CN115590914A - 一种红大戟提取物及其在制备抗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红大戟提取物及其在制备抗乳腺癌药物中的应用。所述红大戟提取物的制备方法是将红大戟的干燥块根粉碎后以75%的乙醇进行回流提取,将提取液过滤浓缩干燥得到的浸膏溶解于水中,用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2‑3次,分别收集石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位,最后将各萃取部位分别减压浓缩、冷冻干燥得到红大戟提取物。所述红大戟提取物的应用为在制备抗乳腺癌药物中的应用。本发明获得了4个具有抗肿瘤细胞活性、低细胞毒性的红大戟提取物,其中水萃取部位提取物具有良好的抗乳腺癌MCF‑7活性,可以作为抗乳腺癌的潜在药物,为预防、保健和治疗乳腺癌药物的研发以及临床应用提供新的思路。
Description
技术领域
本发明属于中药提取技术领域,具体涉及一种红大戟提取物及其在制备抗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是威胁全球女性健康的第一大肿瘤杀手,其发生与雌激素水平密切相关,现代女性因不良生活习惯和高压社会环境导致肥胖、月经不调等严重影响体内正常的雌激素水平,致使乳腺癌患病率逐年递增且有年轻化的趋势。迄今为止手术协同化疗药物仍是贯穿乳腺癌治疗的主要手段,但化疗药物具有较强毒副作用和耐药性等严重影响了患者的生存质量和临床疗效。近年来,随着中医药在乳腺癌方面研究的深入,中药在提高患者生活质量、减轻放化疗的不良反应、预防复发及转移等方面逐渐显现优势与特色,已然成为乳腺癌有效的辅助疗法之一。并且所有已知的抗癌药物中,有一半以上来自草药。随着生物医学技术的发展,中药治疗乳腺癌的临床诊疗及基础研究取得一定进展,中药抗乳腺癌的生物学机制研究也有突破。因此,探究中药抗乳腺癌的作用机制成为研究热点。
红大戟 (Knoxia roxburghii (Spreng.) M. A. Rau )为茜草科植物,在近年来中医临床研究发现对痈疽、腹泻、腹水以及慢性咽炎和精神分裂症有疗效。现代药理研究发现它还可能被用于抑制金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌和绿脓杆菌。而关于红大戟在抗乳腺癌方面的研究,尚未见国内外有报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种红大戟提取物,本发明的第二目的是提供所述红大戟提取物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的,一种红大戟提取物,其制备方法如下:
1)将红大戟的干燥块根粉碎成65-80目的药粉;
2)往所述药粉中加入70-90%的乙醇,于70-90℃下回流提取,得到提取液;
3)将提取液过滤浓缩干燥,得到浸膏;
4)将浸膏溶解于水中,用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2-3次,分别收集石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位;
5)将石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位分别减压浓缩去除有机溶剂后冷冻干燥得到红大戟提取物A、B、C和D。
本发明的第二目的是这样实现的,红大戟提取物在制备抗乳腺癌药物中的应用,所述红大戟提取物为红大戟提取物D。
本发明的有益效果为:
本发明获得了4个具有抗肿瘤细胞活性、低细胞毒性的红大戟活性部位提取物,其中水萃取部位提取物具有良好的抗乳腺癌MCF-7活性,可以作为一种抗乳腺癌的潜在药物。另外,本发明还通过试验发现水萃取部位提取物的作用机制是通过线粒体介导的途径和下调乳腺癌细胞PI3K/AKT信号通路从而使MCF-7细胞凋亡的,这对了解乳腺癌的发病机制,制定新策略有重要的意义,也为乳腺癌提供一个潜在的治疗方法,为预防、保健和治疗乳腺癌药物的研发以及临床应用提供新的思路。
附图说明
图1为实施例1制备的不同萃取部位提取物对A549、HepG2、MCF-7和L02细胞的细胞活力影响;其中,A为不同萃取部位提取物对A549细胞活力的影响;B为不同萃取部位提取物对HepG2细胞活力的影响;C为不同萃取部位对MCF-7细胞活力的影响;E为不同萃取部位对L02细胞活力的影响(注:与对照组相比,“*”p < 0.05,“**”表示p < 0.01,“***”表示p <0.001);
图2为试验例2中MCF-7细胞凋亡染色图,Hoechst 33258染色显示了核形态的变化(放大倍数,X10);
图3为试验例2中红大戟水萃取部位提取物对MCF-7细胞凋亡的影响;其中,A为流式细胞仪分析细胞凋亡情况;B为细胞凋亡率(注:与对照组相比,“*”p < 0.05,“**”表示p< 0.01,“***”表示p < 0.001);
图4为试验例2中红大戟水萃取部位提取物对MCF-7细胞线粒体膜电位水平的影响(放大倍数,X10);
图5为试验例2中红大戟水萃取部位提取物对MCF-7细胞活性氧水平的影响;其中,A为流式细胞仪分析细胞活性氧水平;B为活性氧水平(注:与对照组相比,“*”表示p <0.05,“**”表示p < 0.01,“***”表示p < 0.001);
图6为试验例2中用红大戟水萃取部位提取物处理MCF-7细胞后的凋亡蛋白标志物;其中,A为显示PI3K,AKT,p53,Caspase 9和Cytochrome C表达的免疫印迹;B为条带的密度测量,以任意密度单位表示PI3K、AKT、p53、Caspase 9和CytochromeC的表达是通过蛋白印迹分析确定的,β-actin被用作对照(注:与对照组相比,“*”表示p < 0.05,“**”表示p <0.01,“***”表示p < 0.001)。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换或改进,均落入本发明的保护范围。
本发明提供了一种红大戟提取物,所述红大戟提取物的制备方法如下:
1)将红大戟的干燥块根粉碎成65-80目的药粉;
2)往所述药粉中加入70-90%的乙醇,于70-90℃下回流提取,得到提取液;
3)将提取液过滤浓缩干燥,得到浸膏;
4)将浸膏溶解于水中,用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2-3次,分别收集石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位;
5)将石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位分别减压浓缩去除有机溶剂后冷冻干燥得到红大戟提取物A、B、C和D。
步骤2中所述药粉和乙醇的质量体积比为1:8-10 g/L。
步骤2中,药粉在乙醇中浸泡1-2 h后进行回流提取,回流提取次数为2-3次,回流提取时间为2-3h。
本发明进一步提供了所述红大戟提取物作为活性成分在制备抗肿瘤细胞药物中的应用。
所述肿瘤细胞为A549、HepG2或MCF-7。
本发明进一步提供了所述红大戟提取物在制备抗乳腺癌药物中的应用,所述红大戟提取物为红大戟提取物D。
所述抗乳腺癌药物还含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂
实施例1
本实施例中红大戟来自中国云南省楚雄州楚雄市东华镇。
将红大戟干燥的根 (1000 g )打成70目的细粉,用10 L 75%的乙醇先浸泡1 h,之后于80℃下进行2 h回流提取。收集滤液,再加10 L 75%的乙醇再进行2h回流提取,将两次回流提取液进行合并。使用旋转蒸发器和真空泵,将混合滤液减压浓缩得到浸膏。将浸膏(100 g)分散于水中,然后用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇连续萃取,得到石油醚部位(2.32 g)、乙酸乙酯(9.86 g)、正丁醇(7.76 g)和最后的剩余物,即水萃取部位(50.25 g)。将各萃取部位分别浓缩去除有机溶剂后冻干得到红大戟提取物A(石油醚萃取部位提取物)、红大戟提取物B(乙酸乙酯萃取部位提取物)、红大戟提取物C(正丁醇萃取部位提取物)和红大戟提取物D(水萃取部位提取物)。
实施例2
将红大戟干燥的根 (1000 g )打成80目的细粉,用8 L 75%的乙醇先浸泡1.5h,之后于90℃下进行2.5 h回流提取。收集滤液,再加8 L 75%的乙醇再进行2.5h回流提取,将两次回流提取液进行合并。使用旋转蒸发器和真空泵,将混合滤液减压浓缩得到浸膏。将浸膏分散于水中,然后用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇连续萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯、正丁醇和最后的剩余物,即水萃取部位。将各萃取部位分别浓缩去除有机溶剂后冻干得到红大戟提取物A(石油醚萃取部位提取物)、红大戟提取物B(乙酸乙酯萃取部位提取物)、红大戟提取物C(正丁醇萃取部位提取物)和红大戟提取物D(水萃取部位提取物)。
实施例3
将红大戟干燥的根 (1000 g )打成65目的细粉,用9 L 75%的乙醇先浸泡2h,之后于70℃下进行3 h回流提取,共进行2次。收集滤液,将2次回流提取液进行合并。使用旋转蒸发器和真空泵,将混合滤液减压浓缩得到浸膏。将浸膏分散于水中,然后用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇连续萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯、正丁醇和最后的剩余物,即水萃取部位。将各萃取部位分别浓缩去除有机溶剂后冻干得到红大戟提取物A(石油醚萃取部位提取物)、红大戟提取物B(乙酸乙酯萃取部位提取物)、红大戟提取物C(正丁醇萃取部位提取物)和红大戟提取物D(水萃取部位提取物)。
实施例4
将红大戟干燥的根 (1000 g )打成75目的细粉,用10 L 85%的乙醇先浸泡1h,之后于70℃下进行2.5 h回流提取。收集滤液,再加9 L 85%的乙醇再进行2.5h回流提取,将两次回流提取液进行合并。使用旋转蒸发器和真空泵,将混合滤液减压浓缩得到浸膏。将浸膏分散于水中,然后用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇连续萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯、正丁醇和最后的剩余物,即水萃取部位。将各萃取部位分别浓缩去除有机溶剂后冻干得到红大戟提取物A(石油醚萃取部位提取物)、红大戟提取物B(乙酸乙酯萃取部位提取物)、红大戟提取物C(正丁醇萃取部位提取物)和红大戟提取物D(水萃取部位提取物)。
实施例5
将红大戟干燥的根 (1000 g )打成80目的细粉,用8 L 90%的乙醇先浸泡1h,之后于70℃下进行2 h回流提取。收集滤液,再加9 L 90%的乙醇再进行2h回流提取,将两次回流提取液进行合并。使用旋转蒸发器和真空泵,将混合滤液减压浓缩得到浸膏。将浸膏分散于水中,然后用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇连续萃取,得到石油醚部位、乙酸乙酯、正丁醇和最后的剩余物,即水萃取部位。将各萃取部位分别浓缩去除有机溶剂后冻干得到红大戟提取物A(石油醚萃取部位提取物)、红大戟提取物B(乙酸乙酯萃取部位提取物)、红大戟提取物C(正丁醇萃取部位提取物)和红大戟提取物D(水萃取部位提取物)。
试验例1 细胞毒性检测
方法:采用CCK-8法检测实施例1得到的红大戟不同萃取部位提取物对人体三种恶性肿瘤细胞A549(非小细胞肺癌细胞)、HepG2 (肝癌细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞)和L02细胞(人体正常肝细胞)的毒性。
将实施例1制备的石油醚萃取部位提取物、乙酸乙酯萃取部位提取物、正丁醇萃取部位提取物和水萃取部位提取物分别溶解在二甲亚砜(DMSO)中,用培养基分别配置10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL的药物浓度。用0.22 μm的消毒过滤器对药物溶液进行处理,以获得具有适当浓度的药物溶液(以避免DMSO相关的细胞毒性)。将A549、HepG2、MCF-7和L02细胞系(1×104个细胞/孔)均在96孔板中进行培养。24 h后去除培养基,用无菌PBS清洗细胞。在37℃下,用0、10、20、60、80和160 μg/mL的不同红大戟萃取组分(油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水)处理细胞24 h。使用顺铂注射液和DMSO(浓度小于0.2%)作为阳性和阴性对照。移除混合物后,孵化2 h,用100 μL无菌PBS清洗细胞两次。接着,每个孔中加入100 μL含有10% CCK-8的培养液,在37℃下培养2 h。测量450 nm下的吸光值。并计算细胞活力,同时以求得半数抑制浓度(IC50)。细胞存活率(%)=(OD450实验组/OD450对照组)×100%。
实验结果:由图1可知,红大戟不同萃取部位提取物对于本实验所选用的几种肿瘤细胞均有明显的生长抑制效果。比较表1中红大戟不同萃取部提取物位对肿瘤细胞的IC50,可知红大戟水萃取部位提取物对于乳腺癌细胞的毒性最大,而对于实验中的正常细胞L02则没有表现出毒性,证明其具有良好的肿瘤细胞选择性和相对的安全性。
表1 不同萃取部位处理的不同细胞的IC50值的分析
试验例2 水萃取部位提取物抗MCF-7活性检测
1、水萃取部位提取物对MCF-7细胞核形态的影响
试验方法:用Hoechst 33258进行细胞核染色,观察水萃取部位提取物对MCF-7细胞核形态观察,以确定细胞死亡是否由水萃取部位提取物诱导。
在6孔板中,每孔种2×105个MCF-7细胞。24 h后去除培养基,用无菌PBS清洗细胞。在37℃下,分别用浓度为0、10、20、60和80 μg/mL的水萃取部位提取物处理细胞24 h,使用顺铂注射液和DMSO(浓度小于0.2%)作为阳性和阴性对照。使用Hoechst 33342溶液对细胞核进行染色,荧光显微镜检查细胞核的形态变化。正常细胞的细胞核是蓝色的,而凋亡细胞的细胞核处于致密和高色素状态,或类似片段的致密和高色素状态,并呈现出白色的颜色。
结果:由图2可知,实验组和对照组在荧光显微镜分析中有所不同,对照组的细胞核为蓝色。随着水萃取部位提取物浓度的增加,MCF-7细胞的细胞核发生了典型的形态学变化,如细胞核凝缩和碎片化。
2、水萃取部位提取物对MCF-7细胞凋亡程度的影响
试验方法:采用Annexin-V-FITC 凋亡检测试剂盒检测水萃取部位诱发MCF-7细胞的凋亡程度。在6孔板中,每孔种2×105个MCF-7细胞。24 h后去除培养基,用无菌PBS清洗细胞。在37℃下,分别用浓度为0、10、20、60和80 μg/mL的水萃取部位提取物处理细胞24 h,使用顺铂注射液和DMSO (浓度小于0.2% )作为阳性和阴性对照。用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞并离心收集细胞,预冷的PBS洗三次后加入结合缓冲液。使用BD FACSAriaTM III流式细胞仪检测FITC标记的Annexin-V和PI的细胞。使用FlowJo V10软件进行分析。
结果:用水萃取部位提取物处理后,MCF-7细胞用Annexin V-FITC/PI染色以确定细胞凋亡的模式。从图3可知。与对照组相比,水萃取部位提取物处理后,早期 (Annexin-V阳性和PI阴性)和晚期凋亡(Annexin-V阳性和PI阳性)的细胞比例明显增加,活细胞的数量(Annexin-V阴性和PI阴性)明显减少。总的来说,发现早期和晚期凋亡细胞的百分比随着剂量的增加而增加。说明水萃取部位萃取物有效地诱导了MCF-7细胞的凋亡。
3、水萃取部位提取物对MCF-7细胞线粒体膜电位的影响
线粒体膜电位是维持线粒体正常形态和功能的重要指标之一。线粒体膜电位水平的下降表明线粒体功能紊乱,被证明是早期细胞凋亡的一个重要指标。
试验方法:采用倒置荧光镜检测水萃取部位提取物对MCF-7细胞线粒体膜电位的影响。使用Rh123试剂盒检测线粒体膜电位水平的改变。在6孔板中,每孔种2×105个MCF-7细胞。24 h后去除培养基,用无菌PBS清洗细胞。在37℃下,分别用浓度为0、10、20、60和80 μg/mL水萃取部位提取物处理细胞24 h。使用顺铂注射液和DMSO (浓度小于0.2% )作为阳性和阴性对照。第二天,从培养皿中取出上清液,在37°C的5%二氧化碳培养箱中用Rh123染色液处理细胞30分钟。此后用PBS清洗细胞三次,通过倒置荧光显微镜对细胞进行拍照。
结果:从图4可知,在MCF-7细胞中加入不同浓度的水萃取部位提取物后,荧光强度可视化地逐渐降低,说明水萃取部位提取物可以降低MCF-7细胞的线粒体膜电位水平,使其线粒体膜去极化。
4、水萃取部位提取物对MCF-7细胞活性氧的影响
试验方法:采用流式细胞术检测水萃取部位提取物对MCF-7细胞活性氧的影响。
肿瘤的发生、发展和治疗与活性氧密切相关,活性氧在细胞信号传递中起着重要作用。我们用探针DCFH-DA检测活性氧。在6孔板中,每孔种2×105个MCF-7细胞。24 h后去除培养基,用无菌PBS清洗细胞。在37℃下,分别用浓度为0、10、20、60和80 μg/mL水萃取部位处理细胞24 h。使用顺铂注射液和DMSO (浓度小于0.2% )作为阳性和阴性对照。随后将细胞悬浮在DCFH-DA中,在37°C下孵育20分钟。使用流式细胞仪,即BD FACSAriaTM III流式细胞仪,测量重新悬浮在PBS中细胞的胞内荧光强度来量化活性氧。然后用FlowJo V10对数据进行分析。
结果:由图5可知,流式细胞仪中的DCFH-DA荧光显示,与对照组相比,在所选的所有剂量中,活性氧水平都有显著增加。在暴露不同浓度水萃取部位的MCF-7细胞中,通过流式细胞仪测定DCFH-DA的平均荧光强度分别为5.14、5.77、7.52、7.67和9.58。与对照组相比,活性氧的积累是剂量依赖性的。结果表明,水萃取部位提取物可以促进MCF-7细胞的活性氧积累,并表明水萃取部位提取物在MCF-7细胞凋亡过程中诱发了氧化应激。
5、水萃取部位提取物对MCF-7细胞PI3K/AKT信号通路的表达的影响
试验方法:采用蛋白印迹分析检测水萃取部位对MCF-7细胞PI3K/AKT信号通路的表达。
将MCF-7细胞与不同浓度的水萃取部位提取物培养24 h,然后用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。在4℃和12000×g离心10分钟后取上清用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。调整蛋白浓度后将蛋白提取液加入到上样缓冲液中,在99℃下变性10分钟。在10%的SDS-PAGE凝胶上进行电泳,并将其转移到PVDF膜上。用稀释的一抗(1:1000)将膜在4°C孵育过夜,然后用TBST洗3次,每次5分钟。稀释的二抗(1:8000)与膜在室温下孵化1 h,然后用TBST洗3次,每次5分钟。使用化学发光凝胶成像系统检测目标蛋白,并使用ImageJ软件对印迹进行可视化。
结果:由图6可知,与对照组相比,水萃取部位提取物浓度的增加导致PI3K(80 μg/mL)和AKT(20、40和80 μg/mL)的表达明显下调。重要的调节蛋白,如p53 (80μg/mL )、Caspase 9 (80μg/mL )和Cytochrome C (40μg/mL和80μg/mL )在各给药组中水平显著增加,并且它们的影响是呈剂量依赖。
综上可知,红大戟水萃取部位提取物可以抑制MCF-7细胞的增殖并促使其凋亡。另外,水萃取部位提取物可能通过线粒体介导的途径启动MCF-7细胞的凋亡。这些发现可以为更好理解红大戟水萃取部位提取物抗癌作用的潜在机制提供启示,并为寻找乳腺癌的选择性治疗程序提供协助。
Claims (9)
1.一种红大戟提取物,其特征在于,所述红大戟提取物的制备方法如下:
1)将红大戟的干燥块根粉碎成药粉;
2)往所述药粉中加入70-90%的乙醇,于70-90℃下回流提取,得到提取液;
3)将提取液过滤浓缩干燥,得到浸膏;
4)将浸膏溶解于水中,用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2-3次,分别收集石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位;
5)将石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位分别减压浓缩去除有机溶剂后冷冻干燥得到红大戟提取物A、B、C和D。
2.根据权利要求1所述的红大戟提取物,其特征在于,步骤1中,将块根粉粹成65-80目的药粉。
3.根据权利要求1所述的红大戟提取物,其特征在于,步骤2中所述的药粉和乙醇的质量体积比为1:8-10 g/L。
4.根据权利要求1所述的红大戟提取物,其特征在于,步骤2中,药粉在乙醇中浸泡1-2h后进行回流提取,回流提取次数为2-3次,回流提取时间为2-3h。
5.权利要求1所述红大戟提取物作为活性成分在制备抗肿瘤细胞药物中的应用。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述肿瘤细胞为A549、HepG2和MCF-7。
7.权利要求1所述红大戟提取物在制备抗乳腺癌药物中的应用,其特征在于,所述红大戟提取物为红大戟提取物D。
8.根据权利要求7所述红大戟提取物在制备抗乳腺癌药物中的应用,其特征在于,所述抗乳腺癌药物还含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
9.根据权利要求7所述的红大戟提取物在制备抗乳腺癌药物中的应用,其特征在于,所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
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CN106580937A (zh) * | 2015-10-16 | 2017-04-26 | 中国人民解放军第二军医大学 | 月腺大戟素a的制备方法及其在制备乳腺癌药物中的应用 |
CN105943770A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-09-21 | 叶龙海 | 一种治疗乳腺癌、乳腺增生的中药组合物及其制备方法 |
CN106074960A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-11-09 | 原巍俊 | 一种治疗乳腺癌及乳腺增生的中药组合物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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