CN110025613A - 双氢青蒿素在制备AKT/mTOR/P70S6K激活的肝癌细胞药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在制备治疗AKT/mTOR/P70S6K激活的人肝癌Huh7、Huh6细胞药物中的应用。本发明含有药学上的治疗有效剂量的双氢青蒿素，所述双氢青蒿素能够通过抑制AKT/mTOR/P70S6K信号通路的P‑AKT、P‑S6K、P‑S6的表达，进而抑制人肝癌Huh7、Huh6细胞的生长。本发明探索了双氢青蒿素对肝癌细胞Huh7、Huh6具有抑制作用；及发现了其抗肝癌的作用机制，为肝癌患者的治疗和诊断提供新方法，为双氢青蒿素在临床肝癌治疗中的应用奠定理论基础。

Description

双氢青蒿素在制备AKT/mTOR/P70S6K激活的肝癌细胞药物的 应用

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤药物，属于生物制药技术领域，具体涉及一种双氢青蒿素在制备治疗AKT/mTOR/P70S6K激活的人肝癌Huh7、Huh6细胞药物中的应用。

背景技术

根据2018年世界卫生组织最新数据显示，肝癌成为全球癌症相关死亡的第三大原因，仅次于肺癌和胃癌。全球每年新发肝癌患者85万，中国新发肝癌患者46万。我国素有“肝癌大国”之称，我国的人口约占全球人口的1/5，但肝癌的发病率和死亡率都超过了全球一半。

目前，对于肿瘤的治疗通常采用手术、放射治疗及化学药物治疗的方法，还有其他治疗手段包括生物治疗、分子靶向治疗、系统化疗以及中医中药治疗等。长期的临床实践证明，中医药治疗已渗入肝癌综合治疗中的每一环节，从早期术后的预防复发，到中期与微创结合的保肝抑瘤，再到晚期患者的改善症状，延长生存期。

双氢青蒿素是青蒿素的衍生物，因其具有比青蒿素更好的效率和更低的毒性，DHA在抗炎和免疫抑制方面得到进一步的研究，屠呦呦组观察发现DHA治疗系统性红斑狼疮的效果良好，其对治疗系统性红斑狼疮的临床试验在2016年也得到了批准。青蒿素可以消灭疟原虫、寄生虫通过诱导铁依赖的氧化作用压力。

因此，双氢青蒿素可能是一种有效的抗癌化疗药物通过调节氧化还原平衡。双氢青蒿素具有抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，调节免疫功能等作用，然而，DHA确切的抗肿瘤分子机制还有待全面研究。

发明内容

本发明的目的是提供了一种双氢青蒿素在制备治疗AKT/mTOR/P70S6K激活的人肝癌Huh7、Huh6细胞的药物中的应用，所述双氢青蒿素能够通过抑制AKT/mTOR/P70S6K通路的P-AKT、P-S6K、P-S6的表达，进而抑制人肝癌Huh7、Huh6细胞的生长。

AKT调控多个生物过程，包括细胞存活、增殖、生长和糖原代谢。AKT信号通路与恶性肿瘤、糖尿病、类风湿关节炎等多种疾病的发生发展密切相关。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR是一个丝/苏氨酸激酶，属于磷酸肌醇激酶相关的激酶家族。mTOR在胰岛素信号、营养传感信号、有丝分裂信号传递中有重要作用，处于肿瘤信号通路的关键位置。

AKT/mTOR/P70S6K通路作为细胞内非常重要的信号转导途径，在细胞的生长、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等过程中发挥着极其重要的生物学功能。AKT可以通过磷酸化作用激活其表达，mTOR磷酸化后又激活其直接作用底物P70S6K等，从而使细胞蛋白合成加快，细胞生长速度加快，进一步加速了肿瘤的恶化进程。

mTOR作为一种重要的调节基因，通过调节细胞周期、细胞能量代谢、蛋白质合成等多种途径发挥重要的生理功能，在细胞的生长、增殖、分化过程中起着中心调控点的作用。AKT/mTOR/P70S6K信号通路因此是正常细胞和癌细胞的主要生长调节途径。

上述双氢青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的由青蒿素经四氢硼钠还原而成的倍半萜内脂类化合物，分子式为C₁₂H₂₄O₅，分子量为284.35，一种无色针状晶体，来源于美国sigma公司。本品在丙酮中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在水中几乎不溶，其制备熔点为140-150℃，熔融时同时分解。

进一步的，所述青蒿素的浓度≥25μM。当青蒿素浓度≥25μM时，对人肝癌Huh7、Huh6细胞的生长抑制有差异统计学意义，肝癌细胞的集落形成抑制在50％以下，且随着青蒿素浓度增大，抑制效果越好。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)本发明首次发现双氢青蒿素对人肝癌Huh7、Huh6细胞具有增殖抑制作用，并呈现良好的时间和浓度依赖性，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)。细胞活力实验结果显示：

在Huh7细胞中随着双氢青蒿素浓度(0-100μM)的增加，肝癌细胞的存活率都明显下降。在24h、25μM时达到双氢青蒿素的抑制率达到50％，在48h、12.5μM时双氢青蒿素具有一定抑制效果，72h、25μM时抑制率降到IC₅₀以下。

随着药物作用时间的增加，双氢青蒿素对于肝癌细胞的抑制效果更加明显。在Huh6细胞中随着双氢青蒿素浓度(0-100μM)的增加，肝癌细胞的存活率明显下降。在24h、50μM时达到双氢青蒿素的抑制率达到50％。在72h、25μM时双氢青蒿素已有明显的抑制效果，72h、50μM时双氢青蒿素抑制效果最好，Huh6虽然对药物没有Huh7敏感，但双氢青蒿素对于Huh6细胞仍具有明显抑制作用。

细胞克隆形成实验结果显示：

在培养第7天，双氢青蒿素对Huh7、Huh6细胞具有明显抑制细胞增殖的作用，细胞的克隆形成数量明显减少，随着DHA浓度的增大细胞克隆形成越少，故双氢青蒿素能够显著抑制肝癌细胞的增殖。

2)本发明发现双氢青蒿素能够通过抑制AKT/mTOR/P70S6K信号通路上下游蛋白P-AKT、P-S6K、P-S6的表达，进而抑制人肝癌Huh7、Huh6细胞的生长。Western blot实验结果显示：

肝癌细胞Huh7、Huh6中，随药物浓度的增加，各蛋白表达水平均明显降低。在双氢青蒿素50uM作用下，与对照组相比较，AKT、P-AKT、P-S6K、P-S6蛋白表达水平明显降低，说明DHA能够有效抑制肝癌细胞Huh7、Huh6的生长。故双氢青蒿素能够通过AKT/mTOR/P70S6K信号通路抑制肝癌细胞的生长。

3)本发明为研制新的抗肝癌候选药物提供了科学依据，对开发中药新药具有重要意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：

图1a和图1b分别为试验例1中细胞活力实验检测不同浓度的双氢青蒿素在不同时间下，对人肝癌Huh7、Huh6细胞的增殖抑制作用图；

图2a和图2b分别为试验例1中细胞克隆形成实验检测不同浓度的双氢青蒿素对人肝癌Huh7、Huh6细胞的增殖抑制作用图片；

图3a和图3b分别为试验例1中细胞克隆形成实验检测不同浓度的双氢青蒿素对人肝癌Huh7、Huh6细胞的增殖抑制作用柱状图；

图4a、图4b和图4c为试验例2中Western blot检测双氢青蒿素对AKT/mTOR/P70S6K信号通路蛋白的影响图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选试验例进行说明，应当理解，此处所描述的优选试验例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明公开了一种能够抑制肝癌Huh7、Huh6细胞候选药物中的应用。双氢青蒿素具有广泛的生物化学和药理作用，其中有效的抗肿瘤作用近年来引起了广泛的关注。双氢青蒿素发挥特定抗肿瘤活性的作用机制仍不清楚，这可能限制其在临床方面的进一步应用和发展。

本发明探索了双氢青蒿素对肝癌细胞Huh7、Huh6具有抑制作用；及发现了其抗肝癌的作用机制，为肝癌患者的治疗和诊断提供新方法，为双氢青蒿素在临床肝癌治疗中的应用奠定理论基础。因此，双氢青蒿素可作为抑制人肝癌细胞生长的候选药物进行研究和开发。

双氢青蒿素具有毒性较低的特点并显示出良好的抗肿瘤活性。故本发明首次发现其具有作为抗肿瘤候选药物开发的潜在价值。

本发明通过细胞活力测试、细胞克隆形成实验、Western blot实验研究双氢青蒿素抑制人肝癌Huh7、Huh6细胞生长的作用机制。

本发明实施例中的各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。其中，双氢青蒿素由传统中草药黄花蒿中提取有效成分制得，购买于美国sigma公司，体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(Huh7、Huh6)，来源于美国ATCC细胞库。

实施例1

将双氢青蒿素药物制成片剂，其制备方法为：

1)将20g双氢青蒿素和淀粉过120目筛；

2)10％淀粉浆的制备：称取淀粉60g、乳糖60g、微晶纤维素60g、羧甲基淀粉钠15g、十二烷基硫酸钠5g和总质量0.5％的硬脂酸镁，溶解于100ml蒸馏水中，混合均匀，加热约80℃使淀粉糊化，冷却至温浆后使用；

3)等量分次加入2g淀粉进行研磨，混合均匀，加入适量淀粉浆制备软材；

4)将16目尼龙筛制备湿颗粒，将湿颗粒与50～60℃烘箱干燥30min，用16目筛进行整粒，整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀，以8mm冲模进行冲模压片；即得双氢青蒿素片剂。

给药方法：

成人常用量：口服给药，先服1g，6～8小时再服0.5g，第2、3日各服0.5g，疗程3日，总量为2.5g。小儿15mg/kg，按上述方法3日内服完。

注意事项：妊娠早期慎用。

实施例2

将双氢青蒿素药物制成混悬注射液，其制备方法为：

1)取注射用油加热至115～125℃，保温1～2小时，加入助悬剂，搅拌溶解，降温到55℃以下，备用；

2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中，加入双氢青蒿素30.0g，以4000r/min的速度，高速剪切30min，制成混悬液，备用；

3)将步骤2)的液体，依次加入助悬剂5.0g、抗氧化剂0.5g、湿润剂3.0g、絮凝剂2.0g，边加边搅拌，直至完全均匀，再连续研磨10min，备用；

4)将步骤3)的研磨后的液体，置于高压均质机中，以压力50-55兆帕，进行高压灭菌，然后，灌装封口，包装，即得100mL双氢青蒿混悬注射液。

给药方法：深部肌注：第1次200mg，6～8小时后再给100mg，第2、3日各肌注100mg，总剂量500mg(别重症第4天再给100mg)。连用3日，每日肌注300mg，总量900mg。小儿15mg/kg，按上述方法3日内注完。

注意事项：妊娠早期慎用。

效果验证试验例

试验例1

检测不同浓度的双氢青蒿素在不同时间下对人肝癌Huh7、Huh6细胞的增殖抑制作用。

(一)CCK-8法测定细胞增殖

采用CCK-8法检测细胞，使用对数生长期的细胞进行铺板使用。于96孔板内每孔加入2000个细胞，轻晃至细胞均匀平铺于板底即可。第二天待细胞贴壁后加药(双氢青蒿素：0μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)，使每孔中有100μl含10％FBS的DMEM，分别在加药后24h、48h、72h使用Spectra Max190酶标仪在450nm下进行检测，每个浓度设4个复孔，实验重复三次。

细胞活力实验结果显示：

分别作用24h、48h、72h后，双氢青蒿素能剂量依赖和时间依赖性抑制人肝癌Huh7、huh6细胞的增殖。如图1a和图1b所示，在同一作用时间的药物浓度越高，与空白对照相比，细胞增殖抑制率也随之增高，在双氢青蒿素浓度为25μM时，对人肝癌Huh7、Huh6细胞的抑制有差异统计学意义。

(二)细胞克隆形成实验

复苏的肝癌细胞传代两次后铺板使用，于12孔板内每孔加入2000个细胞，轻晃至细胞均匀平铺于板底，第二天待细胞贴壁后加药(双氢青蒿素：0μM、12.5μM、25μM、50μM)，置于37℃培养箱中再次培养7天后取出12孔板，弃去培养基加入PBS洗净，加入1ml结晶紫染料(0.5％结晶紫溶在10％甲醇中配制)，置于摇床上30分钟进行染色，用PBS清洗3次，每次5min，晾干，观察后拍照。每孔加入1ml 10％冰醋酸，置于摇床上30min进行脱色，在96孔板中每孔加入100μl溶液，使用酶标仪在550nm下进行数值读取，实验重复三次。

细胞克隆形成实验结果显示：

如图2a和图2b所示，随着双氢青蒿素浓度的增大，肝癌细胞的克隆细胞数明显减少，得到了抑制。如图3a和图3b所示，在培养第7天，双氢青蒿素对Huh7、Huh6细胞在25μM时，具有明显抑制细胞增殖的作用，细胞的克隆形成数量明显减少，随着DHA浓度的增大细胞克隆形成越少，故双氢青蒿素能够显著抑制肝癌细胞的增殖，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

试验例2

Western blot检测青蒿素对AKT/mTOR/P70S6K信号通路蛋白表达的变化。

考察的相关蛋白有：P-AKT、AKT、P-ERK、ERK、P-S6K、S6K、P-S6、S6。

双氢青蒿素(0μM、12.5μM、25μM)处理细胞48小时后收集各组细胞，用细胞刮产刮下细胞，加入相应裂解液充分裂解细胞，以14000g在4℃条件下离心20min，取上清，采用BCA法读取蛋白浓度。在80V时电泳，250mA下转膜后，封闭1h，加入一抗(1：1000稀释)过夜，次日用TBST洗涤后加入二抗(1：3000稀释)置于摇床上封闭2h，采用增强化学发光法发光，压片曝光扫描。

采用Image对图像进行分析，以特异性条带平均吸光度与面积的乘积为有效值，反映蛋白表达水平。采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

以上实验重复三次，实验结果如图4a-c所示。

实验结果显示：

如图4a-c所示，肝癌细胞Huh7中，随药物浓度的增加，各蛋白表达水平均明显降低。在双氢青蒿素25uM作用下，与对照组相比较，p-AKT、p-ERK、p-S6K、p-S6蛋白表达水平明显降低，说明DHA能够有效抑制肝癌细胞Huh7的生长。作用于肝癌细胞Huh7中，DHA能够降低mTOR信号通路下游蛋白S6K、S6蛋白表达水平。已知Huh6细胞是mTOR激活的肝癌细胞，故我们选用肝癌细胞Huh6再次进行验证。

实验中发现随药物浓度的增加，各蛋白表达水平均明显降低，在双氢青蒿素50uM作用下，与对照组相比较，p-AKT、p-ERK、p-S6K、p-S6蛋白表达水平明显降低，说明DHA能够在mTOR激活的情况下抑制肝癌细胞Huh6的生长。

综上，双氢青蒿素能够通过AKT/mTOR信号通路抑制人肝癌细胞Huh7、Huh6的生长。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.双氢青蒿素在制备治疗AKT/mTOR/P70S6K激活的人肝癌Huh7、Huh6细胞的药物中的应用，其特征在于：含有药学上的治疗有效剂量的双氢青蒿素，所述双氢青蒿素能够通过抑制AKT/mTOR/P70S6K信号通路的P-AKT、P-S6K、P-S6的表达，进而抑制人肝癌Huh7、Huh6细胞的生长。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述双氢青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的由青蒿素经四氢硼钠还原而成的倍半萜内脂类化合物，分子式为C₁₂H₂₄O₅，分子量为284.35，具有吸收快、分布广、排泄快、代谢迅速、高效低毒副作用等优点，其口服生物利用度是青蒿素的10倍以上，抗疟作用是青蒿素的4-8倍。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述双氢青蒿素的浓度≥25μM。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述候选药物可制成片剂，其制备方法为：

1)将20g双氢青蒿素和淀粉过120目筛；

2)10％淀粉浆的制备：称取淀粉60g、乳糖60g、微晶纤维素60g、羧甲基淀粉钠15g、十二烷基硫酸钠5g和总质量0.5％的硬脂酸镁，溶解于100ml蒸馏水中，混合均匀，加热约80℃使淀粉糊化，冷却至温浆后使用；

3)等量分次加入2g淀粉进行研磨，混合均匀，加入适量淀粉浆制备软材；

4)将16目尼龙筛制备湿颗粒，将湿颗粒与50～60℃烘箱干燥30min，用16目筛进行整粒，整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀，以8mm冲模进行冲模压片；即得双氢青蒿素片剂。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物可制成混悬注射液，其制备方法为：

1)取注射用油加热至115～125℃，保温1～2小时，加入助悬剂，搅拌溶解，降温到55℃以下，备用；

2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中，加入双氢青蒿素30.0g，以4000r/min的速度，高速剪切30min，制成混悬液，备用；

3)将步骤2)的液体，依次加入助悬剂5.0g、抗氧化剂0.5g、湿润剂3.0g、絮凝剂2.0g，边加边搅拌，直至完全均匀，再连续研磨10min，备用；

4)将步骤3)的研磨后的液体，置于高压均质机中，以压力50-55兆帕，进行高压灭菌，然后，灌装封口，包装，即得100mL双氢青蒿素混悬注射液。