CN106924714A - 多肽c2orf40mpf在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多肽C2ORF40MPF在制备抗肿瘤药物中的应用;所述多肽C2ORF40MPF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对多肽C2ORF40MPF在肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和瘤体形成等方面的生物学功能进行研究。体外实验表明C2ORF40MPF能够明显抑制乳腺癌和肺癌细胞的增殖能力,且对肿瘤细胞迁移和侵袭具有明显的抑制作用;同时,体内实验表明C2ORF40MPF在裸鼠异体移植瘤模型中能明显抑制肿瘤生长。更重要的是,细胞周期实验表明此多肽可能通过诱导有丝分裂期阻滞来发挥其抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及多肽C2ORF40MPF在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
在中国,每年有超过160万人被诊断为癌症,约120万人因癌症而死亡。自从上世纪90年代以来,中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的两倍多,城市地区尤为显著。目前,乳腺癌是中国女性发病率最高的肿瘤,其死亡率在肿瘤性恶性疾病中位居第六,已成为危害人类健康的主要疾病。因此,加强乳腺癌治疗的研究,探索新的治疗靶点具有非常重要的意义。
肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,由于诊断和治疗方面没有根本的改善,5年生存率没有明显的变化,主要原因是肺癌缺乏早期症状,发病比较隐匿,确诊时已是中晚期,肺癌目前的治疗方案主要是放、化疗和手术,虽然可增加患者的存活率,但放、化疗毒副作用明显,耐受性差,目前治疗的新技术是分子靶向性治疗,寻找新的诊断和治疗方法仍是肺癌治疗的关键。
多肽类药物是生物医药领域目前最具成长潜力的崭新领域,其适用于肿瘤、免疫性疾病和传染性疾病等的预防和治疗。近年来生物技术及多肽合成技术不断进步,多肽药物具有纯度高、毒副作用低且几乎无免疫原性等优点,已成为研究热点。同时其合成成本较低,利于规模化生产,具有广阔的应用前景。目前,已有超过60多种多肽药物被批准上市,多肽药物适应症广泛且疗效明显,世界范围内还有大量的多肽药物已进入或完成临床研究,未来治疗类多肽药物会有更广泛的应用前景。
C2ORF40MPF为一段含有16个氨基酸的多肽,有研究报道以神经胶质瘤细胞作为实验对象,上述氨基酸组成的多肽具有促炎作用。但由于不同种类的肿瘤的发病机理、治疗靶点和作用机制不同,目前尚未有关于多肽C2ORF40MPF在治疗乳腺癌和肺癌中的报道。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的提供多肽C2ORF40MPF在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明通过对多肽C2ORF40MPF在肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和瘤体形成等方面的生物学功能进行研究。体外实验表明C2ORF40MPF能够明显抑制乳腺癌和肺癌细胞的增殖能力,且对肿瘤细胞迁移和侵袭具有明显的抑制作用;同时,体内实验表明C2ORF40MPF在裸鼠异体移植瘤模型中能明显抑制肿瘤生长。更重要的是,细胞周期实验表明此多肽可能通过诱导有丝分裂期阻滞来发挥其抗肿瘤作用。由此提出了下述发明内容:
多肽C2ORF40MPF在制备抗肿瘤药物中的应用;所述多肽C2ORF40MPF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的,所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。
本发明还提供了多肽C2ORF40MPF在制备抑制肿瘤细胞增殖、迁移和/或侵袭的药物中的用途。
优选的,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞或肺癌细胞。
本发明还提供了多肽C2ORF40MPF在制备抑制肿瘤瘤体生长的药物中的用途
优选的,所述肿瘤瘤体为乳腺癌或肺癌瘤体。
本发明还提供了多肽C2ORF40MPF在制备诱导肿瘤细胞有丝分裂期阻滞的药物中的用途。
优选的,所述诱导肿瘤细胞有丝分裂期阻滞是将细胞周期阻滞在M期。
优选的,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞或肺癌细胞。
本发明的有益效果:
本发明的多肽C2ORF40MPF为一段模拟抑癌基因C2ORF40作用的具有抑癌作用的多肽,其氨基酸序列来源于人体固有的蛋白质,去除了免疫排除反应的可能性。并且该多肽可以体外合成。
本发明首次发现,多肽C2ORF40MPF能够明显抑制乳腺癌和肺癌细胞的增殖能力,且对肿瘤细胞迁移和侵袭具有明显的抑制作用,并能通过诱导有丝分裂期阻滞来发挥其抗肿瘤作用。因此,本发明所提供的小分子多肽为肿瘤临床治疗提供了新的有效途径,具有重要的应用前景。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。
图1是细胞增殖实验(MTT)结果:其中,分别为MTT检测不同浓度C2ORF40MPF对(A)BT549和(B)MDAMB231细胞增殖的影响;其中(C)和(D)为MTT检测75μmol/l的ScrC2ORF40和C2ORF40MPF对细胞增殖影响,是为了比较C2ORF40MPF相对于Scrambled C2ORF40 mimicpeptide对细胞增殖影响的特异性;(E)和(F)分别为BT549和MDAMB231细胞的IC50值;(G)和(H)为MTT检测不同浓度C2ORF40MPF对A549和H1299细胞增殖的影响。C2ORF40MPF和ScrC2ORF40:C2ORF40 mimic peptide和Scrambled C2ORF40 mimic peptide;*P<0.05and**P<0.01基于t-检验。
图2是克隆形成实验结果:其中,分别为克隆形成实验检测C2ORF40MPF对于(A)BT549和(B)MDAMB231细胞增殖的影响。C2ORF40MPF和ScrC2ORF40:C2ORF40mimic peptide和Scrambled C2ORF40 mimic peptide;*P<0.05and**P<0.01基于t-检验。
图3是细胞迁移和侵袭实验结果:其中,分别为Transwell细胞迁移实验检测C2ORF40MPF对于(A)BT549和(B)MDAMB231细胞迁移能力的影响;Matrigel细胞侵袭实验检测C2ORF40MPF对于(C)BT549和(D)MDAMB231细胞侵袭能力的影响。C2ORF40MPF和ScrC2ORF40:C2ORF40 mimic peptide和Scrambled C2ORF40mimic peptide;图中的标尺=200μm;*P<0.05and**P<0.01基于t-检验。
图4是流式细胞术检测C2ORF40MPF多肽对有丝分裂期的影响:其中,(A)BT549和(B)MDAMB231细胞分别在Control或100μM ScrC2ORF40或100μM C2ORF40MPF条件下培养48小时,然后经流式细胞术检测并分析细胞周期的变化:(C)将流式分析细胞周期和细胞同步化处理结合,同步化处理的MDAMB231细胞释放一定的时间后,经流式细胞术检测C2ORF40MPF对于细胞周期的影响。C2ORF40MPF和ScrC2ORF40:C2ORF40 mimic peptide和Scrambled C2ORF40 mimic peptide;*P<0.05and**P<0.01基于t-检验。
图5是裸鼠移植瘤实验结果:裸鼠腋下接种MDAMB231细胞后,待瘤体达到一定体积,给予多肽治疗,(A)和(B)治疗第23天,麻醉处死后取瘤体;(C)瘤体称重后,统计分析;(D)瘤体体积增长情况。C2ORF40MPF和ScrC2ORF40:C2ORF40 mimic peptide和ScrambledC2ORF40 mimic peptide;*P<0.05and**P<0.01基于t-检验。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,现有技术中还未有关于多肽C2ORF40MPF在治疗乳腺癌和肺癌中的报道。基于此,本发明提出了一种多肽C2ORF40MPF在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本申请的一种实施方案中,通过MTT实验发现:C2ORF40MPF(C2ORF40 mimicpeptide)能够显著抑制BT549和MDAMB231细胞的增殖能力;并能显著抑制肺癌细胞系A549和H1299的增殖能力。
在本申请的另一种实施方案中,通过克隆形成实验发现:C2ORF40MPF能够显著抑制BT549和MDAMB231细胞的克隆形成能力,从而进一步证明C2ORF40MPF能够抑制肿瘤细胞增殖。
在本申请的另一种实施方案中,通过细胞迁移和侵袭实验发现:C2ORF40MPF能够抑制乳腺癌细胞和肺癌细胞的迁移和侵袭能力。
在本申请的另一种实施方案中,通过流式分析细胞周期实验发现:C2ORF40MPF对细胞周期的阻滞作用,能够将细胞周期阻滞在M期。
在本申请的另一种实施方案中,通过裸鼠移植瘤实验发现:C2ORF40MPF能够显著降低瘤体重量和体积。
综上,通过上述研究发现:小分子多肽C2ORF40MPF对肿瘤细胞,特别是乳腺癌和肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用,能够显著降低瘤体重量和体积,并且对细胞周期的阻滞作用,能够将细胞周期阻滞在M期。由此认定,本申请的小分子多肽C2ORF40MPF能够为肿瘤的临床治疗提供新的有效途径。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。
实施例1:多肽C2ORF40MPF的合成
本发明的多肽C2ORF40MPF的氨基酸序列为:Ser-Pro-Tyr-Gly-Phe-Arg-His-Gly-Ala-Ser-Val-Asn-Tyr-Asp-Asp-Tyr(SEQ ID NO.1),委托Synpeptide公司进行多肽的合成。
为了比较本发明所设计的抑癌多肽C2ORF40MPF的实际效果,我们将其氨基酸序列打乱,委托公司进行合成,得到Scrambled C2ORF40 mimic peptide(ScrC2ORF40),其序列为Asp-Ala-Phe-Tyr-Tyr-Arg-Asn-Gly-Asp-His-Tyr-Pro-Val-Ser-Gly-Ser。
实施例2:MTT实验
1.实验方法:
在37℃,5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养乳腺癌细胞系BT549、MDAMB231,肺癌细胞系A549、H1299,待细胞密度达到70%左右,用PBS洗涤细胞一次,并用胰蛋白酶消化,然后加入培养液悬浮细胞并离心收集细胞,去掉上清液,加入培养液重悬细胞并进行细胞计数,将上述细胞分别按照2×103/孔的密度接种于96孔板;培养24h后更换培养基,分别加入含有不同剂量多肽(实施例1制备的多肽C2ORF40MPF和ScrC2ORF40)的培养基,继续培养;根据实验需要,在不同时间点于各孔中加入10μl的5mg/ml MTT溶液,继续培养4h去掉各孔的上清,然后加入150μlDMSO溶液,放置于摇床上采用低速振荡10min,让结晶物得到充分溶解,最后在酶联免疫检测仪上,测量各孔的吸光度值。
2.实验结果:
细胞增殖实验(MTT)结果如图1所示,图中,A、B分别为MTT检测不同浓度C2ORF40MPF对BT549(A)和MDAMB231(B)细胞增殖的影响;C和D为MTT检测75μmol/l的ScrC2ORF40和C2ORF40MPF对细胞增殖影响,是为了比较C2ORF40MPF相对于ScrambledC2ORF40 mimic peptide对细胞增殖影响的特异性;E和F分别为BT549和MDAMB231细胞的IC50值;G和H为MTT检测不同浓度C2ORF40MPF对A549和H1299细胞增殖的影响。C2ORF40MPF和ScrC2ORF40:C2ORF40 mimic peptide和Scrambled C2ORF40 mimic peptide;*P<0.05and**P<0.01基于t-检验。
由图1中A和B可知,MTT实验表明C2ORF40MPF(C2ORF40 mimic peptide)能够显著抑制BT549和MDAMB231细胞的增殖能力;图1中C和D表明,ScrC2ORF40(Scrambled C2ORF40mimic peptide)对细胞增殖无显著影响,证明C2ORF40MPF能特异性抑制乳腺癌细胞增殖;图1中E和F表明,BT549和MDAMB231细胞的IC50值分别为106μM和93μM。
图1中G和H表明,C2ORF40MPF(C2ORF40 mimic peptide)能够显著抑制肺癌细胞系A549和H1299的增殖能力。
以上实验表明,C2ORF40MPF对肿瘤细胞(特别是乳腺癌和肺癌细胞)增殖有显著的抑制作用。
实施例3:克隆形成实验
1.实验方法
将BT549和MDAMB231细胞分别接种到6cm培养皿,500个细胞/培养皿,培养96h后更换培养基,分别加入含有100μM ScrC2ORF40或100μM C2ORF40MPF多肽的培养液,继续培养到2周左右,终止培养。弃去培养液,PBS洗两次,加入5ml甲醇进行细胞固定,15分钟后去掉固定液,加入1ml Giemsa应用染液染色30分钟。然后,用流水轻柔洗去染液,将培养皿置于空气中干燥,最后在显微镜下计数克隆数,按照每个克隆的细胞个数30-50、50-100、100-200、>200来分别计算其克隆数。
2.实验结果:
实验结果如图2所示,图中,A和B分别为克隆形成实验检测C2ORF40MPF对于(A)BT549和(B)MDAMB231细胞增殖的影响。C2ORF40MPF和ScrC2ORF40:C2ORF40 mimic peptide和Scrambled C2ORF40 mimic peptide;*P<0.05and**P<0.01基于t-检验。
克隆形成实验显示C2ORF40MPF能够显著抑制BT549和MDAMB231细胞的克隆形成能力,从而进一步证明C2ORF40MPF能够抑制肿瘤细胞增殖。
实施例4:细胞迁移和侵袭实验
将BT549和MDAMB231细胞分别在Control或100μM ScrC2ORF40或100μMC2ORF40MPF多肽的培养基中培养24h,胰蛋白酶消化细胞,然后加入培养液悬浮细胞并离心收集细胞,加入无血清培养基重悬细胞并进行细胞计数,随后分别进行Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验。
1.Transwell迁移实验:
将上述细胞,分别按照3×104/孔的密度接种于Tranwell小室的上室(200μl),下层加入800ul培养液,培养24h后用棉签擦去未穿过的细胞,然后用甲醇固定细胞15min,再用Giemsa应用染液染色30分钟,最后用PBS轻柔洗掉染色液,在显微镜下观察计数穿过的细胞数,每孔选五个不同视野,结果图3(A)和(B)所示。
细胞迁移实验表明:C2ORF40MPF能够显著抑制BT549和MDAMB231的细胞迁移能力。
2.Matrigel侵袭实验:
在Transwell小室中加入Matrigel,并在37℃条件下温育半小时使其成胶状,将上述细胞,分别按照3×104/孔的密度接种于Tranwell小室的上室(200μl),下层加入800ul培养液,培养48h后用棉签擦去未穿过的细胞,然后用甲醇固定细胞15min,再用Giemsa应用染液染色30分钟,最后用PBS轻柔洗掉染色液,在显微镜下观察计数穿过的细胞数,每孔选五个不同视野,结果如图3(C)和(D)所示。
细胞侵袭实验表明:C2ORF40MPF能够显著抑制BT549和MDAMB231的细胞侵袭能力。以上结果表明,C2ORF40MPF能够抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
实施例5:流式分析细胞周期实验
将BT549和MDAMB231细胞分别在Control或100μM ScrC2ORF40或100μMC2ORF40MPF多肽的培养基中培养48h后,胰蛋白酶消化并收集细胞,采用70%预冷的乙醇固定细胞24h以上,经流式细胞仪来检测细胞周期,结果如图4(A)和(B)所示,流式检测细胞周期结果表明:C2ORF40MPF对G2/M期有阻滞作用。
为了进一步验证C2ORF40MPF对细胞周期的阻滞作用,将流式分析细胞周期与细胞同步化实验相结合:将MDAMB231细胞分别在100μM ScrC2ORF40或100μM C2ORF40MPF多肽的培养基中培养48h后,用含2mM胸苷培养24h,PBS洗两遍,加无血清培养基培养3h,用含100ng/ml诺考达唑的培养基继续培养12h,更换培养基,根据需要待细胞释放一定时间后收集并固定细胞,流式分析细胞周期,结果如图4(C)所示,结果表明:C2ORF40MPF将细胞周期阻滞在M期。
实施例6:裸鼠移植瘤实验
1.实验方法:
培养MDAMB231细胞,待细胞密度达70-80%,收集细胞并计数,制备成3×107个/ml,以0.1ml/只接种于6-7周雌性裸鼠左侧腋下。待肿瘤体积达70-100mm3,将裸鼠平均分成两组,每组4只。通过瘤体局部注射方式给予多肽治疗,给药剂量30mg/kg,给药频率为每日1次。肿瘤体积的测量次数为每隔1天测量1次。治疗23天后,裸鼠处死并拍照,手术剥取瘤块称重并拍照。
肿瘤体积(Tumor volume)计算公式为V=(a×b2)/2;
其中a、b分别表示长宽。
2.实验结果:
实验结果如图5所示,图中,A和B为裸鼠腋下接种MDAMB231细胞后,待瘤体达到一定体积,给予多肽治疗治疗第23天,麻醉处死后取瘤体的图片;C为瘤体重量增重情况,D为瘤体体积增长情况。
裸鼠移植瘤实验表明:C2ORF40MPF能够显著抑制肿瘤增长(图5中A和B),C2ORF40MPF能够显著降低瘤体重量(图5C)和体积(图5D)。以上数据表明,C2ORF40MPF能够对乳腺肿瘤生长具有潜在的治疗作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 多肽C2ORF40MPF在制备抗肿瘤药物中的应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 多肽C2ORF40MPF
<400> 1
Ser Pro Tyr Gly Phe Arg His Gly Ala Ser Val Asn Tyr Asp Asp Tyr
1 5 10 15
Claims (9)
1.多肽C2ORF40MPF在制备抗肿瘤药物中的应用;所述多肽C2ORF40MPF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。
3.多肽C2ORF40MPF在制备抑制肿瘤细胞增殖、迁移和/或侵袭的药物中的用途;所述多肽C2ORF40MPF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞或肺癌细胞。
5.多肽C2ORF40MPF在制备抑制肿瘤瘤体生长的药物中的用途;所述多肽C2ORF40MPF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述肿瘤瘤体为乳腺癌或肺癌瘤体。
7.多肽C2ORF40MPF在制备诱导肿瘤细胞有丝分裂期阻滞的药物中的用途;所述多肽C2ORF40MPF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述诱导肿瘤细胞有丝分裂期阻滞是将细胞周期阻滞在M期。
9.如权利要求7或8所述的用途,其特征在于,所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞或肺癌细胞。
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