WO2010126338A2 - 유방암 진단용 바이오마커 및 유방암 진단제 - Google Patents

유방암 진단용 바이오마커 및 유방암 진단제 Download PDF

Info

Publication number
WO2010126338A2
WO2010126338A2 PCT/KR2010/002768 KR2010002768W WO2010126338A2 WO 2010126338 A2 WO2010126338 A2 WO 2010126338A2 KR 2010002768 W KR2010002768 W KR 2010002768W WO 2010126338 A2 WO2010126338 A2 WO 2010126338A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
breast cancer
gene
seq
full
dna
Prior art date
Application number
PCT/KR2010/002768
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2010126338A3 (ko
Inventor
맹필재
김리라
박영우
Original Assignee
충남대학교 산학협력단
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충남대학교 산학협력단, 한국생명공학연구원 filed Critical 충남대학교 산학협력단
Publication of WO2010126338A2 publication Critical patent/WO2010126338A2/ko
Publication of WO2010126338A3 publication Critical patent/WO2010126338A3/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a breast cancer diagnostic agent comprising a biomarker for diagnosing breast cancer and a probe specifically binding thereto.
  • the present invention also relates to a breast cancer diagnostic composition comprising a biomarker composition for diagnosing breast cancer and a probe specifically binding thereto.
  • breast cancer is the second most common cancer in the world after lung cancer, with mortality at the fifth most dangerous cancer.
  • early detection is more important than other cancers because cancer is difficult to cure once cancer cells invade surrounding tissues or begin to metastasize to lymph nodes.
  • breast cancer In order to reduce mortality from breast cancer, it is important to first diagnose breast cancer early, and secondly, to diagnose the prognosis after treatment by primary surgery and to perform appropriate adjuvant therapy.
  • breast X-ray angiography and ultrasonography are used as preventive screening methods, and this method is most widely used to diagnose early breast cancer.
  • x-ray mammography is a dense breast that is commonly found in Korean women, because of the high fiber content, the diagnosis rate is low, especially the younger women, even if the mammary gland is developed a lot, the diagnosis rate drops.
  • the possibility of developing breast cancer in the diagnosis can not be excluded.
  • ultrasonography is used, but it is also difficult to distinguish between malignant and non-cancer tumors.
  • diagnosis rate is increased by additionally using fine needle aspiration cytology and magnetic resonance imaging.
  • fine needle aspiration cytology and magnetic resonance imaging Even if these methods are used to distinguish between normal and abnormal tissues in a morphological form, it is not easy to distinguish between cancerous and non-cancer tumors.
  • breast cancer has been developed to diagnose breast cancer in a relatively molecular genetic way compared to other cancers. The biopsy will reveal the lesion by cutting the tissue and then undergo a primary surgery for removal.
  • HER2 / neu also known as Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, ErbB-2 or ERBB2
  • ER estrogen receptor
  • HER2 / neu also known as Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, ErbB-2 or ERBB2
  • In situ hybridization is used. If the cancer tissue found has an estrogen receptor, it is treated with an estrogen analogue such as Tamoxifen, and if the HER2 / neu gene is overexpressed, Herceptin commercialized with the HER2 / neu monoclonal antibody trastuzumab. Herceptin will be used to treat breast cancer.
  • HER2 / neu gene the breast cancer specific diagnostic marker most useful for the diagnosis and treatment of breast cancer, is found in 20-35% of invasive breast cancers. therefore.
  • Oncotype DX is a method for screening 16 breast cancer genes and 5 control genes by real-time quantitative PCR
  • MammaPrint is a microarray method for 70 genes.
  • the present inventors have isolated total RNA from trace amounts of tissue obtained during breast cancer diagnosis, synthesized with cDNA using reverse transcriptase, and then synthesized into the tissue through real-time polymerase reaction using specific primers.
  • the present invention was completed by finding that the expression level of KRT15 gene, ECRG4 gene, INHBA gene, ISG15 gene, or MMP11 gene, especially the expression of a specific region of the gene transcript, is significantly related to breast cancer.
  • a DNA fragment or full-length DNA alone, or a combination thereof, of the breast cancer-related genes as a biomarker or biomarker composition for diagnosing breast cancer, a method of simply identifying breast cancer may be provided.
  • the present invention shows a difference in expression levels between breast cancer tissues and normal tissues, and diagnoses breast cancer including a novel biomarker that can be used to diagnose early stages of breast cancer and a probe that can specifically bind to it.
  • the purpose is to provide an offering.
  • an object of the present invention is to provide a biomarker composition capable of improving specificity and sensitivity for diagnosing breast cancer, and a breast cancer diagnostic composition comprising a probe capable of binding specifically thereto as an active ingredient.
  • One object of the present invention can be achieved by providing a biomarker for diagnosing breast cancer with a specific DNA fragment of the KRT15 gene, a full-length DNA alone, or a specific DNA fragment of the ECRG4 gene, a full-length DNA alone. have.
  • one object of the present invention is a breast cancer comprising a probe that specifically binds to a specific DNA fragment or full-length DNA of the KRT15 gene or a probe that specifically binds to a specific DNA fragment or full-length DNA of the ECRG4 gene as an active ingredient
  • a diagnostic agent By providing a diagnostic agent.
  • Another object of the present invention is 1) biomarker composition for diagnosing breast cancer consisting of specific DNA fragments of the KRT15 gene to full length DNA and ECRG4 gene, and 2) specific DNA fragments of the KRT15 gene to the full length DNA and ECRG4 gene.
  • One or more biomarkers selected from the group consisting of specific DNA fragments to full-length DNA, specific DNA fragments to full-length DNA of the INHBA gene, specific DNA fragments to full-length DNA of the ISG15 gene, and specific DNA fragments to full-length DNA of the MMP11 gene It can be achieved by providing a biomarker composition for diagnosing breast cancer consisting of one or more biomarkers selected from the group consisting of.
  • Another object of the present invention 3) breast cancer comprising a probe specifically binding to a specific DNA fragment to the full-length DNA of the KRT15 gene and a probe specifically binding to a specific DNA fragment to the full-length DNA of the ECRG4 gene as an active ingredient
  • a diagnostic agent composition 4) at least one probe selected from the group consisting of a probe that specifically binds to a specific DNA fragment to full length DNA of the KRT15 gene and a probe that specifically binds to a specific DNA fragment to full length DNA of the ECRG4 gene;
  • a component containing one or more probes selected from the group consisting of probes as an active ingredient. Cancer may be achieved by providing a diagnostic composition.
  • the expression level of the DNA fragment of KRT15 which is a gene constituting the breast cancer diagnostic biomarker of the present invention
  • the full length DNA alone or the DNA fragment of ECGR4 which is a gene constituting the breast cancer biomarker of the present invention
  • the expression level of the DNA fragment of KRT15 is compared with the expression level in normal tissues It is possible to effectively diagnose breast cancer, in particular, breast cancer in which stage 1 is advanced as an early stage, and thereby early treatment of breast cancer.
  • measuring the expression level of the DNA fragment to the full-length DNA of the gene constituting the breast cancer biomarker composition of the present invention and comparing it with the expression level in normal tissues can improve the specificity and sensitivity for the diagnosis of breast cancer.
  • the breast cancer diagnostic agent or breast cancer diagnostic composition of the present invention it is possible to easily measure the expression level of DNA fragments to full-length DNA of genes constituting the biomarker or biomarker composition for breast cancer diagnosis.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression levels of candidate biomarker genes for breast cancer diagnosis in normal tissues and breast cancer tissues of breast cancer patients according to the stage of progression
  • FIG. 1A is the INHBA gene
  • FIG. 1B is the MMP11 gene
  • FIG. 1C is the ISG15 gene
  • 1D shows the KRT15 gene
  • FIG. 1E shows the ECRG4 gene.
  • Figure 2 is a graph showing the ROC curve for the expression level of the candidate biomarker for breast cancer diagnosis without considering the progression stage of breast cancer patients
  • Figure 2A is a reconstruction of Figure 1
  • Figure 2B is a ROC curve for each gene.
  • FIG. 3 is a graph showing ROC curves of expression levels of candidate biomarkers for diagnosing breast cancer, targeting only breast cancer patients whose stage 1 is advanced.
  • FIG. 3A is a graph illustrating reconstructed values of only breast cancer patients whose stage 1 is advanced.
  • 3B is a ROC curve for each gene targeting only breast cancer patients whose progression stage is stage 1.
  • the present invention uses as a biomarker a specific DNA fragment to full-length DNA and a specific DNA fragment to full-length DNA of genes that are specifically low expression than normal tissue in breast cancer tissue, and the gene constituting the biomarker Probes that can specifically bind to specific DNA fragments to full-length DNA to measure expression levels are used as active ingredients of diagnostic agents.
  • the information of the gene used as a biomarker for diagnosing breast cancer and the sequence number of the full-length DNA are shown in Table 1, and the probe, the sequence number of the probe and the probe used to measure the expression level of the gene are recognized. Nucleotide sequence positions on the gene mRNA are shown in Table 2. Specific DNA fragments of each gene measured by the quantitative real-time PCR (QRT-PCR) method using the probe and cDNA of each gene The sequence number, base length and melting point of are shown in Table 3.
  • QRT-PCR quantitative real-time PCR
  • One aspect of the present invention relates to a breast cancer diagnostic agent comprising a biomarker for diagnosing breast cancer and a probe specifically binding thereto.
  • the present invention is a biomarker for diagnosing breast cancer comprising a DNA fragment of the KRT15 gene containing the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to full length DNA, and a biomarker for diagnosing breast cancer consisting of a DNA fragment of the ECRG4 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 5 to a full length DNA
  • a biomarker for diagnosing breast cancer consisting of a DNA fragment of the ECRG4 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 5 to a full length DNA
  • the full-length DNA of each gene may be used as a biomarker for diagnosing breast cancer, and in particular, the polynucleotide of SEQ ID NO.
  • the amount of DNA fragments of the KRT15 gene and the amount of DNA fragments of the ECRG4 gene containing the polynucleotide of SEQ ID NO: 5 can be indirectly measured for the quantitative expression level of the KRT15 gene and the quantitative expression level of the ECRG4 gene, respectively. Therefore, each DNA fragment can also be used as a biomarker for diagnosing breast cancer.
  • the present invention provides a breast cancer diagnostic agent or a DNA of an ECRG4 gene comprising a polynucleotide of SEQ ID NO: 5, including a DNA fragment of KRT15 gene comprising a polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to a probe that specifically binds to the full-length DNA. It provides a breast cancer diagnostic agent comprising a probe that specifically binds fragments to full-length DNA as an active ingredient. In this case, the probe is not particularly limited as long as it can specifically bind to DNA fragments or full-length DNA of each gene to measure the expression level of each gene to the amount of DNA fragments of each gene.
  • a pair of primers capable of complementarily binding to and amplifying full-length DNA and more preferably, a sense primer of SEQ ID NO: 3 and an antisense primer of SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5, capable of recognizing a polynucleotide of SEQ ID NO: 1 And a sense primer of SEQ ID NO: 7 and an antisense primer of SEQ ID NO: 8 capable of recognizing a polynucleotide.
  • the method of diagnosing breast cancer using the biomarker for diagnosing breast cancer of the present invention and a breast cancer diagnostic agent is not particularly limited as long as it is a method used in the art of the present invention, including a quantitative real-time PCR (QRT-PCR) method.
  • QRT-PCR quantitative real-time PCR
  • Step b) of the breast cancer diagnosis method may be implemented by one kit including a reverse transcriptase and an oligo dT primer having a length of 18 to 20 bp, and steps c) and d) are thermostable polymerases.
  • thermostable polymerases hot-start Taq
  • sense and antisense primers that can amplify full-length cDNA or cDNA fragments by complementarily binding to full-length cDNA or cDNA fragments of KRT15 gene (or ECRG4 gene), dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • a kit comprising a quantitative real-time PCR reaction pre-mixture for breast cancer diagnosis consisting of a fluorescent material (for example, SYBR Green I) and the like necessary for quantifying the amount of buffer, cDNA or cDNA fragment
  • the breast cancer diagnosis method of all stages may be implemented by a lab on a chip (LOC) including a kit or a device implementing each stage as a
  • KRT15 protein or ECRG4 protein can be used as a biomarker for diagnosing breast cancer, and specific for KRT15 protein or ECRG4 protein. It is apparent to those skilled in the art that binding antibodies can be used as a diagnostic agent for breast cancer.
  • the progression of breast cancer that can be diagnosed using the biomarker for diagnosing breast cancer and the breast cancer diagnostic agent of the present invention includes stages 1 to 4, and especially when the stage of breast cancer is stage 1, high sensitivity and specificity are maintained. Since the biomarker for diagnosing breast cancer and the breast cancer diagnostic agent of the present invention can be used, the early stage breast cancer can be diagnosed and treated.
  • Another aspect of the present invention relates to a breast cancer diagnostic composition
  • a breast cancer diagnostic composition comprising a biomarker composition for diagnosing breast cancer and a probe specifically binding thereto.
  • the method of diagnosing breast cancer, the progression stage of breast cancer that can be diagnosed, and using the protein of each gene as a biomarker for diagnosing breast cancer and using the antibody as a breast cancer diagnosing agent are the same as described above, and thus are omitted.
  • the present invention provides DNA fragments to full-length DNA of the KRT15 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 1; And it provides a biomarker composition for diagnosing breast cancer consisting of a DNA fragment of the ECRG4 gene to a full-length DNA comprising a polynucleotide of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention includes a probe that specifically binds to the DNA fragment of the KRT15 gene to the full-length DNA comprising a polynucleotide of SEQ ID NO: 1 and a probe that specifically binds to the DNA fragment to the full-length DNA of the ECRG4 gene as an active ingredient It provides a breast cancer diagnostic composition.
  • the probe for the DNA fragment to the full-length DNA of the KRT15 gene is composed of the sense primer of SEQ ID NO: 3 and the antisense primer of SEQ ID NO: 4 that can recognize the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, DNA fragment of the ECRG4 gene to full length DNA Probe for is preferably composed of the sense primer of SEQ ID NO: 7 and the antisense primer of SEQ ID NO: 8 that can recognize the polynucleotide of SEQ ID NO.
  • the present invention is selected from the group consisting of DNA fragments of the KRT15 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to full length DNA and DNA fragments of the ECRG4 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 5 to full length DNA, breast cancer tissue Biomarker characterized in that the low expression specifically; And DNA fragments or full-length DNA of the INHBA gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 9, DNA fragments of the ISG15 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 13 to the full-length DNA, and the MMP11 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 17. At least one selected from the group consisting of DNA fragments and full-length DNA, and provides a biomarker composition for diagnosing breast cancer consisting of a biomarker characterized in that it is specifically expressed in breast cancer tissue.
  • the DNA fragment of the KRT15 gene when DNA fragments or full-length DNAs of genes specifically expressed in breast cancer tissues and DNA fragments or full-length DNAs of genes specifically expressed in breast cancer tissues are combined and used as a biomarker composition for breast cancer diagnosis.
  • Sensitivity probability of judging cancer patients as cancer, or specificity
  • the degree can be increased to increase the accuracy of sample sorting.
  • the present invention is specific to the DNA fragment of the KRT15 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to the DNA fragment of the ECRG4 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 5 and full length DNA
  • One or more probes selected from the group consisting of probes that bind to each other And a probe that specifically binds to a DNA fragment of the INHBA gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 9 to a full length DNA, a probe that specifically binds to a DNA fragment of the ISG15 gene comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 13 to a full length DNA
  • a breast cancer diagnostic composition comprising at least one probe selected from the group consisting of a DNA fragment of the MMP11 gene comprising a polynucleotide of SEQ ID NO: 17 to a probe that specifically binds to the full-length DNA as an active ingredient.
  • the probe for the DNA fragment to the full-length DNA of the KRT15 gene is composed of the sense primer of SEQ ID NO: 3 and the antisense primer of SEQ ID NO: 4 that can recognize the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, DNA fragment of the ECRG4 gene to full length DNA
  • the probe for consists of a sense primer of SEQ ID NO: 7 capable of recognizing the polynucleotide of SEQ ID NO: 5 and an antisense primer of SEQ ID NO: 8
  • the probe for a DNA fragment to full length DNA of the INHBA gene is a polynucleotide of SEQ ID NO: 9 Consisting of a sense primer of SEQ ID NO: 11 and an antisense primer of SEQ ID NO: 12, wherein the probe for the DNA fragment to the full-length DNA of the ISG15 gene has a sense of SEQ ID NO: 15 capable of recognizing the polynucleotide of SEQ ID NO: 13.
  • DNA of MMP11 gene consisting of a primer and an antisense primer of SEQ ID NO: 16
  • Side to probe for a full length DNA is preferably composed of a sense primer and an antisense primer of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 19, which can recognize a polynucleotide of SEQ ID NO: 17.
  • KRT15, ECRG4, INHBA, ISG15, MMP11 were selected as candidate biomarkers for diagnosing breast cancer.
  • QRT-PCR quantitative real-time PCR
  • RNA was isolated from tissues of the sample, and cDNA was synthesized using reverse transcriptase and oligo dT primers.
  • a quantitative real-time PCR reaction pre-mixture consisting of synthesized cDNA as a template and consisting of a thermostable polymerase (hot-start Taq), a primer, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, buffer, and SYBR Green I fluorescent material
  • Expression levels of candidate biomarker genes for breast cancer diagnosis were measured by the quantitative real-time PCR reaction.
  • the expression level of the candidate biomarker gene for diagnosing breast cancer was calculated as a relative expression amount based on the expression amount of beta actin (actin, beta; ACTB) used as a control.
  • the primers used to amplify the cDNA of each gene are the sense primers and the antisense primers of Table 2, and the amplified cDNA fragments are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, It was a polynucleotide of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17.
  • the primers used to amplify the cDNA of the beta-actin gene are the sense primer of SEQ ID NO: 21 and the antisense primer of SEQ ID NO: 22, and the cDNA fragments amplified by the base sequence appearing in Genbenk accession number NM_001101 of the beta actin gene
  • the polynucleotide of 88 bases corresponding to the 876 ⁇ 963 position of the has a melting point of 57.88 ⁇ 57.98 °C.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression levels of candidate biomarker genes for breast cancer diagnosis in normal tissues and breast cancer tissues of breast cancer patients according to the stage of progression
  • FIG. 1A is the INHBA gene
  • FIG. 1B is the MMP11 gene
  • FIG. 1C is the ISG15 gene
  • 1D shows the KRT15 gene
  • FIG. 1E shows the ECRG4 gene.
  • the y-axis denotes a relative expression amount based on the expression amount of beta-actin, and the value "1" indicates that the same amount as the expression amount of beta-actin is expressed. As shown in FIG.
  • KRT15 and ECRG4 genes were expressed at about 10 to 100 times lower than normal tissues in breast cancer tissues of most advanced stage breast cancer patients, and INHBA gene, ISG15 gene, and MMP11 gene were most advanced. Breast cancer tissues of staged breast cancer patients were expressed at about 10-100 times higher than normal tissues.
  • ROC curves were prepared based on the expression level of the breast cancer diagnosis candidate biomarkers. The calculation used the MedCalcversion10.1.7.0 program.
  • Figure 2 is a graph showing the ROC curve for the expression level of the candidate biomarker for breast cancer diagnosis without considering the progression stage of breast cancer patients
  • Figure 2A is a reconstruction of Figure 1
  • Figure 2B is a ROC curve for each gene.
  • the y-axis represents sensitivity (the probability of determining cancer patients as cancer) and the x-axis represents false positive rate (FPR), which is the probability of determining normal people as cancer.
  • FPR false positive rate
  • Specificity the probability of determining a normal person as normal.
  • candidate biomarkers selected for diagnosing breast cancer have high sensitivity and specificity for diagnosing breast cancer.
  • Table 5 shows the sensitivity and specificity for the diagnosis of breast cancer at all stages without considering the progression stage of breast cancer patients of the candidate biomarker for diagnosing breast cancer when cancer and normal criteria were set to specific thresholds.
  • candidate biomarkers have high sensitivity and specificity, especially KRT15 and ECRG4 showed higher sensitivity than other candidate biomarkers.
  • the threshold value in the case of KRT15 and ECRG4 which are low expression in breast cancer tissues, the relative expression levels based on the beta-Actin expression level of each gene in the sample tissues are 0.4577 or less and 0.3511 or less, respectively. If it exceeds, it means that it is determined to be normal, and in the case of INHBA, ISG15, and MMP11 that is highly expressed in breast cancer tissues, the interpretation is reversed.
  • FIG. 3 is a graph showing ROC curves of expression levels of candidate biomarkers for diagnosing breast cancer, targeting only breast cancer patients whose stage 1 is advanced.
  • FIG. 3A is a graph illustrating reconstructed values of only breast cancer patients whose stage 1 is advanced.
  • 3B is a ROC curve for each gene targeting only breast cancer patients whose progression stage is stage 1.
  • Table 6 shows the sensitivity and specificity for the diagnosis of breast cancer in which the stage of progression of the candidate biomarker for diagnosing breast cancer is stage 1 when cancer and normal determination criteria are set to specific threshold values.
  • the pattern sensitivity and specificity of the ROC curve for the stage 1 breast cancer diagnosis are similar to those of the breast cancer diagnosis in which the progress stages of FIGS.
  • the diagnostic candidate biomarker can be used to effectively diagnose breast cancer at stage 1, thereby treating breast cancer at an early stage.
  • KRT15 or ECRG4 which is a specifically low expression gene in breast cancer tissue
  • a combination of KRT15, ECRG4, INHBA, ISG15, MMP11 which is a gene that is specifically low or high expression in breast cancer tissue
  • Logistic regression analysis was performed to determine the diagnosis accuracy when using the biomarker for breast cancer diagnosis. The results are shown in Table 7. However, when only one gene is used as a biomarker for diagnosing breast cancer, there may be a difference between a diagnostic performance value by ROC curve and a diagnostic performance value by logistic regression analysis.
  • the probability of judging breast cancer patients as breast cancer is 96.87%, and the probability of judging normal subjects as normal is 31.25%, whereas the combination of KRT15 gene and ECRG4 gene is used.
  • the probability of determining a normal person as normal increases to 50%, and as a result, the diagnosis accuracy is increased.
  • the probability of determining a breast cancer patient as a breast cancer or a probability of determining a normal person as normal increases the diagnosis accuracy through a combination of breast cancer diagnostic biomarkers.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 유방암 진단용 바이오마커 및 이에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 유방암 진단제에 관한 것으로서, KRT15의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독 또는 ECGR4의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독으로 이루어진 유방암 진단용 바이오마커와, 프로브로서 유방암 진단용 바이오 마커를 구성하는 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 상보적으로 결합하여 증폭할 수 있는 프라이머를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제를 제공한다. 검체의 조직으로부터 본 발명의 유방암 진단용 바이오마커를 구성하는 유전자인 KRT15의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독 또는 ECGR4의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독의 발현 수준을 측정하고 이를 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하는 경우 유방암, 특히 초기단계로서 진행단계가 1기인 유방암을 효과적으로 진단할 수 있고, 이를 통해 유방암을 조기에 치료할 수 있다. 아울러, 본 발명의 유방암 바이오마커 조성물을 구성하는 유전자자의 DNA 단편 내지 전장 DNA의 발현 수준을 이를 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하는 경우 유방암의 진단에 대한 특이도와 민감도를 향상시킬 수 있다.

Description

유방암 진단용 바이오마커 및 유방암 진단제
본 발명은 유방암 진단용 바이오마커 및 이에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 유방암 진단제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유방암 진단용 바이오마커 조성물 및 이에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 유방암 진단제 조성물에 관한 것이다.
전세계에서 유방암은 폐암에 이어 두번째로 흔히 발생되는 암이며, 사망률은 5위에 해당하는 위험한 암이다. 유방암의 경우 일단 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에 조기 발견이 다른 암보다 더 중요하다고 할 수 있다.
유방암에 인한 사망률을 줄이기 위해서는 첫째, 유방암을 초기에 조기 진단하고 둘째, 일차 수술에 의한 치료 이후 예후를 진단하여 적절한 부가 치료 (Adjuvant therapy)를 하는 것이 중요하다. 현재 유방암 진단에는 1차 촉진에 의한 자가 진단 외에, 유방 X-선 조영술, 초음파검사법 등이 예방차원에서의 검진방법으로 사용되고 있으며 이 방법은 초기의 유방암을 진단하는 데에도 가장 널리 사용되는 방법이다. 그러나, 유방 X-선 조영술은 우리나라 여성들에서 흔히 발견되는 조밀유방일 경우 섬유질이 많아서, 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 특히 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있어도 진단율이 떨어진다. 또한, X-선을 사용하기 때문에 진단 과정에서 오히려 유방암이 생길 가능성도 배제 할 수 없다. 그래서 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있지만 이 역시 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구별하기는 쉽지 않다. 실제 임상에서는 이상 소견이 있으면 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등을 부가적으로 사용하여 진단율을 높이고 있다. 그러나, 이 방법들을 사용하더라도 정상조직과 비 정상조직을 형태상으로 구분할 뿐 악성종양(cancer) 과 양성종양(non-cancer)을 구분하기가 쉽지 않기 때문에 확진을 위해서는 더욱 정밀한 조직검사를 하게 된다. 이와 같은 이유들로 인해 유방암은 다른 암에 비해 비교적 분자 유전학적인 방법으로 유방암을 진단하는 방법이 발달되어 있다. 조직검사에서 조직을 잘라서 병변을 확인한 다음 적출을 위한 1차 수술이 시행된다. 이후의 부가치료를 어떻게 할지 결정하기 위하여 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor, ER)의 유무와 유방암 특이 종양표지자인 HER2/neu(Human Epidermal growth factor Receptor 2, ErbB-2 또는 ERBB2라고도 알려져 있다) 유전자의 수를 조직내 교잡법( in situ hybridization)을 통해 확인하는 방법을 사용한다. 만약, 발견된 암 조직이 에스트겐 수용체를 가지고 있으면, 타목시펜(Tamoxifen)과 같은 에스트로겐 유사체를 사용하여 치료를 하게 되고, HER2/neu 유전자가 과발현되어 있으면, HER2/neu 단클론항체인 trastuzumab을 제품화한 허셉틴(Herceptin)을 유방암의 치료에 사용하게 된다. 유방암의 진단 및 치료에 가장 유용하게 사용되는 유방암 특이 진단 마커인 HER2/neu 유전자의 증폭 및 과발현은 침습성 유방암의 20 ~ 35%에서 발견된다. 따라서. HER2/neu 검사는 에스트로겐 수용체 검사와 더불어 유방암 환자의 치료에 결정적인 역할을 한다.
그러나, 유방암 환자 모두가 ER 유전자나 Her2/neu 유전자가 과발현되어 있는 것은 아니므로, 이러한 진단 방법들의 단점을 보완하고 좀더 빠르고 확실하게 암을 구분하기 위하여 암 특이적 종양표지자(biomarker)를 찾기 위한 시도가 다양하게 이루어지고 있으며, 이를 이용한 새로운 진단 방법들이 최근 소개되고 있다. 최근 미국에서 Oncotype DX라고 하는 21-gene assay (Oncotype DX, Genomic Health, Redwood City, CA)와 MammaPrint라고 하는 70-gene assay (MammaPrint, Agendia, Amsterdam, the Netherlands)가 제품화 되어 임상에서 실제 사용되고 있다. Oncotype DX는 실시간 정량 PCR 방법으로16개의 유방암 관련 유전자와 5개의 대조군 유전자를 검사는 방법이고, MammaPrint는 70개의 유전자를 마이크로어레이 방법으로 검사하는 방법이다. 이들 두 방법은 1차 수술이후, 부가 치료를 어떠한 방식으로 할 지에 관한 표준을 제시하고 있으며, 이로 인해 개인 맞춤 치료가 가능하게 되었다 (Am J Health-Syst PharmVol 65 Jan 1, 2008 23-28).
본 발명자들은 유방암 진단 과정에서 수득할 수 있는 미량의 조직으로부터 전체 RNA(total RNA)를 분리하고, 이를 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성한 다음, 특이적 프라이머를 이용한 실시간 중합효소 반응을 통하여 조직 내에 포함되어 있는 KRT15 유전자, ECRG4 유전자, INHBA 유전자, ISG15 유전자, 또는 MMP11 유전자의 발현 정도, 특히 상기 유전자 전사체의 특정 부위의 발현 정도가 유방암과 유의적으로 관련이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였고, 상기 유방암 관련 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독, 또는 이들의 조합을 유방암 진단용 바이오마커 또는 바이오마커 조성물로 사용하여 유방암 유무를 간단하게 확인할 수 있는 방법을 제시하고자 한다.
본 발명은 유방암 환자 조직과 정상 조직간에서 발현 수준의 차이를 보이며, 유방암의 초기 단계를 진단하는데 이용될 수 있는 신규 바이오마커 및 이에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제를 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한, 유방암 진단에 대한 특이도와 민감도를 향상시킬 수 있는 바이오마커 조성물 및 이에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 일 목적은 유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 유전자인 KRT15 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독, 또는 ECRG4 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독으로 유방암 진단용 바이오마커를 제공함으로써 달성될 수 있다.
아울러, 본 발명의 일 목적은 KRT15 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브 단독 또는 ECRG4 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브 단독을 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제를 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 1) KRT15 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA 및 ECRG4 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA로 이루어진 유방암 진단용 바이오마커 조성물, 2) KRT15 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA 및 ECRG4 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커와 INHBA 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA, ISG15 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA, 및 MMP11 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커로 이루어진 유방암 진단용 바이오마커 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.
아울러, 본 발명의 다른 목적은 3) KRT15 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 ECRG4 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제 조성물, 4) KRT15 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 ECRG4 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브와 INHBA 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브, ISG15 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브, 및 MMP11 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.
검체의 조직으로부터 본 발명의 유방암 진단용 바이오마커를 구성하는 유전자인 KRT15의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독 또는 ECGR4의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독의 발현 수준을 측정하고 이를 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하는 경우 유방암, 특히 초기단계로서 진행단계가 1기인 유방암을 효과적으로 진단할 수 있고, 이를 통해 유방암을 조기에 치료할 수 있다. 아울러, 본 발명의 유방암 바이오마커 조성물을 구성하는 유전자자의 DNA 단편 내지 전장 DNA의 발현 수준을 측정하고 이를 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하는 경우 유방암의 진단에 대한 특이도와 민감도를 향상시킬 수 있다. 이때, 본 발명의 유방암 진단제 또는 유방암 진단제 조성물을 이용하는 경우 유방암 진단용 바이오마커 또는 바이오마커 조성물를 구성하는 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA의 발현 수준을 쉽게 측정할 수 있다.
도 1은 정상인의 정상 조직과 진행단계별 유방암 환자의 유방암 조직에서의 유방암 진단용 후보 바이오마커 유전자의 발현수준을 나타낸 그래프로서, 도 1A는 INHBA 유전자를, 도 1B는 MMP11 유전자를, 도 1C는 ISG15 유전자를, 도 1D는 KRT15 유전자를, 도 1E는 ECRG4 유전자를 나타낸 것이다.
도 2는 유방암 환자의 진행단계를 고려하지 않은 유방암 진단용 후보 바이오마커의 발현수준에 대한 ROC 커브를 나타낸 그래프로서, 도 2A는 도 1을 재구성한 것이고, 도 2B는 각 유전자별 ROC 커브이다.
도 3은 진행단계가 1기인 유방암 환자만을 대상으로 하여 유방암 진단용 후보 바이오마커의 발현수준에 대한 ROC 커브를 나타낸 그래프로서, 도 3A는 도 1의 진행단계가 1기인 유방암 환자만의 값을 재구성한 것이고, 도 3B는 진행단계가 1기인 유방암 환자만을 대상으로 한 각 유전자별 ROC 커브이다.
본 발명은 유방암 조직에서 정상 조직보다 특이적으로 저발현되는 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA와 고발현되는 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA를 바이오마커로 이용하고, 상기 바이오마커를 구성하는 유전자의 특정 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하여 발현 수준을 측정할 수 있는 프로브를 진단제의 유효성분으로 이용한다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서 유방암 진단용 바이오 마커로 사용되는 유전자의 정보 및 전장 DNA의 서열번호는 표 1과 같고, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는데 사용되는 프로브, 프로브의 서열번호 및 프로브가 인식할 수 있는 유전자 mRNA상의 염기서열 위치는 표 2와 같고, 상기 프로브 및 각 유전자의 cDNA를 이용한 정량 실시간 PCR(quantitative real-time PCR, QRT-PCR) 방법에 의해 측정되어지는 각 유전자의 특정 DNA 단편의 서열번호, 염기서열 길이 및 녹는점은 표 3과 같다.
표 1
유전자 mRNA 젠뱅크 승인번호 mRNA 염기서열의 길이 전장 DNA 서열번호
KRT15(keratin 15) NM_002275 1861 bp 서열번호 2
ECRG4(esophageal cancer related gene 4 protein) NM_032411 793 bp 서열번호 6
INHBA(inhibin, beta A) NM_002192 2175 bp 서열번호 10
ISG15(ISG15 ubiquitin-like modifier) NM_005101 685 bp 서열번호 14
MMP11(matrix metallopeptidase 11) NM_005940 2276 bp 서열번호 18
표 2
유전자 프로브 프로브 서열번호 프로브가 인식하는 유전자 mRNA상의 염기서열 위치
KRT15(keratin 15) 센스 프라이머 서열번호 3 665~744
안티센스 프라이머 서열번호 4
ECRG4(esophageal cancer related gene 4 protein) 센스 프라이머 서열번호 7 288~361
안티센스 프라이머 서열번호 8
INHBA(inhibin, beta A) 센스 프라이머 서열번호 11 1178~1262
안티센스 프라이머 서열번호 12
ISG15(ISG15 ubiquitin-like modifier) 센스 프라이머 서열번호 15 140~220
안티센스 프라이머 서열번호 16
MMP11(matrix metallopeptidase 11) 센스 프라이머 서열번호 19 1801~1894
안티센스 프라이머 서열번호 20
표 3
유전자 프로브 프로브에 의해 측정되는 유전자 DNA 단편의 서열번호 유전자 DNA 단편의 염기서열 길이 유전자 DNA 단편의 녹는점(℃)
KRT15(keratin 15) 서열번호 3, 서열번호 4 서열번호 1 80 57.92~58.02
ECRG4(esophageal cancer related gene 4 protein) 서열번호 7, 서열번호 8 서열번호 5 74 57.66~57.86
INHBA(inhibin, beta A) 서열번호 11, 서열번호 12 서열번호 9 85 57.92~57.98
ISG15(ISG15 ubiquitin-like modifier) 서열번호 15, 서열번호 16 서열번호 13 81 57.90~58.20
MMP11(matrix metallopeptidase 11) 서열번호 19, 서열번호 20 서열번호 17 94 57.94~58.00
본 발명의 일 측면은 유방암 진단용 바이오마커 및 이에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 유방암 진단제에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 이루어지는 유방암 진단용 바이오마커, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 이루어지는 유방암 진단용 바이오마커를 제공한다. KRT15 유전자 또는 ECRG4 유전자는 유방암 조직에서 정상 조직보다 특이적으로 저발현되는 것을 특징으로 하기 때문에 각 유전자의 전장 DNA를 유방암 진단용 바이오마커로 사용될 수 있으며, 특히 검체 조직에서의 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편의 양, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편의 양을 통해 각각 KRT15 유전자의 정량적인 발현 수준과 ECRG4 유전자의 정량적인 발현 수준을 간접적으로 측정할 수 있으므로 각 DNA 단편 또한 유방암 진단용 바이오마커로 사용될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제 또는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제를 제공한다. 이때 프로브는 각 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하여 각 유전자의 DNA 단편의 양 내지 각 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 각 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 상보적으로 결합하여 증폭할 수 있는 프라이머쌍이고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 3의 센스 프라이머와 서열번호 4의 안티센스 프라이머, 또는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 7의 센스 프라이머와 서열번호 8의 안티센스 프라이머로 구성된다.
본 발명의 유방암 진단용 바이오마커와 유방암 진단제를 이용하여 유방암을 진단하는 방법은 정량 실시간 PCR (quantitative real-time PCR, QRT-PCR) 방법을 포함하여 본 발명의 업계에서 사용되는 방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 바람직한 일 실시예로서 a) 검체의 유방 조직으로부터 전체 RNA(total RNA)를 분리하는 단계, b) 분리된 RNA로부터 역전사효소(Reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하는 단계, c) 합성한 cDNA를 주형으로 하고 정량 실시간 PCR(quantitative real-time PCR, QRT-PCR) 반응을 통해 특정 유전자(KRT15 유전자 또는 ECRG4 유전자)의 전장 cDNA 또는 cDNA 단편을 증폭하는 단계, d) 증폭된 전장 cDNA 또는 cDNA 단편의 양으로부터 특정 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, e) 측정된 검체 유방 조직의 특정 유전자의 발현 수준과 정상 조직의 특정 유전자의 발현 수준을 비교하여 유방암 여부를 판정하는 단계를 포함한다.
상기의 유방암 진단방법 중 b) 단계는 역전사효소와 18~20 bp 길이의 올리고디티(oligo dT) 프라이머를 포함하는 하나의 키트에 의해 구현될 수 있고, c)와 d)단계는 열안정성 중합효소(hot-start Taq), KRT15 유전자(또는 ECRG4 유전자)의 전장 cDNA 또는 cDNA 단편에 상보적으로 결합하여 전장 cDNA 또는 cDNA 단편을 증폭할 수 있는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 완충액, cDNA 또는 cDNA 단편의 양을 정량하는데 필요한 형광물질 (일례로 SYBR Green I) 등으로 구성된 유방암 진단용 정량 실시간 PCR 반응 전혼합물(pre-mixture)을 포함하는 하나의 키트에 의해 구현될 수 있고, 모든 단계의 유방암 진단방법은 각 단계를 구현하는 키트 내지 장치를 하나의 칩으로 구성한 랩온어칩(Lab on a chip, LOC)에 의해 구현될 수 있다.
아울러, 특정 유전자의 발현 수준인 mRNA의 양과 상기 mRNA에 의해 생성되는 단백질의 양은 일반적으로 비례관계에 있으므로, KRT15 단백질 또는 ECRG4 단백질을 유방암 진단용 바이오마커로 이용할 수 있고 KRT15 단백질 또는 ECRG4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유방암 진단제로 이용할 수 있음은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 자명하다.
본 발명의 유방암 진단용 바이오마커와 유방암 진단제를 이용하여 진단할 수 있는 유방암의 진행단계는 1기 내지 4기를 포함하고, 특히 유방암의 진행단계가 1기인 경우에도 높은 수준의 민감도와 특이도를 유지할 수 있으므로, 본 발명의 유방암 진단용 바이오마커와 유방암 진단제를 이용하는 경우 초기단계에 있는 유방암을 진단하여 조기에 치료할 수 있다
본 발명의 다른 측면은 유방암 진단용 바이오마커 조성물 및 이에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 유방암 진단제 조성물에 관한 것이다.
이하, 유방암의 진단방법, 진단할 수 있는 유방암의 진행단계, 각 유전자의 단백질을 유방암 진단용 바이오마커로 이용하고 항체를 유방암 진단제로 이용하는 내용은 앞에서 기술한 것과 동일하므로 생략한다.
본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA; 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 이루어지는 유방암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독 또는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독으로 이루어진 유방암 진단용 바이오마커를 이용하여 유방암을 진단하는 경우 로지스틱 회귀분석에 의한 특이도(Specificity, 정상인을 정상으로 판정할 확률)가 대략 30~50%이나, 유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 두 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA를 조합한 유방암 진단용 바이오마커 조성물을 이용하여 유방암을 진단하는 경우 로지스틱 회귀분석에 의한 특이도가 거의 70%가까이 증가하여 진단하고자 하는 검체의 분류 정확도를 높일수 있다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제 조성물을 제공한다. 이때, KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 대한 프로브는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 3의 센스 프라이머와 서열번호 4의 안티센스 프라이머로 구성되고, ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 대한 프로브는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 7의 센스 프라이머와 서열번호 8의 안티센스 프라이머로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 구성되는 그룹으로부터 하나 이상 선택되고, 유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 것을 특징으로 하는 바이오마커; 및 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 INHBA 유전자의 DNA 내지 또는 전장 DNA, 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ISG15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA, 및 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MMP11 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 구성되는 그룹으로부터 하나 이상 선택되고, 유방암 조직에서 특이적으로 고발현되는 것을 특징으로 하는 바이오마커로 이루어진 유방암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA와 유방암 조직에서 특이적으로 고발현되는 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA을 조합하고, 이를 유방암 진단용 바이오마커 조성물로 이용하는 경우 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독 또는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA 단독으로 이루어진 유방암 진단용 바이오마커를 이용하여 유방암을 진단하는 경우보다 로지스틱 회귀분석에 의한 민감도(암환자를 암으로 판정할 확률, Sensitivity) 또는 특이도가 증가하여 검체의 분류 정확도를 높일수 있다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브; 및 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 INHBA 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브, 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ISG15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브, 및 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MMP11 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제 조성물을 제공한다. 이때, KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 대한 프로브는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 3의 센스 프라이머와 서열번호 4의 안티센스 프라이머로 구성되고, ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 대한 프로브는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 7의 센스 프라이머와 서열번호 8의 안티센스 프라이머로 구성되고, INHBA 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 대한 프로브는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 11의 센스 프라이머 및 서열번호 12의 안티센스 프라이머로 구성되고, ISG15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 대한 프로브는 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 15의 센스 프라이머 및 서열번호 16의 안티센스 프라이머로 구성되고, MMP11 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 대한 프로브는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드를 인식할 수 있는 서열번호 19의 센스 프라이머 및 서열번호 20의 안티센스 프라이머로 구성되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 명확하게 설명하기 위한 것일뿐, 본 발명의 권리범위가 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1. 유방암 진단용 후보 바이오마커의 선별
정상조직 27개 및 유방암 조직 78개로부터 전체 RNA를 분리한 후 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하고, Affymetrix 사의 GeneChip 시스템인 U133 GeneChip(45000 probe sets, 39,000 transcripts)에 혼성화(hybridization)시켜 유전자 발현 양상, 즉 mRNA의 양을 분석하였다. 이때 적절한 조직 시료는 PCR 통계 분석법(Principal Component Analysis: 각 시료의 발현 유사성을 조사하는 통계적 분석법)을 이용하여 구하였고, 분석된 mRNA의 양을 기초로 발현도가 통계적 유의성을 가지고 변하는 유전자들을 확보하였다(p-value ≤0.05, fold change ≥3.0). 본 실험을 통하여 9개의 유전자를 확보하였고, 구체적으로 유방암 고발현 유전자인 INHBA, HIST2H2AA, FNDC1, MMP11, CXCL9, CXCL10, ISG15 와 유방암 저발현 유전자인 ECRG4, KRT15 이었다. 이중 KRT15, ECRG4, INHBA, ISG15, MMP11을 유방암 진단용 후보 바이오마커로 선별하였다.
실시예 2. 선별된 유방암 진단용 후보 바이오마커의 유방암 진행 단계에 따른 발현수준 분석
(1) 선별된 유방암 진단용 후보 바이오마커의 발현수준 측정
16명의 암이 아니라고 판정된 환자 조직으로부터 분리한 유방 조직과 실제 암으로 판정된 128명의 유방암 환자로부터 분리한 유방암 조직을 가지고, 정량 실시간 PCR (quantitative real-time PCR, QRT-PCR) 방법을 이용하여 선별된 유방암 진단용 후보 바이오마커인 KRT15, ECRG4, INHBA, ISG15, MMP11의 발현량을 분석하였다. 이때 정상인의 정보와 유방암 환자의 진행단계 별 정보는 표 4에 나타나는 바와 같다.
표 4
환자 구분 유방암 진행단계 환자수 나이 평균값
정상인 16 45.9
유방암 환자 1기 23 60.3
2A기 36 56.4
2B기 23 55.3
3A기 22 54.6
3B기 6 66.2
3C기 13 52.4
4기 5 46.6
먼저 검체의 조직으로부터 전체 RNA를 분리하고, 역전사효소 및 올리고디티(oligo dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 열안정성 중합효소(hot-start Taq), 프라이머, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 완충액, SYBR Green I 형광물질로 구성된 정량 실시간 PCR 반응 전혼합물(pre-mixture)을 이용한 정량 실시간 PCR 반응법으로 유방암 진단용 후보 바이오마커 유전자의 발현수준을 측정하였다. 이때 유방암 진단용 후보 바이오마커 유전자의 발현수준은 대조군으로 사용된 베타엑틴(actin, beta; ACTB)의 발현량을 기준으로 하여 상대적인 발현량으로 계산하였다.
정량 실시간 PCR 반응법에서 각 유전자의 cDNA를 증폭하는 데 사용된 프라이머는 표 2의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머이고, 증폭된 cDNA 단편은 각각 표 3에 나타난 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드이었다. 또한, 베타엑틴 유전자의 cDNA를 증폭하는 데 사용된 프라이머는 서열번호 21의 센스 프라이머와 서열번호 22의 안티센스 프라이머이고, 그에 의해 증폭된 cDNA 단편은 베타엑틴 유전자의 젠벤크 승인번호 NM_001101에 나타나는 염기서열의 876~963 위치에 해당하는 88개 염기의 폴리뉴클레오티드이고 녹는점은 57.88~57.98℃의 범위를 가지다.
도 1은 정상인의 정상 조직과 진행단계별 유방암 환자의 유방암 조직에서의 유방암 진단용 후보 바이오마커 유전자의 발현수준을 나타낸 그래프로서, 도 1A는 INHBA 유전자를, 도 1B는 MMP11 유전자를, 도 1C는 ISG15 유전자를, 도 1D는 KRT15 유전자를, 도 1E는 ECRG4 유전자를 나타낸 것이다. 도 1에서 y축은 베타엑틴(Beta-Actin)의 발현량을 기준으로 한 상대적인 발현량을 의미하는 것으로서, 값 "1"은 베타엑틴의 발현량과 동일한 양이 발현됨을 의미한다. 도 1에서 보이는 바와 같이 KRT15 유전자와 ECRG4 유전자는 대부분의 진행단계별 유방암 환자의 유방암 조직에서 정상인의 정상조직보다 약 10~100배 수준으로 저발현되었고, INHBA 유전자, ISG15 유전자 및 MMP11 유전자는 대부분의 진행단계별 유방암 환자의 유방암 조직에서 정상인의 정상조직보다 약 10~100배 수준으로 고발현되었다.
(2) ROC(receiver operating characteristic) 커브 분석을 통한 선별된 유방암 진단용 후보 바이오마커의 유방암 진단 성능
유방암 진단용 후보 바이오마커의 유방암 진단에 대한 민감도 및 특이성을 알아보기 위하여 유방암 진단용 후보 바이오마커의 발현수준을 기초로 ROC 커브를 작성하였다. 이때 계산은 MedCalcversion10.1.7.0 프로그램을 사용하였다.
도 2는 유방암 환자의 진행단계를 고려하지 않은 유방암 진단용 후보 바이오마커의 발현수준에 대한 ROC 커브를 나타낸 그래프로서, 도 2A는 도 1을 재구성한 것이고, 도 2B는 각 유전자별 ROC 커브이다. ROC 커브에서 y축은 민감도(sensitiviy, 암환자를 암으로 판정할 확률)를, x축은 정상인을 암으로 판정할 확률인 FPR(False positive rate)을 의미하고, 백분율을 기준으로 "100-FPR"은 특이도(specificity, 정상인을 정상으로 판정할 확률)를 의미한다. 도 2에서 보이는 바와 같이 선별된 유방암 진단용 후보 바이오마커는 유방암 진단에 대한 높은 민감도와 특이도를 가지고 있다.
암과 정상의 판정기준을 특정 임계값으로 설정하였을때 유방암 진단용 후보 바이오마커의 유방암 환자의 진행단계를 고려하지 않은 전체 단계의 유방암 진단에 대한 민감도와 특이도를 표 5에 나타내었다. 표 5에서 나타내는 바와 같이 후보 바이오마커는 높은 민감도와 특이도를 가지고 있고, 특히 KRT15와 ECRG4는 다른 후보 바이오마커보다 더 높은 민감도를 보였다.
표 5
구분 ECRG4 ISG15 INHBA KRT15 MMP11
민감도(%) 89.8 74.2 78.9 91.4 71.9
특이도(%) 100 100 93.7 93.7 93.7
임계값 <= 0.3511 > 2.395 > 1.9834 <= 0.4577 > 2.4751
P value 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
여기서, 임계값을 살펴보면, 유방암 조직에서 저발현되는 KRT15, ECRG4의 경우 검체 조직에서의 각 유전자의 베타엑틴(Beta-Actin) 발현량을 기준으로 한 상대적인 발현량이 각각 0.4577이하, 0.3511 이하이면 암으로 판정하고, 초과하면 정상으로 판정함을 의미하고, 유방암 조직에서 고발현되는 INHBA, ISG15, MMP11의 경우 반대로 해석된다.
도 3은 진행단계가 1기인 유방암 환자만을 대상으로 하여 유방암 진단용 후보 바이오마커의 발현수준에 대한 ROC 커브를 나타낸 그래프로서, 도 3A는 도 1의 진행단계가 1기인 유방암 환자만의 값을 재구성한 것이고, 도 3B는 진행단계가 1기인 유방암 환자만을 대상으로 한 각 유전자별 ROC 커브이다. 또한, 표 6은 암과 정상의 판정기준을 특정 임계값으로 설정하였을때 유방암 진단용 후보 바이오마커의 진행단계가 1기인 유방암 진단에 대한 민감도와 특이도를 나타낸 것이다.
표 6
구분 ECRG4 ISG15 INHBA KRT15 MMP11
민감도(%) 78.3 82.5 91.3 82.6 69.6
특이도(%) 100 100 93.7 87.5 100
임계값 <= 0.3511 > 2.395 > 1.9834 <= 0.4577 > 2.4751
P value 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
도 3과 표 6에서 나타나는 바와 같이 진행단계가 1기인 유방암 진단에 대한 ROC 커브의 패턴 민감도, 특이도는 도 2 및 표 5의 진행단계가 전체인 유방암 진단의 경우와 거의 유사하므로, 선별된 유방암 진단용 후보 바이오마커를 이용하여 진행단계가 1기인 유방암을 효과적으로 진단할 수 있고, 이를 통해 조기에 유방암을 치료할 수 있다.
(3) 로지스틱 회귀분석을 통한 유방암 진단용 후보 바이오마커 조합의 진단 성능 분석
유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 유전자인 KRT15 또는 ECRG4 하나만을 유방암 진단용 바이오마커로 이용하는 경우와 유방암 조직에서 특이적으로 저발현 또는 고발현되는 유전자인 KRT15, ECRG4, INHBA, ISG15, MMP11의 조합을 유방암 진단용 바이오마커로 이용하는 경우의 진단 정확도를 알아보기 위하여 로지스틱 회귀분석을 실시하였고, 그 결과를 표 7에 나타내었다. 단, 하나만의 유전자를 유방암 진단용 바이오마커로 사용하는 경우 ROC 커브에 의한 진단 성능 값과 로지스틱 회귀분석에 의한 진단 성능 값은 차이가 있을 수 있다.
표 7
바이오마커 유전자의 조합수 KRT15 ECRG4 ISG15 INHBA MMP11 특이도(정상 구분률)(%) 민감도(암 구분률)(%) 진단 정확도(%)
1 ○ 31.25 96.87 89.58
○ 50 96.87 91.67
2 ○ ○ 68.75 96.87 93.75
○ ○ 75 99.22 96.53
○ ○ 68.75 98.44 95.14
○ ○ 50 98.44 93.06
○ ○ 81.25 98.44 96.53
○ ○ 68.75 97.66 94.44
○ ○ 62.5 97.66 93.75
3 ○ ○ ○ 75 97.66 95.14
○ ○ ○ 75 99.22 96.53
○ ○ ○ 75 96.87 94.44
○ ○ ○ 81.25 99.22 97.22
○ ○ ○ 81.25 96.87 95.14
○ ○ ○ 75 97.66 95.14
○ ○ ○ 93.75 99.22 98.61
○ ○ ○ 87.5 99.22 97.92
○ ○ ○ 81.25 98.44 96.53
4 ○ ○ ○ ○ 93.75 99.22 98.61
○ ○ ○ ○ 87.5 99.22 97.92
○ ○ ○ ○ 81.25 98.44 96.53
○ ○ ○ ○ 75 97.66 95.14
○ ○ ○ ○ 93.75 99.22 98.61
5 ○ ○ ○ ○ ○ 93.75 99.22 98.61
표 7에서 나타나는 바와 같이 KRT15 유전자만을 유방암 진단용 바이오마커로 사용하는 경우 유방암 환자를 유방암으로 판정할 확률은 96.87%이고 정상인을 정상으로 판정할 확률은 31.25%인데 반해, KRT15 유전자와 ECRG4 유전자를 조합하여 유방암 진단용 바이오마커로 사용하면 정상인을 정상으로 판정할 확률이 50%로 증가하고, 결과적으로 진단 정확도가 높아진다. KRT15, ECRG4, INHBA, ISG15, MMP11의 조합수가 증가할수록 유방암 환자를 유방암으로 판정할 확률 또는 정상인을 정상으로 판정할 확률이 증가하므로 유방암 진단용 바이오마커의 조합을 통해 진단 정확도를 높일 수 있다.

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 이루어지고, 유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 바이오마커.
  2. 제 1항의 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3의 센스 프라이머 및 서열번호 4의 안티센스 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 유방암 진단제.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 유방암은 진행단계가 1기인 것을 특징으로 하는 유방암 진단제.
  5. 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 이루어지고, 유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 바이오마커.
  6. 제 5항의 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 7의 센스 프라이머 및 서열번호 8의 안티센스 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 유방암 진단제.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 유방암은 진행단계가 1기인 것을 특징으로 하는 유방암 진단제.
  9. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA; 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 이루어지고,
    유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 바이오마커 조성물.
  10. 제 9항의 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 3의 센스 프라이머 및 서열번호 4의 안티센스 프라이머로 구성되고,
    상기 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 7의 센스 프라이머 및 서열번호 8의 안티센스 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 유방암 진단제 조성물.
  12. 제 10항 또는 제11항에 있어서, 상기 유방암은 진행단계가 1기인 것을 특징으로 하는 유방암 진단제.
  13. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA 및 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 구성되는 그룹으로부터 하나 이상 선택되고, 유방암 조직에서 특이적으로 저발현되는 것을 특징으로 하는 바이오마커; 및
    서열번호 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 INHBA 유전자의 DNA 내지 또는 전장 DNA, 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ISG15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA, 및 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MMP11 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA로 구성되는 그룹으로부터 하나 이상 선택되고, 유방암 조직에서 특이적으로 고발현되는 것을 특징으로 하는 바이오마커로 이루어진 유방암 진단용 바이오마커 조성물.
  14. 제 13항의 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브; 및
    INHBA 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브, ISG15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브, 및 MMP11 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단제 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 KRT15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 3의 센스 프라이머 및 서열번호 4의 안티센스 프라이머로 구성되고,
    상기 ECRG4 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 7의 센스 프라이머 및 서열번호 8의 안티센스 프라이머로 구성되고,
    상기 INHBA 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 11의 센스 프라이머 및 서열번호 12의 안티센스 프라이머로 구성되고,
    상기 ISG15 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 15의 센스 프라이머 및 서열번호 16의 안티센스 프라이머로 구성되고,
    상기 MMP11 유전자의 DNA 단편 내지 전장 DNA에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 19의 센스 프라이머 및 서열번호 20의 안티센스 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 유방암 진단제 조성물.
  16. 제 14항 또는 제15항에 있어서, 상기 유방암은 진행단계가 1기인 것을 특징으로 하는 유방암 진단제 조성물.
PCT/KR2010/002768 2009-05-01 2010-04-30 유방암 진단용 바이오마커 및 유방암 진단제 WO2010126338A2 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090038713A KR101174369B1 (ko) 2009-05-01 2009-05-01 유방암 진단용 바이오마커 및 유방암 진단제
KR10-2009-0038713 2009-05-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2010126338A2 true WO2010126338A2 (ko) 2010-11-04
WO2010126338A3 WO2010126338A3 (ko) 2011-06-23

Family

ID=43032714

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2010/002768 WO2010126338A2 (ko) 2009-05-01 2010-04-30 유방암 진단용 바이오마커 및 유방암 진단제

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101174369B1 (ko)
WO (1) WO2010126338A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013048238A1 (en) * 2011-09-26 2013-04-04 Macawi International B.V. Dynamic blower module
CN106924714A (zh) * 2017-03-16 2017-07-07 山东大学 多肽c2orf40mpf在制备抗肿瘤药物中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102133432B1 (ko) * 2019-12-26 2020-07-14 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 폐암 질환의 진단용 마커

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040029114A1 (en) 2001-01-24 2004-02-12 Eos Technology, Inc. Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
AU2002322280A1 (en) 2001-06-21 2003-01-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
CN1898563B (zh) 2003-09-24 2011-11-23 肿瘤疗法科学股份有限公司 诊断乳腺癌的方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUN-MEI YUE ET AL.: 'Expression of ECRG4, a novel esophageal cancer-related gene, downregulated by CpG island hypermethylation in human esophageal squamous cell carcinoma.' WORLD J. GASTROENTEROL. vol. 9, no. 6, 2003, pages 1174 - 1178 *
DATABASE GENBANK 07 October 2008 'Synthetic construct DNA, clone: pF1KB7035, Homo sapiens INHBA gene for inhibin, beta A, without stop codon, in Flexisystem.' Database accession no. AB464591 *
DATABASE GENBANK 10 May 2008 'Synthetic construct Homo sapiens clone IMAGE:100010086; FLH186114.01L; RZPDo839B0261D esophageal cancer related gene 4 protein (ECRG4) gene, encodes complete protein.' Database accession no. DQ895626 *
DATABASE GENBANK 16 September 2006 'PREDICTED: Pan troglodytes matrix metalloproteinase 11 (MMP11), mRNA.' Database accession no. XM 515022 *
DATABASE GENBANK 21 December 2008 'Homo sapiens keratin 15 (KRT15), mRNA.' Database accession no. NM 002275 *
DATABASE GENBANK 26 April 2009 'Homo sapiens ISG15 ubiquitin-like modifier (ISG15), mRNA.' Database accession no. NM_005101 *
RIA H. W. WETZELS ET AL.: 'Basal Cell-specific and Hyperproliferation-related Keratins in Human Breast Cancer.' AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY. vol. 138, no. 3, 1991, pages 751 - 763 *
SHYAMAL D. DESAI ET AL.: 'ISG15 as a novel tumor biomarker for drug sensitivity.' MOL. CANCER THER. vol. 7, no. 6, 2008, pages 1430 - 1439 *
XIAO-JUN MA ET AL.: 'Gene expression profiling of the tumor microenvironment during breast cancer progression.' BREAST CANCER RESEARCH. vol. 11, no. 1, 02 February 2009, pages 1 - 18 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013048238A1 (en) * 2011-09-26 2013-04-04 Macawi International B.V. Dynamic blower module
CN106924714A (zh) * 2017-03-16 2017-07-07 山东大学 多肽c2orf40mpf在制备抗肿瘤药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100119661A (ko) 2010-11-10
KR101174369B1 (ko) 2012-08-16
WO2010126338A3 (ko) 2011-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1670946B1 (en) Predicting breast cancer treatment outcome
US20180127834A1 (en) Predicting breast cancer treatment outcome
BRPI0708534A2 (pt) ensaio molecular para prognosticar a recorrência de cáncer do cólon dukes b
KR20090098677A (ko) 폐암특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 폐암 검출방법
Rogers et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs
CA3026809A1 (en) Compositions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles
KR20180002882A (ko) 유전자 발현 프로파일 및 유방암에 대한 이의 용도
US9353416B2 (en) Gene relating to estimation of postoperative prognosis for breast cancer
KR20130017525A (ko) 대장암, 유방암, 신장암 또는 갑상선암의 조기 진단을 위한 바이오 마커 및 이의 용도
EP3368684B1 (en) Biomarker for breast cancer
WO2010126338A2 (ko) 유방암 진단용 바이오마커 및 유방암 진단제
EP2341150A1 (en) Breast cancer metastasis determination method and blood serum evaluation method
KR20190121578A (ko) 전립선암 진단용 바이오마커 및 이의 용도
KR101441013B1 (ko) 유방암 진단용 바이오마커
US20070281895A1 (en) Molecular Marker
WO2022196750A1 (ja) 子宮体がんのリンパ節転移能の評価方法のためのコンパニオンマーカー
EP1660676B1 (en) Diagnosis of risk of breast cancer
CN117305450A (zh) 用于检测膀胱癌相关基因甲基化的核酸组合物及其相应的试剂盒和用途
US20030198961A1 (en) Determining cancer aggressiveness
CN117004727A (zh) 用于检测膀胱癌的组合物及其用途
ES2399246T3 (es) Predicción del resultado del tratamiento del cáncer de mama
KR20220035790A (ko) 양성 종양 또는 결절로부터 암을 구분하기 위한 바이오마커
KR20210040921A (ko) 신장암 환자의 치료 전략 결정 및 예후 진단용 재발 특이적 마커
CN118028469A (zh) 用于检测卵巢癌的组合物及其用途
KR20200012380A (ko) 유방암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 재발 특이적 마커

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10769983

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10769983

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2