CN101843584B

CN101843584B - 一种全反式维甲酸与脂质体的复合物及其应用

Info

Publication number: CN101843584B
Application number: CN2010101903962A
Authority: CN
Inventors: 吕万良; 李若婧; 张燕; 应雪; 姚红娟
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: CN101843584A

Abstract

本发明公开了一种全反式维甲酸与脂质体的复合物及其应用。本发明提供的全反式维甲酸与脂质体的复合物，由脂质体和包封在其内的全反式维甲酸组成。所述复合物所述复合物由下述方法获得：1)将脂材和全反式维甲酸溶解，获得脂膜和全反式维甲酸的混合物；2)将所述脂膜和全反式维甲酸的混合物水化得到水化产物；3)将所述水化产物超声，获得全反式维甲酸与脂质体的复合物。本发明的实验证明，全反式维甲酸与脂质体的复合物可用于抑制肿瘤细胞的繁殖，全反式维甲酸与脂质体的复合物与长春瑞宾隐形脂质体的联合应用对肿瘤复发的抑制作用最强。

Description

一种全反式维甲酸与脂质体的复合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种全反式维甲酸与脂质体的复合物及其应用。

背景技术

肿瘤干细胞在肿瘤的发生、转移和复发过程中起着重要作用，并且肿瘤的复发是导致肿瘤治疗失败的主要原因。与正常组织的干细胞相似，肿瘤干细胞具有自我更新和分化(即成为更加成熟的肿瘤细胞)的能力。在正常的组织中，一个干细胞分裂出另一个干细胞和一个分化了的细胞，从而使干细胞的数量保持恒定，并且受到严格的限制。但是肿瘤干细胞可以分裂出多个新的肿瘤干细胞，而这个过程的持续会导致肿瘤细胞数量的增加，引起肿瘤的复发。有证据显示具有CD44⁺/CD24^-表型的乳腺癌干细胞具有很强的成瘤能力，一个例子是仅仅很少量的具有这种表型的细胞即可形成新的肿瘤，而具有其他表型的普通肿瘤细胞(non-cancer stem cell)需要百万个才能在SCID小鼠中形成肿瘤。另一个例子是只需要100个CD44⁺/CD24^-就可以在NOD/SCID小鼠体内诱导形成肿瘤。

最近，一项临床研究表明在乳腺癌患者中乳腺癌干细胞(CD44⁺/CD24^-)对传统的化学疗法不敏感，有一定的抵抗作用。肿瘤干细胞与肿瘤细胞相比有很多不同之处，其中，以下量方面主要和肿瘤干细胞的耐药相关：一是由于肿瘤干细胞强大的DNA修复功能，它们对凋亡刺激表现出明显的耐受能力，比如具有CD44⁺表型的乳腺癌干细胞能够耐受放射治疗；二是肿瘤干细胞多数处于静止状态，而抗肿瘤的化疗大多数是针对分裂期的细胞，所以肿瘤干细胞能够在化疗中幸免并且重新形成肿瘤，导致肿瘤复发。所以传统的放疗和化疗只能杀死大部分普通肿瘤细胞，而对肿瘤干细胞表现出较弱的抑制作用。因为肿瘤的潜在复发是由于肿瘤干细胞对于化疗药的耐药，所以很有必要提出一种新的方法通过非凋亡和非坏死途径来清除肿瘤干细胞，比如通过诱导肿瘤干细胞分化的方式来降低它们对化疗药的耐受性。

使用分子标志物来鉴定肿瘤干细胞，比如乳腺癌干细胞的CD44⁺/CD24^-，白血病干细胞的CD34⁺/CD38^-。具有这类表型的肿瘤干细胞即SP细胞，它们只需要很少的数量即可产生大量的肿瘤细胞。SP细胞被鉴定在很多中细胞系中存在，比如成神经细胞瘤，黑色素瘤和C6胶质瘤细胞系。乳腺癌细胞中的SP细胞是一类不成熟的祖先肿瘤细胞，高表达干细胞标志物(CD44⁺/CD24^-)并且低表达分化细胞标志物(CD44^-，CD24⁺)。除此之外，SP细胞具有较高的Hoechst外排活性，所以利用Hoechst荧光染料外排法收集肿瘤干细胞。

因此，研究一种新型抑制肿瘤干细胞增殖并诱导肿瘤干细胞分化的药物制剂成为发展热点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种全反式维甲酸与脂质体的复合物。

本发明提供全反式维甲酸与脂质体的复合物，由脂质体和包封在其内的全反式维甲酸组成。所述复合物可由下述方法制的：

1)将脂材和全反式维甲酸用氯仿溶解，旋转蒸发去除氯仿，获得脂膜和全反式维甲酸的混合物；2)将所述脂膜和全反式维甲酸的混合物水化得到水化产物；3)将所述水化产物超声，获得全反式维甲酸与脂质体的复合物。

所述脂质体由蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000制成；

步骤1)中所述脂材为蛋黄卵磷脂、胆固醇和PEG2000-DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)；所述蛋黄卵磷脂、胆固醇和PEG2000-DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)的摩尔比为(57-61)∶(37-41)∶(3.5-5.5)，具体为59∶39∶4或57∶37∶3.5或61∶41∶5.5；所述全反式维甲酸与所述脂材的质量比为(18-22)∶(0.8-1.2)，具体为20∶1或18∶0.8或22∶1.2；

步骤2)中所述水化的方法是：将所述脂膜和全反式维甲酸的混合物和磷酸盐缓冲液混合，在(24-26)℃下持续超声(9-11)min，具体为在24℃、25℃或26℃下超声9min、10min或11min；

步骤3)中，所述超声的功率为200W，所述超声时间为(5-7)min，具体为5min、6.8min或7min，所述超声方式为超声10秒，间断10秒。

所述复合物的粒径为80nm-82nm，具体为80nm、81.5nm或82nm；Zeta电位为(-7.5)mV-(-4.7)mV，具体为(-7.5)mV、(-6)mV或(-4.7)mV；所述复合物的包封率不小于90％，优选为92％、93％或94％。

一种制备全反式维甲酸与脂质体的复合物的方法也是本发明保护的范围，步骤具体如下：1)将脂材和全反式维甲酸用氯仿溶解，旋转蒸发去除氯仿，获得脂膜和全反式维甲酸的混合物；2)将所述脂膜和全反式维甲酸的混合物水化得到水化产物；3)将所述水化产物超声，获得全反式维甲酸与脂质体的复合物。

本发明的另一个目的是提供一种全反式维甲酸与脂质体的复合物的应用。

本发明提供一种具有抑制肿瘤干细胞增殖功能、具有抑制肿瘤复发功能和/或具有治疗肿瘤功能的产品，其活性成分为所述复合物或所述复合物和长春瑞宾隐形脂质体的组合物，所述复合物和所述长春瑞宾隐形脂质体均为独立包装。

采用硫酸铵梯度法制备上述长春瑞宾隐形脂质体。精密称取卵磷脂、胆固醇和PEG2000-DSPE，溶解于氯仿中，使卵磷脂、胆固醇和PEG2000-DSPE在氯仿中的浓度分别为55μmol、40μmol和5μmol，通过旋转蒸发40℃真空干燥除去氯仿，在茄形瓶底部及内壁形成一层薄薄的均匀脂膜。加入250mM硫酸铵水溶液(pH 5.1)水化，先在冰浴中超声5min，然后转移到青霉素小瓶中在JY92-2D型超声波细胞粉碎机中进一步超声，设置超声工作时间为10s，间歇时间为10s，全程时间为6.8min，白色浑浊溶液逐渐形成带有蓝色荧光透明液体。加入水化液的体积由药脂比和最后脂质体混悬液中的药物浓度来决定。脂质体囊泡依次挤压通过孔径为400nm，200nm聚碳酯膜3次，然后将过膜后的空白脂质体封装到透析膜袋中，在十倍体积的生理盐水(0.9％NaCl)中透析48h，每12h更换一次新的透析液。具有硫酸铵梯度的空白隐形脂质体制备完成。重酒石酸长春瑞宾(购自北京嘉瑞时代科技有限公司，CAS号：125317-39-7)溶解在蒸馏水中。药物溶液与空白脂质体都在60℃水浴中预热，然后以1∶5的药脂比混合，在60℃浴振摇20min，即得长春瑞宾隐形脂质体。

所述的全反式维甲酸与脂质体的复合物在制备具有抑制肿瘤细胞增殖功能的产品中的应用；所述的全反式维甲酸与脂质体的复合物在制备具有抑制肿瘤复发功能的产品中的应用；所述的全反式维甲酸与脂质体的复合物在制备具有治疗肿瘤功能的产品中的应用。

所述复合物和长春瑞宾隐形脂质体的组合物在制备具有抑制肿瘤细胞增殖功能的产品中的应用；所述复合物和长春瑞宾隐形脂质体的组合物在制备具有抑制肿瘤复发功能的产品中的应用；所述复合物和长春瑞宾隐形脂质体的组合物在制备具有治疗肿瘤功能的产品中的应用。

所述肿瘤细胞为肿瘤干细胞；所述肿瘤干细胞为乳腺癌干细胞；乳腺癌干细胞为MCF-7干细胞或MDA-MB-231干细胞；所述产品为药物；

所述抑制肿瘤细胞增殖的方式是通过如下1)和/或2)方式实现的：

1)促进所述肿瘤干细胞分化；提高所述肿瘤干细胞中处于G₀/G₁期细胞比例。

本发明的实验证明，全反式维甲酸与脂质体的复合物可用于抑制普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞的繁殖，可与化疗药长春瑞宾隐形脂质体联合应用抑制肿瘤的复发，该复合物的粒径约80nm，包封率大于90％。该复合物对于肿瘤干细胞比普通肿瘤细胞有更强的抑制能力，其机制主要表现在两个方面：阻滞肿瘤干细胞的细胞周期停留在G₀/G₁期，以及诱导乳腺癌干细胞的分化。复合物与长春瑞宾隐形脂质体的联合应用对肿瘤复发的抑制作用最强。

附图说明

图1为复合物的体外泄露率(％)

图2为复合物被乳腺癌细胞摄取实验

图3为人乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞(SP细胞)的分析和收集

图4为乳腺癌干细胞(SP)细胞的表型鉴定

图5为复合物及各对照组对乳腺癌细胞MCF-7(A)或MDA-MB-231(B)细胞的作用

图6为复合物及各对照组对MCF-7细胞的SP细胞和NSP细胞的作用

图7为复合物诱导肿瘤干细胞分化

图8为肿瘤复发模型通过向雌性NOD/SCID小鼠体内异种移植人乳腺癌干细胞建立

图9为复合物对肿瘤复发模型的抑制作用

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、全反式维甲酸与脂质体的复合物的制备及鉴定

方法一、

1、制备

通过薄膜分散法和挤压过膜制备全反式维甲酸与脂质体的复合物。以蛋黄卵磷脂(EPC)(购自日本油脂株式会社，Lot No：108057-3)，胆固醇(购自北京市海淀区微生物培养基制品厂)和PEG2000-DSPE(购自日本油脂株式会社，Lot No：M86563)作为脂材，摩尔比为59∶39∶4。

(1)溶解：脂材和全反式维甲酸(购自北京贝丽莱斯生物化学有限公司，CAS号：302-79-4)(脂材∶全反式维甲酸＝20∶1，质量/质量)置茄形瓶中用氯仿溶解后，旋转蒸发除去氯仿，将得到的产物记作溶解产物。此步骤产生脂膜，脂膜与全反式维甲酸形成混合物；

(2)水化：将溶解产物与磷酸盐缓冲液(即PBS，pH为7.4，其由137mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄和水组成)混合，在25℃用超声波清洗仪器(宁波新芝SB-5200超声波清洗仪器)持续超声10分钟获得产物记作水化产物。使用超声波清洗仪器是利用超声波使脂膜被超下来形成小球分散在水化液(磷酸盐缓冲液)构成水化产物。

(3)超声处理：将水化产物用细胞粉碎仪超声6.8分钟(200W)，超声的方式为：超声10秒，间断10秒。使用细胞破碎仪超声使水化产物中的大部分大粒径的磷脂囊泡变成80nm的脂质体囊泡，即得到全反式维甲酸与脂质体的复合物(以下也可称为全反式维甲酸与脂质体的复合物悬液)。

2、表征测定

1)全反式维甲酸与脂质体的复合物的体外泄露率

将上述获得的全反式维甲酸与脂质体的复合物过Sephadex G-50柱(购自北京拜尔迪生物技术公司，所属公司：Pharmacia，Code：17-0042-01)，分离游离全反式维甲酸和全反式维甲酸与脂质体的复合物，流动相为PBS(PH 7.4)，收集洗脱峰即为纯化后的全反式维甲酸与脂质体的复合物悬液，其中全反式维甲酸的浓度为1mg/ml。

将纯化后的全反式维甲酸与脂质体的复合物悬液用9倍体积甲醇破坏，用紫外检测器的高效液相色谱测定包封率。测定条件：ODS柱(Diamonsil，5μ，250×4.6mm)；检测温度为25℃；检测波长为350nm；流速为1.0ml/min；流动相为乙腈/水/乙酸(体积比为95∶4.5∶0.5)。全反式维甲酸的包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(W_i/W_total)×100％，其中，W_i是过Sephadex G-50柱后被甲醇破坏的复合物中全反式维甲酸的质量。W_total是与过柱的脂质体体积相同的过柱前的经甲醇破坏的复合物中的全反式维甲酸质量。结果显示全反式维甲酸与脂质体的复合物的包封率为92％。

体外全反式维甲酸与脂质体的复合物释放实验在含血清的释放液(含10％(体积百分比))胎牛血清的PBS，其PH为7.4)中进行。4ml纯化后的全反式维甲酸与脂质体的复合物悬液密封在透析袋中，透析袋浸没在15ml释放液中，马上置于振荡器中，37℃，100次/分钟条件下持续震荡24小时。分别在0.25，0.5，1，2，4，6，8，12和24小时取0.2ml释放液，并马上补加相同体积的新鲜释放液。释放液中全反式维甲酸浓度的测定方法同包封率的测定。释放率(LR，％)的计算公式：LR＝(W_i/W_total)×100％，其中W_i是在i时间点取出的释放液中全反式维甲酸的质量，W_total是与透析体积相同的复合物在透析前全反式维甲酸的质量。

结果如图1所示，图1为全反式维甲酸与脂质体的复合物的体外泄露率(％)。实验在含有胎牛血清的释放液中透析进行，分别在0.25，0.5，1，2，4，6，8，12和24小时取样，实验重复三次，结果用平均值表示。从图1中可以看出，24小时内全反式维甲酸与脂质体的复合物的泄露率为9.3±0.1％，显示出全反式维甲酸与脂质体的复合物在含血清的体系中具有较好的稳定性。

2)脂质体的粒径和Zeta电位

全反式维甲酸与脂质体的复合物的粒径和Zeta电位用Nano Series Zen 4003ZetaSizer测定。实验重复三次取平均值±标准差。结果显示全反式维甲酸与脂质体的复合物的平均粒径为81.1±0.8nm，粒度分布(PDI)在0.18±0.01，Zeta电位为-6.1±1.4mV，即接近中性，有少量负电荷分布在脂质体囊泡周围。

采用同样的方法检测长春瑞宾隐形脂质体的表征，结果为长春瑞宾隐形脂质体平均粒径约为115nm，粒径分布范围为0.18，Zeta电位约为-2mV，包封率约为90％(2mg/ml脂质体悬液)。

方法二、

1、制备

步骤与方法二基本相同，不同的是蛋黄卵磷脂(EPC)，胆固醇和PEG2000-DSPE摩尔比为57∶37∶3.5，脂材和全反式维甲酸的质量比为18∶0.8；水化产物在24℃用超声波清洗仪器超声9分钟获得悬液，超声的方式为：持续超声；然后，超声后的悬液用细胞粉碎仪超声5分钟(200W)，获得全反式维甲酸与脂质体的复合物。

2、脂质体表征测定

采用方法一中的测定方法检测方法二获得的全反式维甲酸与脂质体的复合物的表征。结果为：所述复合物的粒径、Zeta电位、复合物泄漏率和粒度分布与方法一制备的复合物一致，所述复合物的包封率94％。

方法三、

1、制备

步骤与方法二基本相同，不同的是蛋黄卵磷脂(EPC)，胆固醇和PEG2000-DSPE摩尔比为61∶41∶5.5；脂材和全反式维甲酸的质量比为22∶1.2；水化产物在26℃用超声波清洗仪器超声11分钟获得悬液，超声的方式为：持续超声；然后，超声后的悬液用细胞粉碎仪超声7分钟(200W)，获得全反式维甲酸与脂质体的复合物。

2、脂质体表征测定

采用方法一中的测定方法检测方法三获得的全反式维甲酸与脂质体的复合物的表征。结果为：所述复合物的粒径、Zeta电位、复合物泄漏率和粒度分布与方法一制备的复合物一致，所述复合物的包封率90％。

实施例2、全反式维甲酸与脂质体的复合物的功能鉴定

1、乳腺癌细胞细胞培养及复合物的摄取检测

MCF-7乳腺癌细胞(购自中国医学科学院药物所)用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液(迈晨科技北京有限公司，商品目录号：CM-10041)培养；MDA-MB-231乳腺癌细胞(购自中国医学科学院药物所)用含10％胎牛血清的Leibovitz’s L-15培养液(迈晨科技北京有限公司，商品目录号：CM-10045)培养；两种细胞的培养条件均为5％CO₂，37℃培养。

乳腺癌细胞对全反式维甲酸与脂质体的复合物的摄取通过激光扫描共聚焦显微镜观察。用香豆素(购自SIGMA公司，商品目录号：442631)标记由实施例1获得的全反式维甲酸与脂质体的复合物。将上述培养的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞接种在玻底皿中，经过24小时常规培养(5％CO₂，37℃)后加入香豆素标记的全反式维甲酸与脂质体的复合物(在培养体系中的终浓度是5μM)37℃孵育3小时。以与游离香豆素共孵育的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞作为空白对照组。用PBS洗两遍后，细胞用4％的多聚甲醛(体积分数)固定后，用DiI(一种橙色/红色细胞膜荧光探针)标记细胞膜。每个实验重复三次。激光扫描共聚焦显微镜显示结果如图2所示，其中MCF-7(图2A1-图2A3)和MDA-MB-231(图2B1-图2B3)细胞与游离香豆素孵育，作为对照组。MCF-7(图2A4-图2A6)和MDA-MB-231细胞(图2B4-图2B6)用香豆素(绿色)标记的全反式维甲酸与脂质体的复合物(5μM)处理3小时。从图2A1、2A4、2B1和2B4看出，MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞可见清晰的橙/红色细胞膜轮廓。游离香豆素作为绿色荧光探针可标记肿瘤细胞的胞浆，经香豆素标记的隐形脂质体处理的肿瘤细胞中可见绿色囊泡(图2A5为MCF-7细胞；图2B5为MDA-MB-231细胞)，显示复合物可以经内吞作用完整地被乳腺癌细胞摄取，这一现象也在叠加图像中更明显证明(见图2的A3和A6，或B3和B6)。

2、乳腺癌干细胞的分选及鉴定

MCF-7和MDA-MB-231细胞用上述方法培养，当细胞铺满培养瓶底部90％时，消化细胞，并以1×10⁶/ml的浓度悬浮在染色液中，MCF-7细胞的染色液为含2％胎牛血清的RPMI-1640培养液，MDA-MB-231细胞的染色液为含2％胎牛血清的Leibovit’zL-15培养液。悬浮在各自染色液中的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞均在37℃水浴中预热10分钟，之后在37℃均用5μg/ml的Hoechst 33342(购自SIGMA，商品目录号：B2261)染色90分钟，以在加入Hoechst 33342同时加入100μM盐酸维拉帕米(购自中国生物制品药品检定所，编号：100223)的细胞为对照。然后，将各细胞用冰PBS洗2遍后，分别过40-μm细胞筛得到单个细胞的PBS悬液(1×10⁶/ml)。最后，用1μg/ml的碘化丙啶(购自SIGMA，商品目录号：P4170)标记死细胞。Hoechst拒染的细胞被称为SP细胞，即干细胞。采用双波长分析(blue，420-470nm；red，660-680nm)通过FACSDiva进行乳腺癌干细胞(SP细胞)的分析和分选，Hoechst 33342-/PI-为P3门(SP细胞)。通过流式细胞分选仪从MCF-7和MDA-MB-231细胞中收集肿瘤干细胞，从MCF-7细胞系中收集普通肿瘤细胞(非肿瘤干细胞，non-cancer stem cell)记作MCF-7-NSP，肿瘤干细胞记作MCF-7-SP，从MDA-MB-231细胞系中收集普通肿瘤细胞记作MDA-MB-231-NSP，肿瘤干细胞记作MDA-MB-231-SP。结果如图3所示，MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)细胞用Hoechst 33342染色，对照组加入维拉帕米，用FACSDiva流式细胞仪分析和收集肿瘤干细胞。图3A1和3B1为单独用Hoechst 33342染色，图3A2和3B2为Hoechst 33342和维拉帕米共同染色。实验重复三次。

从图3中可以看出，在MCF-7细胞系中，肿瘤干细胞(MCF-7-SP)的比例为3.1％，在MDA-MB-231细胞系中，肿瘤干细胞(MDA-MB-231-SP)的比例为0.9％。

将上述获得的MCF-7细胞系的肿瘤干细胞MCF-7-SP按下述分组在4℃避光条件下染色30分钟，染色液为PH 7.4的PBS：(1)实验组细胞加入anti-CD44-FITC(英国Abcam公司，商品目录号：ab34280)和anti-CD24-PE(英国Abcam公司，商品目录号：ab30351)各5μl，充分混匀；(2)对照组细胞加入anti-CD44和anti-CD24的同型对照抗体(英国Abcam公司，anti-CD44同型对照的商品目录号：1280，anti-CD24同型对照的商品目录号：ab1264)，充分混匀。染色之后细胞用冰PBS(PH 7.4)洗3次，并且重悬于500μl冷的PBS中。用FACScan流式细胞仪进行测定，使用前向角散射和侧向角散射来排除双细胞团块。结果如图4所示，SP细胞用anti-CD44-FITC和anti-CD24-PE抗体染色，用FACScan流式细胞仪分析。图上所示CD24和CD44的散点图。注释：A.同型对照组。B.用anti-CD44-FITC和anti-CD24-PE抗体染色。从图4中可以看出，MCF-7-SP高表达CD44(用CD44⁺表示)并且低表达CD24(用CD24^-)，表明得到的MCF-7-SP是乳腺癌干细胞。

3、全反式维甲酸与脂质体的复合物对乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞的抑制

1)全反式维甲酸与脂质体的复合物对乳腺癌细胞的抑制

MCF-7和MDA-MB-231细胞分别以2000至3000个/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂培养24小时后，分别在游离药组和脂质体组加入全反式维甲酸游离药和全反式维甲酸与脂质体的复合物，并且全反式维甲酸的终浓度范围为0-50μM。加入不含药的培养液作为空白对照组，长春瑞宾隐形脂质体作为阳性对照组。37℃，5％CO₂孵育96小时后，用乙酰罗丹明B染色法评价细胞毒作用。酶标仪的吸收波长为540nm，抑制率使用以下公式计算：抑制率％＝100％-(加药组在540nm处的吸光度值/空白对照组在540nm处的吸光度值)×100％。每个实验重复三次，每个浓度设五个复孔。

结果见图5所示，图5.全反式维甲酸与脂质体的复合物及各对照组对乳腺癌细胞MCF-7(A)或MDA-MB-231(B)细胞的作用。分别加入系列浓度的游离全反式维甲酸、全反式维甲酸与脂质体的复合物和长春瑞宾隐形脂质体(阳性对照组)，不加药培养液作为空白对照组。孵育96小时后进行SRB染色。每个实验重复3次。注释：1.游离全反式维甲酸；2.全反式维甲酸与脂质体的复合物；3.长春瑞宾隐形脂质体。a，p＜0.05，vs空白对照；b，p＜0.05，vs全反式维甲酸(0.1μM)；c，p＜0.05，vs全反式维甲酸(0.5μM)；d，p＜0.05，vs全反式维甲酸(1μM)；e，p＜0.05，vs全反式维甲酸(2μM；f，p＜0.05，vs全反式维甲酸(5μM)；g，p＜0.05，vs全反式维甲酸(10μM)；h，p＜0.05，vs全反式维甲酸(20μM)；i，p＜0.05，vs全反式维甲酸(50μM)；j，p＜0.05，vs空白对照；k，p＜0.05，vs长春瑞宾(0.01μM)；l，p＜0.05，vs长春瑞宾(0.1μM)；m，p＜0.05，vs长春瑞宾(0.5μM)；n，p＜0.05，vs长春瑞宾(1μM)；o，p＜0.05，vs长春瑞宾(2μM)；q，p＜0.05，vs长春瑞宾(5μM)。

从图5中看出，当全反式维甲酸的终浓度达到1μM时，游离全反式维甲酸和全反式维甲酸与脂质体的复合物都可以在一定程度上抑制乳腺癌细胞的增殖。当全反式维甲酸的终浓度达到10μM时，全反式维甲酸与脂质体的复合物分别对MCF-7的抑制率为27.3±1.5％，对MDA-MB-231细胞的抑制率为25.9±3.8％。作为阳性对照组，1μM长春瑞宾隐形脂质体分别对MCF-7细胞的抑制率为85.5±1.5％，对MDA-MB-231细胞的抑制率为51.8±0.8％。说明全反式维甲酸与脂质体的复合物对乳腺癌细胞有抑制作用。

2)全反式维甲酸与脂质体的复合物对乳腺癌干细胞的抑制

将上述获得的MCF-7-SP和MCF-7-NSP，分别以2000个/孔接种在96孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂培养24小时。在游离药组和脂质体组分别加入系列浓度的全反式维甲酸游离药和全反式维甲酸与脂质体的复合物，全反式维甲酸的终浓度范围为0-50μM。未加药的培养液作为空白对照组，长春瑞宾隐形脂质体作为阳性对照组，孵育96小时后用乙酰罗丹明B(SRB)染色法评价细胞毒作用。结果如图6所示，图6.全反式维甲酸与脂质体的复合物及各对照组对MCF-7细胞的SP细胞和NSP细胞的作用。注释：A.游离全反式维甲酸；B.全反式维甲酸与脂质体的复合物；C.长春瑞宾隐形脂质体。*p＜0.05；**p＜0.01。从图6中看出，在全反式维甲酸的终浓度10μM时，游离全反式维甲酸对SP细胞的抑制率为34.3±2.6％，而对NSP细胞的抑制率仅为14.8±4.1％；全反式维甲酸与脂质体的复合物对SP细胞的抑制率为39.1±3.7％，对NSP细胞的抑制率仅为13.4±0.7％。阳性对照长春瑞宾隐形脂质体(终浓度0.1μM)对SP细胞的抑制率为31.3±0.6％，对NSP细胞的抑制率为41.5±1.3％。说明游离全反式维甲酸和全反式维甲酸与脂质体的复合物对肿瘤干细胞(SP)的抑制作用都比普通肿瘤细胞(NSP)更强。

4、乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞周期测定

将上述获得的MCF-7-SP和MCF-7-NSP，分别以3.5×10⁴/孔接种在12孔细胞培养板中，在37℃，5％CO₂条件下培养24小时。分别加入全反式维甲酸游离药和全反式维甲酸与脂质体的复合物，并且全反式维甲酸和全反式维甲酸与脂质体的复合物的终浓度均为10uM。在0h，24h，48h进行细胞周期的测定，方法如下：消化细胞，用冰冷的70％乙醇4℃固定过夜，用冰PBS(PH 7.4)洗涤两次后，细胞与RNase A(100μg/ml)在37℃孵育30分钟，DNA用碘化丙啶(PI，50μg/ml)染色，用FACScan流式细胞仪测定进行细胞周期分析。

结果见表1，从表1中看出游离全反式维甲酸(10μM)和全反式维甲酸与脂质体的复合物(10μM)均可显著性提高MCF-7-SP和MCF-7-NSP处于G₀/G₁期的细胞比例，且对MCF-7-SP比对MCF-7-NSP的细胞周期阻滞作用更加显著(24小时或48小时)，显示出SP细胞对全反式维甲酸更加敏感。

表1.经过全反式维甲酸与脂质体的复合物处理后细胞周期阻滞

数据用平均值±标准偏差表示，每个实验重复三次。

**p＜0.01，vs在0小时的结果。

5、乳腺癌干细胞的分化

将上述获得的MCF-7-SP以3.5×10⁴个/孔接种在12孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂培养24小时后，加入全反式维甲酸游离药(终浓度10μM)和全反式维甲酸与脂质体的复合物(终浓度10μM)孵育5天，未加药培养液作为空白对照组。经过消化和洗涤，空白对照组和实验组细胞分别同时与anti-CD44-FITC和anti-CD24-PE在4℃避光条件下染色30分钟，染色液为PH 7.4的PBS。设置同型对照组，在相同条件下染色。之后，细胞样本用冷PBS(PH 7.4)洗涤3次，并且重悬于500μl冷PBS中。CD44⁺/CD24^-细胞比例使用FACScan流式细胞仪进行分析测定。

结果如图7所示，图7为全反式维甲酸与脂质体的复合物诱导肿瘤干细胞分化。图7中A为同型对照组；B为空白对照组；C为游离全反式维甲酸；D为全反式维甲酸与脂质体的复合物。结果显示全反式维甲酸诱导乳腺癌干细胞分化，使CD44⁺/CD24^-的表达降低。说明全反式维甲酸与脂质体的复合物能够诱导乳腺癌干细胞向非干细胞分化。

6、对乳腺癌复发模型的作用

在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下异种接种人乳腺癌干细胞建立肿瘤复发模型。5周龄雌性NOD/SCID小鼠从中国医学科学院动物研究所购得。NOD/SCID小鼠肌肉注射40μl雌激素(给药剂量为0.4mg/kg，溶剂为乙醇/CremophorEL(购自SIGMA公司，商品目录号：C5135)/PBS，1∶1∶9，体积比)。3天后，将由实施例2获得的MCF-7-SP，以大约7×10⁴个/只皮下接种在NOD/SCID小鼠的左下乳腺脂肪垫(左侧的第四个乳头)。

小鼠随机分为5组(每组5只)，分别为生理盐水组(即空白组，组1)，游离全反式维甲酸组(剂量为15mg/kg，组2)，全反式维甲酸与脂质体的复合物组(剂量为15mg/kg，组3)，长春瑞宾隐形脂质体组(剂量为15mg/kg，组4)，全反式维甲酸与脂质体的复合物(剂量为15mg/kg)联合长春瑞宾隐形脂质体(剂量为15mg/kg)组(组5)。含全反式维甲酸的给药组(组2、组3和组5)从接种SP细胞后的第二天开始经尾静脉给药，每隔两天给药一次直到处死。当瘤体积长到约150mm³时，给予两次长春瑞宾隐形脂质体，即组4分别在第20天和第24天给予长春瑞宾隐形脂质体，组5分别在第24天和第29天给予长春瑞宾隐形脂质体。在整个实验过程中，观察小鼠的状态，并每一或两天测量小鼠的体重和瘤体积，第38天处死剥瘤。肿瘤体积按下述公式计算：肿瘤体积＝(瘤长×瘤宽²/2)。

拍照为图8所示(空白对照组小鼠)，大约向小鼠左侧第四个乳腺皮下注射7×10⁴个SP细胞，于移植后第38天将小鼠处死拍照。在空白对照组中(组1)，平均瘤体积为1712.50±389.13mm³。

将5组实验的所有数据用Mean±S.D.表示。采用单因素方差分析(ANOVA)，然后经过Bonferroni校验，p＜0.05认为有显著性差异。统计结果如图9所示，图9为全反式维甲酸与脂质体的复合物对肿瘤复发模型的抑制作用。数据用平均值±标准偏差表示(n＝5)。注释：A.不同天数肿瘤体积；B.第38天时的肿瘤质量。a，p＜0.05，同一时间点，全反式维甲酸与脂质体的复合物vs生理盐水；b，p＜0.05，同一时间点，全反式维甲酸与脂质体的复合物联用长春瑞宾隐形脂质体vs生理盐水；c，p＜0.05，同一时间点，长春瑞宾隐形脂质体vs生理盐水；d，p＜0.05，同一时间点，全反式维甲酸与脂质体的复合物vs游离全反式维甲酸；e，p＜0.05，同一时间点，全反式维甲酸与脂质体的复合物联用长春瑞宾隐形脂质体vs游离全反式维甲酸；f，p＜0.05，同一时间点，长春瑞宾隐形脂质体vs游离全反式维甲酸；g，p＜0.05，vs生理盐水；h，p＜0.05，vs游离全反式维甲酸i，p＜0.05，vs全反式维甲酸与脂质体的复合物；j，p＜0.05，vs长春瑞宾隐形脂质体；k，p＜0.05，vs全反式维甲酸与脂质体的复合物联用长春瑞宾隐形脂质体。

从图9中看出，与空白对照组相比，给予全反式维甲酸的组(组2、组3和组5，)直到第15天瘤体积才可以测量，表明全反式维甲酸或全反式维甲酸与脂质体的复合物可使肿瘤的形成推迟，对照组第11天可以测量瘤体积。在第38天，游离全反式维甲酸对肿瘤的抑制率为26.2±24.3％，全反式维甲酸与脂质体的复合物对肿瘤抑的制率为51.9±29.1％。与游离药相比，全反式维甲酸与脂质体的复合物产生了更显著的抑制作用。作为阳性对照组，在单独给予长春瑞宾隐形脂质体后可明显观察到对肿瘤的抑制作用(第38天的抑制率为81.6±12.7％)。全反式维甲酸与脂质体的复合物和长春瑞宾隐形脂质体的联合治疗组对肿瘤的抑制作用在几组中最为显著(第38天的抑制率为91.6±3.6％)(图9A)。第38天瘤重量的测定结果也证明了相同的结果(图9B)。

Claims

1.一种全反式维甲酸与脂质体的复合物，由脂质体和包封在其内的全反式维甲酸组成；

所述复合物由下述方法获得：

1)将构成脂质体的材料和全反式维甲酸用氯仿溶解，旋转蒸发去除氯仿，获得脂膜和全反式维甲酸的混合物；

2)将所述脂膜和全反式维甲酸的混合物水化得到水化产物；

3)将所述水化产物超声，获得全反式维甲酸与脂质体的复合物；

步骤1)中所述构成脂质体的材料为蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；所述蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为59∶39∶4；所述全反式维甲酸与所述构成脂质体的材料的质量比为1∶20。

2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：步骤3)中，所述超声的功率为200W，所述超声时间为6.8min，所述超声方式为超声10秒，间断10秒。

3.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于：所述复合物的粒径为80.3nm-81.9nm；Zeta电位为(-7.5)mV-(-4.7)mV；所述复合物的包封率为92％。

4.一种制备全反式维甲酸与脂质体的复合物的方法，步骤如下：

1)将脂材和全反式维甲酸用氯仿溶解，旋转蒸发去除氯仿，获得脂膜和全反式维甲酸的混合物；

2)将所述脂膜和全反式维甲酸的混合物水化得到水化产物；

步骤1)中所述脂材为蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；所述蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为59∶39∶4；所述全反式维甲酸与所述脂材的质量比为1∶20。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述超声的功率为200W，所述超声时间为6.8min，所述超声方式为超声10秒，间断10秒。

6.一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的产品，其活性成分为权利要求1-3中任一所述复合物，所述肿瘤细胞为乳腺癌干细胞。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述乳腺癌干细胞为MCF-7干细胞或MDA-MB-231干细胞。

8.一种具有抑制肿瘤复发功能的产品，其活性成分为权利要求1-3中任一所述复合物，所述肿瘤为乳腺癌。

9.一种具有抑制肿瘤复发功能的产品，其活性成分为权利要求1-3中任一所述复合物和长春瑞宾隐形脂质体的组合物，所述复合物和所述长春瑞宾隐形脂质体均为独立包装，所述肿瘤为乳腺癌。

10.权利要求1-3中任一所述的全反式维甲酸与脂质体的复合物在制备具有抑制肿瘤细胞增殖功能的产品中的应用，所述肿瘤细胞为乳腺癌干细胞。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述乳腺癌干细胞为MCF-7干细胞或MDA-MB-231干细胞。

12.权利要求1-3中任一所述的全反式维甲酸与脂质体的复合物在制备具有抑制肿瘤复发功能的产品中的应用，所述肿瘤为乳腺癌。

13.权利要求1-3中任一所述复合物和长春瑞宾隐形脂质体的组合物在制备具有抑制肿瘤复发功能的产品中的应用，所述肿瘤为乳腺癌。