素的浓度为50-150μg/mL，FGF7的浓度为1-15ng/mL，FGF10的浓度为1-15ng/mL，Y-27632的浓度为1-15μmol/L，Nicotinamide的浓度为1-15mmol/L，EGF的浓度为1-15ng/mL，BSA的浓度为1-10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳腺癌骨转移细胞由乳腺癌骨转移组织酶解得到，利用乳腺癌骨转移组织酶解得到所述乳腺癌骨转移细胞的方法包括：
a、将乳腺癌骨转移组织碎块与酶解液混合并进行酶解，得到第一酶解物料；
b、将所述第一酶解物料与酶解液混合后置于细胞筛中，进行研磨，收集滤液，得到第二酶解物料；
c、将所述第二酶解物料进行离心，收集沉淀，得到乳腺癌骨转移细胞；其中，所述离心的条件包括：离心力为200-400g，离心时间为1-10min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶解液中含有DMEM/F12培养基和1-10％的FBS、1-10mg/mL的胶原蛋白水解酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述饲养层细胞为经辐照处理失去增殖功能的骨髓间充质干细胞，所述饲养层细胞的制备方法包括：
将骨髓间充质干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中，并于所述第一培养基中培养12-36h，然后对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照，得到所述饲养层细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述将骨髓间充质干细胞铺板于含有温敏性水凝胶的细胞培养板中时，每个培养孔中含有20-80μL所述温敏性水凝胶，每个培养孔中铺设400-600个所述骨髓间充质干细胞；所述第一培养基的使用量为100-300μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述对含有人子宫内膜干细胞的细胞培养板进行辐照的条件包括：
辐照剂量为70-90KV，辐照时间为20-40min。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基混合时，相对于20000个所述乳腺癌骨转移细胞，所述饲养层细胞的用量为400-600个，所述温敏性水凝胶的用量为20-80μL，所述第一培养基的用量为300-500μL。
10.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述培养包括：
将乳腺癌骨转移细胞、饲养层细胞、温敏性水凝胶和第一培养基的混合物置于35-39℃的恒温培养箱中进行培养，在培养过程中，每1-3天更换一次第一培养基，直至观察到直径大于0.5mm的乳腺癌骨转移类器官。
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