CN105030770B - 黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用，开辟了黄连素作为药物的新用途，也为难治性急性髓系白血病治疗提供新的途径，并且通过以急性髓系MV4‑11细胞和难治患者分离的急性髓系白血病细胞为模型，证明了黄连素对急性髓系MV4‑11细胞具有抑制作用，细胞周期阻滞在G1/G2期，延长急性髓系白血病小鼠的生存时间，因此黄连素可作为治疗急性髓系白血病的新药。

Description

黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用。

背景技术

白血病又称“血癌”，是造血组织的恶性疾病，其特征为白细胞在骨髓及其他造血组织中呈恶性、无限制地增生，进而浸润全身各组织和脏器，对机体产生严重损害。根据细胞的成熟度和自然病程，白血病可分为急性白血病和慢性白血病两大类。急性白血病根据细胞类型又分为急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病两大类。急性非淋巴细胞性白血病又称急性髓细胞白血病，它是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生突变所形成的一类疾病。急性早幼粒细胞白血病是的一种急性非淋巴细胞性的特殊类型，而人前髓细胞(HL-60)是一种急性早幼粒白血病细胞系，其不表达多药耐药蛋白P-gp和MRP，对化疗药物较敏感。急性髓系白血病是成年人常见的一种急性白血病，其发病率随年龄而增加，美国仅在2012年有将近14,000名成年人诊断为急性髓系白血病，这一年中大约10,000名白血病患者失去生命。虽然，大多数年龄小于60岁的初发急性髓系白血病(AML)可以达到完全缓解，但是只有30-40％的患者能够长期存活，而年龄超过60岁AML患者中只有10％至15％、复发的AML患者中仅仅<10％的患者能够长期存活。因此，新的治疗AML方案和药物的寻找显得尤为必要。尽管在支持治疗和优化治疗方案的进步，成人急性髓系白血病的5年生存率也只有20％至25％左右。按目前AML治疗水平，有10％～20％的患者对一线标准诱导方案无效，50％～80％已经获得CR的患者早晚(多数在1年内)还要复发，这是AML治疗失败的主要原因。因此急性髓系白血病(AML)目前仍是白血病治疗上的难点。国内外对其治疗失败病例进行分析总结，发现急性髓系白血病患者中大部分都存在FLT3基因突变。现国内外研究发现，FLT3在人类白血病细胞中的表达非常广泛，70％-100％的AML、100％B系急性淋巴细胞白血病、27％的T系急性淋巴细胞白血病、混合性白血病、慢粒急变期(CML)和慢性淋巴细胞白血病都有FLT3的异常表达，其中20％～25％的AML的患者FLT3基因发生FLT3-ITDs基因突变，并见于AML各亚型，其中以M3和M5多见。FLT3异常表达包括野生型FLT3的过表达和FLT3基因突变，这类患者临床上多存在有高白细胞综合症、缓解率低、复发早等特点。因此，对FLT3的突变引起的急性髓系白血病药物研究如火如荼，但成功药物尤其少见。

黄连素其作为中药治疗消化道疾病用药已有3000多年的历史。研究发现，黄连素具有明显的抗肿瘤作用，对许多肿瘤细胞的生长、增殖都有抑制作用，目前依然主要用于消化道系统的疾病。国内外研究表明，黄连素具有的能力诱导早幼粒细胞白血病HL-60细胞凋亡，表明黄连素对未发生FLT3突变的HL60(人急性早幼粒白血病细胞)细胞系有一定的抑制。但目前对黄连素在FLT3突变引起的急性髓系白血病研究几乎近于空白。鉴于黄连素来源广泛、价格低廉，加之毒副作用小，如能对其相关药理效应及其作用机制进行深入研究，有望为难治性急性髓系白血病的治疗提供一种有效、安全、价廉的新型药物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用，开辟了黄连素作为药物的新用途，也为难治性急性髓系白血病治疗提供新的途径，从而为难治性急性髓系白血病的治疗提供一种新的有效、安全、价廉的新型药物。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用。

目前黄连素主要应用于抗感染、肿瘤、调整血脂血糖以及抗动脉硬化炎症反应，为了方便服用，通过现阶段常用药物制剂手段可以将黄连素按照药学上的常规工艺，添加常规辅料制成药学上可接受的口服制剂或注射制剂，可以是片剂、胶囊、散剂、口服液或颗粒剂。也可以与药学上的治疗急性髓系白血病药物等制成复方制剂，用于治疗急性髓系白血病。

更优选的，所述急性髓系白血病为FLT3的突变引起的急性髓系白血病。

本发明通过以下方法研究黄连素在难治性急性髓系白血病过程中的抑制作用，寻找黄连素在难治性急性髓系白血病领域旧药新用的研究依据：

通过难治性急性髓系白血病(FLT3突变)标准细胞系MV-41模型，通过体外细胞形态学，细胞增殖活性和细胞周期的影响，表明黄连素在急性髓系白血病过程中的抑制作用，能够用于治疗急性髓系白血病。

通过难治性急性髓系白血病患者分离的细胞，通过增殖活性影响，表明黄连素对急性髓系白血病有抑制作用。

通过难治性急性髓系白血病分离MV-41细胞接种老鼠动物模型，也表明了黄连素在难治性急性髓系白血病的抑制作用。因此，黄连素还能用于制备抑制急性髓系MV-41细胞的药物。

本发明的有益效果在于：本发明公开了黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用，急性髓系白血病患者提供了新的治疗方案。与现有的临床上用于治疗急性髓系白血病的阿胞糖苷相比，对细胞抑制率、凋亡率均更好。并且黄连素为祖国传统中药，成本较低，副作用小，为急性髓系白血病患者带来福音。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为黄连素素抑制MV-41作用24h后光学显微镜图(100倍)。

图2为黄连素素抑制MV-41作用48h后光学显微镜图(100倍)。

图3为黄连素素抑制MV-41作用12和24小时抑制率柱形图。

图4为黄连素素抑制MV-41作用48、72、96小时抑制率柱形图。

图5为黄连素素抑制MV-41作用24h,48h和72h抑制率柱形图。

图6为FSC-H对不同黄连素作用MV-41检测结果图。

图7为Comp-FL1-H对不同黄连素作用MV-41检测结果。

图8为不同浓度黄连素对MV-41细胞作用48的细胞凋亡检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、黄连素对难治性急性髓系白血病标准细胞系MV-41的形态学影响

本实施例使用的实验材料如下：MV-41细胞系(难治性急性髓系白血病细胞)购自美国ATCC；黄连素(Berberine，含量98.5％)购自陕西大地制药公司，生产批号为20111016；阿胞糖苷(Cytarabine)购自辉瑞制药有限公司；DMEM培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；NaHCO3购自上海久亿化学试剂有限公司，Cat.No.11810-033；胰蛋白酶、EDTA、青霉素G钠盐、链霉素硫酸盐购自AMRESCO公司；无水乙醇购自重庆川东化工有限公司；PBS购自北京中杉金桥生物技术有限公司；莱卡倒置显微镜购自德国Leica公司，型号为DMIL；CO₂培养箱购自FORMA公司，型号为3111；超净台由苏净集团安泰公司制造，型号为SW-CJ-ZFD；纯水仪购自美国Sprlng公司，型号为S/N020579；精密移液器购自法国吉尔森公司，型号为P2；电子天平购自德国赛多利斯有限公司，型号为BT323S；全自动高压灭菌锅购自日本SANYO公司，型号为MLS-3020；台式电热鼓风干燥箱购自上海精密实验设备公司，型号为DHG9123A；冰箱购自西门子公司，型号为KG18V21TI；液氮罐购自CBS公司，型号为2001；低速离心机购自上海安亭科学仪器厂，型号为KA-1000；0.2μm滤器购自MILLIPORE公司，型号为SLGP033RB；1cm培养皿购自NEST公司、96孔培养板购自Costar公司；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。

实验方法：准确称取0.2g黄连素，溶于10ml生理盐水中，用0.2μm滤器过滤后用500μl离心管分装，得黄连素储备液，然后-20℃存储，备用。使用前将黄连素储备液分别配制为含100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml黄连素的0.9％氯化钠水溶液，同时配制含2000μg/ml阿糖胞苷的0.9％氯化钠水溶液。将MV-41细胞系用DMEM+10％FBS于37℃、5％CO₂进行常规培养(10cm培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，然后加入3ml含0.25％(wt)胰蛋白酶和0.04％EDTA(wt)的消化液，于37℃条件下消化2min，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度1×10⁵个/ml，再将细胞悬液种入96孔培养板中，每孔加入180μl，再分别加入黄连素和阿糖胞苷，至黄连素终浓度为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和阿糖胞苷终浓度为200μg/ml，然后将培养板放入细胞培养箱中在37℃、5％CO₂培养下培养24h和48h，培养后弃去各孔培养液，用PBS漂洗3次，按照常规HE染色方法进行。待烘干后，在普通生物显微镜下观察，记录并照相，培养24h和48h分别如图1所示和图2所示。

从图1可看出，随着黄连素浓度从10μg/ml到200μg/ml的增加，MV-41细胞的数量明显减少。200μg/ml的阿胞糖苷处理后MV-41细胞的数量明显少于空白溶剂对照组，而与相同浓度的黄连素比，阿胞糖苷处理后细胞数量明显多余黄连素处理组，表明黄连素能够有效抑制难治性急性髓系白血病细胞MV-41细胞作用，且呈现一定的剂型依赖效应，黄连素和阿胞糖苷作用MV-41细胞24小时其细胞形态未发生明显改变。

从图2可看出，随着黄连素浓度从10μg/ml到200μg/ml的增加，MV-41细胞存活数量明显减少，尤其是黄连素浓度大于10μg/ml时，其细胞形态发生明显改变，其细胞开始脱落，细胞密度低，细胞连接不紧密，排列紊乱，有些细胞出现核浓缩现象；而200μg/ml的阿胞糖苷处理MV-41细胞24小时后，其细胞形态也发生明显改变。从图2还可以看出，相同浓度的黄连素比阿胞糖苷处理后存活细胞数量明显多余黄连素处理组的，表明黄连素能够有效抑制难治性急性髓系白血病细胞MV-41细胞作用，且呈现一定的剂型依赖效应。

图1和图2的结果充分证实了黄连素能够有效抑制难治性急性髓系白血病细胞MV-41细胞的存活，当浓度大于10μg/ml时抑制作用尤其明显。与目前医院大规模临床使用的化学药物阿胞糖苷相比，相同浓度的黄连素显示出较好的抑制作用。

实施例2、黄连素对难治性急性髓系白血病标准细胞系MV-41半数抑制浓度

本实施例使用的实验材料如下：MTT(四甲基偶氮唑蓝)试剂购自Sigma公司；酶联免疫检测仪购自Bio-RAD公司。MV-41细胞系在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。

实验方法：用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2×10⁵/mL接种于96孔培养板中，每孔体积为100μL，然后将培养板移入CO₂培养箱中，在温度为37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养24h。去除培养液，然后分别加入黄连素0.9％氯化钠水溶液和阿糖胞苷0.9％氯化钠水溶液，至黄连素终浓度为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，阿糖胞苷终浓度为200μg/ml，对照组添加等量的0.9％氯化钠水溶液，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下，继续培养12、24、28、72、96h。在培养结束前4h，每孔加入20μL浓度为5mg/mLMTT溶液，37℃继续培养4h后终止培养，弃去孔内培养上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解，再在酶联免疫检测仪上测定570nm处吸收值，记录结果。根据结果计算每个培养板各浓度吸光度的平均值，再计算每一浓度下所做培养板的吸光度的均值，每组的吸光度减去空白对照，再利用该值求出各处理组相对于对照组的抑制率。

抑制率计算公式如下：细胞增值抑制率(％)＝(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值×100％。统计处理采用SSPS19.0软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示，具体如表1所示。

表1、不同浓度的黄连素作用MV-41细胞不同时间的抑制率(％)n＝3

从表1可看出，黄连素随着浓度的增加，其对细胞抑制率明显增加，当黄连素浓度为10μg/ml，24h的抑制率为13.79％，而黄连素浓度为200μg/ml时，24h的抑制率为76.86％，而200μg/ml的阿胞糖苷24h的细胞抑制率仅为6.88％。结果还显示，黄连素随着作用时间的延长，对细胞的抑制率明显增加，不同浓度黄连素在72h细胞的抑制率均达到90％，而阿胞糖苷仅为41.47％。

将黄连素作用12h和24h抑制率绘制成柱形图，结果如图3所示。从图3可以看出，不同浓度黄连素作用MV-41细胞12h和24h后，均随着浓度的增加其抑制率明显增加，且浓度为200μg/ml的黄连素抑制率明显高于相同浓度的阿胞糖苷，而浓度为200μg/ml的阿胞糖苷的抑制率明显低于浓度为10μg/ml的黄连素，上述结果充分证实黄连素能够有效抑制MV-41细胞的增殖活性。将黄连素作用48h，72h，96h小时抑制率绘制成柱形图，见图4。从图4看出，不同浓度黄连素作用MV-41细胞48h，27h和96h均随着浓度的增加对MV-41的抑制率增加。当黄连素浓度为200μg/ml的抑制率均明显高于相同浓度的阿胞糖苷，而浓度为200μg/ml阿胞糖苷的抑制率也明显低于浓度为10μg/ml的黄连素。从图3和图4可看出，用不同浓度的黄连素作用MV-41细胞12h、24h、48h、72h和96h后，黄连素均能够有效抑制MV-41细胞的增殖活性。同时，阿胞糖苷对MV-41细胞的抑制作用较弱。同时，对其存活率和浓度的相关性分析，黄连素半数抑制浓度为125.1μg/ml。上述结果充分证实黄连素能够有效抑制MV-41细胞的增殖活性。

实施例3、黄连素对难治性急性髓系白血病标准细胞系MV-41增殖活性验证

根据实施例2初步确定黄连素对MV-41的半数抑制浓度和时间基础上，选择浓度为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml的黄连素及浓度为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的阿胞糖苷分别作用MV-41细胞24h、48h和72h，检测其抑制率，结果如表2所示。

表2、不同黄连素作用MV-41细胞不同时间的抑制率(％)n＝3

从表2可看出，黄连素随着浓度的增加，其对细胞抑制率也明显增加，当黄连素浓度为50μg/ml时，24h的抑制率为61.61％；当浓度增加到200μg/ml时，24h的抑制率为79.63％；而200μg/ml阿胞糖苷的细胞抑制率仅为9.77％。结果还显示，黄连素随着作用时间的延长，对细胞的抑制率明显增加，且不同浓度黄连素在72h细胞的抑制率均达到90％左右，而阿胞糖苷在72h细胞的抑制率仅为41.09％。

将其作用24、48、72小时抑制率绘制成柱形图，结果见图5。从图5看出，不同浓度黄连素作用MV-41细胞24h和48h、72h后，均随着浓度的增加其抑制率明显增加，当黄连素浓度为100μg/ml和200μg/ml时抑制率明显高于相同浓度的阿胞糖苷；而阿胞糖苷浓度为400μg/ml时抑制率也明显低于浓度为50μg/ml黄连素，上述结果充分证实黄连素能够有效抑制MV-41细胞的增殖活性。

上述图5结果充分证实黄连素具有极强抑制MV-41细胞的增殖活性能力，与目前治疗难治性急性髓系白血病最常用的阿胞糖苷相比，黄连素对其抑制能力较好。实验证实，目前治疗难治性急性髓系白血病最常用的阿胞糖苷对MV-41细胞抑制作用较弱，效果也较差。因此上述结果充分证实黄连素是一个能用于难治性急性髓系白血病良好药物。

实施例4、黄连素对难治性急性髓系白血病MV-41细胞周期的影响

本实施例实验材料如下：Annexin V-FITC(膜联蛋白-V-FITC)、细胞周期测定试剂盒购自美国Sigma-AldriCh公司；标记缓冲液(Binding Buffer)、FACSCALibur流式细胞仪购自美国BeetonDiekinson公司。

实验方法：将对数期细胞终止后离心收集，并将收集制成细胞悬液，用倒置荧光显微镜观察细胞状态，用细胞计数器计数，用培养基调整其浓度至1.0×10⁷/ml。然后将MV-41细胞以3×10⁵个细胞/每孔接种于24孔板200ml细胞培养瓶，并于37℃、5％CO₂培养箱内培养24小时后，分别加入黄连素和阿糖胞苷至黄连素终浓度为50μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和阿糖胞苷浓度为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml继续孵育48小时；在1000转/min离心4min收集细胞，细胞用PBS洗涤3次，将洗涤细胞以1×10⁷/ml浓度溶于检测缓冲液中，再用预冷的1ml无水乙醇固定2小时以上；固定后1000转/min离心4min除去乙醇，然后用PBS洗涤，每管加入0.5ml含有200μl Pl染料与200μl打孔剂的染色液，在室温下避光30min，利用200目的滤膜过滤除去细胞团，小时内上机测定细胞的周期，数据用MODFIT3.0软件分析，结果如表3所示。

表3、不同黄连素作用MV-41细胞的细胞周期检测结果(％)n＝3

从表3可看出，与正常的MV-41相比，黄连素随着浓度的增加至150μg/ml，其对G1期细胞数量明显减少，S期间细胞数量明显增加。不同浓度阿胞糖苷和正常的MV-41细胞相比，G1期细胞数量明显减少，S期间细胞数量明显增加。说明黄连素和阿胞糖苷一样都让MV-41的G1期细胞数量明显减少而S期间细胞数量增加。且与正常细胞相比，不同浓度的黄连素G2/G1期的细胞比率增加，S期细胞数量增加，表明细胞周期明显阻滞在G1/G2期。G1/G2期细胞比率随不同浓度黄连素作用延长而减少，S期细胞比率随黄连素和阿胞糖苷的作用而增加。

实施例5、黄连素对难治性急性髓系白血病MV-41细胞凋亡的影响

将MV-41接种于24孔板200ml细胞培养瓶里(1×10⁷细胞/孔)，在CO₂细胞培养箱内孵育24小时，孵育后在各培养孔中分别加入浓度为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml的黄连素和浓度为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的阿胞糖苷孵育24小时。然后离心收集细胞，再用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次，并将细胞悬浮于100μL l×结合缓冲液中，接着在常温(18～25℃)下用5μL膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素标记外翻的磷脂酞丝氨酸和10μL PI标记细胞核在暗室里孵育10分钟。孵育后，将400μL l×结合缓冲液加入每管中，立即用流式细胞术分析，用FL1通道，在激发波长为488nm，发射波长为530nm检测AnnexinV-FITC荧光信号，用FLZ通道600nm滤镜检测PI荧光信号，结果如图6所示。由图6可看出，正常MV-41细胞G1期细胞比其他药物处理组均高。同时将图6圈出的细胞用FSH-1通道对不同黄连素作用MV-41检测结果，结果如图7所示。从图7的检测结果可知，凋亡细胞均集中于右上象限(AnnexinV-FITC+/PI+)，为晚期凋亡和坏死，而早期凋亡位于右下象限(Annexin V-FITC+/PI-)。然后对细胞比例进行分析，其结果见图8。从图8可以看出，不同浓度黄连素作用于MV-41细胞，其总凋亡率均大于80％，与空白细胞组比较，有显著统计学意义(P<0.01)。不同浓度阿胞糖苷作用于MV-41细胞，其总凋亡率均约60％，与空白细胞组比较，有显著统计学意义(P<0.01)。不同浓度黄连素作用于MV-41细胞与不同浓度阿胞糖苷相比，均有显著统计学意义(P<0.01)。若细胞死亡为诱导性死亡，则必须先合成蛋白质，有序地降解细胞内物质，最终细胞死亡。若抑制细胞内蛋白质的合成，诱导性细胞死亡可以被逆转，细胞的存活率就会增加，反之则不能。而黄连素和阿胞糖苷处理后均未出现细胞死亡逆转现象，表明黄连素和阿胞糖苷主要引起MV-41细胞发生晚期凋亡和坏死，说明两个药物能导致MV-41细胞的死亡是诱导性死亡。

实施例6、黄连素对难治疗急性髓系白血病患者骨髓细胞的生长抑制作用

收集难治疗急性髓系白血病患者(第三军医大学新桥医院血液科)的骨髓2ml，用淋巴细胞分离液在2000rpm条件下密度梯度离心20min，吸取单个核细胞，用1×PBS洗涤3次，然后接种于96孔板，调整细胞浓度为5×10⁵/ml，每孔总体积为200μl，分别以50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml的黄连素和100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的阿糖胞苷孵育48小时，用MTT法检测不同浓度黄连素对其抑制作用，试验重复3次，结果如表4所示。

表4、不同黄连素作患者细胞的抑制率检测结果(％)n＝3

从表4可看出，黄连素随着浓度的增加其对细胞抑制率也明显增加，当黄连素浓度为50μg/ml时，24h的抑制率为50.45％，当浓度增加到200μg/ml时，24h的抑制率为77.32％，而200μg/ml阿胞糖苷的细胞抑制率仅为10.43％。并且100μg/ml和200μg/ml的黄连素抑制率明显高于相同浓度的阿胞糖苷，但400μg/ml的阿胞糖苷的抑制率明显低于50μg/ml的黄连素，上述结果充分证实黄连素能够有效抑制骨髓细胞的增殖活性。

实施例7、黄连素对难治性急性髓系白血病小鼠模型的生存率检测

本实施例使用的实验材料如下：NOD/SCID：雄性，4～6周龄，平均体重18～20g，购自中国医学科学院协和医科所实验动物中心，在第三军医大学实验动物中心SPF层流室饲养。其余同前。

难治性急性髓系白血病模型的建立：生活状态良好的小鼠腹腔连续2d按0.1g/kg注射环磷酰胺，第3d取对数生长期MV-41细胞，调整细胞数，悬浮于无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，从尾静脉注射直接接种5×10⁶个细胞/只，骨髓涂片检测模型的建立。接种细胞后24h，随机抽取3只裸鼠，将其处死，取股骨骨髓，生理盐水稀释涂片，瑞氏染色光镜下观察。结果发现所有老鼠骨髓中均可以看到肿瘤细胞，圆形或卵圆形，细胞核大，几乎充满整个细胞，胞浆很少符合MV-41细胞的形态，从而提示肿瘤细胞已侵入骨髓。骨髓结果表明已成功建立难治性急性髓系白血病模型。

然后根据随机数字表，将动物分成3组，分别为200μg/ml黄连素、200μg/ml阿胞糖苷组和空白对照组，每组10只。200μg/ml黄连素每只老鼠灌胃0.2ml浓度为200μg/ml的黄连素、200μg/ml阿胞糖苷组每只老鼠灌胃0.2ml浓度为200μg/ml的阿胞糖苷的生理盐水溶液，空白对照组每只老鼠灌胃0.2ml的生理盐水，持续给药15天，然后记录每只动物的生存时间。将计数小鼠生存天数，根据公式计算其生命延长率：生命延长率＝(给药组平均生存天数-生理盐水组平均生存天数)/生理盐水组平均生存天数×100％。

结果显示，对照空白组老鼠在接种MV-41细胞2周后出现不同程度的皮毛起皱、萎靡少动、步态不稳及体重减轻，而后迅速发展为体温下降，极度消瘦，恶液质直至死亡。黄连素、阿胞糖苷和空白对照的组小鼠平均生存天数分别为：(88.7±6.23)天、(36.6±5.63)天、(21.5±8.97)天。黄连素和阿胞糖苷的延长生存率分别是312％和69.9％。黄连素、阿胞糖苷和空白对照组的平均生存天数差异显著。

从难治性急性髓系白血病标准细胞系MV-41的细胞以及难治性急性髓系白血病患者分离骨髓细胞，用动物模型在细胞形态学，细胞抑制率，细胞周期和细胞凋亡和平均生存时间充分证实黄连素对难治性急性髓系白血病具有良好的治疗作用，延长小鼠的生存时间。因而，黄连素可作为治疗急性髓系白血病的新药。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.黄连素在制备治疗急性髓系白血病的药物中的应用，其特征在于：所述急性髓系白血病为FLT3突变的急性髓系白血病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为药学上可接受的口服制剂或注射制剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述口服制剂为片剂、胶囊、散剂、口服液或颗粒剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：黄连素在制备抑制急性髓系MV-41细胞的药物中的应用。