CN105012326B - 人参皂苷CK、Rh1及其组合物在制备改善非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗药物中的应用 - Google Patents

人参皂苷CK、Rh1及其组合物在制备改善非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗药物中的应用 Download PDF

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人参皂苷CK、Rh1及其组合物在制备改善非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗药物中的应用,涉及人参皂苷CK、Rh1及其组合物的医药用途。本发明通过体外、体内研究表明人参皂苷CK、Rh1及其组合物可以调控大鼠HSC‑T6肝星状细胞外基质的合成与降解,明显改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的肝功能异常、脂质代谢紊乱、糖代谢异常和肝纤维化程度,具有作为非酒精性脂肪性肝纤维化合并胰岛素抵抗用药的开发前景。

Description

人参皂苷CK、Rh1及其组合物在制备改善非酒精性脂肪性肝纤 维化与胰岛素抵抗药物中的应用
技术领域
本发明属于医药制品,具体涉及人参皂苷CK、Rh1及其组合物的医药用途。
背景技术
NAFLF(Non-Alcoholic Fatty Liver Fibrosis,非酒精性脂肪性肝纤维化)与NASH(Non-Alcoholic Steato-Hepatitis,非酒精性脂肪性肝炎)为NAFLD(nonalcoholicfatty liver disease,非酒精性脂肪性肝病)疾病谱中的不同病理阶段。NAFLF、NASH与胰岛素抵抗密切相关。作为慢性肝脏疾病的NAFLD,影响着全世界超过1千万的人口,约30%的NAFLD患者会进展为NASH、NAFLF或肝硬化、肝细胞癌。由于肥胖和NAFLD发病率上升,未来10~15年NAFLF患者将增加至目前的三倍以上。
NAFLF本质是由于细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)合成与降解不平衡导致ECM过度沉积。ECM的降解主要由MMP-2、MMP-9(Matrix Metalloproteinase-2、9,基质金属蛋白酶-2、9)及TIMP-1(Tissue Inhibitors of Metallo-Proteinase-1,基质金属蛋白酶组织抑制因子-1)调控,MMP-2、MMP-9所增加的ECM降解和TIMP-1所减弱的胶原降解此二者表达异常可导致ECM降解不足,导致ECM过度沉积而加速NAFLF。从而,必需减少ECM沉积以阻断NAFLF的形成和发展使NAFLF逆转,防止肝硬化或肝细胞癌。
胰岛素的代谢主要由PI3K/Akt(Phosphoinositide-3-Kinase/Serine/ThreonineKinase,磷酯酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶)信号转导途径介导,当胰岛素信号途径受损时,机体对胰岛素的敏感性就会降低,导致胰岛素抵抗。胰岛素抵抗的发病机制与IRS(Insulin Receptor Substrate,胰岛素受体底物)的蛋白质磷酸化异常有密切关系,胰岛素与胰岛素受体结合使胰岛素受体底物磷酸化,激活下游的PI3K/Akt途径,下游GSK3β(Glycogen Synthase Kinase-3β,糖原合成酶激酶-3)磷酸化失活,导致糖原合成增加。NAFLD病程及NAFLF形成中,胰岛素抵抗是一重要发病机制。体内外实验证实了NAFLD大多合并胰岛素抵抗,是NASH形成的重要因素,而伴有胰岛素抵抗的NASH比单纯的脂肪肝更易进展为NAFLF。肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗可互为因果,导致代谢异常的恶性循环,加速NAFLF。因此,改善NAFLD患者胰岛素抵抗有助于延缓NAFLF形成。
NAFLF合并胰岛素抵抗在临床非常常见,尚无有效的药物,该适应症药物的研发是新药研发的热点之一,具有广阔的市场前景。
另一方面,人参皂苷CK、Rh1及其组合物对于改善非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗方面的研究未见文献报道。文献中,人参皂苷CK(20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇)在天然人参、西洋参和三七中并不存在,是原人参二醇型人参皂苷在人体肠道内的主要代谢产物和药效实体,其主要具有抗肿瘤、改善化疗副作用、抗炎、抗衰老、抗应激、抗氧化作用。人参皂苷Rh1(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参三醇)少量存在于人参药材中,其主要具有保护神经、抗氧化、抗炎、抗过敏和雌激素样作用。
发明内容
本发明的目的是提出人参皂苷CK、Rh1及其组合物的医药新用途,所要解决的技术问题是提出人参皂苷CK、Rh1及其组合物在改善非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗方面的应用。
人参皂苷CK、Rh1及其组合物在制备改善非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗药物中的应用。
进一步的应用是,所述的人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1分散片的制备包括以下步骤:
(1)称取人参皂苷CK:200 g或Rh1:200 g或CK:Rh1=1:1,200 g于50 L圆底烧瓶中,加入20 L无水乙醇,搅拌至完全溶解;加入600 g药用口服级大豆磷脂,搅拌至完全溶解;升温至40℃,回流、搅拌反应2小时,蒸干无水乙醇,即得人参皂苷CK-磷脂复合物、Rh1-磷脂复合物或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物。
(2)称取上述制得的人参皂苷CK-磷脂复合物100 g或Rh1-磷脂复合物100 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物100 g,微晶纤维素150 g,羟丙基纤维素16 g,交联聚维酮16 g过50目筛混合均匀,再加入0.5 g吐温80为粘合剂过20目筛制粒,55℃干燥3小时,过18目筛整粒,加入16 g交联聚维酮、1.5 g的硬脂酸镁和0.05 g阿司帕坦混匀,分别压成1000片,每片含0.025 g人参皂苷CK、或0.025 g人参皂苷Rh1、或0.025 g CK:Rh1=1:1。
进一步的应用是,所述的人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1软胶囊的制备包括以下步骤:
称取以上分散片步骤(1)所制得的人参皂苷CK-磷脂复合物100 g、Rh1-磷脂复合物100 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物100 g,加入250 g聚乙二醇400,搅拌均匀,再分别加入65 g吐温80和35 g丙二醇,50℃加热搅拌至完全溶解;将所得溶液与明胶带在25±2℃、相对湿度40%条件下,经自动旋转轧囊机压制成1000粒软胶囊,每粒含0.025 g人参皂苷CK、或0.025 g人参皂苷Rh1、或0.025 g CK:Rh1=1:1。
进一步的应用是,所述的人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1注射液的制备包括以下步骤:
(1)称取人参皂苷CK:200 g或Rh1:200 g或CK:Rh1=1:1,200 g于50 L圆底烧瓶中,加入20 L无水乙醇,搅拌至完全溶解。加入600 g药用注射级大豆磷脂,搅拌至完全溶解;升温至40℃,回流、搅拌反应2小时,蒸干无水乙醇,即得人参皂苷CK-磷脂复合物、Rh1-磷脂复合物或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物;
(2)称取上述制得的人参皂苷CK-磷脂复合物0.4 g或Rh1-磷脂复合物0.4 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物0.4 g,加注射用水至1000 mL,高剪切乳化机乳化得乳白色初乳;将制得的初乳移入高压匀质机匀化;用0.22 微米微孔滤膜过滤乳液;将乳剂灌封于适当的容器内;置100℃条件下灭菌30分钟,制得的1 mL注射液含0.1 mg人参皂苷CK、或0.1 mg人参皂苷Rh1、或0.1 mg CK:Rh1=1:1。
本发明的实质性特点和显著进步是:
1、与模型组及三七总皂苷处理组相比,人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1明显下调大鼠肝星状细胞HSC-T6的基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(Tissue Inhibitor of MatrixMetalloproteinase-1,TIMP-1)、I型前胶原(Procollagen-I,PC-I)及III型前胶原(Procollagen-III,PC-III)的蛋白表达,上调基质金属蛋白激酶-2(MatrixMetalloproteinase-2,MMP-2)及基质金属蛋白激酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)的蛋白表达,调控肝星状细胞外基质的合成与降解。
2、与模型组、三七总皂苷处理组、磷脂处理组及罗格列酮阳性对照组相比,人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1明显降低非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl Transpeptidase,γ-GT)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酸(Aspartate aminotransferase,AST)和碱性磷酸酶(AlkalinePhosphates,ALP)水平,改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的肝功能异常。
3、与模型组、三七总皂苷处理组、磷脂处理组及罗格列酮阳性对照组相比,人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1明显降低非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠血清的总胆固醇(TotalCholesterol,TC)、游离胆固醇(Free Cholesterol,FCHOL)、低密度脂蛋白(Low DensityLipoprotein,LDL)和甘油三酯(Triglyceride,TG)水平,明显升高其高密度脂蛋白(HighDensity Lipoprotein,HDL)水平,改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的脂质代谢紊乱。
4、与模型组、三七总皂苷处理组及磷脂处理组相比,人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1明显降低非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠血清的血清空腹、餐后0.5小时、1小时、2小时血糖水平及胰岛素抵抗指数,调节非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的糖代谢,改善其胰岛素抵抗。
5、与模型组、三七总皂苷处理组、磷脂处理组及罗格列酮阳性对照组相比,人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1明显降低非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠细胞脂肪变性、肝脏炎症活动度计分和肝纤维化分级,改善非其肝纤维化程度。
附图说明
图1是人参皂苷CK的结构式。
图2是人参皂苷Rh1的结构式。
图3是2.5 μg/mL的人参皂苷CK、Rh1、CK:Rh1=1:1及三七总皂苷,以及30 μg/mL的罗格列酮作用大鼠肝星状细胞HSC-T6 6 h后对TIMP-1蛋白相对表达量的影响(n=3)。图中1:CK组;2: Rh1组;3: CK:Rh1=1:1组;4: 三七总皂苷组;5: 罗格列酮组;6: 模型组。
图4是2.5 μg/mL的人参皂苷CK、Rh1、CK:Rh1=1:1及三七总皂苷,以及30 μg/mL的罗格列酮作用大鼠肝星状细胞HSC-T6 6 h后对MMP-2蛋白相对表达量的影响(n=3)。图中1:CK组;2: Rh1组;3: CK:Rh1=1:1组;4: 三七总皂苷组;5: 罗格列酮组;6: 模型组。
图5是2.5 μg/mL的人参皂苷CK、Rh1、CK:Rh1=1:1及三七总皂苷,以及30 μg/mL的罗格列酮作用大鼠肝星状细胞HSC-T6 6 h后对MMP-9蛋白相对表达量的影响(n=3)。图中1:CK组;2: Rh1组;3: CK:Rh1=1:1组;4: 三七总皂苷组;5: 罗格列酮组;6: 模型组。
图6是2.5 μg/mL的人参皂苷CK、Rh1、CK:Rh1=1:1及三七总皂苷,以及30 μg/mL的罗格列酮作用大鼠肝星状细胞HSC-T6 6 h后对PC-I蛋白相对表达量的影响(n=3)。图中1: CK组;2: Rh1组;3: CK:Rh1=1:1组;4: 三七总皂苷组;5: 罗格列酮组;6: 模型组。
图7是2.5 μg/mL的人参皂苷CK、Rh1、CK:Rh1=1:1及三七总皂苷,以及30 μg/mL的罗格列酮作用大鼠肝星状细胞HSC-T6 6 h后对PC-III蛋白相对表达量的影响(n=3)。图中1:CK组;2: Rh1组;3: CK:Rh1=1:1组;4: 三七总皂苷组;5: 罗格列酮组;6: 模型组。
图8是高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型10周肝组织HE染色±(×20),肝细胞脂肪变3分。
图9是高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型10周肝组织Masson染色(×20),肝纤维化1b期。
下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明,实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
具体实施方式
本发明以下实施例中使用的人参皂苷CK及Rh1由云南与诺生物工程有限责任公司参照文献报道的方法从人参或三七药材中提取、酶转化、分离和纯化;含量:HPLC≥99%;分子量、1H及13C NMR的化学位移值与文献报道的一致。
实施例1:人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1调控大鼠肝星状细胞HSC-T6胶原合成与降解相关基因表达的体外研究
(一)材料与方法
1、细胞株:大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自中国科学院昆明动物研究所细胞库,表型为活化的HSC,具纤维化特性。HSC-T6细胞株用含有100 U/mL青霉素,100 μg/mL链霉素和10%热灭活胎牛血清的DMEM培养基,在37°C、体积分数为5%CO2的培养箱培养,48h更换培养基,待细胞长至80%密度时,用0.25%胰蛋白酶消化,2~3d传代1次,实验选用对数生长期细胞。
2、人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1对HSC-T6细胞凋亡的影响
取对数生长期HSC-T6,以1×106 /孔接种在6孔板继续培养,待细胞贴壁后,更换培养基继续培养24h,PBS清洗细胞2次,血清饥饿4h,分别以1.25 μg/mL、2.5 μg/mL和5 μg/mL的浓度加入CK、Rh1、CK:Rh1=1:1及三七总皂苷作用HSC-T6细胞6h作为药物处理组,以10 μg/mL、30 μg/mL和60 μg/mL的浓度加入罗格列酮作用HSC-T6细胞6h作为阳性对照,常规培养的HSC-T6细胞作为模型组,用PBS缓冲盐溶液清洗细胞两次,以2000rpm转速离心5min收集培养基上清及细胞,调整细胞数为5×105个,加入500μL的binding buffer悬浮细胞,加入5μL的Annexin-fitc混匀,再加入5μL的PI混匀,室温下避光孵育15min,1h内上流式细胞仪检测。
3、人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1对HSC-T6细胞胶原合成与降解相关蛋白表达的影响
取对数生长期HSC-T6细胞,以1×106/孔接种在6孔板继续培养,待细胞贴壁后,更换培养基继续培养24h,PBS清洗细胞2次,血清饥饿4h;分别以2.5 μg/mL浓度的CK、Rh1、CK:Rh1=1:1、三七总皂苷混合无血清的DMEM处理HSC-T6细胞6h作为药物处理组;以30 μg/mL浓度的罗格列酮混合无血清的DMEM处理HSC-T6细胞6h作为阳性对照组;无血清的DMEM常规培养的HSC-T6细胞作为模型组。按照蛋白酶裂解液RIPA及PMSF说明书抽提总蛋白,定量后进行Western-Blot,检测基TIMP-1、MMP-2、MMP-9、PC-I及PC-III的蛋白相对表达量。
统计学处理:采用SPSS17.0统计学软件处理数据,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。所有数据均进行数据的正态性及方差齐性检验。计量资料的多组数据比较采用随机区组设计的方差分析,组间的两两多重比较采用最小显著差法(LSD法)。等级资料比较采用秩和检验。检验所取的显著水平α=0.05。
(二)实验结果
1、人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1诱导HSC-T6细胞凋亡的作用呈剂量依赖性。与常规培养HSC-T6细胞的模型组及三七总皂苷处理组相比,人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1处理组诱导HSC-T6细胞凋亡比例显著性增加(P<0.05)。
2、人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1调控HSC-T6细胞胶原合成与降解相关基因的表达
与模型组及三七总皂苷处理组相比,人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1处理组TIMP-1、PC-I、PC-III蛋白相对表达量明显减少(分别见图3、图6和图7,P值均<0.05),MMP-2、MMP-9的蛋白相对表达量明显增加(分别见图4和图5,P值均P<0.05)。人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1通过下调HSC-T6细胞TIMP-1、PC-I、PC-III的表达及上调MMP-2、MMP-9的表达,调控肝星状细胞外基质的合成与降解,提示其具有改善肝纤维化的活性。
实施例2:人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1对大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗的影响
(一)材料与方法
1、实验动物
清洁级健康雄性SD大鼠,5周龄,体重160±10g,由昆明医科大学动物科提供,动物合格证号:SCXK(滇)2005–2008。在无特殊病原菌(SPF)条件下分笼饲养,控制室温(23±1ºC),湿度40%,明暗各12 h,自由觅食、饮水。
2、主要试剂的制备
高脂饲料:胆固醇(1%)+胆盐(0.3%)+丙硫氧嘧啶(0.1%)+猪油(10%)+鸡蛋黄(10%)+玉米面(78.6%);普通饲料:为实验动物标准饲料,由昆明医科大学动物科配制,能量密度为14.56kJ/g。
3、模型制备与分组给药
造模:清洁级SD雄性大鼠180只实验前称重,普通饲料适应性喂养1周后,随机抽取其中30只作为正常对照组,其余150只大鼠自由食入高脂饲料。第10周末随机选择10只高脂饮食大鼠和10只普通饲料饮食的大鼠饥饿12小时后,采用陆眠宁肌松、镇静后经切断腹股沟动脉采血,检测血清学指标,颈椎脱臼处死大鼠,剖腹取肝脏组织用10%甲醛固定,病理切片HE染色、Masson染色后检测肝脏脂肪变及肝纤维化。
分组:将造模成功的大鼠继续予以高脂饮食1周后,随机分为A、B、C、D、E、F和模型组,每组20只。A组:CK-磷脂复合物3 mg/kg/d组;B组:Rh1-磷脂复合物3 mg/kg/d组;C组:CK:Rh1=1:1-磷脂复合物3 mg/kg/d组;D组:三七总皂苷-磷脂复合物50 mg/kg/d组;E组:磷脂30 mg/kg/d对照组;F组:罗格列酮4 mg/kg/d阳性对照组;模型组:自由食入高脂饲料,0.9%氯化钠2 mL/只。正常对照组:自由食入普通饲料,0.9%氯化钠2 mL/只。
给药:各组大鼠于第12周每天清晨称重,灌胃相应剂量的治疗药物共2周。
标本处理:各组大鼠分别于给药第1周末和给药第2周末禁食24小时,予以剪尾采血进行葡萄糖耐量实验(Oral Glucose Tolerance Test,OGTT)检测;各组大鼠每组随机选取10只处死。第13周末大鼠全部处死。各组大鼠均采用陆眠宁肌松、镇静后经经切断腹股沟动脉采血,收集血液,分离并分装血清,全自动生化分析仪检测血清学指标;剩余血清进行分装于-70°C冰箱中保存备用。采血后颈椎脱臼处死大鼠,剖腹取肝脏组织用10%甲醛固定,石蜡包埋切片,分别进行HE染色、Masson染色,由病理专业医师读片,光镜下观察炎症活动度分级及肝纤维化分级;剩余肝脏置于冻存管中,液氮速冻后于-70°C冰箱保存备用。
病理标本检测:非酒精性脂肪性肝病病理特征为肝腺泡3区大泡性或以大泡为主的混合性肝细胞脂肪变,伴或不伴有肝细胞气球样变,小叶内混合性炎性细胞浸润以及窦周纤维化。参照美国国立卫生研究院NASH临床研究网病理工作组指南进行NAFLD活动度计分(NAFLD activity score,NAS)和肝纤维化分级。
NAS计分(0~8分):(1)肝细胞脂肪变:0分(<5%);1分(5%~33%);2分(34%~66%);3分(>66%)。(2)小叶内炎症(20倍镜计数坏死灶):0分,无;1分(<2个);2分(2~4个);3分(>4个)。(3)肝细胞气球样变:0分,无;1分,少见;2分,多见。NAS为半定量评分系统而非诊断程序,NAS<3分可排除NASH,NAS>4分则可诊断NASH,介于两者之间者为NASH可能。规定不伴有小叶内炎症、气球样变和纤维化但肝脂肪变>33%者为NAFL,脂肪变达不到此程度者仅称为肝细胞脂肪变。
肝纤维化分级(0~4):0:无纤维化;1a:肝腺泡3区轻度窦周纤维化;lb:肝腺泡3区中度窦周纤维化;1c:仅有门脉周围纤维化;2:腺泡3区窦周纤维化合并门脉周围纤维化;3:桥接纤维化,4:高度可疑或确诊肝硬化,包括NASH合并肝硬化、脂肪性肝硬化以及隐源性肝硬化。这是因为肝脂肪变和炎症随着肝纤维化进展而减轻。
统计学处理:采用SPSS17.0统计学软件处理数据,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。所有数据均进行数据的正态性及方差齐性检验。计量资料的多组数据比较采用随机区组设计的方差分析,组间的两两多重比较采用最小显著差法(LSD法)。等级资料比较采用秩和检验。检验所取的显著水平α=0.05。
(二)实验结果
1、动物模型建立
高脂喂养至第10周末,各实验组行HE染色、Masson染色后的结果显示肝脏组织内肝小叶结构紊乱,轻-中度肝细胞脂肪变性,可见窦周及门脉周围纤维化,提示成功建立大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型(见图8,图9)。
2、人参皂苷CK、人参皂苷Rh1及CK:Rh1=1:1改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的肝功能异常
给药1周和2周后,模型组大鼠血清的γ-GT、ALT、AST和ALP水平与正常对照组比较(见表1,表2)显著升高(P值均<0.05),表明非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的肝功能异常。
表1 给药1周后模型组与正常组大鼠肝功能比较(x±s,n=10)
与正常组比较P<0.05
表2 给药2周后模型组与正常组大鼠肝功能比较(x±s,n=10)
与正常组比较P<0.05
给药1周和2周后,A组、B组和C组大鼠血清γ-GT、ALT、AST和ALP的水平明显降低,与D组、E组、F组和模型组比较差异(见表3,表4)有统计学意义(P值均<0.05),表明人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1可以改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的肝功能。
表3 给药1周后各组大鼠肝功能比较(x±s,n=10)
与D组、E组、F组和模型组比较P<0.05
表4 给药2周后各组大鼠肝功能比较(x±s,n=10)
与D组、E组、F组和模型组比较P<0.05
3、人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1调节非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的脂质代谢紊乱
给药1周和2周后,与正常对照组比较,模型组大鼠血清的TC、FCHOL、LDL和TG水平(见表5,表6)显著升高(P值均<0.05),HDL水平(见表5,表6)明显降低(P值均<0.05),表明非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的脂质代谢紊乱。
表5 给药1周后模型组大鼠与正常组大鼠血脂比较(x±s,n=10)
与正常组比较P<0.05
表6 给药2周后模型组大鼠与正常组大鼠血脂比较(x±s,n=10)
与正常组比较P<0.05
给药1周和2周后,A组、B组和C组大鼠血清TC、FCHOL、LDL和TG的水平明显降低,与D组、E组、F组和模型组比较差异(见表7,表8)有统计学意义(P值均<0.05);A组、B组和C组大鼠血清HDL的水平升高,与D组、E组、F组和模型组比较差异(见表7,表8)有统计学意义(P值均<0.05);表明人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1可以改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的脂质代谢紊乱。
表7 给药1周后各组大鼠血脂比较(x±s,n=10)
与D组、E组、F组和模型组比较P<0.05
表8 给药2周后各组大鼠血脂比较(x±s,n=10)
与D组、E组、F组和模型组比较P<0.05
4、人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1调节非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的糖代谢异常
给药1周和2周后,与正常对照组比较,模型组大鼠血清空腹、餐后0.5小时、1小时、2小时血糖水平及胰岛素抵抗指数(见表9,表10)明显升高(P值均<0.05),OGTT曲线表明非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的糖耐量降低。
表9 给药1周后模型组大鼠与正常组大鼠糖代谢比较(x±s,n=10)
与正常组比较P<0.05
表10 给药2周后模型组大鼠与正常组大鼠糖代谢比较(x±s,n=10)
与正常组比较P<0.05
给药1周和2周后,A组、B组和C组大鼠血清空腹、餐后0.5小时、1小时、2小时血糖水平及胰岛素抵抗指数水平降低,与D组、E组和模型组比较差异(见表11,表12)有统计学意义(P值均<0.05); OGTT曲线表明人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1通过调节非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的糖代谢,改善其胰岛素抵抗。给药1周和2周后,F组大鼠血清空腹、餐后0.5小时、1小时、2小时血糖水平及胰岛素抵抗指数水平降低,与模型组比较差异(见表11,表12)有统计学意义(P值均<0.05),表明罗格列酮具有改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠胰岛素抵抗的作用。
表11 给药1周后各组大鼠糖代谢的比较(x±s,n=10)
与D组、E组和模型组比较P<0.05。*和模型组比较P<0.05。
表12 给药2周后各组大鼠糖代谢的比较(,n=10)
与D组、E组和模型组比较P<0.05。*和模型组比较P<0.05。
5、人参皂苷CK、人参皂苷Rh1及CK:Rh1=1:1改善大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化
给药1周和2周后,肝组织HE染色及Masson染色后分级结果表明,模型组大鼠肝细胞脂肪变、肝脏炎症活动度计分和肝纤维化分级与正常对照组比较差异(见表13,表14)有统计学意义(P值均<0.05),其肝组织脂肪变程度达中至重度,纤维化面积增大。
表13 给药1周后模型组与正常组大鼠肝脏病理分级情况
与正常组比较P<0.05
表14 给药2周后模型组与正常组大鼠肝脏病理分级情况
与正常组比较P<0.05
给药1周和2周后,肝组织HE染色及Masson染色后分级结果表明,A组、B组和C组大鼠肝细胞脂肪变、肝脏炎症活动度计分和肝纤维化分级的水平降低,与D组、E组、F组和模型组比较差异(见表15,表16)有统计学意义(P值均<0.05),表明人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1可以改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的肝纤维化程度。
表15 给药1周后各组大鼠肝脏病理分级情况
与D组、E组、F组和模型组比较P<0.05
表16 给药2周后各组大鼠肝脏病理分级情况
与D组、E组、F组和模型组比较P<0.05
实施例3:人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1分散片的制备
分别称取人参皂苷CK:200 g,Rh1:200 g或CK:Rh1=1:1,200 g于50 L圆底烧瓶中,加入20 L无水乙醇,搅拌至完全溶解。加入600 g药用口服级大豆磷脂,搅拌至完全溶解。升温至40℃,回流、搅拌反应2小时,蒸干无水乙醇,即得人参皂苷CK-磷脂复合物、Rh1-磷脂复合物或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物。
分别称取上述制得的人参皂苷CK-磷脂复合物100 g、Rh1-磷脂复合物100 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物100 g,微晶纤维素150 g,羟丙基纤维素16 g,交联聚维酮16 g过50目筛混合均匀,再加入0.5 g吐温80为粘合剂过20目筛制粒,55℃干燥3小时,然后过18目筛整粒,加入16 g交联聚维酮、1.5 g的硬脂酸镁和0.05 g阿司帕坦混匀,分别压成1000片,每片含0.025 g人参皂苷CK、或0.025 g人参皂苷Rh1、或0.025 g CK:Rh1=1:1。
实施例4:人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1软胶囊的制备
分别称取实施例3制得的人参皂苷CK-磷脂复合物100 g、Rh1-磷脂复合物100 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物100 g,加入250 g聚乙二醇400,搅拌均匀,再分别加入65 g吐温80和35 g丙二醇,50℃加热搅拌至完全溶解。将所得溶液与明胶带在25±2℃、相对湿度40%条件下,经自动旋转轧囊机压制成1000粒软胶囊,每粒含0.025 g人参皂苷CK、或0.025 g人参皂苷Rh1、或0.025 g CK:Rh1=1:1。
实施例5:人参皂苷CK、Rh1及CK:Rh1=1:1注射液的制备
分别称取人参皂苷CK:200 g、Rh1:200 g或CK:Rh1=1:1,200 g于50 L圆底烧瓶中,加入20 L无水乙醇,搅拌至完全溶解。加入600 g药用注射级大豆磷脂,搅拌至完全溶解。升温至40℃,回流、搅拌反应2小时,蒸干无水乙醇,即得人参皂苷CK-磷脂复合物、Rh1-磷脂复合物或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物。
分别称取上述制得的人参皂苷CK-磷脂复合物0.4 g、Rh1-磷脂复合物0.4 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物0.4 g,加注射用水至1000 mL,高剪切乳化机乳化得乳白色初乳;将制得的初乳移入高压匀质机匀化;用0.22 微米微孔滤膜过滤乳液;将乳剂灌封于适当的容器内;置100℃条件下灭菌30分钟。制得的1 mL注射液含0.1 mg人参皂苷CK、或0.1 mg人参皂苷Rh1、或0.1 mg CK:Rh1=1:1。
综上,人参皂苷CK、人参皂苷Rh1及其组合物可以调控肝星状细胞外基质的合成与降解,明显改善非酒精性脂肪性肝纤维化大鼠的肝功能异常、脂质代谢紊乱、糖代谢异常和肝纤维化程度,因而具有作为非酒精性脂肪性肝纤维化合并胰岛素抵抗用药的开发前景。

Claims (1)

1.人参皂苷CK、Rh1及其组合物在制备改善非酒精性脂肪性肝纤维化与胰岛素抵抗药物中的应用,其特征是:
(a)制备分散片包括以下步骤:
(1)称取人参皂苷CK:200 g或Rh1:200 g或CK:Rh1=100g:100g,200 g于50 L圆底烧瓶中,加入20 L无水乙醇,搅拌至完全溶解;加入600 g药用口服级大豆磷脂,搅拌至完全溶解;升温至40°C,回流、搅拌反应2小时,蒸干无水乙醇,即得人参皂苷CK-磷脂复合物、Rh1-磷脂复合物或CK:Rh1=1:1 -磷脂复合物;
(2)称取上述制得的人参皂苷CK-磷脂复合物100 g或Rh1-磷脂复合物100 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物100 g,微晶纤维素150 g,羟丙基纤维素16 g,交联聚维酮16 g过50目筛混合均匀,再加入0.5 g吐温80为粘合剂过20目筛制粒,55℃干燥3小时,过18目筛整粒,加入16 g交联聚维酮、1.5 g的硬脂酸镁和0.05 g阿司帕坦混匀,分别压成1000片,每片含0.025g人参皂苷CK或0.025 g人参皂苷Rh1或CK:Rh1=1:1;
(b)制备软胶囊包括以下步骤:
(1)称取人参皂苷CK:200 g或Rh1:200 g或CK:Rh1=100g:100g,200 g于50 L圆底烧瓶中,加入20 L无水乙醇,搅拌至完全溶解;加入600 g药用口服级大豆磷脂,搅拌至完全溶解;升温至40°C,回流、搅拌反应2小时,蒸干无水乙醇,即得人参皂苷CK-磷脂复合物、Rh1-磷脂复合物或CK:Rh1=1:1 -磷脂复合物;
(2)称取制得的人参皂苷CK-磷脂复合物100 g、Rh1-磷脂复合物100 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物100 g,加入250 g聚乙二醇400,搅拌均匀,再分别加入65 g吐温80和35 g丙二醇,50℃加热搅拌至完全溶解;将所得溶液与明胶带在25±2℃、相对湿度40%条件下,经自动旋转轧囊机压制成1000粒软胶囊,每粒含0.025 g人参皂苷CK或0.025 g人参皂苷Rh1或0.025g CK:Rh1=1:1;
(c)制备注射液包括以下步骤:
(1)称取人参皂苷CK:200 g或Rh1:200 g或CK:Rh1=100g:100g,200 g于50 L圆底烧瓶中,加入20 L无水乙醇,搅拌至完全溶解;加入600 g药用注射级大豆磷脂,搅拌至完全溶解;升温至40℃,回流、搅拌反应2小时,蒸干无水乙醇,即得人参皂苷CK-磷脂复合物、Rh1-磷脂复合物或CK:Rh1=1:1 -磷脂复合物;
(2)称取上述制得的人参皂苷CK-磷脂复合物0.4 g或Rh1-磷脂复合物0.4 g或CK:Rh1=1:1-磷脂复合物0.4 g,加注射用水至1000 mL,高剪切乳化机乳化得乳白色初乳;将制得的初乳移入高压匀质机匀化;用0.22 微米微孔滤膜过滤乳液;将乳剂灌封于适当的容器内;置100℃条件下灭菌30分钟,制得的1 mL注射液含0.1 mg人参皂苷CK或0.1 mg人参皂苷Rh1或CK:Rh1=1:1。
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