CN105087752A - 一种药敏试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药敏试剂盒的制备方法，包括依次、顺序实施的以下步骤：（1）称量：称取药品；（2）试剂溶解及稀释，得到不同浓度的溶液；（3）将步骤（2）中得到的不同浓度的溶液加入容器中；（4）干燥：将装有不同浓度溶液的容器进行干燥除去水分；（4）封装：对干燥得到的容器进行封装；（5）灭菌，对封装好的容器进行灭菌，得到成品药敏试剂盒；所述干燥为冷冻干燥。本发明中，将营养培养基与抗生素一起加入到试剂盒中作为底物，营养培养基及抗生素黏贴到试剂盒底部。不会影响抗生素效价；得到的药敏试剂盒，可长时间保存，而不影响试剂盒质量。底物可迅速溶解，抗生素可即时产生抑菌效果。容易灭菌，并且不易污染。
Description
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体地，本发明涉及一种药敏试剂盒的制备方法。
背景技术
公开号为CN102199530A的中国发明专利申请，公开了一种药敏试剂盒的制备方法以及药敏检测方法，所述药敏试剂盒的制备方法包括装有增菌培养液的离心管的制备和装有固体培养基的培养皿的制备和药敏贮药圈的制备，其中，固体培养基的培养皿的制备包括培养液的制备、灭菌及分装，然后在超净台紫外灯的作用下是培养液冷却成固体培养基并抽真空。紫外灯灭菌存在灭菌不彻底的问题。
为了使试剂盒得到有效的干燥，目前，制备药敏试剂盒的一般流程是：将抗生素溶解于特定的营养肉汤中，然后加入96孔药敏板，放入烘箱烘干。烘干后真空包装。
此方法不适用于热敏药物，如热敏抗生素阿莫西林、头孢呋辛等等，否则热敏药物的药价会受影响、降低，甚至失效，从而影响检测结果。
公开号为CN1616673A的中国发明专利申请公开了一种酶法测定血氨试剂盒，其经过溶解、分装及冷冻干燥后，在冷藏的条件下，有效期可达两年，复溶后，室温稳定一周，冷藏稳定一个月，抗干扰能力强，中等程度融血、乳摩血、血糖20mmol/l以下，胆红素100μmol/l以下，对测定不产生干扰，冻干试剂冷藏一年，试剂盒中酶活力损失小于5％，NADPH损失小于10％。
公开号为CN1057484A的中国发明专利申请公开了一种尿酸测定酶试剂盒的制备方法，其中包括产朊假丝酵母菌微生物的培养、提取，2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸色原的合成和冻干准备液的配制，分装，低温冷冻干燥密封等，支撑的酶盒敏感度高，稳定性好，抗干扰性能好等优点。
但是，在冷冻干燥的过程中，由于存在负压，很容易使酶或药物离开试剂盒，从而导致试剂盒内有效酶或药物的含量减少，甚至完全流失。公开号为CN1057484A的中国发明专利申请中，添加了其他非反应成分，公开号为CN1616673A的中国发明专利申请中，也添加了乳糖等成分，使得酶在冷冻干燥的过程中不会在负压的作用下，离开试剂盒。但是，药敏试剂盒的制备中，并不能按照酶试剂盒的制备中那样，随便添加其他成分使得药物固定在试剂盒而不在负压的作用的下流失，因为添加的物质及其含量，均会对后续细菌培养的结果产生影响。
发明内容
为了克服以上现有技术中的技术问题，本发明提供一种药敏试剂盒的制备方法，包括依次、顺序实施的以下步骤：
(1)称量：称取药品；所述药品包括抗生素，如阿莫西林、头孢唑林、头孢呋辛亚胺培南西司他丁、哌拉西林、氨苄西林、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、替卡西林、苯唑西林、阿莫西林克拉维酸等；
(2)试剂溶解及稀释：配制培养液与所述药品的混合液，并对其进行稀释，得到不同浓度的溶液；培养液中含有明胶和/或甘露醇；
(3)将步骤(2)中得到的不同浓度的混合液加入容器中；
(4)干燥：将装有不同浓度溶液的容器进行干燥，除去水分；
(5)封装：将步骤(4)中得到的干燥产物在真空下进行包装；
(6)灭菌：将包装好的产品进行灭菌，记得到成品药敏试剂盒；
所述干燥为冷冻干燥。采用冷冻干燥，不会影响抗生素的药价，尤其是对于热敏抗生素，从而使得体外检测检验所用的药敏试剂盒的灵敏度得到保证，检测结果准确。
优选的是，所述冷冻干燥包括以下步骤：
A、预冻；
B、至少一次升华；
C、解析过程。
上述任一方案中，优选的是，所述预冻是在零下50℃环境下，预冻1-3小时，使物料成固体。
上述任一方案中，优选的是，步骤B中是至少一次升华包括初次升华和二次升华。与只采用一次升华相比，采用两次升华，物料更容易干燥，而且药品成分最大限度得到保留；而采用三次及以上次数的升华，干燥时间长，耗能大，并且，会使物料过度干燥，导致底部的药品容易脱落，从而造成封装、运输等后续过程操作困难等。
上述任一方案中，优选的是，所述初次升华是将温度从零下50℃升温至零下25℃，并在零下25℃下保温2-4个小时；所述二次升华将温度从零下25℃升温至零下20℃，并在零下20℃下保温2-5小时。
上述任一方案中，优选的是，所述解析过程华将温度从零下20℃升温至30℃，并在30℃下保温10-20分钟。
所述二次升华是通过从-25℃升温至-20℃，物料温度与箱体温度形成一定温度差，从而加速升华速度。同时，以上所有提到的升温，均是缓慢升温，如在40-50分钟内，温度从零下50℃升温至零下25℃；在两个小时左右，温度从零下25℃升温至零下20℃；在2-3个小时内，温度从零下20℃升温至30℃。采用缓慢升温避免了底部的药品等成分脱落；换言之，即，如果采用快速升温，在短时间内将温度升高至目标温度，则会导致底部的药品脱落。
上述任一方案中，优选的是，所述初次升华、二次升华和解析过程均是在300μbar的真空度下进行。
上述任一方案中，优选的是，所述预冻结束后，使所述初次升华、二次升华和解析过程均是在300μbar的真空度下进行。
在一定真空度下进行干燥，将冷冻干燥和真空干燥结合，提高了干燥的效率，并且，在一定真空度下，升华、解析过程中产生的水蒸气，能顺利排出，有利于干燥过程的进行。而采用300μbar的真空度时，有利于干燥的进行，采用过低的真空度，使得物料中的水分不容易得到干燥，而采用过高的真空度，真空设备内会保持一定水分，不利于升华。
上述任一方案中，优选的是，所述冷冻干燥在冻干机内完成。采用冻干机进行冷冻干燥，操作方便，有利于实现全自动。
上述任一方案中，优选的是，在所述干燥工序之前，还包括加样工序，即，将溶液加入容器中。优选的是，将步骤(2)中得到的溶液，加入到96孔板的每个孔中，干燥、封装、检测都可以在96孔板中完成，简单、方便。
上述任一方案中，优选的是，在称量药品、试剂前，还包括准备工序，所述准备工序包括根据标准检验药品。检验药品有利于保证试剂盒的使用效果，使得体外检测检验结果准确。
上述任一方案中，优选的是，在称量药品、试剂前，还包括准备工序，所述准备工序包括配置所述培养液。
上述任一方案中，优选的是，所述培养液(也叫做营养肉汤)中含有浓度(100ml纯化水内的质量，即g/100ml)为6.93g/100ml的MH培养基、0.2-1.0g/100ml的明胶、9g/100ml-12g/100ml的甘露醇，明胶的浓度优选为0.4-0.8g/100ml，更加优选为0.6g/100ml。其中，明胶起固定作用，明胶太低，底物容易脱落，太高会导致MH培养基不易溶解，并且加入菌液后，容易产生气泡。甘露醇起到提高营养肉汤的崩解温度，甘露醇太低，会导致营养肉汤崩解温度低，在冷冻干燥过程中，干燥的营养肉汤崩解而不能维持形态，继而被抽出试剂盒孔。甘露醇含量太高会抑制细菌生长，并且不易溶解。
上述任一方案中，优选的是，得到成品试剂盒后，还包括质检工序，以检查得到的成品药敏试剂盒是否符合标准。设置质检程序，有利于把握、监管产品的质量，使得试剂盒的使用效果进一步得到保证。
本发明提供的药敏试剂盒制备方法，将营养培养基与抗生素一起加入到试剂盒中作为底物，并且，在明胶和甘露醇的作用下，营养培养基及抗生素牢固的黏贴到试剂盒底部，营养培养基起一定粘结作用，将底物牢固粘结在试剂盒底部，另外由于营养培养基加入试剂盒底部，使得在使用过程中可以直接用生理盐水稀释微生物，然后加入到试剂盒中。
本发明的有益效果如下：
第一，本发明的药敏试剂盒的制备方法，在试剂盒生产过程中不会影响抗生素效价；特别地，对于热敏抗生素来说，不会影响热敏感抗生素效价。
第二，本发明提供的药敏试剂盒制备方法，将营养培养基与抗生素一起加入到试剂盒中作为底物，然后冷冻干燥，将营养培养基及抗生素牢固的黏贴到试剂盒底部。
第三，本发明的药敏试剂盒的制备方法制备得到的药敏试剂盒，可在室温长时间保存，而不会影响试剂盒质量。甚至可以在高温下保存长达15天。
第四，冻干工艺生产出的产品疏松多孔，与空气接触面大，加入液体后，底物可迅速溶解，抗生素可即时产生抑菌效果。
第五，在试剂盒实际使用过程中，配套试剂为生理盐水，容易灭菌，并且不易污染。
具体实施例
为了更好、清楚地理解本发明的发明内容，下面将结合具体实施例对本发明做进一步的说明、解释。
以下所有实施例中所用的原料来源或信息如下：MH培养基购自OXIOD集团，明胶为99％高纯度明胶，甘露醇及其他药品购自国药集团。
实施例1
一种药敏试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：
首先配制培养液(营养肉汤)，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………0.4g；
甘露醇………………9g；
纯化水………………100ml。
配制营养肉汤时，煮沸溶解。
然后制备药敏试剂盒：
步骤一：称量，采用电子天平进行称量，所述电子天平提前预热20min，并校正；称取头孢吡肟0.0195g，误差不大于±0.0002g；
步骤二：试剂溶解及稀释：将步骤一中称取的药品中溶于20ml纯化水，搅拌溶解，混匀后得到原液，先用纯化水对原液进行对倍稀释两次，得到3个浓度梯度(包括原液的浓度、一次对倍稀释后的浓度和两次对倍稀释后的浓度)，然后再用所述培养液进行10倍稀释；
步骤三：加样：按每个孔30μl的量，将步骤二中得到10倍稀释后的不同浓度的溶液按照浓度从高到低或从低到高的顺序分别加入96孔板的孔中；
步骤四：冷冻干燥，加样后的试剂盒放入冷冻干燥箱内进行冷冻干燥，先在-50℃预冻两个小时；然后抽真空至真空度为300μbar，然后将温度升高至-25℃，进行初次升华，保温两个小时；初次升华结束后，将温度升高至-20℃，进行二次升华，保温四个小时；二次升华结束后，将温度升高至30℃，进行解析，保温15分钟；
步骤五：封装，从冷冻干燥箱内拿出试剂盒，使用真空封装机进行真空封装；
步骤六：灭菌：将抽真空包装完毕的试剂盒送辐照中心进行辐照灭菌(辐照剂量为8KGy)；
步骤七：质检、入库或出售或使用。
使用的时候，加入菌悬液等后，一般而言，相当于再次进行了3.3倍的稀释，此时三个梯度浓度的反应孔中头孢吡肟的浓度约为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml。
实施例2.1
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，冷冻干燥时，先在-50℃预冻一个半小时；然后抽真空至真空度为300μbar，然后将温度升高至-25℃，进行初次升华，保温四个小时；初次升华结束后，将温度升高至-20℃，进行二次升华，保温三个小时；二次升华结束后，将温度升高至30℃，进行解析，保温18分钟。
实施例2.2
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，冷冻干燥时，先在-50℃预冻一个小时；然后抽真空至真空度为300μbar，然后将温度升高至-25℃，进行初次升华，保温两个小时；初次升华结束后，将温度升高至-20℃，进行二次升华，保温两个小时；二次升华结束后，将温度升高至30℃，进行解析，保温10分钟。
实施例2.3
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，冷冻干燥时，先在-50℃预冻三个小时；然后抽真空至真空度为300μbar，然后将温度升高至-25℃，进行初次升华，保温三个小时；初次升华结束后，将温度升高至-20℃，进行二次升华，保温五个小时；二次升华结束后，将温度升高至30℃，进行解析，保温20分钟。
实施例2.4
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，冷冻干燥时，先在-50℃预冻两个半小时；然后抽真空至真空度为300μbar，然后将温度升高至-25℃，进行初次升华，保温三个半小时；初次升华结束后，将温度升高至-20℃，进行二次升华，保温四个小时；二次升华结束后，将温度升高至30℃，进行解析，保温13分钟。
实施例3.1
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………0.6g；
甘露醇………………9g；
纯化水100ml。
实施例3.2
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………0.3g；
甘露醇………………10g；
纯化水100ml。
实施例3.3
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………0.4g；
甘露醇………………11g；
纯化水100ml。
实施例3.4
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………0.5g；
甘露醇………………12g；
纯化水………………100ml。
实施例3.5
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………0.2g；
甘露醇………………9.5g；
纯化水………………100ml。
实施例3.6
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………0.8g；
甘露醇………………10.5g；
纯化水………………100ml。
实施例3.7
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………0.9g；
甘露醇………………12g；
纯水………………100ml。
实施例3.8
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，所述培养液有以下物质制成：
MH培养基………………6.93g；
明胶………………1.0g；
甘露醇………………12g；
纯化水………………100ml。
实施例4
一种药敏试剂盒的制备方法，与实施例1不同的是，在称量药品前，对所述药品进行检验，看药品是否符合相关标准(《抗菌药物敏感性试验执行标准；第二十三版资料增刊》中的表4A“非苛养菌质量控制允许范围”)。
实施例5.1
一种药敏试剂盒的制备方法，与上述实施例不同的是，称取氨苄西林0.0214g溶于5ml纯化水，混匀后先用纯化水进行对倍稀释两次，得到3个浓度梯度，然后再用所述培养液进行10倍稀释，然后再进行加样、干燥等。
使用的时候，加入菌悬液等后，一般而言，相当于再次进行了3.3倍的稀释，此时三个梯度浓度的反应孔中氨苄西林的浓度约为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml。
实施例5.2
一种药敏试剂盒的制备方法，与上述实施例不同的是，称取左氧氟沙星0.0027g溶于10ml纯化水，混匀后先用纯化水进行对倍稀释六次，得到7个浓度梯度，然后再用所述培养液进行10倍稀释，然后再进行加样、干燥等。
使用的时候，加入菌悬液等后，一般而言，相当于再次进行了3.3倍的稀释，此时七个梯度浓度的反应孔中左氧氟沙星的浓度约为稀释即得到8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml。
本实施例中，如果容器采用96孔板，可将第五梯度浓度去掉，即，使用时浓度为0.5μg/ml的浓度可以去掉，而不会影响实验结果。
实施例5.3
一种药敏试剂盒的制备方法，与上述实施例不同的是，分别称取哌拉西林0.0428g溶于5ml纯化水、他唑巴坦0.0134g溶于5ml磷酸盐缓冲液；混匀后用他唑巴坦溶液对哌拉西林溶液进行对倍稀释四次，得到4个浓度梯度(包括原液稀释2倍、4倍、8倍和16倍后的浓度)，然后再用所述培养液进行10倍稀释，然后再进行加样、干燥等。
使用的时候，加入菌悬液等后，一般而言，相当于再次进行了3.3倍的稀释，此时四个梯度浓度的反应孔中哌拉西林/他唑巴坦的浓度约为128/4μg/ml、64/4μg/ml、32/4μg/ml、16/4μg/ml。
为了进一步说明本发明的有益效果，下面考察烤干工艺与冻干工艺对热敏抗生素药价影响。
以热稳定较差的抗生素亚胺培南西司他丁、哌拉西林、氨苄西林、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、替卡西林、苯唑西林、阿莫西林、阿莫西林克拉维酸为例，说明烤干试剂盒与冻干试剂盒的抗生素效价。以抗生素全值法验证。
实验步骤：按照配方称量以上几种抗生素，对倍稀释12或者更多梯度，然后按照要求加入到试剂盒中，分别烤干和冻干，在试剂盒内的梯度如下表1所示：
表1冻干和烘干对比试验方案
然后按照说明书将标准菌株接种到试剂盒，放入18到24小时后，记录结果。
结果如下表2和表3：
表2冻干和烘干对比试验结果
表3头孢噻肟与头孢噻肟克拉维酸验证产ESBL菌株(ATCC700603)
结果显示，采用冻干工艺干燥对抗生素的药价没有影响，而烘干工艺使抗生素的药价损失较大。
试剂盒在-20℃储存15个月后，重复检验试剂盒，实验结果复合CLSI标准。具体数据见如下表4、表5和表6：
表4大肠杆菌冻干药敏试剂盒质检
表5葡萄球菌冻干药敏试剂盒质检
表6非发酵菌冻干药敏试剂盒质检
表7链球菌冻干药敏试剂盒质检
备注：“---”代表无标准。
为了考察本发明的制备方法得到的药敏试剂盒经过长距离运输后，其药价的变化，模拟运输实验，将所述试剂盒在30℃下储存3天、5天、10天及15天，然后检测其药价，结果如表8所示：
表8试剂盒在30℃下储存3天、5天、10天及15天后药价结果
(备注：PRL：哌拉西林，TZP：哌拉西林他唑巴坦，AMP：氨苄西林，A/S：氨苄西林舒巴坦，FOX：头孢西丁，IPM：亚胺培南，CTX：头孢噻肟，CTX/C：头孢噻肟克拉维酸，ESBL：超广谱β内酰胺酶)
结果显示，本发明的制备方法得到的试剂盒在30℃恒温环境下可以存放15天，因为试剂盒在30℃存放15天后，个别抗生素(如亚胺培南)效价超出了CLSI标准。无水分的抗生素比较稳定，不易损失效价。
在研发过程中，发明人也曾做了多组试验，实验方案及结果见表9。
表9本申请及对比试验方案及结果
从表9中可以看出，当预冻时间、初次升华时间、二次升华时间、解析时间和/或营养肉汤中的明胶、甘露醇在本申请的范围之外时，均不能达到药敏检测的结果，对细菌的生长、繁殖没有抑制或作用很小。
针对于本申请提及或未提及的其他的抗生素，也做了相应的对比试验，得到了一样的结果，即当预冻时间、初次升华时间、二次升华时间、解析时间和/或营养肉汤中的明胶、甘露醇在本申请的范围之外时，均不能达到药敏检测的结果，对细菌的生长、繁殖没有抑制或作用很小。
值得注意的是，以上实施例仅仅是本发明的发明内容的优选实施方式，用来解释、说明发明内容，不能用来限制被发明的内容，且，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的总构思的前提下，还可以做出若干不需创造性劳动的改变，而这个改变也应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种药敏试剂盒的制备方法，包括依次、顺序实施的以下步骤：
（1）称量：称取药品；
（2）试剂溶解及稀释，得到不同浓度的溶液；
（3）将步骤（2）中得到的不同浓度的溶液加入容器中；
（4）干燥：将装有不同浓度溶液的容器进行干燥除去水分；
（4）封装：对干燥得到的容器进行封装；
（5）灭菌，对封装好的容器进行灭菌，得到成品药敏试剂盒；
其特征在于：所述干燥为冷冻干燥。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥包括以下步骤：
A、预冻；
B、至少一次升华；和
C、解析过程。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述预冻工序是在零下50℃环境下，预冻1-3小时，使物料成固体。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤B中是至少一次升华包括初次升华和二次升华。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述初次升华是将温度从零下50℃升温至零下25℃，并在零下25℃下保温2-4小时，所述二次升华将温度从零下25℃升温至零下20℃，并在零下20℃下保温2-5小时。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述解析过程华将温度从零下20℃升温至30℃，并在30℃下保温10-20分钟。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述初次升华、二次升华和解析过程均是在300μbar的真空度下进行。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述预冻结束后，使所述初次升华、二次升华和解析过程均是在300μbar的真空度下进行。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥在冻干机内完成。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：在所述干燥之前，还包括加样工序，即，将溶液加入容器中。
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- 2015-07-30 CN CN201510458062.1A patent/CN105087752A/zh active Pending
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