CN111607568A - 一种原代卵巢癌细胞的培养方法及其在药物筛选中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种原代卵巢癌细胞的培养方法及其在药物筛选中的应用,该方法包括离体组织中原代卵巢癌细胞的分离,原代卵巢癌细胞的3D的体外培养,以及基于卵巢癌类器官芯片进行抗癌药物的体外筛选。本方法利用器官芯片技术构建患者来源的卵巢癌类器官芯片,并利用该芯片进行体外的抗肿瘤药物筛选,较好的模拟了肿瘤在人体内的生长环境,从而提高肿瘤药物筛选的效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及了一种原代卵巢癌细胞的培养方法及其在药物筛选中的应用。
技术背景
卵巢肿瘤是女性生殖器官常见的肿瘤之一,卵巢肿瘤肿以上皮癌细胞最多见,其次是生殖细胞肿瘤。其中卵巢上皮癌死亡率占各种妇科肿瘤的首位,对女性生命造成严重威胁。
化学治疗(简称化疗)是治疗卵巢肿瘤的主要方法之一。虽然目前临床可以使用的化疗药物已经有许多,但卵巢肿瘤的临床治疗有效率仅为25%左右。其主要原因在于,目前患者所使用的化疗药物的方案大多是根据临床医生的经验,在没有考虑到患者个体差异的前提下,通过尝试-评估-换药尝试-再评估的方法,不但未能提高药物的治疗效果,同时会错过最佳的治疗时期,从而使肿瘤进入晚期。此外,在整个治疗过程中,患者会承受药物副作用以及极高的医疗费用的负担。
因此,在体外建立原代肿瘤模型,并利用它进行高效的药物筛选实验是一个有良好前景的方案。目前建立原代卵巢肿瘤的体外培养模型主要的方法有人源肿瘤异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX),该方法是将患者的肿瘤细胞移植到裸鼠体内,再考察不用抗肿瘤药物对其的治疗效果。然而,PDX方法也有一些不足,例如:人与鼠之间的物种差异;测试周期长(4周以上);成本高(20万以上);假阳性与假阴性等。
发明内容
本发明为了解决上述问题,提供了一种高度还原体内生理环境的原代卵巢癌细胞的类器官培养方法,并提供了在此培养方法基础上的一种快速、可靠、低成本的肿瘤药物筛选的应用方案。
为了实现上述目的,本发明提供了如下的技术方案,整体流程参看附图1:
一种原代卵巢癌细胞的培养方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将离体的新鲜卵巢癌组织置于预冷的PBS中,清洗3-5次,去除血液;
(2)利用眼科剪刀将癌组织切碎0.5-1mm3大小,PBS清洗1次;
(3)将剪碎的组织置于70目的筛网研磨,收集筛网下的组织,PBS重悬,离心收集组织细胞;
(4)将沉淀的组织细胞用细胞培养基重悬;细胞培养基配方如下:
基础培养基:高糖DMEM:DMEM/F12=1:1;
添加物:B27(1:100-1:1000),(1-10)ng/ml的EGF,(1-10)ng/ml FGF, (1-1000)ng/ml胰岛素,(1-10)nM的转铁蛋白,(2-20)%胎牛血清。
(5)将重悬的细胞接种到培养皿内进行2D扩增培养后接种到微流控芯片内形成3D细胞球培养;或者将重悬的细胞直接接种到微流控芯片内形成3D细胞球培养。经过本方法分离培养的原代卵巢癌细胞,分离效率高,培养存活率高,经过优化配比的培养基的培养后,生长情况良好。
进一步的,上述一种原代卵巢癌细胞的培养方法,优选为如下步骤:
(1)将离体的新鲜卵巢癌组织置于预冷的PBS中,清洗4次,去除血液;
(2)利用眼科剪刀将癌组织切碎0.75mm3大小,PBS清洗1次;
(3)将剪碎的组织置于70目的筛网研磨,收集筛网下的组织,PBS重悬,离心收集组织细胞;
(4)将沉淀的组织细胞用细胞培养基重悬;细胞培养基配方如下:
基础培养基:高糖DMEM:DMEM/F12=1:1;
添加物:B27(1:1000),5ng/ml的EGF,4ng/ml FGF,500ng/ml胰岛素,2nM的转铁蛋白,10%胎牛血清。
(5)将重悬的细胞直接接种到微流控芯片内形成3D细胞球培养。
进一步的,上述一种原代卵巢癌细胞的培养方法,所述微流控芯片含有一个卵巢癌原代细胞培养区域,该区域可以进行灌流培养。
进一步的,上述一种原代卵巢癌细胞的培养方法,所述卵巢癌原代细胞培养区域按照病理分型采用上下分层芯片结构,如附图2所示。我们在微流控芯片,也就是器官芯片中,设置上下分层的结构,可以在上下层分别培养不同病理分型的卵巢癌细胞,提高筛分效率。
进一步的,上述一种原代卵巢癌细胞的培养方法,所述上下分层芯片结构的通道长度为200-1500微米,宽度为100-1000微米,高度为100-1000微米,中间由一个多孔膜分割,多孔膜的孔径为0.22-15微米。
进一步的,上述一种原代卵巢癌细胞的培养方法,所述上下分层芯片结构的通道长度为1000微米,宽度为500微米,高度为500微米,中间由一个多孔膜分隔,多孔膜的孔径为0.22微米。
进一步的,上述一种原代卵巢癌细胞的培养方法,所述卵巢癌原代细胞培养区域采用微孔芯片结构,如附图3所示,实际工作中可以根据实际培养情况选用不同微孔数量的微孔芯片板。利用在微流控芯片,也就是器官芯片中设置微孔阵列的培养区,可以一次性高通量的培养原代卵巢癌细胞,在进行药物筛选时,也可以进行高通量的筛选。
进一步的,上述一种原代卵巢癌细胞的培养方法,所述微孔芯片结构,其微孔为阵列结构,微孔的孔径为100-1000微米,深度为100-800微米。
进一步的,上述一种原代卵巢癌细胞的培养方法,所述微孔芯片结构,其微孔为阵列结构,微孔的孔径为500微米,深度为400微米。
进一步的,上述原代卵巢癌细胞的培养方法在药物筛选中的应用,其特征在于:所述应用的步骤为:将不同种类、浓度、组合的抗肿瘤药物作用于肿瘤类器官芯片,并于一段时间后检测药物对肿瘤类器官的治疗效果、耐药等。由于本发明中的微流控芯片,也就是器官芯片,具有3D的结构,可以很好的模拟人体内的生理环境,因此在进行药品筛选中得出的结论,会比安装2D普通细胞培养得出的结论更加可靠,可以大大节省筛选中假阳性的发生,提高筛选的效率。使得本发明在肿瘤药物筛选中具有良好的应用前景。
进一步的,上述应用中,所述原代卵巢癌细胞来自人类。
上述方案表明,本发明至少具有以下有益效果:
1.本发明提出了一种优化的原代卵巢癌组织预处理、破碎和细胞分离的方法;特别优化了重悬培养基的配比;使得能够从原代卵巢癌组织中高效分离出原代卵巢癌细胞;
2.本发明提供了一种高度还原体内生理环境的原代卵巢癌细胞的3D的类器官培养方法,并提供了在此培养方法基础上的一种快速、可靠、低成本的肿瘤药物筛选的应用方案,可以广泛用于病理学、医学、药学、毒理学等领域的科研和生产。
附图说明
附图1为本发明所述的原代卵巢癌细胞的培养和药物筛选流程;
附图2为本发明所述的微流控芯片中的上下分层芯片结构;
附图3为本发明所述的微流控芯片中的阵列结构的微孔芯片;
附图4为本发明实施例1中2D培养原代卵巢癌细胞的图片;
附图5为本发明实施例2中在微孔芯片对原代卵巢癌细胞进行3D培养时形成3D细胞球的图片;
附图6为本发明实施例2中3D培养完成后将3D卵巢癌细胞球转移到低粘附培养板中扩增培养的图片;
附图7为本发明实施例3中细胞经过不同药物筛选后细胞死活染色方法计算死亡细胞率的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确的限定。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解,例如,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或一体地连接;可以是机械连接,也可以是电连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触,也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且,第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方,或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方,或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
实施例1
原代卵巢癌细胞分离的方案:
(1)将病理分型为高级别浆液性卵巢癌新鲜组织置于预冷的PBS中,清洗3-5次,去除血液;
(2)利用眼科剪刀将癌组织切碎0.5-1mm3大小,PBS清洗1-2次;
(3)将剪碎的组织置于70目的筛网研磨,收集筛网下的组织,PBS重悬,离心收集组织细胞;
(4)将沉淀的组织细胞用细胞培养基重悬;细胞培养基配方如下:
基础培养基:高糖DMEM:DMEM/F12=1:1;
添加物:B27(1:1000),5ng/ml的EGF,4ng/ml FGF, 500ng/ml胰岛素,2nM的转铁蛋白,10%胎牛血清。
(5)将重悬的细胞直接接种到培养皿内进行2D扩增培养,培养情况如图4所示。
实施例2
利用原代卵巢癌细胞制备肿瘤类器官方法
将收集到的新鲜的或者2D扩增培养后的原代卵巢癌细胞制备成密度为1X106个/毫升细胞悬液,培养基配比同原代培养。将细胞接种到微孔芯片内,12-24小时形成3D细胞球,如图5所示;再将细胞球转移到低粘附培养板中扩增培养,每分钟10-30转动态培养,如图6所示。
实施例3
针对高级别浆液性卵巢癌进行个性化药物筛选。依据临床已有的几个方案,进行筛选。具体流程如下:
将按照实施例2方法所制备的基于患者原代肿瘤细胞的肿瘤类器官接种在一个可以进行灌流培养的微流控芯片内。将医生给患者提供的2种化疗药物分别加入到培养基中,利用含有药物的培养基进行肿瘤类器官的灌流培养。在用药物培养一段时间后(24、48、72小时),暂停灌流培养,检测微流控芯片内肿瘤类器官的治疗效果。采用细胞死活染色方法考察不同用药方案对卵巢癌细胞的杀伤作用,计数每个视野的死、活细胞个数,至少选择3个以上视野,计算公式:(死细胞/总细胞数)X100%。最后通过对比得出哪种化疗药物对肿瘤的杀伤效果最佳,如附图7所示,分别使用顺铂和紫杉醇对癌细胞进行杀伤试验。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种原代卵巢癌细胞的培养方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将离体的新鲜卵巢癌组织置于预冷的PBS中,清洗3-5次,去除血液;
(2)利用眼科剪刀将癌组织切碎0.5-1mm3大小,PBS清洗1次;
(3)将剪碎的组织置于70目的筛网研磨,收集筛网下的组织,PBS重悬,离心收集组织细胞;
(4)将沉淀的组织细胞用细胞培养基重悬;细胞培养基配方如下:
基础培养基:高糖DMEM:DMEM/F12=1:1;
添加物:B27(1:100-1:1000),(1-10)ng/ml的EGF,(1-10)ng/ml FGF, (1-1000)ng/ml胰岛素,(1-10)nM的转铁蛋白,(2-20)%胎牛血清;
(5)将重悬的细胞接种到培养皿内进行2D扩增培养后接种到微流控芯片内形成3D细胞球培养;或者将重悬的细胞直接接种到微流控芯片内形成3D细胞球培养。
2.根据权利要求1所述的一种原代卵巢癌细胞的培养方法,其特征在于,将步骤5所述的重悬的细胞直接接种到微流控芯片内形成3D细胞球培养,并培养成肿瘤类器官。
3.根据权利要求2所述的一种原代卵巢癌细胞的培养方法,其特征在于,所述微流控芯片含有一个卵巢癌原代细胞培养区域,该区域可以进行灌流培养。
4.根据权利要求3所述的一种原代卵巢癌细胞的培养方法,其特征在于,所述卵巢癌原代细胞培养区域按照病理分型采用上下分层芯片结构。
5.根据权利要求3所述的一种原代卵巢癌细胞的培养方法,其特征在于,所述上下分层芯片结构的通道长度为200-1500微米,宽度为100-1000微米,高度为100-1000微米,中间由一个多孔膜分割,多孔膜的孔径为0.22-15微米。
6.根据权利要求3所述的一种原代卵巢癌细胞的培养方法,其特征在于,所述卵巢癌原代细胞培养区域采用微孔芯片结构。
7.根据权利要求6所述的一种原代卵巢癌细胞的培养方法,其特征在于,所述微孔芯片结构,其微孔为阵列结构,微孔的孔径为100-1000微米,深度为100-800微米。
8.如权利要求1-7任一项所述的原代卵巢癌细胞的培养方法在药物筛选中的应用,其特征在于:所述应用的步骤为:将不同种类、浓度、组合的抗肿瘤药物作用于肿瘤类器官芯片,并于一段时间后检测药物对肿瘤类器官的治疗效果、耐药等。
9.根据权利要求8所述的原代卵巢癌细胞的培养方法在药物筛选中的应用,其特征在于,所述原代卵巢癌细胞来自人类。
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