CN106265640B - Appa在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。APPA(1‑acetyl‑5‑phenyl‑1H‑pyrrol‑3‑yl acetate，1‑乙酰基‑5‑苯基‑1H‑吡咯‑3‑基乙酸酯)作为治疗或预防早期糖尿病肾病药物，具有剂量小、副作用小、效果好等优点，对早期糖尿病肾病具有明显的治疗作用。本发明同时公开了应用APPA的治疗或预防早期糖尿病肾病药物的制备方法。

Description

APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用

技术领域

本发明属于一种化学药物及药物制剂的技术领域，尤其是涉及一种1-乙酰基-5-苯基-1H-吡咯-3-基乙酸酯(1-acetyl-5-phenyl-1H-pyrrol-3-yl acetate，APPA)在治疗2型糖尿病药物制备中的应用。

背景技术

糖尿病被世界卫生组织列为三大疑难病之一。随着糖尿病的发展，患者常会产生多种形式的糖尿病并发症，其中，糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见的并发症之一，是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病肾病是糖尿病的一种严重血管并发症，是由糖尿病引起的微血管病变而导致肾小球硬化。肾小球系膜细胞是肾小球内非常活跃的细胞，具有调节肾小球毛细血管表面积、控制肾小球血流量、分泌细胞基质、产生细胞因子、吞噬和清除大分子物质的功能。转化生长因子(Trans forming GrowthFactor-β,TGF-β)TGF-β1是与DN相关的重要细胞因子，其通过多种途径引起细胞外基质积聚，在DN发生发展进程中起着重要作用；另外高糖环境下细胞外基质如IV型胶原和层粘蛋白等代谢失衡，进行性积聚、增生，引起肾小球硬化，并进一步继发肾间质纤维化，这是导致DN的重要病理基础。

临床上用来治疗糖尿病肾病药物较少，仅有依帕司他等少数药物可以用来治疗糖尿病肾病，其它可被用来治疗糖尿病肾病的药物少有报道。

化合物1-乙酰基-5-苯基-1H-吡咯-3-基乙酸酯，英文名为1-acetyl-5-phenyl-1H-pyrrol-3-yl acetate(APPA)，其结构式如下：

结构式中，Ac为乙酰基；

经文献检索，关于化合物APPA的药理活性研究，未见相关报道。

发明内容

为了克服现有治疗糖尿病肾病药物的不足，本发明提供一种化合物APPA的新用途，即在制药中的新应用。

进一步地，本发明的目的是提供一种新的可用来治疗糖尿病肾病的药物APPA，以及其在治疗糖尿病肾病药物方面的应用。

具体地，本发明提供一种APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。

为了研究APPA对糖尿病肾病的作用，本发明在体外实验中，通过高糖诱导肾小球系膜细胞建立损伤模型，研究在高糖刺激作用下，肾小球系膜细胞内引起的代谢异常现象，通过对高糖诱导细胞凋亡水平作用的测定，细胞IV型胶原和层粘蛋白水平的测定，及TGF-β1蛋白表达量的测定，来研究APPA对肾小球系膜细胞的作用，进一步对本发明提供一种新的可用来治疗糖尿病肾病的药物APPA进行解释和说明。

APPA对肾小球系膜细胞(HBZY-1)增殖情况的影响。结果表明，APPA对高糖损伤引起的细胞凋亡具有一定的抑制作用，当其终浓度达到0.6μM时，APPA作用效果与阳性药10μM依帕司他(epalrestat，EPS)效果相似，当浓度达到0.9μM时效果显著优于阳性药物EPS(10μM)组。

APPA对肾小球系膜细胞外基质IV型胶原和层粘蛋白水平的作用。结果表明，与高糖组(HG)组相比，APPA给药浓度越高，IV型胶原和层粘蛋白含量均有不同程度的降低，高浓度APPA(0.9μM)对肾皮质细胞质IV胶原蛋白的抑制程度高于EPS(10μM)对照组；高浓度APPA(0.9μM)对层粘蛋白抑制程度与EPS(10μM)对照组相当；说明，在细胞水平上，APPA具有较好的抑制细胞间基质增生，效果等于或优于阳性药物依帕司他。

APPA对肾小球系膜细胞(HBZY-1)TGF-β1蛋白表达量的影响。结果表明，与HG组相比，低剂量组(AL)、中剂量组(AM)、高剂量组(AH)和EPS组细胞的TGF-β1蛋白表达量显著性降低P<0.05，说明，APPA能够有效抑制TGF-β1蛋白表达量，其作用效果与依帕司他相当。

综合以上体外实验研究结果，本发明得出，APPA通过抑制TGF-β1蛋白表达量，进一步抑制细胞外基质(IV型胶原和层粘蛋白)增生和聚集，进而对高糖诱导HBZY-1细胞损伤模型具有保护作用，其作用效果与依帕司他相当或优于依帕司他。

本发明为了进一步研究APPA在体内对高糖诱导肾小球系膜细胞损伤是否具有保护作用，选用Wistar雄性大鼠，采用“三联法”(单肾切除+高糖高脂饮食+STZ腹腔注射)造早期糖尿病肾病模型，通过观察APPA给药对DN大鼠尿微量白蛋白影响；APPA给药对肾皮质细胞质IV胶原蛋白及层粘蛋白的变化，肾皮质中TGF-β1表达量的变化，以及HE染色对肾组织切片观察肾脏形态学改变，来进一步研究APPA对DN的作用。

实验结果表明：低剂量(20mg.kg^-1)、中剂量(40mg.kg^-1)、高剂量(80mg.kg^-1)APPA与依帕司他(100mg.kg^-1)均能够有效降低早期DN大鼠尿微量白蛋白含量，APPA作用效果优于依帕司他；低剂量、中剂量、高剂量APPA与依帕司他对DN大鼠肾皮质中IV型胶原和层粘蛋白影响起到一定的作用，高剂量的APPA作用效果优于依帕司他；低剂量、中剂量、高剂量APPA与依帕司他可明显抑制TGF-β1的蛋白表达量，其作用效果与EPS相似；通过HE染色对肾组织切片观察肾脏形态学改变，发现，APPA与依帕司他均能够改善DN大鼠的肾脏组织形态。这说明，APPA对早期糖尿病肾病具有一定治疗作用，其作用效果与依帕司他相当或优于依帕司他。

进一步地，根据本发明APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，APPA具有抗糖尿病肾病药物活性，按照常规制药技术，加入常规辅料，制备成常规口服固体药剂。

进一步地，所述常规辅料为淀粉、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇中任意一种或几种。

进一步地，所述常规口服固体药剂为片剂或胶囊剂。

应用APPA制备治疗糖尿病肾病口服胶囊的制备方法，取200克通过80目筛的APPA与30克淀粉混合均匀，加入适量50％乙醇，搅拌，过18目筛，制成颗粒，60～70℃干燥，干粒经16目筛整，加入3.0克硬脂酸镁混匀后，制成1000粒，测定含量，按照颗粒含量计算灌装。

应用APPA制备治疗糖尿病肾病口服片剂的制备方法，取200克通过80目筛的APPA与30克淀粉混合均匀，加入适量50％乙醇，搅拌，过18目筛，制成颗粒，60～70℃干燥，干粒经16目筛整，加入3.0克硬脂酸镁混匀后，制成1000粒，测定水分与含量，供压片用；按照颗粒含量计算片重，压片，检查合格后分装。

本发明与现有技术相比的有益效果为：

(1)本发明发现了APPA新的药物活性和新的医疗用途，拓展APPA一个新的应用领域；

(2)本发明APPA对于治疗糖尿病肾病具有剂量小、副作用小、效果好等优点，预示着有良好的药用前景。

因此，本发明APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用是十分必要的。

附图说明

图1为APPA对肾小球系膜细胞(HBZY-1)增殖情况的测定结果

图2为APPA对肾小球系膜细胞(HBZY-1)IV型胶原和层粘蛋白的影响

图3为APPA对肾小球系膜细胞(HBZY-1)TGF-β1蛋白含量的影响

图4为APPA对DN大鼠尿微量白蛋白的影响

图5为APPA对DN大鼠肾皮质中IV型胶原和层粘蛋白的影响

图6为APPA对DN大鼠肾皮质中TGF-β1表达量的影响

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。

实施例1 APPA对肾小球系膜细胞(HBZY-1)增殖情况的影响

为确定APPA不同浓度间对HBZY-1细胞增殖活性的影响情况，设6组(NS:正常对照组；HG:高糖给药模型组；AL:APPA低剂量(0.3μM)给药组；AM:APPA中剂量(0.6μM)给药组；AH:APPA高剂量(0.9μM)给药组；EPS:依帕司他(10μM)阳性对照组)，各组在糖浓度为33mmol/L培养72h，APPA各组和EPS组同时给药，使用MTT法检测不同浓度的APPA对各孔的细胞在490nm处的吸光度(OD)值。；

实验结果：附图1显示：与NS组相比，各实验组OD值均降低，HG、AL、AM、EPS组P<0.001，AH组P<0.05；与HG组相比，AM及EPS组OD值显著性升高P<0.05，AH组OD值升高最为显著P<0.01；与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与高糖模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01。

实施例2细胞IV型胶原和层粘蛋白含量的测定

通过设定6组(NS:正常对照组；HG:高糖给药模型组；AL:APPA低剂量(0.3μM)给药组；AM:APPA中剂量(0.6μM)给药组；AH:APPA高剂量(0.9μM)给药组；EPS:依帕司他(10μM)阳性对照组)测定细胞间IV型胶原和层粘连蛋白的含量，结果如附图2所示：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与高糖模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；通过对比正常对照组和高糖诱导组，可发现高糖诱导能显著增加细胞间基质增生现象的产生，细胞提取液中IV型胶原含量和层粘连蛋白含量显著高于溶媒对照组；而APPA给药后，发现与HG组相比，APPA给药浓度越高，IV型胶原含量和层粘连蛋白含量均有不同程度的降低，其中IV型胶原含量降低程度较层粘连蛋白更大，且高浓度APPA对IV胶原的抑制程度高于EPS。说明在细胞水平上，APPA具有较好的抑制细胞间基质增生的能力。

实施例3细胞TGF-β1蛋白表达量的测定

本实验采用Western Bloot的方法测定6组(NS:正常对照组；HG:高糖给药模型组；AL:APPA低剂量(0.3μM)给药组；AM:APPA中剂量(0.6μM)给药组；AH:APPA高剂量(0.9μM)给药组；EPS:依帕司他(10μM)阳性对照组)细胞内TGF-β1蛋白，如附图3结果显示：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与高糖模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；与NS组相比，HG及AL组细胞内TGF-β1蛋白含量显著性升高P<0.05，与HG组相比，AL及AM组细胞的TGF-β1蛋白含量显著性降低P<0.05，EPS组细胞内TGF-β1含量降低最为显著P<0.01。

综上，APPA对高糖引发的HBZY-1细胞损伤模型具有一定的抑制作用，可降低TGF-β1蛋白的表达，其作用效果优于依帕司他。

实施例4糖尿病肾病大鼠模型建立及给药治疗

Wistar雄性大鼠，体重300±50g，SPF级条件下饲养。实验期间控制实验室温度在20℃±2℃，12小时交替光照，大鼠自由取食、饮水。采用“三联法”(单肾切除+高糖高脂饮食+STZ腹腔注射)造早期糖尿病肾病模型。取60只雄性大鼠适应性喂养一周，随机分取6只为空白对照组(NS)；其余大鼠均左侧单肾切除，高糖高脂饮食喂养4周后，按照30mg.kg^-1连续三次腹腔注射STZ，每次时间间隔为3天。用葡萄糖氧化酶法测定大鼠空腹72h后的血糖含量，当血糖≥13.88mM时，糖尿病大鼠成模；4周后，测定大鼠空腹血糖含量，当血糖≥13.88mM时，且ELISA方法检测尿微量白蛋白含量超过30-300mg/d上限，则说明糖尿病肾病大鼠造模成功。确定DN成模后的大鼠，当天计作第1天，采用灌胃给药法，给药量1.0mL/200g体重，每天同一时间给药1次。将成模后的大鼠分为5组，每组6只，分别为模型对照组(DN)；APPA低、中、高治疗组(AL、AM、AH，剂量分别为20、40、80mg.kg^-1)；阳性药对照组(EPS，剂量100mg.kg^-1)，正常饮食，每周测定一次血糖、尿微量白蛋白，疗程8周后，处死大鼠，收集血浆、血清、取出肾脏，沿肾部侧面中间切开，切片，用甲醛溶液固定，然后将剩余组织分离肾皮质留存备用。

实施例5 APPA对DN大鼠整体生理状况的影响

在整个动物实验过程中，对各实验组动物的全程生理状态观测并记录。空白对照组(NS)动物精神活跃，活动频繁，毛发顺滑有光泽，进食饮水量正常，尿量正常，体重增加趋势稳定且迅速；动物单肾切除手术后，毛发卷曲，表情呆滞，眼睛有火；模型对照组(DN)动物培养过程中精神恍惚，萎靡不振，活动频率低，眼球缺血苍白、毛发粗糙枯燥无光泽，呈现高饮水低进食现象，尿量多，垫料极潮湿需每天更换；APPA低、中、高剂量给药组(AL、AM、AH)较模型对照组(DN)在精神状态、毛发发质、活跃程度、饮食状况、尿量、体重等生理状况均有显著改善。经过8周的给药治疗，APPA低、中、高剂量给药组(AL、AM、AH)和EPS组糖尿病肾病症状有显著改善，生理状态与空白对照组接近。

实施例6 APPA对DN大鼠尿微量白蛋白的影响

通过测定6组(NS：正常对照组；DN：糖尿病肾病模型组；AL：APPA低剂量给药组；AM：APPA中剂量给药组；AH：APPA高剂量给药组；EPS：依帕司他阳性对照组)大鼠尿微量白蛋白含量，如图4所示：与正常对照组相比，**P<0.01；与糖尿病肾病模型组相比，^##P<0.01通过测定各组尿微量白蛋白水平，发现DN组较NS组有显著的差异，说明糖尿病肾病模型造模成功。模型组尿微量白蛋白含量有明显的升高，说明模型组已存在显著的肾损伤情况，导致尿蛋白大量外流；给药后各组DN大鼠的尿微量白蛋白水平得到显著恢复，进一步增加给药浓度，AM组、AH组与AL组相比，糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白水平并没有显著降低，并且均与阳性对照药物EPS效果相似，说明，低剂量组已经是一个比较好的剂量恢复水平。

实施例7 APPA对DN大鼠肾皮质中IV型胶原和层粘蛋白的影响

通过测定6组(NS:正常对照组；DN：糖尿病肾病模型组；AL：低剂量APPA给药组；AM：中剂量APPA给药组；AH：APPA高剂量给药组；EPS：阳性对照组)测定大鼠肾皮质中IV型胶原和层粘蛋白含量，实验结果如附图5显示，与正常对照组相比，**P<0.01；与糖尿病肾病模型组相比，^#P<0.05。在糖尿病肾病大鼠肾皮质中IV型胶原蛋白和层粘蛋白含量均显著性升高P<0.01，但不同浓度的APPA及阳性药EPS对糖尿病肾病大鼠肾表皮中的IV型胶原蛋白和层粘蛋白的含量影响有剂量依赖性等情况。实验数据显示，与DN组相比，AL、AM组及EPS组大鼠肾表皮中的IV型胶原蛋白和层粘蛋白含量均显著性降低P<0.05，P<0.05。AH组大鼠肾表皮中的IV型胶原蛋白和层粘蛋白含量均显著性降低P<0.01。说明，IV型胶原蛋白和层粘蛋白在糖尿病肾病大鼠体内呈升高状态，APPA及EPS对高糖引起的此类变化均具有显著的抑制作用，而APPA的抑制作用优于EPS。

实施例8 APPA对DN大鼠肾皮质中TGF-β1的影响

为了进一步说明DN大鼠肾组织中TGF-β1表达量及APPA对DN大鼠肾组织中TGF-β1表达量的作用，本实验采用Western Bloot的方法，对6组(NS：正常对照组；DN：糖尿病肾病模型组；AL：低剂量APPA给药组；AM：中剂量APPA给药组；AH：APPA高剂量给药组；EPS：阳性对照组)大鼠肾皮质内TGF-β1蛋白进行了测定，结果如附图6所示：与正常对照组相比，***P<0.001；与糖尿病肾病模型组相比，^#P<0.05,^##P<0.01与NS组相比，DN肾皮质内TGF-β1蛋白含量显著性升高P<0.001；与DN组相比，AL及AM组肾皮质内的TGF-β1蛋白含量显著性降低P<0.05，AH及EPS组肾皮质内TGF-β1含量降低最为显著P<0.01。说明APPA高剂量组对糖尿病肾病大鼠肾表皮组织内TGF-β1的表达抑制作用与阳性药EPS组相接近。可见，APPA对DN大鼠肾皮质内TGF-β1蛋白的表达具有一定的抑制作用，说明对早期DN大鼠具有一定的治疗作用。

实施例9 APPA对DN大鼠肾组织形态的影响

经过对6组(NS：正常对照组；DN：糖尿病肾病模型组；AL：低剂量APPA给药组；AM：中剂量APPA给药组；AH：APPA高剂量给药组；EPS：阳性对照组)大鼠病理切片组织形态学观察，我们得出：与NS组相比，DN组肾小球体积明显增大，细胞增多，肾小管上皮细胞有坏死脱落和水肿，小管腔中有透明管型。AL、AM、AH及EPS组组织切片显示对DN大鼠早期肾损伤有改善作用，其中AH组及EPS组作用最为显著。

综上，体内实验结果表明：APPA对早期DN大鼠具有一定的治疗作用，其作用效果与依帕司他相近。

实施例10 APPA口服胶囊的制备

口服胶囊的原料配比：

制剂灌装：取200克通过80目筛的APPA与30克淀粉混合均匀，加入适量50％乙醇，搅拌，过18目筛，制成松紧适度的颗粒，60～70℃干燥，干粒经16目筛整，加入3.0克硬脂酸镁混匀后，制成1000粒，测定含量，按照颗粒含量计算灌装。

实施例11 APPA片剂的制备

口服片剂的原料配比：

制剂灌装：取200克通过80目筛的APPA与30克淀粉混合均匀，加入适量50％乙醇，搅拌，过18目筛，制成松紧适度的颗粒，60～70℃干燥，干粒经16目筛整，加入3.0克硬脂酸镁混匀后，制成1000粒，测定水分与含量，供压片用。按照颗粒含量计算片重，压片，检查合格后分装。

Claims (6)

1.一种APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述APPA指化合物1-乙酰基-5-苯基-1H-吡咯-3-基乙酸酯，其结构式如下：

结构式中，Ac为乙酰基。

2.如权利要求1所述的一种APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，其特征在于，按照常规制药技术，加入常规辅料，制备成常规口服固体药剂。

3.如权利要求2所述的一种APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，其特征在于，所述常规辅料为淀粉、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇中任意一种或几种。

4.如权利要求2所述的一种APPA在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，其特征在于，所述常规口服固体药剂为片剂或胶囊剂。

5.一种应用APPA制备治疗糖尿病肾病口服胶囊的制备方法，所述APPA指化合物1-乙酰基-5-苯基-1H-吡咯-3-基乙酸酯，其结构式如下：

结构式中，Ac为乙酰基；

其特征在于，取200克通过80目筛的APPA与30克淀粉混合均匀，加入适量50％乙醇，搅拌，过18目筛，制成颗粒，60～70℃干燥，干粒经16目筛整粒，加入3.0克硬脂酸镁混匀后，制成1000粒，测定含量，按照颗粒含量计算灌装。

6.一种应用APPA制备治疗糖尿病肾病口服片剂的制备方法，所述APPA指化合物1-乙酰基-5-苯基-1H-吡咯-3-基乙酸酯，其结构式如下：

结构式中，Ac为乙酰基；

其特征在于，取200克通过80目筛的APPA与30克淀粉混合均匀，加入适量50％乙醇，搅拌，过18目筛，制成颗粒，60～70℃干燥，干粒经16目筛整粒，加入3.0克硬脂酸镁混匀后，制成1000粒，测定水分与含量，供压片用；按照颗粒含量计算片重，压片，检查合格后分装。