CN116139205A - 一种化橘红提取物及其提取方法和应用 - Google Patents
一种化橘红提取物及其提取方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116139205A CN116139205A CN202211102712.5A CN202211102712A CN116139205A CN 116139205 A CN116139205 A CN 116139205A CN 202211102712 A CN202211102712 A CN 202211102712A CN 116139205 A CN116139205 A CN 116139205A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ethyl acetate
- pummelo peel
- extract
- tumor
- petroleum ether
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 244000276331 Citrus maxima Species 0.000 title claims abstract description 90
- 235000001759 Citrus maxima Nutrition 0.000 title claims abstract description 87
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 42
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 89
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 57
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims abstract description 26
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 20
- LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.CCOC(C)=O LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;ethyl acetate Chemical compound CCOCC.CCOC(C)=O SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 38
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 23
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 16
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 12
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 11
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 abstract description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 100
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 23
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 21
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 17
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 13
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 9
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 7
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 6
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 6
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 6
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 5
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001606 7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 4
- 229930019673 naringin Natural products 0.000 description 4
- DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N naringin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC=2C=C3O[C@@H](CC(=O)C3=C(O)C=2)C=2C=CC(O)=CC=2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N 0.000 description 4
- 229940052490 naringin Drugs 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- SQSRYWNOKPJENY-UHFFFAOYSA-N (S)-Auraptenol Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C(CC(O)C(C)=C)C(OC)=CC=C21 SQSRYWNOKPJENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 2
- 101100452003 Caenorhabditis elegans ape-1 gene Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 235000019738 Limestone Nutrition 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001093501 Rutaceae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000006028 limestone Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 2
- 206010063659 Aversion Diseases 0.000 description 1
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- OBIOZWXPDBWYHB-UHFFFAOYSA-N Nobiletin Natural products C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(OC)C(=O)C2=C(OC)C(OC)=C(OC)C(OC)=C2O1 OBIOZWXPDBWYHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040007 Sense of oppression Diseases 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- RPMNUQRUHXIGHK-PYXJVEIZSA-N apigenin 7-O-neohesperidoside Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C=C(C=3C=CC(O)=CC=3)OC2=C1 RPMNUQRUHXIGHK-PYXJVEIZSA-N 0.000 description 1
- 229930034861 apigenin-7-O-neohesperidoside Natural products 0.000 description 1
- UMCTXEGQLBHWGF-SCZIOMTRSA-N auraptenol Natural products O(C/C=C(\CC/C=C(\CO)/C)/C)c1cc2OC(=O)C=Cc2cc1 UMCTXEGQLBHWGF-SCZIOMTRSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000007890 cytotoxin activity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000000540 fraction c Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000005918 in vitro anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- MRIAQLRQZPPODS-UHFFFAOYSA-N nobiletin Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(OC)C(OC)=C(OC)C(OC)=C2O1 MRIAQLRQZPPODS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 210000003504 pulmonary stretch receptor Anatomy 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- RPMNUQRUHXIGHK-SBDOOABHSA-N rhoifolin Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1Oc1cc(O)c2C(=O)C=C(c3ccc(O)cc3)Oc2c1)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 RPMNUQRUHXIGHK-SBDOOABHSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/75—Rutaceae (Rue family)
- A61K36/752—Citrus, e.g. lime, orange or lemon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
- A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
- A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
- A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种化橘红提取物的提取方法。所述提取方法包括如下步骤：取化橘红的乙醇‑乙酸乙酯提取液，萃取，萃取部位再依次采用不同配比的石油醚‑乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱分离，收集目标洗脱液组分，硅胶薄层色谱分离，获得化橘红提取物；其中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为(10～0)：(0～10)；目标洗脱液组分为石油醚和乙酸乙酯的体积比为(2.5～3)：1时的洗脱液组分。提取获得的化橘红提取物以酸橙素烯醇为有效活性成分，不仅对于肿瘤细胞具有细胞毒活性，能够有效地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力和横向迁移能力，还可减缓移植瘤的荷瘤生长、降低荷瘤体积以及荷瘤瘤重，起到了优异的抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于中药活性成分提取技术领域。更具体地，涉及一种化橘红提取物及其提取方法和应用。
背景技术
肺癌是全球发病率第二、致死率最高、预后差的肿瘤类型，全球肺癌新发病例的估计值为220.7万，死亡病例的估计值为179.6万，而非小细胞肺癌(Non-Small Cell LungCancer,NSCLC)是肺癌中临床最常见的一种组织学亚型。目前NSCLC的治疗方案有外科手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗及其组合疗法等，使NSCLC的管理进入个性化时代，但NSCLC的年新发病例仍在百万级别、五年相对生存率仅为26％，同时治疗成本高昂、药物毒性较大、易产生耐药性、耐受性，影响生活质量而使NSCLC患者总体生存获益不高，因此NSCLC成为危害人类健康和社会经济的公共卫生问题。研发高效低毒、不易产生耐药性的抗肺癌药物来干预肺癌进展仍然是当前国内外新药研究的一个热点与急迫需要。
据统计，获批上市的抗肿瘤药物中有63％来源于天然产物，中药及传统天然药物是抗肿瘤新药来源的一个宝库。中医药理论对肿瘤的认识中，肿瘤多为痰阻、气滞、血瘀、热毒等相互搏结而成，部分肺癌症状属于“痰证”范畴，肺癌的治疗可以选择从“痰”论治，中医药理论为源于中药的抗肿瘤新药研发提供了理论指导，缩小抗肿瘤中药的品种筛选范围。
化橘红(Exocarpium Citri grandis)归肺、脾经，具有理气宽中，燥湿化痰功效，主治咳嗽痰多，食积伤酒，呕恶痞闷等症状，临床上多应用于止咳化痰方面。中药资源方面，《广东省岭南中药材保护条例》将化橘红列为首个岭南八大中药材保护对象，加强了中药资源保护力度，化橘红按商品规格可分为毛橘红和光橘红，对应的基原植物分别为芸香科柑橘属化州柚Citrus grandis Tomentosa和柚C.grandis(L.)Osbeck，入药部位均为未成熟或近成熟的干燥外层果皮，其中化州柚为柚的变种之一，仅栽培种植于中国广东省化州市，由于两种植物属于变种与种的关系，毛橘红和光橘红的化学成分类似，但在临床应用上，毛橘红的止咳化痰功效优于光橘红，具有道地性特征。中国专利CN10730554A公开了一种化橘红提取物及其在制备治疗APEI介导的疾病的药物中的应用，化橘红提取物包括如下重量百分比的有效成分：川陈皮素20～30％；槲皮素10～20％；柚皮甙30～40％，所述化橘红提取物可抑制A549细胞系APE1蛋白表达并对A549细胞系产生细胞毒作用，具有作为APE1抑制剂使用的前景。但是现有的化橘红止咳化痰的功效物质基础为以柚皮苷为主要成分的黄酮类，且为多类提取物组合，其作用机制与抑制快速适应性肺部牵张感受器(RARs)放电等途径有关，目前化橘红黄酮类、化橘红柚皮苷分别被开发成中药五类新药、化学一类新药进入临床试验阶段，但是现有关于化橘红提取物可用于抗肿瘤的报道仍较少，且提取物内不同有效成分的含量不同，其抗肿瘤效果也具有较大差距。
发明内容
针对上述现有的技术问题，本发明的首要目的在于提供一种新的化橘红提取物的提取方法，通过优化所述提取方法，提取获得的化橘红提取物以酸橙素烯醇为有效活性成分，不仅对于肿瘤细胞具有细胞毒活性，能够有效地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力和横向迁移能力，还可减缓移植瘤的荷瘤生长、降低荷瘤体积以及荷瘤瘤重，起到了优异的抗肿瘤作用。
本发明的第二个目的在于提供一种上述提取方法提取获得的化橘红提取物。
本发明的第三个目的在于提供上述化橘红提取物或酸橙素烯醇在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种化橘红提取物的提取方法，包括如下步骤：取化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液，采用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后，得化橘红乙酸乙酯萃取部位；再将化橘红乙酸乙酯萃取部位依次采用不同配比的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱分离，收集目标洗脱液组分，再采用硅胶薄层色谱进行分离，获得所述化橘红提取物；所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为(10～0)：(0～10)；所述目标洗脱液组分为石油醚和乙酸乙酯的体积比为(2.5～3)：1时的洗脱液组分。
本发明通过采用不同配比的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱分离，梯度洗脱优选分离出了具有特定组分的目标洗脱液组分，即本发明中含有有效活性成分酸橙素烯醇的化橘红提取物，所述化橘红提取物的抗肿瘤药理评价研究结果表明，以酸橙素烯醇为主要成分的化橘红提取物具有抗肿瘤作用，为化橘红所有组分中细胞毒活性最强的组分。更具体而言，所述化橘红提取物对人非小细胞肺癌A549细胞系和/或H1299细胞系展现出了优异的抑制作用，对两类细胞具有优异的毒性，且能够有效地抑制两种细胞的克隆形成能力和横向迁移能力。此外，含有有效活性成分酸橙素烯醇的化橘红提取物还可减缓移植瘤的荷瘤生长、降低荷瘤体积以及荷瘤瘤重，为化橘红的抗肿瘤新用途、化痰中药治疗“痰证”范畴的肿瘤提供了实验依据。
优选地，所述化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液加入乙酸乙酯进行萃取的次数为5～8次。进一步优选地，所述化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液加入乙酸乙酯进行萃取的次数为7次。
优选地，所述目标洗脱液组分为石油醚和乙酸乙酯的体积比为3：1时的洗脱液组分。
优选地，依次采用石油醚和乙酸乙酯体积比为10：0，10：1，10：2，10：3，3：1，2：1，3：2，1：1，2：3，0：10的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱分离。
优选地，所述化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液为化橘红中加入乙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取获得；所述超声提取的次数≥4次，所述乙醇-乙酸乙酯混合溶液的总用量为化橘红干重的8～15倍。
进一步优选地，为了更充分地提取化橘红中的有效活性成分，在化橘红中依次加入化橘红干重4、2、2、2倍用量的乙醇-乙酸乙酯混合溶剂，超声提取4次。
优选地，所述超声提取的时间为30～60min。
优选地，所述乙醇-乙酸乙酯混合溶剂中，乙醇和乙酸乙酯体积比为1：(1～3)；进一步优选地，乙醇和乙酸乙酯体积比为1：1。
此外，本发明也可以采用化州柚(Citrus grandis Tomentosa)果实通过上述提取方法获得含有酸橙素烯醇的提取物。
进一步地，本发明还提供了上述提取方法提取获得的化橘红提取物。
优选地，按重量百分比计，所述化橘红提取物包含如下有效成分：65～75％的酸橙素烯醇。
进一步优选地，按重量百分比计，所述化橘红提取物包含如下有效成分：70～75％的酸橙素烯醇。
此外，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
上述化橘红提取物或酸橙素烯醇在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为肺癌。
优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
优选地，所述非小细胞肺癌为人非小细胞肺癌A549细胞系和/或人非小细胞肺癌H1299细胞系。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种化橘红提取物的提取方法，通过优化提取过程中的梯度洗脱步骤的工艺条件，分离出了具有优异抗肿瘤作用的以酸橙素烯醇为有效活性成分的化橘红提取物，且分离组分之间的化学成分重叠性低，提高了化橘红提取物中的有效成分含量。
(2)本发明提供一种以酸橙素烯醇为有效活性成分的新的化橘红提取物，不仅对于肿瘤细胞具有细胞毒活性，能够有效地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力和横向迁移能力，还可减缓移植瘤的荷瘤生长、降低荷瘤体积以及荷瘤瘤重，起到了优异的抗肿瘤作用。为化橘红的抗肿瘤新用途、化痰中药治疗“痰证”范畴的肿瘤提供了实验依据。
附图说明
图1为本发明实施例1中化橘红提取物提取的工艺流程图。
图2为实施例1中化橘红提取物和酸橙素烯醇的高效液相色谱图谱。
图3为实施例1中分离提取的酸橙素烯醇的高分辨质谱图。
图4为实施例1中分离提取的酸橙素烯醇的核磁共振氢谱图。
图5为实施例1中分离提取的酸橙素烯醇的核磁共振碳谱图。
图6为酸橙素烯醇的抗肿瘤活性试验；其中，图a为酸橙素烯醇作用于A549细胞系48h的IC50图，图b为酸橙素烯醇作用于H1299细胞系48h的IC50图。
图7为不同浓度给药组对A549和H1299细胞系毒活性测试；其中，a为不同浓度给药组对A549细胞增殖抑制作用，b为不同浓度给药组对H1299细胞增殖抑制作用。
图8为不同浓度给药组抑制A549和H1299细胞系克隆形成试验；其中，a为不同浓度给药组处理A549细胞和H1299细胞一周后的细胞数量变化；b和c分别为不同浓度给药组处理A549细胞和H1299细胞一周后的细胞数量变化柱状统计。
图9为不同浓度给药组对A549和H1299细胞划痕情况；其中，a为不同浓度给药组下，A549细胞和H1299细胞在0h和24h的愈合情况，b和c分别为不同浓度给药组下，A549细胞和H1299细胞在0h和24h的愈合率柱状统计。
图10为不同试验组裸鼠的皮下荷瘤图。
图11为不同试验组裸鼠的皮下荷瘤瘤重。
图12为不同试验组裸鼠的皮下荷瘤体积生长曲线。
图13为不同试验组裸鼠体重生长曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1化橘红提取物和酸橙素烯醇的分离制备
1、实验材料
化橘红(Exocarpium Citri grandis)采收自广东省化州市新安镇大合化橘红种植基地，基原为芸香科柑橘属化州柚Citrus grandis Tomentosa的幼果。
2、化橘红提取物的提取
本实施例中化橘红提取物的提取流程如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)化橘红超声提取：取化橘红药材，粉碎，依次加入4、2、2、2倍量的乙醇-乙酸乙酯(1:1，v/v)混合溶剂进行超声提取30min，过滤，共提取4次，合并4次的提取液，减压浓缩至浓稠状，得化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液，通过薄层色谱法监测每次提取的情况，254、365nm紫外检视下样品无法被乙酸乙酯展开则确定为提取终点。橘红提取液进行活性测试，作用48小时后，化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液对A549和H1299细胞系的IC50均大于500μg/mL。
活性测试的操作步骤为：通过MTT法检测细胞存活率，进行细胞毒活性测试，简要步骤为将3000cells/well的NSCLC细胞接种于96孔板中，孵育过夜后加入不同浓度的待测药物(提取物和萃取物给药浓度梯度为0～500μg/mL，分离组分给药浓度梯度为0～200μg/mL)作用48h，加入MTT工作液继续孵育4h后去除培养液，加入DMSO溶解甲瓒，通过酶标仪检测490nm的吸光值来表征细胞存活。
(2)化橘红乙酸乙酯萃取：取步骤(1)中化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液，加入纯水分散，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取7次，合并7次的乙酸乙酯层，稍微减压浓缩后进行水洗、乙酸乙酯反萃处理，减压浓缩除去溶剂，得化橘红乙酸乙酯萃取部位；通过薄层色谱法监测每次萃取的情况，254、365nm紫外检视下样品无法被乙酸乙酯展开则确定为萃取终点。
其中，在第1次萃取静置分层中，析出大量不溶于两相的黄白色固体，过滤，滤液继续萃取，收集滤渣，乙酸乙酯洗涤并干燥后得到化橘红不溶物萃取部位，通过高效液相色谱法比对标准品，鉴定主要成分为柚皮苷和野漆树苷。
萃取完成后，余下的水层减压浓缩除去溶剂，得化橘红水萃取部位。各萃取部位进行步骤(1)中的活性测试，作用48小时后，化橘红不溶物萃取部位、水萃取部位对A549和H1299细胞系的IC50均大于500μg/mL，化橘红乙酸乙酯萃取部位对A549和H1299细胞系的IC50分别为296.8，326.5μg/mL，选择化橘红乙酸乙酯萃取部位继续分离筛选。
(3)梯度洗脱分离：取步骤(2)中获得的化橘红乙酸乙酯萃取部位，干法装柱(200-300目硅胶)，湿法上样后，用石油醚-乙酸乙酯体系(石油醚和乙酸乙酯的体积比从10：0到0：10，v/v)进行梯度洗脱分离，具体而言，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂体积配比依次为10：0，10：1，10：2，10：3，3：1，2：1，3：2，1：1，2：3，0：10，通过薄层色谱法监测所在梯度洗脱的情况，254、365nm紫外检视下样品展开无斑点或斑点极浅则变换至下一梯度。洗脱液通过薄层色谱法监测，按极性大小将其合并为8份(分别为化橘红组分A-H)，具体为：收集石油醚-乙酸乙酯(体积比从10：0到10：3，v/v)的洗脱液，减压浓缩除去溶剂，得化橘红组分A；收集石油醚-乙酸乙酯(体积比为3：1，v/v)的洗脱液，减压浓缩除去溶剂，得化橘红组分B(即化橘红提取物)；收集石油醚-乙酸乙酯(体积比为2：1到3：2，v/v)的洗脱液，减压浓缩除去溶剂，得化橘红组分C；收集石油醚-乙酸乙酯(体积比为1：1，v/v)的洗脱液，减压浓缩除去溶剂，得化橘红组分D；收集石油醚-乙酸乙酯(体积比为2：3，v/v)的洗脱液，减压浓缩除去溶剂，得化橘红组分E；收集石油醚-乙酸乙酯(体积比为0：10，v/v)的洗脱液，根据薄层色谱行为合并为3份，分别减压浓缩除去溶剂，依次得化橘红组分F、G和H。对各化橘红组分A-H进行步骤(1)中的活性测试，作用48小时后，化橘红组分B对A549细胞系的IC50为77.00μg/mL，其余组分对A549细胞系的IC50均大于200μg/mL，化橘红组分B对H1299细胞系的IC50为78.61μg/mL，化橘红组分C、D、F对H1299细胞系的IC50分别为190.6，127.6，145.8μg/mL，其余组分对H1299细胞系的IC50均大于200μg/mL；选择化橘红组分B(即化橘红提取物)进行抗肿瘤药理评价及后续化学成分研究。
上述提取、萃取、分离过程，通过薄层色谱法监测提取、萃取、分离洗脱情况，确保药材提取完全，按极性大小分离的萃取部位之间、分离组分之间的化学成分重叠性低。
(4)对化橘红组分B的主要成分进行分离：将化橘红组分B通过硅胶薄层色谱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯(体积比为1：1,v/v)展开后，366nm紫外检识下，收集比移值Rf＝0.5的浅蓝色条带，通过乙酸乙酯浸泡将目标产物从硅胶中洗脱出来，过滤除去硅胶收集滤液，减压浓缩除去溶剂，得浅黄色粉末，对上述化橘红组分B和酸橙素烯醇进行高效液相色谱分析，如图2所示，酸橙素烯醇占化橘红组分B的72％。
通过薄层色谱法分析，化橘红提取物、乙酸乙酯萃取部位、化橘红组分B经乙酸乙酯展开后，在366紫外下均有蓝色荧光斑点，具有香豆素类化合物的理化性质；对化橘红组分B进行分离纯化，得两种单体化合物，两者的核磁共振氢谱中均有一组dd峰，耦合常数为9.4～9.5Hz，通过该典型信号特征鉴定两种单体化合物属于香豆素类化合物，含量占化橘红组分B的10％左右。
对上述浅黄色粉末进行质谱和核磁共振分析，并与文献(Barik B,Dey A,Das P,et al.Phytochemistry,1983,22,792.)对比，上述分离制备所得的浅黄色粉末易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，高分辨质谱图、核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图3、图4和图5所示，其具体数据如下：
高分辨质谱数据为：ESI-MS m/z:261.1119[M+H]+；分子式为C15H16O4。
核磁共振氢谱(400MHz)数据为：1H NMR(Chloroform-d,400MHz):δH 7.64(1H,d,J＝9.5Hz,H-4),7.35(1H,d,J＝8.6Hz,H-5),6.87(1H,d,J＝8.6Hz,H-6),6.25(1H,d,J＝9.5Hz,H-3),4.90(1H,s,H-4′a),4.81(1H,s,H-4′b),4.35(1H,dd,J＝8.2,4.7Hz,H-2′),3.94(3H,s,7-OMe),3.20(1H,dd,J＝13.5,4.6Hz,H-1′a),3.10(1H,dd,J＝13.5,8.5Hz,H-1′b),1.89(3H,s,5′-Me)。
核磁共振碳谱(100MHz)数据为：13C NMR(Chloroform-d,100MHz):δC161.15(C-2),160.66(C-7),153.49(C-8a),147.19(C-3′),143.85(C-4),127.04(C-5),115.05(C-8),113.13(C-4a),113.04(C-3),110.55(C-4′),107.36(C-6),75.28(C-2′),56.19(7-OMe),29.42(C-1′),18.09(C-5′)。
以上数据与文献报道的一致，故鉴定为酸橙素烯醇(Auraptenol,CAS:1221-43-8)。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：步骤(1)中超声提取的次数为6次，依次加入4、2、2、2、2、2倍量的乙醇-乙酸乙酯混合溶剂进行超声提取。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：步骤(1)中超声提取的次数为4次，依次加入4、2、1、1倍量的乙醇-乙酸乙酯混合溶剂进行超声提取。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取5次，合并5次的乙酸乙酯层。
实验例
(1)酸橙素烯醇的抗肿瘤活性试验
人非小细胞肺癌A549和H1299细胞系按常规方法培养至对数生长期，通过PBS清洗、胰酶消化、离心收集所需细胞，加入完全培养基重悬后进行血球计数板细胞计数，调整细胞密度至5.0×104cells/mL，按100μL/well，即5.0×103cells/well将细胞接种于96孔板中。细胞种板过夜确保细胞贴壁后，于超净工作台中将上述配置成的药物母液加入完全培养基中，通过连续稀释配成系列浓度的含药培养基，最高浓度的含药培养基按体积分数计算不高于1‰的DMSO，含药培养基现配现用，然后弃96孔板中完全培养基，各浓度给药组(50，75，100，150，200μg/mL)每孔加入100μL相应的含药培养基，阴性对照组(0μg/mL)每孔加入100μL的完全培养基，放入培养箱中继续培养48h。
药物作用48h后，超净工作台中避光加入10μL/well的5mg/mL MTT工作液，置培养箱中孵育4h，弃96孔板中的溶液，加入150μL/well的DMSO，水平摇床振摇10min确保甲瓒结晶完全溶解，于酶标仪中震荡30s后测试490nm下的吸光值。对阴性对照组的吸光值归一化处理后，计算各组的细胞存活率。
如图6所示，图a、图b分别为酸橙素烯醇作用于A549和H1299细胞系48h的IC50图，从图中可以看出，随着酸橙素烯醇浓度的不断增高，A549和H1299的细胞活力不断下降，说明酸橙素烯醇对于A549和H1299细胞系的细胞活力具有抑制作用。
因酸橙素烯醇对于A549和H1299细胞系的抑制IC50低于化橘红组分B(化橘红提取物)，因此，下面采用实施例1中的化橘红提取物进行体内外抗肿瘤作用评价试验。具体为实施例1中的化橘红提取物加入DMSO配成200mg/mL的药物母液供细胞生物学实验使用，以DMSO/Corn Oil(1：9，v/v)作为药物溶媒配成50mg/mL和100mg/mL的化橘红组分溶液供皮下荷瘤试验使用。
(2)化橘红提取物的细胞毒活性测试
人非小细胞肺癌A549和H1299细胞系按常规方法培养至对数生长期，通过PBS清洗、胰酶消化、离心收集所需细胞，加入完全培养基重悬后进行血球计数板细胞计数，调整细胞密度至5.0×104cells/mL，按100μL/well，即5.0×103cells/well将细胞接种于96孔板中。细胞种板过夜确保细胞贴壁后，于超净工作台中将上述配置成的药物母液加入完全培养基中，通过连续稀释配成系列浓度的含药培养基，最高浓度的含药培养基按体积分数计算不高于1‰的DMSO，含药培养基现配现用，然后弃96孔板中完全培养基，各浓度给药组(75，100，125，150，180，200μg/mL)每孔加入100μL相应的含药培养基，阴性对照组(0μg/mL)每孔加入100μL的完全培养基，放入培养箱中继续培养48h。
药物作用48h后，超净工作台中避光加入10μL/well的5mg/mL MTT工作液，置培养箱中孵育4h，弃96孔板中的溶液，加入150μL/well的DMSO，水平摇床振摇10min确保甲瓒结晶完全溶解，于酶标仪中震荡30s后测试490nm下的吸光值。对阴性对照组的吸光值归一化处理后，计算各组的细胞存活率。
如图7所示，其中图a为不同浓度给药组(75～200μg/mL)梯度处理A549细胞48h后对A549细胞系细胞增殖抑制作用。其中，最低浓度给药组(75μg/mL)与阴性对照组(0μg/mL)对比具有极其显著统计学差异(P<0.001)。图b为不同浓度给药组(75～200μg/mL)梯度处理H1299细胞48h后对H1299细胞系细胞增殖抑制作用，其中，最低浓度给药组(75μg/mL)与阴性对照组(0μg/mL)对比具有极其显著统计学差异(P<0.001)。
(3)化橘红提取物抑制细胞克隆形成实验
人非小细胞肺癌A549和H1299细胞系按常规方法培养至对数生长期，通过PBS清洗、胰酶消化、离心收集所需细胞，调整细胞密度至500cells/mL，以2000μL/well，即1000cells/well将细胞接种于6孔板中。细胞种板过夜确保细胞贴壁后，于超净工作台中将上述配置成的药物母液加入完全培养基中，通过连续稀释配成系列浓度的含药培养基，含药培养基现配现用，各浓度给药组(25，50，75μg/mL)每孔加入2000μL相应的含药培养基，阴性对照组(0μg/mL)每孔加入2000μL的完全培养基，放入培养箱中继续培养约一周。当阴性对照组的细胞克隆数量呈现肉眼可见明显增加时即可终止培养，弃培养基，PBS清洗3次，加入1000μL/well的4％多聚甲醛固定液，孵育10min，加入1000μL/well的0.1％结晶紫染色液，染色15min，回收染色液，以水冲洗干净，拍照后计算各组的细胞克隆数量。
如图8所示，其中，图a为不同浓度给药组处理A549细胞和H1299细胞一周后的细胞数量变化，图b和图c分别为不同浓度给药组处理A549细胞和H1299细胞一周后的细胞数量变化柱状统计。可见，处理A549细胞约一周后，各浓度梯度(25，50，75μg/mL)对A549细胞系产生克隆形成抑制作用，50μg/mL处理组、75μg/mL处理组与阴性对照组(0μg/mL)对比具有极其显著统计学差异(P<0.001,P<0.001)。处理H1299细胞约一周后各浓度梯度(25，50，75μg/mL)对H1299细胞系产生克隆形成抑制作用，50μg/mL处理组、75μg/mL处理组与阴性对照组(0μg/mL)对比具有显著统计学差异(P<0.01,P<0.01)。
(4)化橘红提取物的划痕愈合实验
人非小细胞肺癌A549和H1299细胞系按常规方法培养至对数生长期，通过PBS清洗、胰酶消化、离心收集所需细胞，调整细胞密度至1.5×105cells/mL，以2000μL/well，即3×105cells/well将细胞接种于6孔板中。细胞种板后在培养箱中孵育至形成单层细胞，于超净工作台中将上述配置成的药物母液加入无血清的完全培养基中，通过连续稀释配成系列浓度的含药培养基，含药培养基现配现用；随后用10μL枪头在单层细胞上划出笔直的划痕，PBS清洗脱落的细胞，弃PBS，各浓度给药组(25，50，75μg/mL)每孔加入2000μL相应的含药培养基，阴性对照组(0μg/mL)每孔加入2000μL/well无血清的完全培养基，放入培养箱中继续培养24h。显微镜下观察并拍照记录0h和24h的细胞划痕情况，通过Image J软件计算图片中的划痕面积，并计算划痕愈合率。
如图9所示，其中，图a为不同浓度给药组下，A549细胞和H1299细胞在显微镜下0h和24h的愈合情况，图b和图c为不同浓度给药组下，A549细胞和H1299细胞在0h和24h的愈合率统计柱状图。如图9b和图9c所示，处理A549细胞24h后，各浓度给药组(25，50，75μg/mL)对A549细胞产生的横向迁移具有抑制作用，50μg/mL处理组、75μg/mL处理组与阴性对照组(0μg/mL)对比具有极其显著统计学差异(P<0.001,P<0.001)。处理H1299细胞约一周后，各浓度梯度(25，50，75μg/mL)对H1299细胞系产生的横向迁移具有抑制作用，50μg/mL处理组、75μg/mL处理组与阴性对照组(0μg/mL)对比具有极其显著统计学差异(P<0.001,P<0.001)。
(5)化橘红提取物的皮下荷瘤试验
人非小细胞肺癌A549细胞系按常规方法培养至对数生长期，通过PBS清洗、胰酶消化、离心收集所需细胞，用预冷的PBS重悬细胞，调整细胞悬液密度为1.0×108cells/mL，加入等体积基质胶调整细胞悬液密度至5.0×107cells/mL。BALB/c nude裸鼠经过适应性饲养后，将上述细胞悬液接种于经过一周适应性饲养的BALB/c nude裸鼠腋窝中后部的皮下，每只接种100μL细胞悬液，即每只5.0×106cells。接种后，每天测量皮下荷瘤的长径、短径，按公式[(长径×短径2)×0.5]计算皮下荷瘤体积，待裸鼠皮下荷瘤体积生长至100mm3时开始分组进行药物干预。将荷瘤裸鼠分为4组，每组6只：阴性对照组(Vehicle Group，0.05mL/10g/day)给予等量的药物溶媒灌胃给药，化橘红组分低剂量组(Fr.B-LD Group，250mg/kg/day)、化橘红组分高剂量组(Fr.B-HD Group，500mg/kg/day)分别给予50mg/mL、100mg/mL的化橘红组分溶液灌胃给药，阳性对照组(CDDP Group，2mg/kg/3days)给予0.4mg/mL的顺铂生理盐水溶液腹腔注射给药。药物干预期间，测量裸鼠体重、皮下荷瘤的长径和短径、每周的摄食饮水量，绘制体重生长曲线、皮下荷瘤体积生长曲线；试验终点时，将裸鼠进行安乐死，取皮下荷瘤并称重，拍照记录。
如图10所示，试验终点时，解剖取出皮下荷瘤后多呈椭圆状，有完整被膜包裹，质坚韧，未见肿瘤浸润。皮下荷瘤瘤重结果如图11所示，化橘红组分低剂量组、化橘红组分高剂量组、阳性对照组均能降低皮下瘤瘤重，对皮下荷瘤的生长产生抑制作用，与阴性对照组(2.1098±0.0715g)比较，化橘红组分高剂量组(1.1592±0.0800g)、阳性对照组(0.8717±0.0955g)具有极其显著统计学差异(P<0.001,P<0.001)。且化橘红组分降低皮下荷瘤瘤重呈剂量依赖性。
通过计算试验终点时的平均肿瘤负担(瘤重/体重，％)可得阴性对照组、化橘红组分低剂量组、化橘红组分高剂量组、阳性对照组的平均肿瘤负担依次为8.9002％、7.9149％、5.8321％、3.7314％，说明化橘红组分降低平均肿瘤负担呈剂量依赖性。
皮下荷瘤体积生长曲线如图12所示，化橘红组分、顺铂均能降低皮下荷瘤体积，减缓皮下荷瘤的体积增长速度，对皮下荷瘤的生长产生抑制作用，药物干预第17天时，与阴性对照组(2539.8433±178.0549mm3)比较，化橘红组分低剂量组(Fr.B-LD Group)(1633.7302±148.0168mm3)、化橘红组分高剂量组(Fr.B-HD Group)(1264.8382±70.3657mm3)、阳性对照组(CDDP Group)(835.6652±62.4282mm3)具有极其显著统计学差异(P<0.001,P<0.001,P<0.001)，化橘红组分降低皮下荷瘤体积呈剂量依赖性。通过计算药物干预第17天时各组的相对肿瘤增殖率(T/C，％)可得化橘红组分低剂量组、化橘红组分高剂量组、阳性对照组的T/C分别为63.8516％、47.0814％、32.0942％，说明化橘红组分干预相对肿瘤增殖率呈剂量依赖性。
裸鼠体重生长曲线如图13所示，阴性对照组(23.9333±0.8842g)比较，化橘红组分低剂量组(Fr.B-LD Group)(21.2333±0.9608g)、化橘红组分高剂量组(Fr.B-HD Group)(20.6833±1.3580g)、阳性对照组(CDDP Group)(23.5000±0.8610g)不具有统计学差异(P>0.05,P>0.05,P>0.05)，说明化橘红组分在药物干预期间对裸鼠体重影响不大。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种化橘红提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：取化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液，采用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后，得化橘红乙酸乙酯萃取部位；再将化橘红乙酸乙酯萃取部位依次采用不同配比的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱分离，收集目标洗脱液组分，再采用硅胶薄层色谱进行分离，获得所述化橘红提取物；
所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为(10～0)：(0～10)；所述目标洗脱液组分为石油醚和乙酸乙酯的体积比为(2.5～3)：1时的洗脱液组分。
2.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，所述目标洗脱液组分为石油醚和乙酸乙酯的体积比为3：1时的洗脱液组分。
3.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，所述化橘红的乙醇-乙酸乙酯提取液为化橘红中加入乙醇-乙酸乙酯混合溶液，经超声提取获得；所述超声提取的次数≥4次，所述乙醇-乙酸乙酯混合溶液的总用量为化橘红干重的8～15倍。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，依次采用石油醚和乙酸乙酯体积比为10：0，10：1，10：2，10：3，3：1，2：1，3：2，1：1，2：3，0：10的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱分离。
5.权利要求1～4任一所述提取方法提取获得的化橘红提取物。
6.根据权利要求5所述化橘红提取物，其特征在于，按重量百分比计，包含如下有效成分：65～75％的酸橙素烯醇。
7.权利要求5所述化橘红提取物或权利要求6中所述酸橙素烯醇在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌为人非小细胞肺癌A549细胞系和/或人非小细胞肺癌H1299细胞系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211102712.5A CN116139205B (zh) | 2022-09-09 | 一种化橘红提取物及其提取方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211102712.5A CN116139205B (zh) | 2022-09-09 | 一种化橘红提取物及其提取方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116139205A true CN116139205A (zh) | 2023-05-23 |
| CN116139205B CN116139205B (zh) | 2024-07-12 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116998559A (zh) * | 2023-08-11 | 2023-11-07 | 广东科贸职业学院 | 一种具有止咳化痰作用的橘红金花茶及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101124986A (zh) * | 2007-09-13 | 2008-02-20 | 林仁和 | 化橘红纯的制备方法及其用途 |
| CN107320554A (zh) * | 2017-08-02 | 2017-11-07 | 广东医科大学附属医院 | 一种化橘红提取物及其在制备治疗ape1介导的疾病的药物中的应用 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101124986A (zh) * | 2007-09-13 | 2008-02-20 | 林仁和 | 化橘红纯的制备方法及其用途 |
| CN107320554A (zh) * | 2017-08-02 | 2017-11-07 | 广东医科大学附属医院 | 一种化橘红提取物及其在制备治疗ape1介导的疾病的药物中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 赵雪梅;叶兴乾;朱大元;: "柑桔属植物中香豆素类化合物研究进展", 天然产物研究与开发, vol. 19, no. 04, pages 718 - 723 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116998559A (zh) * | 2023-08-11 | 2023-11-07 | 广东科贸职业学院 | 一种具有止咳化痰作用的橘红金花茶及其制备方法 |
| CN116998559B (zh) * | 2023-08-11 | 2024-05-07 | 广东科贸职业学院 | 一种具有止咳化痰作用的橘红金花茶及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sartippour et al. | Rabdosia rubescens inhibits breast cancer growth and angiogenesis | |
| CN107213145B (zh) | 细锥香茶菜乙素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用 | |
| CN111499649B (zh) | 一种具有抗肿瘤活性的苯并二呋喃酮类化合物、制备方法及其用途 | |
| CN109875998B (zh) | 酰胺类生物碱在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用及抗肿瘤药物组合物 | |
| CN116139205B (zh) | 一种化橘红提取物及其提取方法和应用 | |
| CN103191143B (zh) | 一种强心苷化合物的用途 | |
| CN116139205A (zh) | 一种化橘红提取物及其提取方法和应用 | |
| CN103230388B (zh) | 鄂西香茶菜素作为Wnt信号通路抑制剂及抗癌药物的应用 | |
| CN115590914A (zh) | 一种红大戟提取物及其在制备抗乳腺癌药物中的应用 | |
| CN111358804B (zh) | Cynanoside H在制备防治乳腺癌的药物中的应用 | |
| CN110776542A (zh) | 一种从金花茶提取的化合物及其制备抗肿瘤药物应用 | |
| CN114129558B (zh) | 倍半萜内酯类化合物在制备化疗药物抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂中的应用 | |
| CN111150752A (zh) | 鸡骨草提取物在制备抗癌药物中的应用 | |
| CN111494397B (zh) | 麦冬皂苷类化合物在制备预防和治疗肿瘤的药物中的用途 | |
| Zhang et al. | Cannabisin G from Sinomenium acutum induces apoptosis in human glioblastoma cells | |
| Xiong et al. | Isolation and identification of active components from Grifola frondosa and its anti‐EV71 virus effect | |
| CN113831274B (zh) | 一种从香菇中提取的双环吡咯醛类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN111228384B (zh) | 治疗食管癌的组合物及其应用 | |
| CN114432310B (zh) | 异莲心碱在制备治疗白血病药物中的应用 | |
| CN114315850B (zh) | 菊芋倍半萜内酯及其药用衍生物与在抗急性髓性白血病中的应用 | |
| CN112439042B (zh) | 具有抑制肿瘤细胞活性和耐药性的中药组合物及其制备方法和应用 | |
| CN113425725B (zh) | 盖裂果及其提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用 | |
| CN112516134B (zh) | 一种含羟基的化合物在制备药物中的应用 | |
| CN109867644B (zh) | 一种苯醌类化合物及其制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN113398155A (zh) | 一种含有苦木内酯类成分的鸦胆子药渣有效部位的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |