CN102106872A

CN102106872A - 一种鳄鱼血冻干粉及其制备方法和用途

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Publication number: CN102106872A
Application number: CN2010101330829A
Authority: CN
Inventors: 张博
Original assignee: BEIJING HONGYUAN AODA BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: BEIJING HONGYUAN AODA BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-06-29
Anticipated expiration: 2030-03-26
Also published as: CN102106872B

Abstract

本发明公开了一种鳄鱼血冻干粉的制备方法，在本发明方法中，采取了冷冻干燥的方法，通过实验筛选得出冷冻干燥的具体工艺参数，使本发明鳄鱼血冻干粉的质量达到最优化。另外，通过药效学实验表明，本发明鳄鱼血冻干粉具有显著的抗肿瘤、抗病毒或增强免疫的功效，具有广阔的市场前景。

Description

一种鳄鱼血冻干粉及其制备方法和用途

发明领域

本发明涉及一种鳄鱼血冻干粉及其制备方法和在抗肿瘤、抗病毒或增强免疫方面的用途。

背景技术

对鳄鱼血的研究始于1998年，研究结果发现这种爬行动物血液中含有的几种蛋白质抗体可以杀死如金黄葡萄球菌(Staphy-lococcusaureus)等具有抗药性的病毒。据美国科学家马克·麦钱特研究表明，鳄鱼血液中所含的某些蛋白质能够杀死对盘尼西林有抗药性的细菌。马克说：“鳄鱼在争斗时会把对方的肢体撕扯下来，尽管它们生活在一个充满微生物的环境中，但它们的伤口却可以很快愈合，通常情况下不会受到任何感染。”Emily Ackiss是加州Scripps Mercy医院的一名临床流行病学家，他也熟悉这个研究结果。他说：在这篇文章中研究讨论只是基础的研究。在药物被开发出来前还需要更加广泛的研究和实验。可能在十年内变成人类的一种药物来源。

发明内容

本发明目的在于公开一种鳄鱼血冻干粉，本发明的目的还在于公开该冻干粉的制备方法，本发明的目的还在于公开该冻干粉在抗肿瘤、抗病毒或增强免疫方面的用途。

本发明目的是通过如下方法实现的。

本发明鳄鱼血冻干粉由如下方法制备而成：

A.无菌条件下，在健康鳄鱼颈部抽取动脉血，放至含浓度为3.2％枸橼酸钠抗凝剂采血袋中，密闭，在摇床内摇匀；置低温高速离心机中，在2-6℃下以5000～20000转/分钟的转速分离20-90分钟，静置，分层；抽取上清液得血浆，收集沉淀液得血细胞，分别置无菌容器中，称重，备用；

B.血浆中加入33％山梨醇，于40-80℃下，静置5-15小时后，充氮气；灭活病毒，病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定，将灭活病毒的鳄鱼血浆装入托盘，置冷冻干燥机搁板上，铺量为8-12mm，以每分钟降1℃的速度慢冻使血浆温度达到-20℃～-40℃，启动冷凝器，0.5-2小时后，使捕水器内温度达到-30℃～-50℃后，启动真至泵抽真空，气压达到10-20MPa后开启加热系统，缓慢加热至20-40℃，12-24小时后取出血浆，充氮气；此时冷凝器捕水量占血浆水分总量的90-98％，粉碎；过100目筛，得血浆细粉，待用；

C.血细胞中加入等体积的脱盐去离子水，搅拌均匀，静置20-90分钟，使血细胞膨胀，用超微胶体磨粉碎，使粉碎后的粒度小于5微米；灭活病毒，病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定，将灭活病毒的血细胞放入冷冻干燥机冻干仓内，以每分钟降10-50℃的速度速冻使血细胞温度达到-30℃～-50℃后，启动冷凝器，1-3小时后，使捕水器内温度达到-40℃～-60℃后，启动真至泵抽真空，气压达到1-6MPa后开启加热系统，缓慢加热至20-40℃，18-30小时后取出血细胞，充氮气；此时冷凝器捕水量占总量的90-98％；粉碎，过100目筛，待用；

或者血细胞中加入等体积的脱盐去离子水，搅拌均匀，静置20-90分钟，使血细胞膨胀，置1-30L800MPa小型静态超高压机中，以水为加压介质，于400-600MPa，50-80℃下加压6-14分钟，减压，气压正常后取出，滤过，微孔滤膜滤过，粒度小于5微米，将血细胞放入冷冻干燥机冻干仓内，以每分钟降10-50℃的速度速冻使血细胞温度达到-30℃～-50℃后，启动冷凝器，1-3小时后，使捕水器内温度达到-40℃～-60℃后，启动真至泵抽真空，气压达到1-6MPA后开启加热系统，缓慢加热至20-40℃，18-30小时后取出血细胞，充氮气；此时冷凝器捕水量占总量的90-98％；粉碎，过100目筛，待用；

D.将血浆细粉和血细胞细粉混匀，再粉碎，过200目细筛，得本发明鳄鱼血冻干粉；密闭，低温储存。

本发明鳄鱼血冻干粉优选由如下方法制备而成：

A.无菌条件下，在健康鳄鱼颈部抽取动脉血，放至含3.2％枸橼酸钠抗凝剂采血袋中，密闭，在摇床内摇匀；置低温高速离心机中，在4℃下以5000～20000转/分钟的转速分离30-60分钟，静置，分层；抽取上清液得血浆，收集沉淀液得血细胞，分别置无菌容器中，称重，备用；

B.血浆中加入33％山梨醇，于60℃下，静置10小时后，充氮气；灭活病毒，病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定，将灭活病毒的鳄鱼血浆装入托盘，置冷冻干燥机搁板上，铺量为10mm，以每分钟降1℃的速度慢冻使血浆温度达到-28℃～-32℃，启动冷凝器，1小时后，使捕水器内温度达到-40℃后，启动真至泵抽真空，气压达到15MPa后开启加热系统，缓慢加热至25～30℃，18小时后取出血浆，充氮气；此时冷凝器捕水量占血浆水分总量的92～96％，粉碎；过100目筛，得血浆细粉，待用；

C.血细胞中加入等体积的脱盐去离子水，搅拌均匀，静置30-60分钟，使血细胞膨胀，用超微胶体磨粉碎，使粉碎后的粒度小于5微米；灭活病毒，病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定，将灭活病毒的血细胞放入冷冻干燥机冻干仓内，以每分钟降10-50℃的速度速冻使血细胞温度达到-40℃～-45℃后，启动冷凝器，1.5～2.0小时后，使捕水器内温度达到-50℃～-55℃后，启动真至泵抽真空，气压达到1.5～5MPa后开启加热系统，缓慢加热至25～30℃，22～24小时后取出血细胞，充氮气；此时冷凝器捕水量占总量的92～96％；粉碎，过100目筛，待用；

或者血细胞中加入等体积的脱盐去离子水，搅拌均匀，静置30-60分钟，使血细胞膨胀，置1-30L800MPa小型静态超高压机中，以水为加压介质，于500MPa，65℃下加压10分钟，减压，气压正常后取出，滤过，微孔滤膜滤过，粒度小于5微米，将血细胞放入冷冻干燥机冻干仓内，以每分钟降10-50℃的速度速冻使血细胞温度达到-40℃～-45℃后，启动冷凝器，1.5～2.0小时后，使捕水器内温度达到-50℃～-55℃后，启动真至泵抽真空，气压达到1.5～5MPa后开启加热系统，缓慢加热至25～30℃，22～24小时后取出血细胞，充氮气；此时冷凝器捕水量占总量的92～96％；粉碎，过100目筛，待用；

本发明公开了一种鳄鱼血冻干粉的制备方法，在本发明方法中，采取了冷冻干燥的方法，通过实验筛选得出冷冻干燥的具体工艺参数，如冷冻温度、冷凝温度、气压、捕水量的比例等，使本发明鳄鱼血冻干粉的质量达到最优化。另外，通过药效学实验表明，本发明鳄鱼血冻干粉对四种肿瘤细胞增殖均有明显的抑制作用；灌胃本发明鳄鱼血后，荷瘤小鼠的生存质量明显改善，毛色光滑，活动正常，胸腺系数较阴性对照增加，S180实体瘤缩小，显著实现了对肿瘤的抑制作用；本发明鳄鱼血具有较好的抗甲型流感病毒的作用，在所试剂量内对流感病毒引起的小鼠肺炎均有明显抑制作用；同时，本发明鳄鱼血还有增强机体免疫的功能，显著提高吞噬细胞的吞噬百分率及吞噬指数，有很好的促淋巴细胞增值的能力，对小鼠NK细胞活性有明显促进作用。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1本发明鳄鱼血冻干粉制备工艺考察实验

按照本发明实施例1所述方法，其中B步骤中水汽凝结温度(℃)、典型压力(Pa)和干燥时间(h)参数不固定，以B步骤中水汽凝结温度(℃)、典型压力(Pa)和干燥时间(h)为考察因素，按正交设计L₉(3⁴)表安排实验，筛选冻干工艺参数，见表1：

表1L₉(3⁴)因素水平表

得出的鳄鱼血冻干粉按照下述实验例5所述方法进行小鼠NK细胞活性测定，以小鼠NK细胞活性％为标准进行正交实验结果分析，结果见表2：

表2正交试验与结果

优选顺序A＞B＞C，优选组合A₂B₂C₃(即-40℃、15MPa、18h)

将上述结果进行正交实验方差分析，见表3：

表3正交试验方差分析表

注：F0.05(2，2)＝18.47，F0.01(2，2)＝98.64

方差分析结果表明：水汽凝结温度(℃)、典型压力(Pa)和干燥时间(h)对小鼠NK细胞活性％有显著性影响。考虑到生产成本，最终确定鳄鱼血冻干粉冻干的最佳参数为：水汽凝结温度(℃)-40℃、典型压力(Pa)15MPa、干燥时间(h)18h即A₂B₂C₃。

实验例2鳄鱼血抗肿瘤的研究

1.鳄鱼血体外肿瘤细胞的增殖抑制实验

(1)细胞株的来源与培养

肝癌细胞株(HepG2)；宫颈癌细胞株(Hela)；卵巢癌细胞株(SKOV3)；胃癌细胞株(BGC823)均为北京中医药大学生物系提供。前两种细胞株培养于含10％FBS的DMEM培养基中，后两种细胞株培养于含10％FBS的RPMI1640培养基。冻存于-70℃超低温冰箱。

(2)方法：采用MTT法测鳄鱼血对四种肿瘤细胞的增殖抑制作用

用10％FBS DMEM培养液在37℃、5％ CO₂条件下培养肝癌细胞HepG2和Hela细胞，用10％FBS RPMI1640培养液培养SKOV3细胞和BGC823细胞。取对数生长期细胞，离心收集细胞，用完全培养基(含10％FBS)调整至一定密度(5x10⁴个/ml)，取96孔板，将细胞悬液摇匀后，每孔加入100μl，同时设置空白对照(只加100μl培养液)，后置于含5％CO₂的37℃恒温箱中培养。4h后，轻轻吸取上层培养液并弃去。

取本发明实施例1方法制备得到的本发明鳄鱼血冻干粉，用不完全培养基(不含FBS的培养基)配制不同浓度的鳄鱼血，各取10μl加入各样品测试孔中，空白对照和生长对照孔只加10μl不完全培养基，各测试孔均做3个平行，将96孔板放回上述培养箱继续温育48h。取出96孔板，每孔加入15μl MTT，再温育4h，轻轻吸出上清，每孔加入150μl DMSO，振摇使孔底生成的蓝色甲瓒溶解，用酶标仪于450nm处测定各孔光吸收值，并用以下公式计算细胞生长抑制率：

ΔA％＝[A₀一A)/A₀]×100％，A和A₀分别是加样组和生长对照组平均光吸收值

(3)结果

本发明鳄鱼血冻干粉对四种肿瘤细胞增殖均有明显的抑制作用。结果见表2。

表2本发明鳄鱼血冻干粉对四种肿瘤细胞增殖的抑制率(％)

2.鳄鱼血对移植性肿瘤S180荷瘤鼠的影响

(1)实验材料

S180鼠肉瘤细胞株，由北大医学部提供。ICR小鼠，SPF/VAF级，雌性，体重(24±2)g。由北京大学医学部实验动物科学部提供。鳄鱼血是根据本发明实施例2所述方法制备得到的鳄鱼血冻干粉。

(2)小鼠移植性肿瘤试验

选择接种10d生长良好的S180腹水小鼠，断颈处死，用一次性注射器抽取乳白色腹水，台盼蓝染色，观察细胞活力大于95％，用无菌生理盐水稀释成1×10⁷个·mL^-1的细胞悬液，接种于小鼠右前肢腋部皮下，每只0.2mL，接种60只。

(2)小鼠的分组

接种次日，将荷瘤小鼠随机分5组，每组20只，分别设为荷瘤阴性空白对照组、荷瘤阳性对照组(于接种第2天腹腔注射环磷酰胺一次，80mg/kg·只)，鳄鱼血低剂量组(40mg/kg)、鳄鱼血中剂量组(80mg/kg)、鳄鱼血高剂量组(160mg/kg)。给药量为0.4mL/d·只)，连续28天，空白给等量的生理盐水。

(3)检测指标

每日观察小鼠活动、皮毛等生理指标，每日灌胃后称重，于接种后第29天处死，取肿瘤，脾脏，肝脏，胸腺称重，计算抑瘤率和脾指数，肝指数及胸腺指数。肿瘤抑制率(％)＝(C-T)/C*100％，式中C为对照组平均瘤重量，T为给药组平均瘤重量。脏器指数＝脏器重量(mg)/体重(10g)，结果以mg/10g为单位表示。

(4)鳄鱼血对小鼠S180实体瘤的影响

灌胃鳄鱼血后，荷瘤小鼠的生存质量明显改善，毛色光滑，活动正常，胸腺系数较阴性对照增加，肿瘤缩小。各剂量组对肿瘤均有抑制作用，大剂量组对肿瘤的抑制率达到42.6％。结果见表3

表3本发明鳄鱼血冻干粉对S180荷瘤鼠的影响

与荷瘤鼠阴性相比**P＜0.01。

实验例3鳄鱼血抗流感甲型病毒活性研究

1.材料

病毒株：流感甲型病毒(济防90-15)，在鸡胚尿囊腔内培养传代(2008.1)，-80℃保存。本发明实施例3制备得到的鳄鱼血冻干粉，溶于DMSO配成适宜初始浓度，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度，作为样品。阳性对照药：病毒唑(利巴韦林)RBV

2.方法

接种MDCK细胞96孔培养板，置5％CO₂，37℃培养24小时。MDCK细胞加入流感甲型病毒10^-4(50倍TCID₅₀)，37℃吸附2小时后倾去病毒液，分别加入不同稀释度样品。设病毒对照和细胞对照，37℃培养36小时，观察结果，记录CPE，计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度(IC₅₀)。

3.结果

结果见表4，本发明鳄鱼血具有较好的抗甲型流感病毒的作用。

表4鳄鱼血抗流感病毒活性

注：TC₅₀：药物半数有毒浓度；IC₅₀：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC₅₀/IC₅₀。

实验例4鳄鱼血对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用

1.材料：

流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)，购自中国预防医学科学院病毒研究所。

鳄鱼血根据本发明实施例4制备而成。

2.方法：

取小鼠60只，按体重随机分成6组。分别为鳄鱼血大、中、小剂量组；肺宁冲剂对照组；病毒感染对照组及正常对照组。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD₅₀流感病毒液滴鼻感染，每只0.05ml。感染前一天开始灌胃给药，每天2次，每次0.5ml，连续5天，对照组在同等条件下用蒸馏水灌胃。第6天称取小鼠体重后解剖，摘取全肺称重，计算肺指数值，并求出肺指数抑制率。

肺指数＝[肺重(g)/体重(g)]*100

表5鳄鱼血对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用

结果显示：鳄鱼血三个剂量组的肺指数值明显低于病毒对照组，与病毒对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。表明鳄鱼血在所试剂量内对流感病毒引起的小鼠肺炎均有明显抑制作用。

实验例5：鳄鱼血增强免疫的药理研究

1.材料与试剂

清洁级BALB/C小鼠，雄性，180只，18～22g，购自北京大学医学部实验动物中心。刀豆蛋白A(ConA)、鸡红细胞、Hanks液(pH7.2～7.4)RPMI1640完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑(INT)等。鳄鱼血为本发明实施例1制备得到的鳄鱼血冻干粉。

2.动物实验分组与剂量设定

实验动物用于3项免疫功能实验(细胞免疫、NK细胞活性及单核巨噬细胞实验)，分别为碳廓清实验和脏器/体重实验、小鼠脾淋巴细胞转化实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、小鼠NK细胞活性测定，分为4个组，每组15只动物，分别为对照组、5倍人体摄入量组(高剂量组)、2倍人体摄入量组(中剂量组)、1倍人体摄入量组(低剂量组)。1倍人体摄入量为1mg/kg·bw。灌胃体积为0.2ml/20g·bw。

3.单核-巨噬细胞功能实验

3.1碳廓清实验

实验前称重一次，实验每隔5天称一次重，结果显示：鳄鱼血对小鼠的体重影响与对照组相比无显著性差异。见表6。实验末期，小鼠称重后，按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(100ml/kg)，注入墨汁后2min(t1)、10min(t2)，分别从内眦静脉丛取血20μl，并立即将其加到2ml 0.1％Na₂CO₃溶液中。用分光光度计在600nm处测光密度值(OD)，以Na₂CO₃溶液做空白对照，分别用OD1和OD2来表示2min和10min所取血样的光密度。将小鼠处死，解剖动物，取出肝脏、脾脏及胸腺，用滤纸吸干血迹后称重。

K＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)

吞噬指数＝体重×K1/3(肝重+脾重)

结果显示，脾指数与胸腺指数均升高，与对照组有显著差异。说明鳄鱼血有增强机体免疫的功能。结果见表7

表6鳄鱼血生血冻干粉对正常小鼠体重的影响

表7鳄鱼血对小鼠脾指数胸腺指数的影响

注：*与正常组比较，P＜0.05

3.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)

小鼠连续灌胃30d后，每鼠腹腔注射2％鸡红细胞悬液1ml。30min后，颈椎脱臼处死动物，仰位固定于蜡板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，于37℃孵箱温育30min。孵毕，在生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞。晾干，以1∶1(V/V)丙酮甲醇溶液固定20min，4％(V/V)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，于显微镜下计数巨噬细胞。吞噬百分率与吞噬指数按以下公式计算。

结果显示：鳄鱼血组吞噬百分率及吞噬指数均有提高，且与对照组有显著差异，说明鳄鱼血有很好的增强机体免疫的功效。结果见表8

表8鳄鱼血对小鼠单核巨噬细胞功能的影响

注：*与正常组比较，P＜0.05。

4.细胞免疫实验之ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

小鼠连续灌胃30d后，颈椎脱臼处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，经200目筛网过滤，制成单细胞悬液，将细胞悬液分为两部分，用于ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验。

用Hanks液洗涤细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中，台盼蓝染色计数活细胞数(在95％以上)，调整细胞浓度为3×10⁶个/ml。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液作为实验，另一孔作为对照，置培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT 50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。以实验孔与对照孔OD的差值代表淋巴细胞增殖能力。

结果显示，鳄鱼血组有很好的促淋巴细胞增值的能力，与对照组有显著差异。见表9

表9小鼠脾淋巴细胞转化实验

注：*与正常组比较，P＜0.05。

5.小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)

实验前24h按常规培养靶细胞、效应细胞，取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50∶1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl、靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μl，上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将培养板1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μl置96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。

结果显示，鳄鱼血对小鼠NK细胞活性有明显促进作用。结果见10

表10鳄鱼血对小鼠NK细胞活性的测定结果

注：*与正常组比较，P＜0.05。

下述实施例进一步说明上述实验例所述的效果。

具体实施方式

实施例1：鳄鱼血冻干粉

A.无菌条件下，在健康鳄鱼颈部抽取动脉血，放至含3.2％枸橼酸钠抗凝剂采血袋中，密闭，在摇床内摇匀；置低温高速离心机中，在4℃下以10000转/分钟的转速分离45分钟，静置，分层；抽取上清液得血浆，收集沉淀液得血细胞，分别置无菌容器中，称重，备用；

B.血浆中加入33％山梨醇，于60℃下，静置10小时后，充氮气；灭活病毒，病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定，将灭活病毒的鳄鱼血浆装入托盘，置冷冻干燥机搁板上，铺量为10mm，以每分钟降1℃的速度慢冻使血浆温度达到-30℃，启动冷凝器，1小时后，使捕水器内温度达到-40℃后，启动真至泵抽真空，气压达到15MPa后开启加热系统，缓慢加热至28℃，18小时后取出血浆，充氮气；此时冷凝器捕水量占血浆水分总量的92～96％，粉碎；过100目筛，得血浆细粉，待用；

C.血细胞中加入等体积的脱盐去离子水，搅拌均匀，静置45分钟，使血细胞膨胀，用超微胶体磨粉碎，使粉碎后的粒度小于5微米；灭活病毒，病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定，将灭活病毒的血细胞放入冷冻干燥机冻干仓内，以每分钟降30℃的速度速冻使血细胞温度达到-42℃后，启动冷凝器，1.8小时后，使捕水器内温度达到-52℃后，启动真至泵抽真空，气压达到3MPa后开启加热系统，缓慢加热至28℃，24小时后取出血细胞，充氮气；此时冷凝器捕水量占总量的92～96％；粉碎，过100目筛，待用；

实施例2：鳄鱼血冻干粉

A.无菌条件下，在健康鳄鱼颈部抽取动脉血，放至含浓度为3.2％枸橼酸钠抗凝剂采血袋中，密闭，在摇床内摇匀；置低温高速离心机中，在5℃下以18000转/分钟的转速分离25分钟，静置，分层；抽取上清液得血浆，收集沉淀液得血细胞，分别置无菌容器中，称重，备用；

B.血浆中加入33％山梨醇，于75℃下，静置6小时后，充氮气；灭活病毒，病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定，将灭活病毒的鳄鱼血浆装入托盘，置冷冻干燥机搁板上，铺量为10mm，以每分钟降1℃的速度慢冻使血浆温度达到-28℃，启动冷凝器，1.5小时后，使捕水器内温度达到-46℃后，启动真至泵抽真空，气压达到13MPa后开启加热系统，缓慢加热至35℃，15小时后取出血浆，充氮气；此时冷凝器捕水量占血浆水分总量的92-96％，粉碎；过100目筛，得血浆细粉，待用；

C.血细胞中加入等体积的脱盐去离子水，搅拌均匀，静置30分钟，使血细胞膨胀，用超微胶体磨粉碎，使粉碎后的粒度小于5微米；灭活病毒，病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定，将灭活病毒的血细胞放入冷冻干燥机冻干仓内，以每分钟降30℃的速度速冻使血细胞温度达到-48℃后，启动冷凝器，1小时后，使捕水器内温度达到-48℃后，启动真至泵抽真空，气压达到4.5MPa后开启加热系统，缓慢加热至33℃，20小时后取出血细胞，充氮气；此时冷凝器捕水量占总量的92-96％；粉碎，过100目筛，待用；

实施例3：鳄鱼血冻干粉

C.血细胞中加入等体积的脱盐去离子水，搅拌均匀，静置45分钟，使血细胞膨胀，置1-30L800MPa小型静态超高压机中，以水为加压介质，于500MPa，65℃下加压10分钟，减压，气压正常后取出，滤过，微孔滤膜滤过，粒度小于5微米，将血细胞放入冷冻干燥机冻干仓内，以每分钟降30℃的速度速冻使血细胞温度达到-43℃后，启动冷凝器，1.8小时后，使捕水器内温度达到-53℃后，启动真至泵抽真空，气压达到1.5MPa后开启加热系统，缓慢加热至28℃，24小时后取出血细胞，充氮气；此时冷凝器捕水量占总量的92～96％；粉碎，过100目筛，待用；

实施例4：鳄鱼血冻干粉

B.血浆中加入33％山梨醇，于75℃下，静置6小时后氮气回充，杀病毒；病理检疫符合《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定后，将鳄鱼血浆装入托盘，置冷冻干燥机搁板上，铺量为10mm，慢冻使血浆温度达到-28℃，启动冷凝器，1.5小时后，使捕水器内温度达到-46℃后，启动真至泵抽真空，气压达到13MPa后开启加热系统，缓慢加热至35℃，15小时后取出血浆，氮气回冲；此时冷凝器捕水量占血浆水分总量的92-96％，粉碎；过100目筛，得血浆细粉，待用；

C.血细胞中加入等体积的脱盐去离子水，搅拌均匀，静置30分钟，使血细胞膨胀，置1-30L800MPa小型静态超高压机中，以水为加压介质，于450MPa，75℃下加压8分钟，减压，气压正常后取出，滤过，微孔滤膜滤过，粒度小于5微米，将血细胞放入冷冻干燥机冻干仓内，以每分钟降30℃的速度速冻使血细胞温度达到-48℃后，启动冷凝器，1小时后，使捕水器内温度达到-43℃后，启动真至泵抽真空，气压达到4.5MPa后开启加热系统，缓慢加热至33℃，20小时后取出血细胞，充氮气；此时冷凝器捕水量占总量的92-96％；粉碎，过100目筛，待用；

Claims

1.一种鳄鱼血冻干粉，其特征在于该冻干粉由如下方法制备而成：

D.将血浆细粉和血细胞细粉混匀，再粉碎，过200目细筛，得鳄鱼血冻干粉；密闭，低温储存。

2.如权利要求1所述的鳄鱼血冻干粉，其特征在于该冻干粉由如下方法制备而成：

3.如权利要求1所述的鳄鱼血冻干粉的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

4.如权利要求3所述的鳄鱼血冻干粉的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

5.如权利要求1或2所述的鳄鱼血冻干粉在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于其中抗肿瘤是指对肝癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞或S180实体瘤有抑制作用。

7.如权利要求1或2所述的鳄鱼血冻干粉在制备抗病毒药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于其中抗病毒是指抗甲型流感病毒或抑制流感病毒引起的小鼠肺炎。

9.如权要求1或2所述的鳄鱼血冻干粉在制备增强免疫药物中的应用。