CN109364027B - 全反式维甲酸准晶体及其脂质体制剂和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种全反式维甲酸准晶体及其脂质体制剂和制备方法，全反式维甲酸脂质体的内水相含有热熔温度在70‑80摄氏度的全反式维甲酸‑钙的准晶结构(如式(I)所示)。所述制备方法无需加热，通过提高载药时间可以提高药物的释放的稳定性，进而可以提高药物的载药量。因此，本申请为全反式维甲酸的使用提供了基础。

Description

全反式维甲酸准晶体及其脂质体制剂和制备方法
技术领域
本发明涉及一种全反式维甲酸准晶体及其脂质体制剂和制备方法。
背景技术
全反式维甲酸(ATRA)是维生素A类天然衍生物，其生物效应广泛，在胚胎发育、视觉形成、诱导正常分化、抗炎抗凝，干扰肿瘤细胞代谢等方面具有重要作用。最著名的应用是其与三氧化二砷联合治疗初发急性早幼粒细胞白血病的重大成效。
目前已上市的全反式维甲酸产品有口服片剂、软膏等。作为口服片剂而言，其起效剂量大且用药频率高，生物利用度有限。因此，选择一种适于全反式维甲酸的药物输送方式尤为重要。
脂质体(Liposomes)是由卵磷脂和胆固醇等制备得到的一种纳米药物输送载体，具有的双分子层结构与细胞膜结构相似，具有肝脾网状内皮系统的被动靶向性、一定的缓释效果、保护药物分子提高药物稳定性、降低药物毒副作用等一系列优点。大部分文献所述的全反式维甲酸脂质体为将全反式维甲酸嵌合于磷脂双脂层中的脂质复合制剂，所得到的脂质体载药量低且药物释放过快，因此此载药体系有待改善。
Nano DSC(differential scanning calorimetry)超灵敏差式扫描量热仪，其原理是对样品池与参比池进行程序控温，在温度变化的同时，测定试样和参比物的功率差(热流率)与温度的关系，对样品的热参数进行测定，可以用于脂质载体的研究。通过测定脂质体双分子层膜的相变温度、药物在脂质体内的结晶情况、药物与膜相互作用情况等，进行载药结构的研究。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种全反式维甲酸准晶体及其脂质体制剂和制备方法，用于解决现有技术中全反式维甲酸脂质体制剂载药量低以及释放不稳定的问题。
现有技术研究表明，全反式维甲酸脂质体的载药量过多时会使得药物释放不稳定，因此现有技术中的全反式维甲酸脂质体都是载药量较低。本申请通过特殊的制备方法无需加热，制备出的全反式维甲酸稳定性高，药物释放均匀稳定，为全反式维甲酸脂质体的新治疗方案提供了基础。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供包载全反式维甲酸的脂质体制剂，所述制剂内含有全反式维甲酸脂质体，所述全反式维甲酸脂质体制剂的内水相含有全反式维甲酸-钙准晶结构，如式(I)：
Figure BDA0001902835010000021
进一步地，所述全反式维甲酸脂质体制剂中全反式维甲酸脂质体内装载的全反式维甲酸脂质体的药脂比为：0.01～0.5；优选为0.2～0.5。
进一步地，所述的式(I)所示准晶结构在脂质体内水相中以微晶、液晶或类晶的形式存在，且在nano-DSC热力学信号图中，于70℃--80℃处出现吸收峰。。
进一步地，所述全反式维甲酸脂质体的内水相中钙离子浓度为100mM～500mM。
进一步地，所述全反式维甲酸脂质体的外水相中不含有钙离子。
进一步地，所述全反式维甲酸脂质体为粒径在50-1000纳米的单室脂质体。
进一步地，所述全反式维甲酸脂质体的内水相包括醋酸钙水溶液；所述全反式维甲酸脂质体的外水相为生理等渗溶液。
进一步地，所述生理等渗溶液选自5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液中的任意一种。更优选为质量浓度10％的蔗糖溶液。
进一步地，在所述全反式维甲酸脂质体制剂中，所述全反式维甲酸的浓度大于等于0.1mg/ml。
所述全反式维甲酸脂质体的载体制备原料包括磷脂和胆固醇。本发明对于脂质体的载体制备原料及含量并无特别的限制，只要能够形成稳定的、无泄漏的呈双分子层结构的脂质体膜即可。这些均在本领域技术人员所能知晓的知识范围内。
进一步地，所述全反式维甲酸脂质体的成膜组分包括卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂。更进一步地，所述磷脂、所述胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂之间的摩尔比为(30～80)：(0.1～40)：(0.1～30)。
更进一步地，所述磷脂、所述胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂之间的摩尔比为55：40:5。
本发明的另外一个方面提供了上述全反式维甲酸脂质体的制备方法，所述方法至少包括以下步骤：
(1)按配比将各成膜原料溶解于有机溶剂中，获得混合液；
(2)将混合液加入pH为8～10的醋酸钙水溶液中，挤压过膜，获得单室脂质体；
(3)将脂质体置于pH为6～7的生理等渗液中透析，得到脂质体a；
(4)将全反式维甲酸、pH8～9的碳酸盐缓冲溶液以及5％-20％碳酸盐缓冲液体积的DMSO混合，至药物完全溶解获得药物溶液；
(5)药物溶液与脂质体a混合，孵育，透析去除DMSO和碳酸盐缓冲溶液。
进一步地，所述步骤(1)中所述有机溶剂为乙醇。
进一步地，所述步骤(2)中生理等渗溶液可选自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液中的任意一种。
进一步地，所述步骤(2)中水浴的温度为60～70℃，时间10～30min。
进一步地，所述步骤(3)中聚碳脂膜的孔径范围是50～200nm。
进一步的，所述碳酸盐缓冲液为碳酸钠和碳酸氢钠的混合水溶液。
更进一步地，所述碳酸盐缓冲液按照<中华人民共和国药典>中的方法制备。具体为缓冲液中的碳酸钠和碳酸氢钠的质量比为：2.82：39.76。
进一步地，所述碳酸盐缓冲液的体积和脂质体中的全反式维甲酸的体积质量比为0.5ml：(1-4)g。
进一步地，所述DMSO的体积和脂质体中的全反式维甲酸的体积质量比为((0.01-0.2)ml：(1-4)g。
本发明提供了前述全反式维甲酸制剂在在制备肿瘤治疗药物中的用途，所述肿瘤治疗药物具以下任一项或多项用途：
(1)促进肿瘤部位MDSC分化为成熟DC；
(2)使实体肿瘤体积缩小；
(3)降低病人体内MDSC的数量。
上述全反式维甲酸脂质体制剂可以为注射给药制剂。
如上所述，本发明的全反式维甲酸脂质体制剂及其制备方法，具有以下有益效果：
通过DMSO以及碳酸盐缓冲液对药物进行增溶，脂质体中载药量明显高于现有技术中脂质体的载药量，包封率达到94～100％。制备方法中无需加热，简化了制备方法。通过控制载药，制备获得的全反式维甲酸晶体结构稳定，提高了药物释放的稳定性。
附图说明
图1显示为本发明实施例7中药脂比0.35脂质体的体外释放情况示意图
图2实施例8中药脂比0.1条件下采用不同载药时间的全反式维甲酸脂质体nano-DSC图谱
图3实施例8中药脂比0.2条件下采用不同载药时间的全反式维甲酸脂质体nano-DSC图谱
图4实施例8中药脂比0.25条件下采用不同载药时间的全反式维甲酸脂质体nano-DSC图谱
图5实施例8中药脂比0.3条件下采用不同载药时间的全反式维甲酸脂质体nano-DSC图谱
图6实施例9中MDSC变化图
图7实施例9中肿瘤大小变化图
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的药剂学，药物分析学，药物化学，分析化学，分子生物学、生物化学及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
术语定义：
载药时间：药物溶液与空白脂质体混合后开始计时的混合时间。
药脂比：脂质体中药物的量与脂质体膜的摩尔质量之比。
实施例1制备全反式维甲酸脂质体
(1)称取121.742克氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)、38.22克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及40.04克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解，并于65摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合，获得乙醇混合物；
(2)将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由400mM乙酸钙和水组成)，并置于65摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
(3)将步骤(2)所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为200nm，100nm，80nm，50nm聚碳酯膜各8次，最终得到平均粒径约为75nm左右的水相为乙酸钙的脂质体；
(4)将步骤(3)所制得的脂质体通过10000孔径透析膜置于10％质量分数且pH为6～7的蔗糖水溶液中透析，将脂质体的外水相置换为10％质量分数且pH为6～7的蔗糖水溶液，得到具有磷脂双层膜、且双侧膜内外水相具有一定pH梯度和离子梯度的乙酸钙脂质体。具体地，双层膜内水相为乙酸钙水溶液(pH9.0，浓度400mM)、双层膜外水相为蔗糖水溶液(pH为6～7，质量分数10％)。
(5)将3.5g全反式维甲酸与0.5ml 400mM、pH9碳酸盐缓冲溶液(碳酸盐缓冲液按照《中华人民共和国药典》中的方法制备。具体为缓冲液中的碳酸钠和碳酸氢钠的质量比为：2.82：39.76)及10％体积(是碳酸盐缓冲液体积的10％，下同)的DMSO混合，在65摄氏度下加热至药物完全溶解。
(6)将空白脂质体与药物溶液混合，室温下振荡载药，载药时间为5小时，制得全反式维甲酸脂质体。孵育结束后再次用10000孔径透析膜将未载入脂质体的游离全反式维甲酸去除，所得脂质体样品过0.22um滤膜过滤，最终得到全反式维甲酸脂质体。
(7)建立全反式维甲酸HPLC标准曲线，色谱测定包封率。测定条件：ODS柱(Diamonsil，5μm，250*4.6mm)；检测温度为25摄氏度；检测波长为340nm；流速为1.0ml/min；流动相为pH＝4三乙胺盐酸缓冲液/乙腈/甲醇(体积比为17.5:57.5:25)。全反式维甲酸包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(Wi/Wtotal)*100％，其中，Wi是纯化后被甲醇破坏的复合物中全反是维甲酸的质量，Wtotal是透析分离游离药物前并与透析后全反式维甲酸相同体积的全反式维甲酸质量。所得全反式维甲酸脂质体包封率达94％-100％之间，包封较为完全，药脂比0.5。
我们制备药脂质比0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45的脂质体，载药时间分别为1h、5h、24h，所得到的全反式维甲酸脂质体平均粒径为90nm且PDI小于0.1。
实施例2～6制备全反式维甲酸脂质体
采用与实施例1步骤(1)、(2)、(3)、(4)相同的方法，调整步骤(5)中药物加量以及步骤(6)中的载药时间，完成实施例2～6以及对比例1～2具体如下表。
实施例2～6材料与结果
Figure BDA0001902835010000051
通过比较发现本申请中的制备方法制备的全反式维甲酸脂质体具有较高的药脂比，同时随着载药时间的延长，药物的释放稳定性也明显提升。
对比例1使用滴加法制备全反式维甲酸脂质体
(1)称取121.742克氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)、38.22克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及40.04克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解，并于65摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合，获得乙醇混合物；
(2)将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由400mM乙酸钙和水组成)，并置于65摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
(3)将步骤(2)所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为200nm，100nm，80nm，50nm聚碳酯膜各8次，最终得到平均粒径约为90nm左右的水相为乙酸钙的脂质体；
(4)将步骤(3)所制得的脂质体通过10000孔径透析膜置于10％质量分数且pH为6～7的蔗糖水溶液中透析，将脂质体的外水相置换为10％质量分数且pH为6～7的蔗糖水溶液，得到具有磷脂双层膜、且双侧膜内外水相具有一定pH梯度和离子梯度的乙酸钙脂质体。具体地，双层膜内水相为乙酸钙水溶液(pH9.0，浓度400mM)、双层膜外水相为蔗糖水溶液(pH为6～7，质量分数10％)。
(5)将2mg全反式维甲酸用DMSO溶解，同时将空白脂质体加热至65摄氏度，将药物溶液滴加入空白脂质体中，孵育30分钟。孵育结束后再次用10000孔径透析膜将未载入脂质体的游离全反式维甲酸去除、DMSO以及碳酸盐缓冲液，所得脂质体样品过0.22um滤膜过滤，最终得到全反式维甲酸脂质体。
(6)建立全反式维甲酸HPLC标准曲线，色谱测定包封率。测定条件：ODS柱(Diamonsil，5μm，250*4.6mm)；检测温度为25摄氏度；检测波长为340nm；流速为1.0ml/min；流动相为pH＝4三乙胺盐酸缓冲液/乙腈/甲醇(体积比为17.5:57.5:25)。全反式维甲酸包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(Wi/Wtotal)*100％，其中，Wi是纯化后被甲醇破坏的复合物中全反是维甲酸的质量，Wtotal是透析分离游离药物前并与透析后全反式维甲酸相同体积的全反式维甲酸质量。制备药脂质比0.1-0.3的全反式维甲酸脂质体，所得包封率过低，达50％-80％之间。
实施例7不同载药时间的全反式维甲酸脂质体体外释放情况
以40mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)溶液为释放介质，将全反式维甲酸脂质体与BSA溶液内1：50体积(60ul脂质体+2940ul BSA溶液)放入300KD透析袋内，透析袋外将400mlBSA溶液作为介质，总的释放体系全反式维甲酸脂质体：BSA溶液体积比约为1:6700倍。全反式维甲酸的蛋白结合率为95％，全反式维甲酸药物释放后与BSA结合，随BSA进出透析袋，药物被带出透析袋。
选取0.5h、2h、5h、10h、24h为取样点，每次测定透析袋内未释放的药物含量，进而得到全反式维甲酸脂质体体外释放情况。此实施例中药脂比0.35、载药时间分别为1h,5h,24h的全反式维甲酸脂质体进行体外释放实验。释放结果如图1所示。
实验结果表明：药脂比0.35的全反式维甲酸脂质体能够在体外均匀、稳定的释放，载药时间为5h,24h样品稳定性优于载药时间为1h的样品。
实施例8全反式维甲酸脂质体nano-DSC表征
我们采用nano-DSC研究了全反式维甲酸脂质体的热力学行为，考察脂质体内药物存在形式。焓是一个状态函数，系统的状态一定，焓值一定，焓变是生成物与反应物的焓值差，焓变为正，反应为吸热反应。同时在脂质体处方中，添加的胆固醇可以调节脂质双分子层的流动性。在C14-C20磷脂酰胆碱中构成的双分子层中添加2-6％的胆固醇，可以消除磷脂的预相变和亚相变，同时会引起DSC吸收峰变宽，相变焓值降低。Tm值是测定的重要参数，可分析样品相变温度范围经受最高的热容变化，脂质膜在加热过程中，脂质膜的Tm值是由凝胶态到液晶态变化的临界温度，药物沉淀的Tm值是药物晶体在加热过程中熔融的温度。在45℃--55℃出现的峰是脂质体的脂质峰，发生了脂质的相转变。70℃--80℃出现的峰是醋酸钙与全反式维甲酸形成的药物结晶(以微晶/液晶/类晶的形式存在)，晶体熔化时所形成的。
制备了药物浓度为1.75mg/ml的脂质体，保证药物浓度不变，分别制备了药脂质比0.1、0.2、0.25、0.3的脂质体，考察载药时间分别为1h、5h、24h的载药情况。用于进行DSC表征的全反式维甲酸脂质体平均粒径为90nm且PDI小于0.1。如图2-图5。
在相同载药量的情况下，随着载药时间的增加，药物结晶的Tm值越大，药物结晶越稳定。随着药脂比的增加，脂质峰会发生分相的现象，我们认为脂质分相会使脂质体的稳定性降低。这可能是由于载药量过大，由于药物的插入，导致脂质膜的脂质排列不均，会有局部堆积的现象发生，因此发生分相。但随着载药时间的增加，脂质分相的现象发生了显著的改善。因此我们认为，增加载药时间有助于脂质体药物稳定的提高，当载药量较高时，可以通过提高载药时间，获得稳定的载药脂质体。
实施例9反式维甲酸脂质体作用于CT26结肠癌小鼠的药效研究
1.Balb/c小鼠的肿瘤模型建立
(1)CT-26细胞培养至对数生长期时使用胰酶消化，离心，最终细胞浓度为1*107个细胞/毫升；
(2)4-6周大小的Balb/c白鼠，麻醉后于右侧腋下部位皮下注射消化下来的CT-26悬液，细胞接种量为5*105-2*106/只，接种后继续饲养；
2.肿瘤生长抑制试验
饲养1周后，使用游标卡尺测量肿瘤长径及短径，通过肿瘤体积计算公式计算肿瘤大小：V＝1/2*长径*短径2，一周后，肿瘤体积约生长至100mm3，此时开始进行实验。
开始实验时，将荷有CT26肿瘤的Balb/c白鼠随机分成两组，每组5只，分别编号为A、B组，并分别给予全反式维甲酸脂质体及空白脂质体，给药剂量为10mpk，通过尾静脉注射给药。每隔三天给药一次，共三次，分别于开始给药的第1天、第4天、第7天进行尾静脉给药。给药期间测定肿瘤体积，并将收集到的数据汇总，绘制肿瘤生长曲线。如图7所示，相比于空白脂质体组，全反式维甲酸脂质体在3次给药后可以有效抑制CT26肿瘤的生长。
3.全反式维甲酸脂质体对CT26肿瘤中肿瘤相关髓系细胞MDSC的抑制检测
(1)断颈处死小鼠，使用镊子与剪刀从皮下去除肿瘤，并于40μm细胞滤网上剪碎，注意剪碎肿瘤组织时应小心避免剪切力对肿瘤细胞的损伤，同时在剪碎组织的过程中用含有5％的PBS不断冲洗组织；
(2)剪碎组织后将所有组织及PBS冲洗液一起离心，小心倾倒上清，去上清后将所有组织一起转移至含3ml肿瘤组织消化液的15ml离心管中，于37℃、200rpm/min的摇床条件下消化1h；
(3)消化后的细胞再次通过40μm细胞滤网，使用PBS清洗细胞以去除残留的肿瘤组织消化液及细胞碎片与死细胞(清洗后离心时的条件为转速：400g离心时间：5min)，清洗2-3遍。最终使用PBS重悬，此时得到肿瘤单细胞悬液。
(4)以每107个细胞/90μl体积的比例加入分选buffer并以每107个细胞/10μl体积的比例加入CD11b磁珠(Miltenyi公司生产)；
(5)将磁珠与细胞充分混匀，于4℃避光条件下孵育30min；孵育结束后按每107个细胞/1ml体积的比例加入90μl Buffer，1000rpm条件下离心5min，离心结束后使用Buffer继续清洗2遍；
(6)最终加入500μl Buffer重悬制得孵育磁珠的肿瘤单细胞悬液；
(7)将MS柱放入配套的磁铁中，预先使用Buffer进行润洗，使MS柱得到充分饱和；
(8)润洗结束后将孵育磁珠的肿瘤单细胞悬液从MS柱上方加入，并用1ml Buffer冲洗MS柱以将未结合磁珠的细胞冲洗下柱子；
(9)反复冲洗3-5遍后取下MS柱，放入15ml离心管中，加入1ml Buffer并用MS柱配套仪器将其快速推下，此时收集到的是停留在MS柱上的CD11b阳性细胞。
(10)将上一步得到的CD11b阳性细胞悬液进行细胞计数，将细胞浓度调整至107/ml，制备流式细胞术样品；
(11)流式细胞样品分为：阴性组、Ly-6C单阳性组、Ly-6G单阳性组、CD11b单阳性组、待测样品组。每组设置2-3个平行管。其中阴性组不加任何荧光抗体以设置阴性条件，3个单阳性分别加入单一荧光抗体以便后续荧光补偿，待测样品组加入待测的荧光抗体；
(12)所有流式管中各加入100μl体积使用流式Staining Buffer重悬的细胞(约106个)，阴性对照组中不加入任何荧光抗体，Ly-6C单阳性组加入Ly-6C抗体，Ly-6G单阳性组加入Ly-6G抗体，CD11b单阳性组加入CD11b抗体，待测样品组同时加入Gr-1、Ly-6C与Ly-6G抗体；
(13)于4℃避光条件下孵育30min，孵育结束后加入1ml Staining Buffer离心以洗去未结合至细胞上的抗体，并接着使用Staining Buffer清洗细胞2次，最后用500μl体积Staining Buffer进行细胞重悬。
(14)使用流式细胞仪检测。收集约106个事件数量，分析CD11b+Ly-6CmidLy-6Ghigh(PMN-MDSC)及CD11b+Ly-6ChighLy-6G-(M-MDSC)的比例。如图6所示，全反式维甲酸脂质体可以有效降低M-MDSC及PMN-MDSC的比例，说明制剂在体内对肿瘤相关的MDSC具有抑制作用。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种包载全反式维甲酸的脂质体制剂，其特征在于，所述制剂内含有全反式维甲酸脂质体，所述全反式维甲酸脂质体的内水相含有全反式维甲酸-钙准晶结构，如式(I)
Figure FDA0002758244860000011
所述制备方法包括以下步骤：
(1)按配比将各成膜原料溶解于有机溶剂中，获得混合液；
(2)将混合液加入pH为8～10的醋酸钙水溶液中，挤压过膜，获得单室脂质体；
(3)将脂质体置于pH为6～7的生理等渗液中透析，得到脂质体a；
(4)将全反式维甲酸、pH8～9的碳酸盐缓冲溶液以及5％-20％碳酸盐缓冲液体积的DMSO混合，至药物完全溶解获得药物溶液；
(5)将药物溶液与脂质体a混合，孵育，透析去除DMSO和碳酸盐缓冲溶液。
2.如权利要求1所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述全反式维甲酸脂质体制剂中全反式维甲酸脂质体内装载的全反式维甲酸与脂质分子的摩尔比为：0.01～0.5。
3.如权利要求2所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述全反式维甲酸脂质体制剂中全反式维甲酸脂质体内装载的全反式维甲酸与脂质分子的摩尔比为：0.2～0.5。
4.根据权利要求1所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于：还包括以下技术特征中的任意一种或几种：
a.所述全反式维甲酸脂质体的内水相中钙离子浓度为100mM～500mM；
b.所述全反式维甲酸脂质体的外水相中不含有钙离子；
c.所述全反式维甲酸脂质体为粒径在50-1000纳米的单室脂质体；
d.所述全反式维甲酸脂质体的成膜组分包括卵磷脂和胆固醇；
e.所述全反式维甲酸脂质体的外水相为生理等渗溶液。
5.根据权利要求1所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于：所述碳酸盐缓冲液的体积和脂质体中的全反式维甲酸的体积质量比为0.5ml：(1-4)g；所述DMSO的体积和脂质体中的全反式维甲酸的体积质量比为(0.01-0.2)ml：(1-4)g。
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