CN104940237A - 一种鳄鱼血去蛋白提取物及其提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鳄鱼血去蛋白提取物及其提取方法和应用，采血及预处理—与水混合后匀浆—灭活血中原有的酶—离心除杂—调节温度、pH值—加入蛋白酶进行水解—灭活—活性炭脱色、离心取上清—过滤、超滤—真空冷冻干燥—即得鳄鱼血去蛋白提取物。该提取物经除去大分子蛋白后，临床拟用给药途径为静脉注射或静脉点滴，有助于人体对其中丰富的氨基酸及小分子多肽的吸收和利用；该去蛋白方法天然、简便、能耗低、节约成本；经KM小鼠尾静脉注射该提取物进行急性毒性试验表明，其毒性极低，安全范围较大。

Description

一种鳄鱼血去蛋白提取物及其提取方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地讲是涉及一种鳄鱼血去蛋白提取物及其提取方法和应用。

技术领域

鳄鱼是一种古老的生物，作为高级爬行动物，不但富有观赏价值，还兼具多种药用保健功效，也因此，现如今鳄鱼的养殖业日益兴旺。其中，暹罗鳄(Siamese crocodile)隶属爬行纲、鳄鱼目、鳄科，为国家二级保护野生动物。它具有繁殖能力强、生长快、抗病力强、皮质优良等优点，是我国人工饲养最多的鳄鱼之一。暹罗鳄全身都是宝，相关药膳已成为许多城市餐饮业菜单上的珍馐，其血液更是被认为可抗炎解热、提高耐力和增强免疫力等。据记载，鳄鱼血中蛋白质含量极高，达80％以上，含有多种人体必须的氨基酸、30多种微量元素和不饱和脂肪酸等，如何从中提取出有效物质，是一项重要且意义深远的工作。

蛋白质类药品的口服存在诸多弊端，比如首过效应、吸收不易等，同时动物血液的保存亦是不便。改变鳄鱼血中的物质和组成，保留甚至增强鳄鱼血的诸多功效，使人体更为方便地进行摄取和利用，是本发明的出发点之一。通过一系列去蛋白的方法及手段，去除大分子物质以得到富含小分子蛋白、多肽和氨基酸等的提取液后，进行冷冻干燥使其稳定并能长久保存，进而改变蛋白质类药品的给药途径，充分发挥该类药品的功效，实乃一条能为人类健康做出贡献的长远康庄之道。

国外心脑血管药上市品种约500种以上，列入美、英、日药典品种近200种，而且新品种不断问市。国内研制设备的新药品种中，心脑血管药物品种约占20％，但在心脑血管药物中，以心血管药物种类为最多，如β-阻滞剂，钙拮抗剂，利尿剂，抗高血压药，血管紧张素转换酶制止剂，抗心绞痛药物，降胆固醇防治动脉粥样硬化药物等等，而用于脑血管药物常用的有维脑路通、脑复康、盐酸培他啶等，近年来脑复康、盐酸培他啶注射液市场极为活跃，市场价格成数倍增长，广泛应用于临床，从中可见，脑血管药物的决定和可能的市场前景。据中国医药报1999年1月报道：对京、津沪十三个地区医院进口药使用情况调查：心脑血管药物达1.6亿元，又据报道：我国对11个成乡普查，60岁以上老年人口中，脑血管性痴呆患病率为3240人/万人。据统计1998年医药用药心脑血管系统用药比上年增长46.85％。上海市典型医院用药分析,心脑血管系统用药排名第二位(世界上心脑血管病用药排名第一位)仅次于抗感染药占15.2％。

随着我国人口老龄化，心脑血管病患者不断增加，特别是脑血管病患者的药物需求将成倍增长，而鳄鱼血去蛋白提取物作为新型的脑血管方面药物，市场广阔。

发明内容

为了克服以上技术存在的相对不足，本发明的目的在于提供一种具有抗缺氧、抗衰老、抗缺血、活血化瘀、改善微循环及增强免疫能力功效的鳄鱼血去蛋白提取物及其提取方法和应用。

从当前营养学、基因组学和分子生物学等多方面考虑，起到上述功效的物质源于鳄鱼血中的多肽与氨基酸，它们具有难以估量的价值和意义。

本发明解决技术问题所采用的技术方案为，一种鳄鱼血去蛋白提取物，其特征在于通过以下步骤取得：

(1)采集血液：通过断头采血的方式，采集泰国暹罗鳄鱼的新鲜血液，室温静置待其凝固；

(2)匀浆：取凝血块，按重量比为1:5的比例加入注射用水稀释，再用匀浆机以13000r/min的速度充分匀浆；

(3)超声波粉碎：取匀浆液于冰浴下用超声波粉碎机进行粉碎，25KHz，一共5次，每次处理15min，冷却15min后再进行处理；

(4)热水浴灭原酶：匀浆液于90℃水浴15min，冷却；

(5)离心除杂：将匀浆液在4℃以12000r/min离心1h，除去大分子蛋白、脂肪及血细胞碎片杂质，得匀浆上清液；

(6)双酶水解：匀浆上清液中加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，于50℃-60℃、pH为7.5-8.5的条件下水解2-4h；

(7)灭活：所得酶解液在90℃下水浴15min灭活，冷却；

(8)活性炭脱色：用磁力搅拌器于4℃下搅拌，10％(g/mL)活性炭脱色20min，在4℃以12000r/min离心15min得酶解上清液；

(9)过滤膜：取酶解上清液分别在0.46μm、0.22μm微孔滤膜下过滤，得滤液；

(10)超滤：将上述滤液经300KDa、100KDa、30KDa、10KDa、1KDa超滤膜下逐级超滤，得超滤液；

(11)真空冷冻干燥：超滤液在-40℃下预冻4h，用冻干机于-40℃下真空冷冻干燥3d，即得鳄鱼血去蛋白提取物。

所述鳄鱼血去蛋白提取物具体的提取方法如下：

(1)采集血液：通过断头采血的方式，采集泰国暹罗鳄鱼的新鲜血液，室温静置待其凝固；

(2)匀浆：取凝血块，按重量比为1:5的比例加入注射用水稀释，再用匀浆机以13000r/min的速度充分匀浆；

(3)超声波粉碎：取匀浆液于冰浴下用超声波粉碎机进行粉碎，25KHz，一共5次，每次处理15min，冷却15min后再进行处理；

(4)热水浴灭原酶：匀浆液于90℃水浴15min，冷却；

(5)离心除杂：将匀浆液在4℃以12000r/min离心1h，除去大分子蛋白、脂肪及血细胞碎片杂质，得匀浆上清液；

(6)双酶水解：加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，于50℃-60℃、pH为7.5-8.5的条件下水解2-4h；

(7)灭活：所得酶解液在90℃下水浴15min灭活，冷却；

(8)活性炭脱色：用磁力搅拌器于4℃下搅拌，10％(g/mL)活性炭脱色20min，在4℃以12000r/min离心15min得酶解上清液；

(9)过滤膜：取酶解上清液分别在0.46μm、0.22μm微孔滤膜下过滤，得滤液；

(10)超滤：将上述滤液经300KDa、100KDa、30KDa、10KDa、1KDa超滤膜下逐级超滤，得超滤液；

(11)真空冷冻干燥：超滤液在-40℃下预冻4h，用冻干机于-40℃下真空冷冻干燥3d，即得鳄鱼血去蛋白提取物。

较佳地，所述步骤(6)酶解部分，通过正交设计得出的水解条件：匀浆上清液中加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，调节温度为53℃、pH为8，水解3h。

所述该提取物用于制备治疗脑部血液循环障碍或营养障碍性疾病所引起的神经功能缺损药物中的应用。

所述该提取物用于制备治疗缺血性损害或颅脑外伤药物中的应用。

本发明的有益效果：该提取物经除去大分子蛋白后，临床拟用给药途径为静脉注射或静脉点滴，有助于人体对其中丰富的氨基酸及小分子多肽的吸收和利用；该去蛋白方法天然、简便、能耗低、节约成本；经KM小鼠尾静脉注射该提取物进行急性毒性试验表明，其毒性极低，安全范围较大。

具体的实施方式

实施例1

鳄鱼血去蛋白提取物的制备：

一种鳄鱼血去蛋白提取物，其具体制备方法包含如下步骤：

(1)采集血液：通过断头采血的方式，采集泰国暹罗鳄鱼的新鲜血液，室温静置待其凝固；

(2)匀浆：取凝血块，按重量比为1:5的比例加入注射用水稀释，再用匀浆机以13000r/min的速度充分匀浆；

(3)超声波粉碎：取匀浆液于冰浴下用超声波粉碎机进行粉碎，25KHz，一共5次，每次处理15min，冷却15min后再进行处理；

(4)热水浴灭原酶：匀浆液于90℃水浴15min，冷却；

(5)离心除杂：将匀浆液在4℃以12000r/min离心1h，除去大分子蛋白、脂肪及血细胞碎片杂质，得匀浆上清液；

(6)双酶水解：匀浆上清液中加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，于50℃、pH＝7.5的条件下水解2h；

(7)灭活：所得酶解液在90℃下水浴15min灭活，冷却；

(8)活性炭脱色：用磁力搅拌器于4℃下搅拌，10％(g/mL)活性炭脱色20min，在4℃以12000r/min离心15min得酶解上清液；

(9)过滤膜：取酶解上清液分别在0.46μm、0.22μm微孔滤膜下过滤，得滤液；

(10)超滤：将上述滤液经300KDa、100KDa、30KDa、10KDa、1KDa超滤膜下逐级超滤，得超滤液；

(11)真空冷冻干燥：超滤液在-40℃下预冻4h，用冻干机于-40℃下真空冷冻干燥3d，即得鳄鱼血去蛋白提取物。

所述的鳄鱼血去蛋白提取物，通过液质联用技术分析酶解液中游离氨基酸成分得到：较之水解前，酶解液中人体精氨酸、丙氨酸和牛磺酸必须氨基酸的含量大大增多，并产生新的功能性小分子鹅肌肽多肽。

临床用前为冻干粉，以0.9％(g/mL)氯化钠注射液或5％(g/mL)葡萄糖溶液溶解稀释，通过静脉注射或点滴对患者进行治疗。

实施例2

实施例2与实施例1相同，仅区别在于，所述步骤(6)酶解部分，通过正交设计得出的优选的水解条件：匀浆上清液中加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，调节温度为53℃、pH为8，水解3h。其它省略。

实施例3

实施例2与实施例1相同，仅区别在于，所述步骤(6)酶解部分，通过正交设计得出的优选的水解条件：匀浆上清液中加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，调节温度为60℃、pH为8.5，水解4h。其它省略。

实施例4

鳄鱼血去蛋白提取物对KM种小鼠尾静脉注射单次给药急性毒性试验：

鳄鱼血去蛋白提取物由海南省药物安全性评价研究中心研制，KM种小鼠来源于广东省医学实验动物中心。

采用半数致死剂量法：取60只健康的KM种小鼠，雌雄各半，体重为18～22g，随机分为6个组(包括5个鳄鱼血去蛋白提取物剂量组和1个阴性对照组)，每组10只。结果得到鳄鱼血去蛋白提取物的LD50值(高于7000mg/kg)为其临床拟用剂量的1000倍以上。这说明动物血去蛋白提取物毒性极小，几乎无毒性。

下面用药效学试验阐明鳄鱼血去蛋白提取物的疗效，证明其在抗缺氧、脑缺血等方面的作用。

实施例5

鳄鱼血去蛋白提取物对KM种小鼠常压耐氧能力的影响：

(1)材料：KM种小鼠由广东省医学实验动物中心提供；鳄鱼血去蛋白提取物由海南省药物安全性评价研究中心提供。

(2)方法：取28-31g的健康KM种小鼠，雄性，每组20只，随机分为鳄鱼血去蛋白提取物低剂量组，中剂量组、高剂量I组、高剂量II组、阴性对照组、丹参注射液对照组、小牛血去蛋白提取物注射液对照组(小鼠约140只)。

根据上市药小牛血去蛋白提取物注射液的临床用药剂量，对鳄鱼血去蛋白提取物的药效学给药剂量进行设计。

各组尾静脉给药1次。于给药后30min，将所有小鼠分别放入装有10g碱石灰的250mL的广口瓶(所有广口瓶用前均盛水校正容量)中，密闭缺氧。观察小白鼠存活时间(每瓶放1只小鼠，以呼吸停止为指标)，结果见表1。

表1鳄鱼血去蛋白提取物对小鼠在缺氧试验中存活时间的影响(n＝20)

结果：各提取物给药组与阴性对照组相比，明显增加小鼠在常压缺氧条件下的存活时间，差异均极显著(P＜0.01)。其效果较丹参注射液对照组好且与小牛血去蛋白提取物注射液对照组效果相当或更好。提示鳄鱼血去蛋白提取物可增加动物的综合抗缺氧能力，提高总体体质和耐受力。

实施例6

鳄鱼血去蛋白提取物对KM种小鼠结扎双侧颈动脉后存活时间的影响：

(1)材料：KM种小鼠由广东省医学实验动物中心提供；鳄鱼血去蛋白提取物由海南省药物安全性评价研究中心研制。

(2)方法：取30-33g的健康KM种小鼠，雄性，每组20只，随机分为鳄鱼血去蛋白提取物低剂量组，中剂量组、高剂量组、阴性对照组、丹参注射液对照组、小牛血去蛋白提取物注射液对照组(小鼠约120只)。

根据上市药小牛血去蛋白提取物注射液的临床用药剂量，对鳄鱼血去蛋白提取物的药效学给药剂量进行设计。

各组尾静脉给药1次。于给药后30min，用1％戊巴比妥钠麻醉所有小鼠，各小鼠纵向切开颈部皮肤，分离出双侧颈总动脉，并用0号线与动脉夹同时结扎小鼠双侧颈总动脉后，立即开始记录小鼠的存活时间，结果见表2。

表2鳄鱼血去蛋白提取物对小鼠结扎双侧颈动脉后存活时间的影响(n＝20)

结果：各提取物给药组与阴性对照组相比，明显增加小鼠结扎双侧颈总动脉后的存活时间，差异均极显著(P＜0.01)，其效果与丹参注射液对照组及小牛血去蛋白提取物注射液对照组相当。提示鳄鱼血去蛋白提取物可增强动物对因脑缺血引起的局部缺氧状态的耐受力，为施救提供宝贵时间。

实施例7

鳄鱼血去蛋白提取物对双侧劲动脉夹闭性脑缺血大鼠的影响：

(1)材料：SD大鼠由广东省医学实验动物中心提供；鳄鱼血去蛋白提取物由海南省药物安全性评价研究中心研制。

(2)方法：SD大鼠体重：250-300g，雄性，随机分为假手术组，脑缺血模型组，鳄鱼血去蛋白提取物低、中、高剂量组，丹参注射液对照组，小牛血去蛋白提取物注射液对照组，每组9只。假手术组只分离但不结扎颈动脉，模型组正常进行手术。

根据上市药小牛血去蛋白提取物注射液的临床用药剂量，对鳄鱼血去蛋白提取物的药效学给药剂量进行设计。

各组尾静脉给药1次。于给药30min后制作大鼠脑缺血模型：将大鼠用10％(g/mL)水合氯醛(4mL/kg)麻醉，固定于手术台上。从正中切开大鼠颈部皮肤，分离肌肉，找到双侧颈总动脉，同时用0号线和动脉夹夹闭，30min后断头处死取脑，分别进行脑含水量的测定和HE染色：

对脑含水量的影响：取上述实验每组6只大鼠的脑置100℃烘箱中烤至恒重(约72h)，计算脑含水量。脑含水量＝[(湿重一干重)/湿重×100％]；

另取每组大鼠3只进行HE染色；

结果分别见表3和表4。

表3鳄鱼血去蛋白提取物对实验性脑缺血大鼠脑含水量的影响(n＝6)

表4缺血大鼠脑部HE染色结果(n＝3)

结果：各提取物给药组与模型对照组相比，明显降低实验性脑缺血大鼠的脑含水量，差异均极显著(P＜0.01)，其效果优于丹参注射液对照组且与小牛血去蛋白提取物注射液对照组相当；各提取物给药组动物脑部存在的坏死灶等明显少于模型对照组，其效果优于丹参注射液对照组且与小牛血去蛋白提取物注射液对照组相当或更好。提示鳄鱼血去蛋白提取物可改善脑水肿情况，降低颅内压力，减轻症状，保护脑组织免受颅内压力过大引起的损伤，同时减少局部脑组织的坏死灶出现频率，减低脑缺血对动物脑组织的损伤。

实施例8

鳄鱼血去蛋白提取物对夹闭性脑缺血模型大鼠血流动力学、脑指数的影响：

(1)材料

SD大鼠由广东省医学实验动物中心提供；鳄鱼血去蛋白提取物由海南省药物安全性评价研究中心研制。

(2)方法

SD大鼠体重：300-350g，雄性。将大鼠随机分为空白对照组，假手术组，脑缺血模型组，鳄鱼血去蛋白提取物低、中、高剂量组，丹参注射液对照组，小牛血去蛋白提取物注射液对照组，每组10只。其中假手术组仅分离血管不结扎，模型组正常进行手术。

根据上市药小牛血去蛋白提取物注射液的临床用药剂量，对鳄鱼血去蛋白提取物的药效学给药剂量进行设计。

试验开始第1d对第1组大鼠进行尾静脉注射给药，此后每天增加1组大鼠进行给药，每组大鼠均连续给药8d。第8d末次给药30min后，对第1组大鼠麻醉并进行手术，第9d对第2组大鼠进行手术，依此类推。

末次给药30min后制作大鼠双侧颈总动脉夹闭性脑缺血模型：将大鼠用10％(g/mL)水合氯醛(4mL/kg)麻醉，固定于手术台上，从正中切开颈部皮肤，分离肌肉，找到双侧颈总动脉，同时用动脉夹和0号线夹闭，30min后经由腹主动脉取血，送SA-6000自动血流变测试仪仪检测。取脑、称重，按“脑指数＝脑重量/体重×100”计算脑指数。

结果分别见表5、表6、表7。

表5鳄鱼血去蛋白提取物对夹闭性脑缺血大鼠全血粘度的影响(n＝10)

表6鳄鱼血去蛋白提取物对夹闭性脑缺血大鼠红细胞聚集指数、卡松粘度的影响(n＝10)

表7鳄鱼血去蛋白提取物对夹闭性脑缺血大鼠脑指数的影响(n＝10)

结果：各提取物给药组与模型对照组相比，明显降低夹闭性脑缺血大鼠的在不同切变率下的全血粘度、红细胞聚集指数和卡松粘度，差异均极显著(P＜0.01)，其效果优于丹参注射液对照组且与小牛血去蛋白提取物注射液对照组相当或更好；各提取物给药组动物的脑指数相较于模型对照组不降反增，与丹参注射液对照组且和小牛血去蛋白提取物注射液对照组作用效果相反，综合鳄鱼血提取物能降低实验性脑缺血大鼠的脑含水量进行考虑：认为各提取物给药组动物的脑指数增加是因为鳄鱼血去蛋白提取物除具有抗脑水肿作用外，也可能会引起机体血液的重新分布，增加脑部的血液分布，脑含血量及脑供血量增加导致脑组织重量增加。提示鳄鱼血去蛋白提取物可降低全血粘度而减轻脑缺血所引起的动物血液高凝状态，从而降低血栓发生的可能性，减轻栓塞性脑缺血的发生率。同时增加红细胞变形能力，改善红细胞在恶劣条件下的生存能力，在发生脑缺血时，红细胞存活数提高意味着增加机体运氧量，进而营养脑部，改善局部脑组织缺氧缺血状态。

实施例9

鳄鱼血去蛋白提取物对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用：

(1)材料

SD大鼠由广东省医学实验动物中心提供；鳄鱼血去蛋白提取物由海南省药物安全性评价研究中心研制。

(2)方法

SD大鼠体重：300-350g，雄性。将大鼠随机分为空白对照组，假手术组，脑缺血模型组，鳄鱼血去蛋白提取物低、中、高剂量组，丹参注射液对照组，小牛血去蛋白提取物注射液对照组，每组10只。其中假手术组仅分离血管不结扎，模型组正常进行手术。

根据上市药小牛血去蛋白提取物注射液的临床用药剂量，对鳄鱼血去蛋白提取物的药效学给药剂量进行设计。

试验开始第1d对第1组大鼠进行尾静脉注射给药，此后每天增加1组大鼠进行给药，每组大鼠均连续给药8d。第8d末次给药30min后，对第1组大鼠麻醉并进行手术，第9d对第2组大鼠进行手术，依此类推。

末次给药30min后参照Zea Longa等改良的线栓法制作大鼠局灶性脑缺血模型：将大鼠用10％(g/mL)水合氯醛(4mL/kg)麻醉后，使其仰卧并固定于手术台上。从正中切开颈部皮肤，钝性分离肌肉，暴露右侧的颈总动脉(commoncarotid artery，CCA)和迷走神经，再逐步依次分离暴露CCA分叉部，颈外动脉(external carotidartery，ECA)，颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，分离ICA至近颅底，并找出ICA颅外段的唯一分支翼腭动脉(pterygopalatine artery，PPA)，在ECA的近心端设置活结，结扎ECA远心端，以个微动脉夹分别夹闭ICA，并在CCA处打一活结，切断ECA，注意尽可能靠近远心端，送入栓线至CCA分叉处，然后翻转方向使ECA与ICA尽量成为平角，以利于栓线通过，松开夹闭ICA的微动脉夹，将栓线向内上方缓慢推进。如果栓线进入PPA，一般插入长度在10mm左右就遇到明显阻力，这时可退出一些栓线，并用微动脉夹临时夹闭PPA适当调整栓线插入方向，插入长度为17～20mm(从CCA分叉处计算)，微遇阻力时即停止插入，ECA和钓鱼线结扎，松开夹闭CCA的微动脉夹，缝合皮肤，将栓线尾部略露出皮肤1cm并用缝线略作固定。上述过程一般10～15min，术后让大鼠自然清醒，在栓线置入2h后再次麻醉和打开先前缝合的皮肤，由露出皮肤的栓线尾部将栓线柔和缓慢地抽出，当栓线球状端遇到ECA结扎线时会有阻力，即停止拔线，剪除栓线的残余末端，实现22h再灌注。参照KuIuz神经缺陷五级评分标准，以1-3分为模型成功的标志，于术后动物苏醒时立即观察动物的行为和运动功能状况，手术24h后再观察一次，并得出相应评分。最后将大鼠断头取脑，称量脑重后，按公式“脑指数＝脑重量/体重×100”计算脑指数；同时将脑冰冻20min，沿冠状面切成厚度相同的5片(片厚约2mm)，脑片置于2％TTC染液中，37℃避光染色30min，正常组织呈红色，梗死组织呈白色，数码相机拍照，利用Photoshop 7.0分析每只大鼠的脑梗死面积占脑片总面积的百分比。因为脑片厚度相同，所以脑梗死面积百分比可反映脑梗死体积百分比。结果见表8、9、10、11。

表8鳄鱼血去蛋白提取物对局灶性脑缺血大鼠脑指数的影响(n＝10)

表9鳄鱼血去蛋白提取物对局灶性脑缺血大鼠术后清醒时神经行为学评分的影响(n＝10)

表10鳄鱼血去蛋白提取物对局灶性脑缺血大鼠术后24h神经行为学评分的影响(n＝10)

表11鳄鱼血去蛋白提取物对局灶性脑缺血大鼠脑梗死面积的影响(n＝10)

结果：各提取物给药组动物的脑指数相较于模型对照组不降反增，与丹参注射液对照组且和小牛血去蛋白提取物注射液对照组作用效果相反，综合鳄鱼血提取物能降低实验性脑缺血大鼠的脑含水量及增加夹闭性脑缺血模型大鼠的脑指数进行考虑，认为鳄鱼血去蛋白提取物具有增加脑血液供应和抗脑水肿的双重作用：各提取物给药组动物的脑指数增加是因为鳄鱼血去蛋白提取物在具有抗脑水肿作用的同时，也可能会引起机体血液的重新分布，增加脑部的血液分布，使脑组织供血量增加以缓解脑部缺氧缺血症状，从而导致脑组织重量增加；当各组大鼠在局灶脑缺血术后清醒时，马上对其进行神经行为学评分，均在2分以上，因此认为各组造模是成功的。到术后24h，脑缺血模型组大鼠的评分随着时间增长而增加，脑缺血症状逐渐加重，这点和临床病人十分相近。各给药组大鼠评分与脑缺血模型组相比，明显下降，说明各给药组药物均有良好的治疗作用，鳄鱼血去蛋白提取物效果优于丹参注射液对照组及小牛血去蛋白提取物注射液对照组；各提取物给药组与模型对照组相比，明显降低局灶性脑缺血大鼠的脑梗死面积，差异均极显著(P＜0.01)，其效果优于丹参注射液对照组及小牛血去蛋白提取物注射液对照组。提示鳄鱼血去蛋白提取物可引起全身血液的重新分配，增加脑供血量，脑组织含血量，改善脑细胞营养状态，增强这些脑细胞应对脑缺血时局部缺血缺氧状态的能力；而从动物整体看，可改善脑缺血动物的神经行为，全面改善动物状态，并减轻局灶性脑缺血引起脑梗死的面积，缓和急性局灶性脑缺血所致的脑损伤。

综上所述，在其制备方法中，采取了酶解、超滤等一系列去蛋白的手段，结合真空冷冻干燥，得到鳄鱼血去蛋白提取物的冻干粉。酶解的最高水解度达55％以上，经液质联用分析得出，较之水解前，酶解液中氨基酸含量大大增多，并产生一些新的小分子多肽，较为有效地去除了原料中一部分大分子蛋白。酶解液经由超滤和冻干等后续手段精制处理，将得到的成品冻干粉进行小鼠尾静脉急性毒性试验，结果证明，本发明鳄鱼血去蛋白提取物毒性极低，安全范围较大，且其所提供的去蛋白提取方法操作简便、节能高效，可最大限度节约成本。另外，通过多种脑部疾患方面的药效学试验表明，鳄鱼血去蛋白提取物对于脑血管及病变组织具有较佳的疗效，其作为可用于治疗脑缺血中风的药物进入临床有很大的应用前景，可创造良好的经济和社会效益。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种鳄鱼血去蛋白提取物，其特征在于通过以下步骤取得：

(1)采集血液：通过断头采血的方式，采集泰国暹罗鳄鱼的新鲜血液，室温静置待其凝固；

(2)匀浆：取凝血块，按重量比为1:5的比例加入注射用水稀释，再用匀浆机以13000r/min的速度充分匀浆；

(3)超声波粉碎：取匀浆液于冰浴下用超声波粉碎机进行粉碎，25KHz，一共5次，每次处理15min，冷却15min后再进行处理；

(4)热水浴灭原酶：匀浆液于90℃水浴15min，冷却；

(5)离心除杂：将匀浆液在4℃以12000r/min离心1h，除去大分子蛋白、脂肪及血细胞碎片杂质，得匀浆上清液；

(6)双酶水解：匀浆上清液中加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，于50℃-60℃、pH为7.5-8.5的条件下水解2-4h；

(7)灭活：所得酶解液在90℃下水浴15min灭活，冷却；

(8)活性炭脱色：用磁力搅拌器于4℃下搅拌，10％(g/mL)活性炭脱色20min，在4℃以12000r/min离心15min得酶解上清液；

(9)过滤膜：取酶解上清液分别在0.46μm、0.22μm微孔滤膜下过滤，得滤液；

(10)超滤：将上述滤液经300KDa、100KDa、30KDa、10KDa、1KDa超滤膜下逐级超滤，得超滤液；

(11)真空冷冻干燥：超滤液在-40℃下预冻4h，用冻干机于-40℃下真空冷冻干燥3d，即得鳄鱼血去蛋白提取物。

2.一种鳄鱼血去蛋白提取物的提取方法，其特征在于具体的工艺步骤如下：

(1)采集血液：通过断头采血的方式，采集泰国暹罗鳄鱼的新鲜血液，室温静置待其凝固；

(2)匀浆：取凝血块，按重量比为1:5的比例加入注射用水稀释，再用匀浆机以13000r/min的速度充分匀浆；

(3)超声波粉碎：取匀浆液于冰浴下用超声波粉碎机进行粉碎，25KHz，一共5次，每次处理15min，冷却15min后再进行处理；

(4)热水浴灭原酶：匀浆液于90℃水浴15min，冷却；

(5)离心除杂：将匀浆液在4℃以12000r/min离心1h，除去大分子蛋白、脂肪及血细胞碎片杂质，得匀浆上清液；

(6)双酶水解：匀浆上清液中加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，于50℃-60℃、pH为7.5-8.5的条件下水解2-4h；

(7)灭活：所得酶解液在90℃下水浴15min灭活，冷却；

(8)活性炭脱色：用磁力搅拌器于4℃下搅拌，10％(g/mL)活性炭脱色20min，在4℃以12000r/min离心15min得酶解上清液；

(9)过滤膜：取酶解上清液分别在0.46μm、0.22μm微孔滤膜下过滤，得滤液；

(10)超滤：将上述滤液经300KDa、100KDa、30KDa、10KDa、1KDa超滤膜下逐级超滤，得超滤液；

(11)真空冷冻干燥：超滤液在-40℃下预冻4h，用冻干机于-40℃下真空冷冻干燥3d，即得鳄鱼血去蛋白提取物。

3.根据权利要求2所述的鳄鱼血去蛋白提取物的提取方法，所述步骤(6)酶解部分，通过正交设计得出的水解条件：匀浆上清液中加入0.5％(g/mL)碱性蛋白酶、0.7％(g/mL)胰蛋白酶和0.1％(g/mL)氯化钙，调节温度为53℃、pH为8，水解3h。

4.根据权利要求1所述的鳄鱼血去蛋白提取物，其特征在于：该提取物用于制备治疗脑部血液循环障碍或营养障碍性疾病所引起的神经功能缺损药物中的应用。

5.根据权利要求5所述的鳄鱼血去蛋白提取物，其特征在于：该提取物用于制备治疗缺血性损害或颅脑外伤药物中的应用。