CN106248922A

CN106248922A - 一种肿瘤细胞药敏检测板及检测方法

Info

Publication number: CN106248922A
Application number: CN201610590692.9A
Authority: CN
Inventors: 瞿国伟; 夏铮; 高娜娜; 黄玉吉; 叶琇锦; 朱丽霞
Original assignee: Jiaxing Dingnuo Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Jiaxing Dingnuo Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-07-22
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2016-12-21

Abstract

本发明公开了一种肿瘤细胞药敏检测板，所述肿瘤细胞药敏检测板包括微孔板以及在微孔板的孔内固化的抗肿瘤药物，其制备方法为：将不同抗肿瘤药物按一定浓度配置成溶液，加入至微孔扳的孔内，随后将溶剂挥干，制成肿瘤细胞药敏检测板。检测时，临床取样并制备肿瘤细胞，将肿瘤细胞混合液加入药检孔内，在一定时间内检测肿瘤细胞的生存率或死亡率。本发明极大地简化了操作程序，提高了检测的准确性和稳定性，预测并指导临床科学合理地用药，减少化疗中的盲目性，提高化疗的有效率。

Description

一种肿瘤细胞药敏检测板及检测方法

技术领域

本发明属于药物筛选技术领域，特别涉及一种肿瘤细胞药敏检测板及使用该检测板检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的方法。

背景技术

化疗在癌症治疗中具有手术、放疗和免疫治疗不可替代的地位。自1946年Gillman和Phillips报道氮芥类药物治疗造血系统肿瘤以来，化疗已取得巨大进步。各种新的抗癌药物不断开发出来，目前临床应用的抗癌药物已达60余种。科学家们经过不懈的努力，已揭示了化疗的部分规律，摸索出联合或序贯用药、大剂量间隙给药、多途径多方式给药以及体内留置药物等多种有助于提高疗效的治疗策略。目前化疗已使绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、急性淋巴细胞性白血病、何杰金氏病等10多种癌症获得治愈的机会，使乳腺癌、儿童淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤等20多种癌症得以缓解，存活期延长，从而列身为癌症治疗的四大主要手段之一。

尽管化疗已经取得如此重大进步，但临床治疗的总有效率仍然很低，仅为14％，这主要是因为：

1.现行化疗的盲目性。抗癌药物敏感性研究表明，即使是相同组织学类型的个体肿瘤，对同一抗癌药物的反应也不尽一致，对不同脏器或不同组织学类型的肿瘤采用相同的方案，效果更是千差万别，然而，现有化疗多以不变应万变，以“共性”化治疗施加于众多个体，无法针对个体采用个性化对策，这只能说明是化疗的盲目性而令其陷入了尴尬的境地。

2.化疗的抗药性：抗药性是癌症化疗中无法回避的现实，研究表明，在化疗的不同阶段检测抗药性随时因时制宜采取不同对策，将大大提高化疗的水平。

3.抗癌药物的选择与毒性避免，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤正常的组织细胞，由于化疗的盲目性和抗药性，当医生试图通过大剂量、联用和药、延长化疗时间等方法改善疗效时，将会进一步加重毒性作用，使病人机体受到严重甚至是致命的损伤。

肿瘤细胞药物敏感性的检测其特点是直接从患者体内获取新鲜的肿瘤细胞进行化疗前培养(初诊病人)，由于肿瘤细胞未接触化疗药物，其耐药性和抗药性等生物学性状尚处于体内环境的原始状态，能较真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性及不同供体的个体差异，能够比较确切地代表体内状态，为不同的病人准确筛选敏感的化疗药物，并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药。目前药敏检测中普遍存在操作不标准、随意性大、不便检测的问题。因此，试验操作的高效便捷是肿瘤细胞药敏检测的关键技术要求。

目前药敏检测方法有很多，如克隆形成法(HTCA)、三磷酸腺苷生物荧光法(ATP-TCA)、流式细胞仪测定法、放射性标记物前体掺入法、MTT法等等。ATP-TCA法因其高精确度、高灵敏度得到应用，但其成本昂贵，不利于普遍推广；流式细胞测定仪设备贵重不普及,也同样存在检测费用高的问题；放射性标记物前体掺入法中放射性本身有细胞毒性，可干扰试验结果，同时会过高地评估药物抑制率，限制了其应用；MTT法、MTS法是目前最常用的体外药敏试验方法，它操作快速、结果重复性好、使用设备简单、成功率高,但是存在试验操作相对繁琐、细胞毒性高、实验结果误差大不精确等问题。适合于临床使用的药敏检测方法应具有经济、准确、灵敏度高、操作方便、检测时间短等特点。

发明内容

为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种肿瘤细胞药敏检测板，将多种抗肿瘤药物分别固化在药敏微孔板内，可直接将患者骨髓、血液等样本细胞混合液加入微孔板孔中，采用CCK-8法或荧光检测方法等检测肿瘤细胞对某种或多种药物的敏感性，使药敏检测标准化、商品化，非常便于检测人员的操作，真正实现临床的个体化用药。

本发明采用的技术方案为：

一种肿瘤细胞药敏检测板，其特征在于，所述肿瘤细胞药敏检测板包括微孔板以及在微孔板的孔内固化的抗肿瘤药物，其制备方法为：将不同抗肿瘤药物按一定浓度配置成溶液，加入至微孔扳的孔内，随后将溶剂挥干，制成肿瘤细胞药敏检测板。

本发明将多种一定浓度的抗肿瘤药物固化在微孔板上，形成肿瘤细胞的多种药物检测，可检测肿瘤细胞对不同抗肿瘤药物的敏感性。

进一步地，抗肿瘤药物溶液的浓度按下列公式计算：成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)(％)。

所述微孔板为48孔、96孔或192孔微孔板。微孔板应选择无破损、污染和划痕的微孔板，用环氧乙烷消毒。

本发明还提供了一种检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供肿瘤细胞药敏检测板，其制备方法为：将不同抗肿瘤药物分别配置成溶液，加入至微孔板的孔内，每孔加入药物溶液1～200μL；将微孔板通过冷冻干燥或惰性气体吹干的方式，使药物溶剂挥干，制成肿瘤细胞药敏检测板；

(2)临床取样，分离肿瘤细胞，将肿瘤细胞混悬于培养液，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，得细胞混合液；

(3)往步骤1)肿瘤细胞药敏检测板的微孔中加入1～200μL的细胞混合液，在CO₂细胞培养箱中培养1～7天；向微孔中加入1～200μL的检测活细胞或死细胞的试剂，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养0～24小时，测定吸光度或荧光强度，计算活细胞或死细胞数量，判断肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。

进一步地，步骤1)中抗肿瘤药物溶液的浓度按下列公式计算：成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)(％)。

步骤1)中惰性气体可以是氮气或氦气。

步骤2)中的肿瘤细胞是来自肿瘤组织、骨髓样本或血液样本，还包括其他体液。

步骤2)中的肿瘤细胞的来自于骨髓样本、血液样本或其他体液时，样本中加有抗凝剂。抗凝剂优选为肝素或EDTA。

步骤3)中细胞混合液的细胞浓度为10³～10⁵个/ml。

与现有技术比较，本发明具有以下优点：

1.本发明提供的检测方法，可以对体外原代培养的肿瘤细胞进行药物敏感检测，将传统的先加细胞后加药物检测改为先加药物、后加细胞检测，从而将药物包被从实验室的检测现场转移至工厂预制，它把现场极易随意发生的操作，统一成一种易于标准化的操作模式，即，将检测常用的药物预先加入到检测板体的药检孔中、经真空冷冻干燥等工艺处理，制成商品化的标准检测板，再以此板为基础，提供给各单位进行药物敏感性检测。

2.将一个以往全部在实验室完成的操作分解成两个阶段，一段为工厂的预制检测板阶段，一段为实验室的检测阶段，具有以下优点：延长药物的储存期；便于检测方法的标准化和商品化；极大地简化了操作程序，提高了检测的准确性和稳定性；由于操作简单、成本降低，从而有利于抗癌药物试验的开展和普及，减少化疗中的盲目性，指导临床合理用药，提高化疗有效率。

具体实施例

实施例1：肿瘤细胞药敏检测板制备

a.准备检测板：选用96孔微孔板作检测板，要求检测板无破损、污染和划痕。

b.消毒：用环氧乙烷消毒。按常规紫外线消毒法消毒无菌间和洁净工作台，整个操作在无菌间洁净工作台内进行。将筛选后的检测板进行消毒，消毒采用环氧乙烷柜室法，还氧乙烷用量：1kg/m³；在相对湿度60～80％情况下，作用6～10h。

c.配制药物：选择常用抗肿瘤药物，分别配制药物溶液，浓度以下列公式计算：浓度＝成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)(％)。其中：成人标准体重按60kg计算，细胞外液按8％计算，常规浓度稀释10倍为试验用浓度。常用的抗肿瘤药物有阿霉素(ADM)、顺铂(COOP)、环磷酰胺(CTX)、氟脲嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)等60余种。药物配制按各药物的有关说明进行，以阿霉素为例，规格为10mg、浓度为20μg/mL，配置方法为：溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)(1mg/mL)中，再取0.2ml加DMSO至10mL即成。其它药物与此类同。

d.药物加入：每孔加入药物溶液10μL，每次更换药物，都必须更换加样器头。全部药检孔加完后，将检测板盖盖上，放入灭菌容器内。

e.固化：将装有检测板的容器放入冻干机内，真空冷冻4h，冷冻真空度为：102Pa，温度：-20～-40℃，将药检孔内的液体冻干成固体。

f.包装：将检测板封装在铝箔袋内，加入干燥剂。

实施例2：检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性(骨髓或静脉血样本)

a.临床取样：由临床医生进行骨髓穿刺，抽取患者骨髓液样本，转移至样本管中，标记。应在4h内检测完毕。

b.分离单个核细胞：冰浴条件下，用PBS按1～2倍的稀释比例稀释骨髓液。在10mL塑料锥形管底部加入2mL的Ficoll液并倾斜试管45°～60°,沿着管壁缓慢加入稀释后的骨髓液样品。室温，500g离心20min。管中液体由上至下分为四层，第二层即为圆片状乳白色单个核细胞层。弃去第一层，小心吸出第二层到新的无菌10mL塑料锥形管中。加入2～3倍预冷PBS，轻柔吹打混匀，室温，500g离心10min。用2～4mL预冷PBS再洗两遍，悬浮于完全培养液备用。

c.细胞培养：悬浮于培养液备用的单个核细胞，转移至细胞培养瓶，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

d.药敏检测：在96孔肿瘤细胞药敏检测板中加入200μL细胞混合液，要求细胞混合液细胞浓度为50000个/ml，充分混匀，将检测板放置于CO₂细胞培养箱中培养72h。在超净工作台中向检测板每个孔中加入20μL的CCK-8试剂，并置于CO₂细胞培养中孵育1～4h，然后用酶标仪在450nm处测定吸光度，根据公式计算并判断常用抗肿瘤药物对肿瘤原代细胞生长的影响。

实施例3：检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性(手术切除肿瘤组织块)

a.取指尖大小的新鲜实体肿瘤组织标本，立即装入标本瓶,内含青霉素和链霉素双抗的生理盐水。若室温运输，应在2～6h内检测完毕。

b.标本预处理：祛除手术切除标本周围的非肿瘤组织和坏死组织，用缓冲液冲洗2～3次祛除血污和残留，无菌条件下剪碎成不大于1mm的碎块。

c.制备肿瘤细胞悬液：将肿瘤组织碎块在200目金属网筛上用注射器针栓轻轻碾磨,肿瘤细胞滤过网孔进入培养液内，移入离心管内离心6～10min，弃去上清，将细胞沉淀混悬于DMEM培养基中，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

d.药敏检测：将96孔肿瘤细胞药敏检测板预加温至37℃，将DMEM培养液亦预热至37℃；在检测板每个孔中加入200μL细胞混合液，细胞混合液细胞浓度要求50000个/ml，充分混匀，将检测板放置于CO₂细胞培养箱中培养72h。在工作台中向上述检测板每个孔中加入20μL CCK-8试剂，并置于CO₂细胞培养中孵育1～4h，然后用酶标仪在450nm处测定吸光度，计算并判断常用抗肿瘤药物对肿瘤原代细胞生长的影响。

Claims

1.一种肿瘤细胞药敏检测板，其特征在于，所述肿瘤细胞药敏检测板包括微孔板以及在微孔板的孔内固化的抗肿瘤药物，其制备方法为：将不同抗肿瘤药物按一定浓度配置成溶液，加入至微孔扳的孔内，随后将溶剂挥干，制成肿瘤细胞药敏检测板。

2.根据权利要求1中所述的肿瘤细胞药敏检测板，其特征在于，抗肿瘤药物溶液的浓度按下列公式计算：成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)(％)。

3.根据权利要求1中所述的肿瘤细胞药敏检测板，其特征在于，所述微孔板为48孔或96孔或192孔微孔板。

4.一种检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供肿瘤细胞药敏检测板，其制备方法为：将不同抗肿瘤药物分别配置成溶液，加入至微孔板的孔内，每孔加入药物溶液1～200μL；将微孔板通过冷冻干燥或惰性气体吹干的方式，使药物溶剂挥干，制成肿瘤细胞药敏检测板；

2)临床取样，分离肿瘤细胞，将肿瘤细胞混悬于培养液，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，得细胞混合液；

3)往步骤1)肿瘤细胞药敏检测板的微孔中加入1～200μL的细胞混合液，在CO2细胞培养箱中培养1～7天；向微孔中加入1～200μL的检测活细胞或死细胞的试剂，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养0～24小时，测定吸光度或荧光强度，计算活细胞或死细胞数量，判断肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。

5.根据权利要求4所述检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的方法，其特征在于，步骤1)中抗肿瘤药物溶液的浓度按下列公式计算：成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)(％)。

6.根据权利要求4所述检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的方法，其特征在于，步骤2)中的肿瘤细胞是来自肿瘤组织、骨髓样本或血液样本。

7.根据权利要求6所述检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的方法，其特征在于，步骤2)中的肿瘤细胞来自于骨髓样本、血液样本时，样本中加有抗凝剂。

8.根据权利要求7所述检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的方法，其特征在于，所述抗凝剂为肝素或EDTA。

9.根据权利要求4所述检测肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的方法，其特征在于，步骤3)中细胞混合液的细胞浓度为10³～10⁵个/ml。