CN1429915A - 一种肿瘤细胞药敏检测方法及其检测板 - Google Patents

Abstract

一种肿瘤细胞药敏检测方法及其检测板，属检测技术领域，用于解决目前检测中操作不标准、随意性大、不便检测的问题。其技术方案是，将检测分为预制检测板阶段和实验室检测阶段，预制检测板阶段是将抗肿瘤药物预先加入特制的检测板药检孔中，并予以冷冻固化，在检测时，将肿瘤细胞加入药检孔中，利用MTT法还原成有色沉淀，再进而制成有色溶液，经酶标仪测定后计算比较，求得药敏数值，作出判断。本发明可以使检测方法标准化、商品化，极大地简化了操作程序，提高了检测的准确性和稳定性，减少化疗中的盲目性，指导临床科学合理地用药，提高化疗的有效率。

Description

一种肿瘤细胞药敏检测方法及其检测板

技术领域

本发明涉及一种对肿瘤细胞进行药物敏感检验的方法，属检测技术领域。

背景技术

化疗在癌症治疗中具有手术和放疗不能替代的地位。自1946年Gillman和Phillips报道氮芥类药物治疗造血系统肿瘤以来，化疗已取得很大进步。各种新的抗癌药物不断开发出来，目前临床应用的抗癌药物已达60余种。专家们经过不懈的努力，已揭示了化疗的部分规律，摸索出联合用药、大剂量间断给药、多途径多方式给药以及双途径化疗等多种有助于提高疗效的治疗策略。目前化疗已使绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、急性淋巴细胞性白血病、何杰金氏病等10多种癌症获得治愈的机会，使乳腺癌、儿童淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤等20多种癌症得以缓解，存活期延长，从而列身为癌症治疗的三大主要手段之一。尽管已经取得如此重大进步，但临床治疗的总有效率仍然仅为14％，这主要是因为：

1.现行化疗的盲目性。抗癌药物敏感性研究表明，即使是相同组织学类型的肿瘤，对同一抗癌药物的反应也不尽一致，对不同脏器或不同组织学类型的肿瘤采用相同的方案，效果更是千差万别，然而，现有化疗多以不变应万变，以“共性”化治疗施加于众多个体，无法针对个体采用个性化对策，这只能说明是化疗的盲目性而令其陷入了尴尬的境地。

2.化疗的抗药性：抗药性是癌症化疗中无法回避的现实，研究表明，在化疗的不同阶段检测抗药性随时因时制宜采取不同对策，将大大提高化疗的水平。

3.抗癌药物的选择与毒性避免，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤正常的组织细胞，由于化疗的盲目性和抗药性，当医生试图通过大剂量、多药物、缩短疗程等方法改善疗效时，将会进一步加重毒性作用，使病人机体受到严重甚至是致命的损伤。药物敏感性的检测为可预见的化疗效果提供了重要依据，这无疑将会大大提高癌症的治疗水平。

有鉴于此，对药物进行药敏检测是如此的必要和紧迫，促使专家们探索出多种检测方法，如集落形成法、放射性同位素前体掺入法、染料排斥法、流式细胞计法、鼠肾包膜下瘤移植法、MTT法等等，其中MTT法是备受推崇的方法。它操作简单、快速、结果重复性好、使用设备简单、成功率高。

MTT法的原理是，凡有代谢活性的细胞核线粒体，其琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子，使之还原为延胡索酸，染料四甲基偶氮唑蓝[3-(4，5-dinethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-tetrazoliunbronide，MTT]作为氢原子的接收剂，能使可溶性黄色MTT还原为不可溶的有色沉淀甲瓒(fomazan)，在这种沉淀中加入二甲亚砜，经比色测定，即可计算药物的敏感度。

MTT法的检测步骤是，

处理标本→制备肿瘤细胞悬液(酶消化和物理分离等)→分离肿瘤细胞→肿瘤细胞计数→肿瘤细胞原代培养→加入抗癌药物→37℃CO2孵箱培养48小时→加MTT继续培养6-12小时→酶标仪比色→计算敏感度。以上步骤在实际操作中将显得非常繁琐而费时。在进行药物筛选时，每检测一次，都要重复一次上述步骤，若要检测60种抗癌药物，就要重复60次。而且，由于步骤多时间长，操作将必然会受到人为因素的干扰，假若检测人员在添加药物时，浓度或药量掌握不准，将直接形成误差，影响比色结果，而这是非常可能发生的。在药敏检测中，由于检测人员一般是先制备肿瘤细胞，而后将待测药物加入进行比色测定，这种操作在不同单位、不同测试人员、不同时段进行时，由于MTT法尚没有一个国际统一的技术标准支持，各科研机构和医疗部门采用的药物浓度、药物与细胞反应时间的确定及敏感标准的设立各不相同，这种误差就更是无法避免的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种便于药敏检测标准化、商品化、便于检测人员操作的肿瘤细胞药敏检测方法。

本发明的另一个目的是提供用于这种检测的检测板。

本发明所述技术问题是由以下技术方案解决的：

一种肿瘤细胞药敏检测方法，它分为预制检测板阶段和实验室检测阶段，所述预制检测板阶段包含如下步骤：

A.准备检测板体：选用每块板上含有多排、每排设有多个药检孔的实验板作检测板，要求检测板无破损、污染和划痕；

B.消毒：用环氧乙烷消毒；

C.配制药物：选择常用抗癌药物，分别配制药物溶液，浓度以下列公式计算：

         浓度＝成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)(％)；

D.药物加入：每孔加入药物溶液10微升，全部药检孔加完后，将检测板盖盖上，放入灭菌容器内；

E.固化：将装有检测板的容器放入冻干机内，真空冷冻4小时，将药检孔内的液体冻干成固体；

F.包装：将检测板封装在铝箔袋内，加入干燥剂；

所述实验室检测阶段包含如下步骤：

G..标本留取

外科手术切除肿瘤组织标本，取指尖大小，立即装入标本瓶内，若室温放置，应在2-6小时内检测完毕。

H.标本预处理：祛除标本周围的非肿瘤组织和坏死组织，用缓冲液冲洗2-3次，剪碎成粒径不大于1毫米的碎块；

I.制备肿瘤细胞悬液：

将肿瘤组织碎块研磨过滤进入缓冲液溶液内，加入离心管内离心操作6-10分钟，弃去上清，用缓冲液混悬肿瘤细胞，再离心操作后弃去上清，将细胞混悬于DMEM培养基中，使细胞计数为5×10⁵/ml。

J.肿瘤细胞原代培养：

将检测板预温至37度，将DMEM培养基亦预温至37℃；

每孔加细胞悬液200微升，轻轻摇荡混匀；

37℃度、5％CO₂孵箱内培养48小时；

K.MTT还原

每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，继续培养3-24小时，至形成蓝色针状结晶为止；

L.检测：

将检测板离心操作8-10分钟，弃去上清，用吸水纸吸去残液；

每孔加入二甲亚砜100微升，轻轻摇荡混匀；

用酶标仪检测各孔OD值；

M.计算与判断：

抑制率(IR)＝(1-给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100％

若：IR＞50％，判定为高度敏感；

    30％≤IR≤50％，判定为敏感；

    IR＜30％，判定为不敏感。

上述肿瘤细胞药敏检测方法，为防止标本凝固，在所述标本留取工序，加入抗凝剂，轻轻摇荡，使抗凝剂充分溶解，所述抗凝剂为肝素。

上述肿瘤细胞药敏检测方法，为防止标本污染受损，在标本预处理工序，当标本用缓冲液冲洗后，再在4℃温度下用含青霉素和链霉素的DMEM培养基浸泡1-3小时。

上述肿瘤细胞药敏检测方法，所述固化工序中真空度为10²Pa，温度-20～-40℃。

上述肿瘤细胞药敏检测方法，为便于观测，所述酶标仪的检测光的波长选定570nm。

本发明要解决的另一个问题是用以下技术方案实现的：

一种肿瘤细胞药敏检测板，它由检测板体和板盖组成，所述检测板体平行设置多排药检孔，每排并列多个药检孔，药检孔为开口的圆筒状容器，药检孔中设有经过真空冷冻干燥固化的药膜；所述板盖为条状板，四周设有边框。

上述肿瘤细胞药敏检测板，所述药检孔设置4-8排，每排设置检测药检孔8-12个。

上述肿瘤细胞药敏检测板，所述盖板的边框与条状板交界处均匀设置微型凸起。

上述肿瘤细胞药敏检测板，所述检测板体为分体结构，各排药检孔连体制作在一起，多排药检孔再嵌镶在框架内。

按照本发明提供的检测方法，可以对体外原代培养的肿瘤细胞进行药物敏感检测，这种检测将传统的先加细胞后加药物检测改为先加药物、后加细胞检测，从而将药物包被从实验室的检测现场转移至工厂预制，这种改变看似简单，实则带来根本性的变革，它把现场极易随意发生的操作，统一成一种易于标准化的操作模式，即，将检测常用的药物预先加入到检测板体的药检孔中、经真空冷冻干燥等工艺处理，制成商品化的标准检测板，再以此板为基础，提供给各单位进行药物敏感性检测，将一个以往全部在实验室完成的操作分解成两个阶段，一段为工厂的预制检测板阶段，一段为实验室的检测阶段，这种变革的优点是：1.延长药物的储存期；2.便于检测方法的标准化和商品化；3.极大地简化了操作程序，提高了检测的准确性和稳定性；4.由于操作简单、成本降低，从而有利于抗癌药物试验的开展和普及，减少化疗中的盲目性，指导临床合理用药，提高化疗有效率。

附图说明

图1是本发明所用检测板体的主视图；

图2是检测板体加盖板盖后的仰视图；

图3是图2的剖视图；

图4是板盖的主视图；

图5是板盖的后视图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详述。

常用的抗癌药物有阿霉素(缩写为ADM，下同)、顺铂(COOP)、环磷酰胺(CTX)、氟脲嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)等60余种，包被这些药物时，按下述工序进行：

抗癌药物的准备：药物浓度按成人常规静脉用量计算。

抗癌药检常规浓度＝成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)：其中：成人标准体重按60KG计算，细胞外液按8％计算，常规浓度稀释10倍为试验用浓度。

药物配制按各药物的有关说明进行，以阿霉素为例，规格为10mg、浓度为20μg/ml，配置方法为：溶于10ml水(1mg/ml)中，再取0.2ml加水至10ml即成。其它药物与此雷同。

按常规紫外线消毒法消毒无菌间和洁净工作台，整个操作在无菌间洁净工作台内进行。将筛选后的检测板进行消毒，消毒采用环氧乙烷柜室法，还氧乙烷用量：1kg/m³；在相对湿度60-80％情况下，作用6-10小时。消毒后，置于消毒的塑料袋内备用，消毒加样器头、刻度离心管和溶液瓶等，密封备用。将药物加入检测板体的药检孔内，加入药物量为每孔10μl，每次更换药物，都必须更换加样器头。加好药物后的检测板体，加盖，放入灭菌容器内。经真空冷冻干燥后，即可包装成成品。至此，在工厂的预制检测板阶段即告完成。

下一阶段为实验室的现场检测阶段。

每次检测，都必须首先制作肿瘤标本，依据标本的不同，标本瓶可分为骨髓、血液、实体癌组织等三种。标本应在2-6小时内检测完毕，在不加培养基的条件下，在4℃温度下可放置2小时，如加培养基可放置6小时，其结果不受影响。疑有轻度外表污染的标本，可用含庆大霉素的生理盐水冲洗标本3次，再在4℃条件下用含青霉素和链霉素的培养基浸泡1-3小时，然后用于检测。调整细胞的浓度为5×10⁵/ml，癌细胞的分散程度将影响检测的平行性，细胞成团严重，可造成各药检孔的加量不均匀，加样时应不断混匀。

肿瘤细胞悬液的制备，从标本瓶中取出肿瘤组织用GKN溶液冲洗2-3次祛除血块和坏死组织，在无菌条件下剪碎成不足1mm大小的碎块。置于200目金属筛上轻轻研磨过滤进入10mlGKN溶液，加于离心管中1000r/min离心7分钟，弃去上清。用GKN液混悬细胞，计数细胞总数，再以1000r/min离心7分钟，弃去上清，细胞混悬于适量DMEM培养基中，使细胞数为5×10⁵/ml左右。

检测前将肿瘤药敏检测板和DMEM培养基预温至37℃。每孔加细胞悬液200μl，轻轻振荡混匀。在37℃度、5％CO2孵箱内培养48小时。每孔加MTT(5mg/ml)20μl，继续培养3-24小时，终止培养时间依据接种组织和细胞的类型及接种细胞的数量决定，可在显微镜下观察MTT的还原情况，若形成兰色针状结晶即可终止反应。

将检测板以1000r/min离心10分钟，弃上清，吸去残液，即可在每孔加入100微升二甲亚砜，充分振荡，使还原的染料溶解，溶解彻底后用酶标仪检测各孔OD值，将数值输入微机进行计算和判断。

参看图2，本发明中的检测用板由检测板体1和板盖3组成，参看图1和图3，检测板体平行设置多排药检孔2，每排又并列许多个药检孔，目的是便于观察和评判。药检孔为开口的圆筒状容器，上口可略大于下底。上口直径为5-8毫米。，板盖的设置是为了防止污染，参看图5，盖板为条状板，四周设有较矮的边框，边框与条状板交界处均匀设置微型凸起8，其目的是为了在对肿瘤细胞进行原代培养阶段，盖板与检测板体之间需留有一定的间隙，以便透入二氧化碳气体。

药检孔设置4-8排，这样，每列药检孔除一个是对照孔外，其余均含有相同的抗癌药物，当被加入肿瘤细胞后，非常便于观察、对比、及计算平均OD值。

检测板体上每排又设置药检孔8-16个，这样就可以包被8-16种抗癌药物，以便同时观察对比同一种肿瘤细胞对8-16种抗癌药物的敏感程度。

检测板体可以将每排每列药检孔制作成固定结构，也可以制作成分体结构，此时，可将一排药检孔连体制作在一起，再跟其它排的药检孔嵌镶在框架内，这样作的优点是可以有选择的使用其中的几排，而将不用的排再与其它的排重新组合在一起，以备下次使用。由图1和图3可见，分体结构的每排药检孔的端部设置一个小把手6，在框架的底部设有与药检孔位置相对应的通孔9，这两处设计可以使药检孔很方便的从框架上取出。在框架上还设有定位柱5，定位柱均布在药检孔的周边，每个药检孔边设置四个，当药检孔插入到框架时可以起到定位作用。

由于检测板体的框架或药检孔的壁厚尺寸都比较小，为了提高刚性，板盖上均匀设置了一些加强筋4，在检测板体的框架上也设有加强筋7。

Claims (9)

1.一种肿瘤细胞药敏检测方法，其特征在于，它分为预制检测板阶段和实验室检测阶段，所述预制检测板阶段包含如下步骤：

A.准备检测板：选用每块板上含有多排、每排设有多个药检孔的实验板作检测板，要求检测板无破损、污染和划痕；

B.消毒：用环氧乙烷消毒；

C.配置药物：选择常用抗癌药物，分别配置药物溶液，浓度以下列公式计算：

          浓度＝成人常规静脉用量/(成人标准体重×8％×1000)(％)；

D.药物加入：每孔加入药物溶液10微升，全部药检孔加完后，将检测板盖盖上，放入灭菌容器内；

E.固化：将装有检测板的容器放入冻干机内，真空冷冻4小时，将药检孔内的液体冻干成固体；

F.包装：将检测板封装在铝箔袋内，加入干燥剂；

所述实验室检测阶段包含如下步骤：

G..标本留取

外科手术切除肿瘤组织标本，取指尖大小，立即装入标本瓶内，若室温放置，应在2-6小时内检测完毕。

H.标本预处理：祛除标本周围的非肿瘤组织和坏死组织，用缓冲液冲洗2-3次，剪碎成粒径不大于1毫米的碎块；

I.制备肿瘤细胞悬液：

将肿瘤组织碎块研磨过滤进入缓冲液溶液内，加入离心管内离心操作6-10分钟，弃去上清，用缓冲液混悬肿瘤细胞，再离心操作后弃去上清，将细胞混悬于DMEM培养基中，使细胞计数为5×10⁵/ml。

J.肿瘤细胞原代培养：

将检测板预温至37℃，将DMEM培养基亦预温至37℃；

每孔加细胞悬液200微升，轻轻摇荡混匀；

37℃度、5％CO2孵箱内培养48小时；

K.MTT还原

每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，继续培养3-24小时，至形成蓝色针状结晶为止；

L.检测：

将检测板离心操作8-10分钟，弃去上清，用吸水纸吸去残液；

每孔加入二甲亚砜100微升，轻轻摇荡混匀；

用酶标仪检测各孔OD值；

M.计算与判断：

抑制率(IR)＝(1-给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100％

若：IR＞50％，判定为高度敏感；

    30％≤IR≤50％，判定为敏感；

    IR＜30％，判定为不敏感。

2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞药敏检测方法，其特征在于，在所述标本留取工序，加入抗凝剂，轻轻摇荡，使抗凝剂充分溶解，所述抗凝剂为肝素。

3.根据权利要求2所述的肿瘤细胞药敏检测方法，其特征在于，在标本预处理工序，当标本用缓冲液冲洗后，再在4℃温度下用含青霉素和链霉素的DMEM培养基浸泡1-3小时。

4.根据权利要求3所述的肿瘤细胞药敏检测方法，其特征在于，所述固化工序中真空度为：10²Pa，温度：-20～-40℃。

5.根据权利要求1或2所述的肿瘤细胞药敏检测方法，其特征在于，所述酶标仪的检测光的波长选定570nm。

6.一种肿瘤细胞药敏检测板，其特征在于，它由检测板体[1]和板盖[3]组成，所述检测板体平行设置多排药检孔[2]，每排并列多个药检孔，药检孔为开口的圆筒状容器，药检孔中设有经过真空冷冻干燥固化的药膜[10]；所述板盖为条状板，四周设有边框。

7.根据权利要求6所述的肿瘤细胞药敏检测板，其特征在于，所述药检孔设置4-8排，每排设置检测药检孔8-12个。

8.根据权利要求7所述的肿瘤细胞药敏检测板，其特征在于，所述盖板的边框与条状板交界处均匀设置微型凸起[8]。

9.根据权利要求7所述的肿瘤细胞药敏检测板，其特征在于，所述检测板体为分体结构，各排药检孔连体制作在一起，多排药检孔再嵌镶在框架内。

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