CN114652682A - 新鱼腥草素钠与顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents

新鱼腥草素钠与顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其将脂质体载体和新鱼腥草素钠溶于有机溶剂中，获得油相，然后减压旋蒸除去有机溶剂，获得薄膜；将顺铂溶于生理盐水溶液中，获得水相，在步骤1）所得产物中加入水相，然后于25‑55℃水化，冰浴超声，经过滤即得。本发明分别将新鱼腥草素钠、顺铂包封在脂质体的类脂双分子层及水相中，并获得良好的pH敏感性及缓释效果。本发明脂质体制剂具有包封率高，载药量高、易于制备的优点，并且酸性敏感性良好、可以延缓药物释放、增加靶向作用，有利于提高药效。

Description

新鱼腥草素钠与顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂及其制备 方法
技术领域
本发明属于纳米药物输送技术领域，具体涉及一种新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂及其制备方法。
背景技术
鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）为三白草科植物蕺菜的新鲜全草或干燥地上部分，始载于《名医别录》，作为药食两用常用中药。其主要含有挥发油、黄酮、生物碱等成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理活性。临床应用广泛，可治疗肺痈吐脓、热痢、痈肿疮毒等。新鱼腥草素钠（Sodium new houttuyfonate , SNH）是其有效成分癸酰乙醛的亚硫酸氢钠合成物，新鱼腥草素钠结构稳定，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效。作为广谱抗菌药，能提高机体Chemicalbook免疫力，对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、肺炎双球菌、大肠杆菌及孢子菌丝等有明显的抑制作用，用于肺炎、慢性支气管炎，上呼吸道感染等呼吸系统炎症，还被用于治疗盆腔炎、附件炎、慢性宫颈炎等妇科炎症。目前也有研究表明：新鱼腥草素钠具有一定的抗癌效用，但其溶解性较差，临床使用受限，故可以将其制成新的剂型，以提高其利用度。
顺铂（Cisplatin，CDDP）是一种常用的抗肿瘤药物，属于周期非特异性的第一代铂类抗肿瘤药，具有抗瘤谱广、对乏氧细胞有效的特点，适用于非小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的治疗。但一般来说，顺铂具有比较大的毒副作用，可以考虑联合用药或将其制成新剂型，减轻其用量，减小副作用。
脂质体（liposome）系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体，具有靶向性、缓释性等特点，并且可以增加药物溶解性，降低药物毒性，提高稳定性，有良好的应用前景。
pH值变化是人体病变组织的特征之一。正常生理状况下，人体组织外基质及血液中的pH值接近7.4。而炎症、感染或肿瘤的病理部位pH值会相应降低。由于肿瘤细胞的侵略性增殖以及不规则血管的快速生成导致肿瘤部位的营养和氧气快速缺乏，使肿瘤细胞内糖酵解产生的乳酸代谢物蓄积在肿瘤间质，造成肿瘤细胞外环境的pH值降低至6.5～7.2，而肿瘤细胞内内涵体和溶酶体的pH值进一步降低至4.0～6.0（［1］StubbsM，McSheehyPMJ，GriffithsJR，BashfordCL．Mol．Med．Today，2000，6(1) :15．［2］ZouJ，ZhangFW，ZhangSY，PollackSF，ElsabahyM，FanJW，WooleyKL．Adv．HealthcareMater．，2014，3(3) :441），这种微酸性环境广泛存在于各种肿瘤中，并在肿瘤的发生、发展，特别是抗药性中起着举足轻重的作用。基于此，可以设计pH响应性药物递送系统，使该系统在正常生理条件下稳定，但到达肿瘤部位时，微酸环境触发释放运载药物，增强化药物的治疗效果并降低药物的毒副反应。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂，用于提高新鱼腥草素钠水溶性及提高两药联用的治疗效果。
本发明还提供上述新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其采用薄膜分散法，具体包括如下步骤：
1）将脂质体载体和新鱼腥草素钠溶于有机溶剂中，获得油相，然后减压旋蒸除去有机溶剂，获得薄膜；
2）将顺铂溶于生理盐水溶液中，获得水相，在步骤1）所得产物中加入水相，然后于25-55℃（优选37℃）搅拌混匀以充分水化，冰浴超声，经过滤即得。
具体的，步骤1）中，所述脂质体载体为1,2-二油酸甘油-3-磷脂酰乙醇胺（dioleoyl phosphoethanolamine，DOPE）、胆甾醇半琥珀酸酯（cholesterylhemisuccinate，CHEMS）、胆固醇（CHOL）、氢化大豆磷脂（HSPC）和DSPE-mPEG2000（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）中的一种或两种以上的混合物。
进一步优选的，步骤1）中，新鱼腥草素钠与脂质体载体的质量比为1:5-13。
具体的，步骤1）中，所述有机溶剂由体积比1:1.5的甲醇和二氯甲烷混合组成。
进一步优选的，油相与水相的体积比为1:1-3。
进一步的，步骤2）中，超声总功率为 130w，超声功率/能量为20%-100%，超声时间为3-10min；过滤时选用0.45 µm的微孔滤膜。
本发明还提供了采用上述制备方法制备获得的新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂。
和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用薄膜分散法制备获得了新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂，并通过单因素优化法确定了脂质体载体组成、新鱼腥草素钠与脂质体载体的质量比（药脂比）、油水相体积比、水化温度、超声功率、超声时间等、并通过高效液相色谱法测定了脂质体制剂的包封率、载药量等，同时考察了其粒径（脂质体的pH敏感性主要通过粒径变化来测定）及电位等指标。此外，还采用动态透析法考察了脂质体制剂在pH=7.4及pH=5.0环境中的释放情况，并研究分析了其药代动力学，实验结果发现：本发明脂质体制剂在pH=5.0的酸性环境下，药物释放效果要优于pH=7.4的中性环境；同时本发明脂质体制剂组在大鼠体内的释放要优于原料药组。本发明分别将新鱼腥草素钠、顺铂包封在脂质体的类脂双分子层及水相中，并获得良好的pH敏感性及缓释效果。本发明脂质体制剂具有包封率高，载药量高、易于制备的优点，并且酸性敏感性良好、可以延缓药物释放、增加靶向作用，有利于提高药效。
附图说明
图1为实施例1制备所得脂质体制剂的粒径图；
图2为实施例1制备所得脂质体制剂的电位图；
图3为实施例1制备所得脂质体制剂的电镜图；
图4为实施例1制备所得脂质体制剂在不同环境（pH=7.4、pH=5.0）下的SNH释放图；
图5为实施例1制备所得脂质体制剂在不同环境（pH=7.4、pH=5.0）下的CDDP释放图；
图6为不同组别大鼠体内的SNH药时曲线；
图7为不同组别大鼠体内的CDDP药时曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
一种新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其采用薄膜分散法，具体包括如下步骤：
1）称取处方量的脂质体载体、SNH，将脂质体载体和SNH 2mg溶于体积比1:1.5的甲醇和二氯甲烷混合有机溶剂中，获得油相，置于250 mL圆底烧瓶中，然后25℃减压旋蒸除去有机溶剂，形成均匀薄膜；脂质体载体组成为摩尔比3:2:0.15的DOPE、CHEMS和DSPE-mPEG2000的混合物共10.86mg；SNH与脂质体载体的质量比为2:10.86作为药脂比；
2）将顺铂2mg溶于生理盐水溶液6mL中，获得水相，在步骤1）所得产物中加入水相（油相与水相的体积比为1:1），然后于37℃磁力搅拌约1h以充分水化，冰浴超声6min（超声1s，停止1 s，超声总功率为 130w，超声功率/能量为60%），经0.45 µm微孔滤膜过滤即得脂质体溶液。
对上述实施例1制备所得的脂质体溶液进行包封率、载药量等的测定。
包封率，载药量测定方式如下：
采用超滤离心法检测脂质体包封率与载药量，具体操作为：取1mL脂质体溶液，加入超滤离心管上层，4000r/min离心20min，上层为包封脂质体，加入5倍量流动相超声20min破乳，进样检测得W包封，下层为未包封药物，进样检测得W未包封。取1mL脂质体溶液，加入5倍量流动相（SNH流动相：乙腈∶三乙胺∶四丁基溴化铵=49∶0.3∶51，v/v；CDDP流动相：甲醇∶水=70∶30，v/v）超声20min破乳，进样检测，得W总。
包封率，载药量计算方式如下：
计算包封率(EE)和载药量(DL)公式如下：
EE(%)= (W包封/ W总) ×100 %； EE(%)= { (1-W未包封)/ W总}×100 %：
DL(%)=W包封/ (W总+ W载体) ×100 %。式中，W包封为包封药物总量，W未包封为未包封入脂质体的药量，W总为总药量，W载体为脂质体载体总量。
酸性敏感性检测方式：
取适量脂质体溶液，分别测定其初始粒径，然后分别加入pH值为5.0及pH值为7.4的PBS溶液，在37℃水浴中孵育30min，再次测定其粒径，分别记做L初始、L5.0、L7.4，粒径单位为nm，下同。
结果显示：SNH包封率：97.06%；CDDP包封率：51.30%；共载药量：12.28%；L初始=164.6；L5.0= 277；L7.4= 185。
单因素优化过程：
下述给出了本申请脂质体制剂制备过程中的单因素筛选优化过程。
1）脂质体载体组成：于本发明的制剂中，所选脂质体载体包括下述4个组别：
<1> DOPE:CHEMS:PEG=3:2:0.15；
<2> DOPE:CHEMS:PEG=2.5:2.5:0.15；
<3> DOPE:CHEMS:CHOL:PEG=3:1:1:0.15；
<4> DOPE:HSPC:CHEMS:CHOL:PEG=1.5:1.5:2:0.15 (mol:mol)；分别按照上述实施例1步骤制备该制剂，然后测定计算其包封率及载药量，并检测其酸性敏感性。结果如下：
<1>SNH包封率：91.26%；CDDP包封率：48.74%；共载药量：5.36%；L初始= 159；L5.0=361；L7.4= 144；
<2> SNH包封率：94.40%；CDDP包封率：53.32%；共载药量：5.63%；L初始= 196；L5.0=255.8；L7.4= 175；
<3> SNH包封率：72.67%；CDDP包封率：7.94%；共载药量：2.42%；L初始=187；L5.0=233；L7.4= 200；
<4> SNH包封率：62.14%%；CDDP包封率：47.54%；共载药量：7.65%；L初始= 111；L5.0=272；L7.4= 126；
由上述结果可知：<1>、<4>组均有较为明显的酸性敏感性，其中<1>组的SNH包封率要远高于<4>组，所以综合考虑多项因素，选择摩尔比DOPE:CHEMS: DSPE-mPEG2000=3:2:0.15作为脂质体载体组成。
2）药脂比（SNH与脂质体载体的质量比）：于本发明的制剂中，所选药脂比包括下述3个组别：<1> SNH:脂质=2：21.72；<2>SNH:脂质=2：16.29； <3> SNH:脂质=2：10.86;(m:m)；分别按照上述实施例1步骤制备该制剂，然后测定计算其包封率及载药量，结果如下：
<1>SNH包封率：94.00%；CDDP包封率：62.30%；共载药量：7.36%；
<2> SNH包封率：95.96%；CDDP包封率：60.08%；共载药量：11.59%；
<3> SNH包封率：97.90%；CDDP包封率：32.37%；共载药量：13.29%；
由上述结果可知：随着脂质体载体重量的增加，对SNH包封率影响相对较小，但对CDDP包封率及共载药量影响较大，考虑两药的包封率及共载药量以及脂质消耗量，虽然10.86时CDDP包封率有一定降低，但其载药量居高，所以选择质量比SNH:脂质体载体=2：10.86作为药脂比。
3）油相与水相的体积比：于本发明的制剂中，所选体积比包括下述3个组别：<1>油相与水相的体积比=1:1；<2>油相与水相的体积比=1:2；<3>油相与水相的体积比=1:3；分别按照上述实施例1步骤制备该制剂，然后测定计算其包封率及载药量，结果如下：
<1>SNH包封率：96.20%；CDDP包封率：32.37%；共载药量：11.40%；
<2> SNH包封率：72.14%；CDDP包封率：35.42%；共载药量：3.94%；
<3> SNH包封率：61.87%；CDDP包封率：22.81%；共载药量：3.02%；
由上述结果可知：当水相体积增加时SNH包封率及共载药量随之下降，CDDP包封率变化不明显，综合考虑多项因素，选择油相与水相的体积比为1:1。
4）水化温度：于本发明的制剂中，所选水化温度包括<1> 25℃；<2> 37℃；<3> 55℃；分别按照上述实施例1步骤制备该制剂，然后测定计算其包封率及载药量，结果如下：
<1>SNH包封率：68.82%；CDDP包封率：34.46%；共载药量：5.27%；
<2> SNH包封率：85.41%；CDDP包封率：37.52%；共载药量：6.64%；
<3> SNH包封率：85.07%；CDDP包封率：34.63%；共载药量：6.65%；
由上述结果可知：当水化温度为37℃及55℃时，SNH、CDDP载药量及包封率均较大，但37℃更接近人体温度，且温度过高可能会引起磷脂变性，所以选择37℃作为水化温度。
5）超声功率/能量百分比：于本发明的制剂中，所选百分比包括<1>超声功率/能量=20%；<2>超声功率/能量=60%；<3>超声功率/能量=100%；其中，总功率为130W；分别按照上述实施例1步骤制备该制剂，然后测定计算其包封率及载药量，结果如下：
<1>SNH包封率：77.03%；CDDP包封率：42.22%；共载药量：5.35%；
<2> SNH包封率：88.41%；CDDP包封率：43.33%；共载药量：6.28%；
<3> SNH包封率：74.38%；CDDP包封率：31.13%；共载药量：4.32%；
由上述结果可知：当超声功率/能量百分比为60%时，SNH、CDDP载药量及包封率均较大，所以选择超声功率/能量百分比选择60%。
6）超声时间：于本发明的制剂中，所选超声时间包括<1>3min；<2> 6min；<3>10min；分别按照上述实施例1步骤制备该制剂，然后测定计算其包封率及载药量，结果如下：
<1>SNH包封率：67.31%；CDDP包封率：79.69%；共载药量：7.28%；
<2> SNH包封率：85.41%；CDDP包封率：37.52%；共载药量：6.64%；
<3> SNH包封率：56.85%；CDDP包封率：58.82%；共载药量：6.27%；
由上述结果可知：当超声时间为6min和3min时，SNH及CDDP分别达到最大包封率，载药量均较大，考虑超声3min时粒径可能较大，所以选择6min作为超声时间。
稳定性试验：
将上述实施例1制备所得的脂质体制剂避光置于4℃下保存，分别于制备的0天、7天、10天、12天、15天及30天测定计算其包封率及载药量，观察其是否稳定，结果如下：
0天：SNH包封率：97.06%；CDDP包封率：49.16%；
7天：SNH包封率：98.07%；CDDP包封率：44.63%；
10天：SNH包封率：99.69%；CDDP包封率：47.36%；；
12天：SNH包封率：97.27%；CDDP包封率：29.32%；
15天：SNH包封率：92.16%；CDDP包封率：27.64%；
30天：SNH包封率：93.71%；CDDP包封率：16.73%；根据结果可知：本发明脂质体制剂SNH包封率在30天内基本未发生明显变化，但CDDP包封率在12天有一定下降，说明本发明制剂于4℃避光保存，在10天内基本稳定，30天内SNH基本稳定。
粒径及电位测定：
取适量上述实施例1制备所得的脂质体制剂，于马尔文粒径仪下测定其粒径及电位，并用醋酸铀染液复染后于透射电镜下观察拍照，图1、2、3分别给出了脂质体制剂的粒径图、电位图和透射电镜图。从图1可以看出：该制剂粒径在200nm以下。从图2可以看出：该制剂基本稳定。从图3可以看出：透射电镜下脂质体呈球形，分布均匀，有螺纹结构，符合脂质体的外观特征。
中性和酸性环境释放情况：
透析袋预先经过下述预处理：把透析袋剪成适当长度的小段。在500mL的2%（w/v）的碳酸氢钠和1mmol/L EDTA2Na（pH=8.0）中将透析袋煮沸10min。用蒸馏水彻底清洗透析袋。在500mL的1mmol/L EDTA2Na（pH=8.0）中将之煮沸10min。冷却后，用蒸馏水将透析袋里外加以清洗干净，再进行使用。
选择适量上述实施例1制备所得的脂质体制剂，采用动态透析法考察该制剂在pH=7.4及pH=5.0的环境中释放情况。量取该制剂2mL 置于预处理过的透析袋中，封闭透析袋两端避免漏液，分别放入30mL pH=7.4和pH=5.0的PBS 溶液中，在恒温摇床上37℃、100 r/min振荡，分别于1、2、4、6、8、12、24、48和72 h 时，取出2mL的释放介质（PBS 溶液），同时补充2mL相同温度、相同pH的释放介质，进样检测，计算累计释放率，绘制累计释放率-时间曲线，结果见附图4和5。
图4给出了脂质体制剂在不同环境（pH=7.4、pH=5.0）下的SNH释放图；从图4可以看出：酸性溶液中SNH释放更快。
图5给出了脂质体制剂在不同环境（pH=7.4、pH=5.0）下的CDDP释放图；从图5可以看出：酸性溶液中CDDP释放更快。
大鼠体内药代实验：
选择适量上述实施例1制备所得的脂质体制剂。随机取6只SD大鼠分成2组，每组3只，分别为制剂组和原料药组（LP表示制剂组，SOL表示原料药组，原料药用生理盐水溶解）。按 CDDP 4 mg/kg、SNH 16 mg/kg 的剂量大鼠腹腔注射。于给药后5min、15min、30min、1h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h，分别从眼眶处取血约500 μL。
量取 100 μL 待测血浆，加入20 μL浓度100μg/ml的鱼腥草素钠(Sodiumhouttuyfonate，SH)标准溶液，加乙腈至500μL，涡旋60 s，14000 r/min 离心10 min，取上清，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样检测血样中的SNH含量。量取100 μL待测血浆，加入20μL浓度2.08mg/ml的氯化镍标准溶液、200 μL 5% DDTC溶液、加蒸馏水至500μL，涡旋60 s，于37 ℃水浴中反应30min ，冷却后加500μL三氯甲烷萃取，涡旋60s，14000 r/min 离心10min，取下层三氯甲烷层，经0.22μm微孔滤膜过滤后，进样检测血样中的CDDP含量。绘制血药浓度-时间曲线，分析药代动力学参数，结果见附图6、7及下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：Cmax：达峰浓度；AUC：血药浓度时间曲线下的面积；Vz/F：表观分布容积；
CLz/F：体内总清除率；t1/2z：半衰期
由图6、7和上表可以看出：SNH及CDDP 制剂组Cmax（达峰浓度）更高，曲线下面积AUC大于原料药组，t1/2z半衰期有一定增加，清除率CLz/F一定程度上降低；以上结果表明制备成脂质体形式给药能够减缓药物的代谢消除过程，延长药物在血液中的循环时间，起到一定的缓释效果。
虽然SNH和CDDP同时具有抗肿瘤作用，但却各自因为溶解度差、副作用大等缺点而导致其使用受限。因此本申请考虑将两者联合起来并共同包载，以减少各自的用量，并提高溶解性，减轻副作用。脂质体是目前发展前景较好且安全性较高的新型药物递送系统，不仅可以改善药物的溶解性和药代动力学性质，还容易通过修饰提高稳定性和靶向性。肿瘤中广泛存在的微酸性环境在各类研究中都发挥着举足轻重的作用。因此，本发明设计了一种pH响应型的脂质体系统，使该系统在正常生理条件下稳定，但到达肿瘤部位时，微酸环境触发释放运载药物，增强化药物的治疗效果并降低药物的毒副反应。本发明采用薄膜分散法制备脂质体共同递送两种药物，制备的新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体包封率较高、稳定性较好，以提高二者联合用药效果。

Claims (7)

1.一种新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将脂质体载体和新鱼腥草素钠溶于有机溶剂中，获得油相，然后减压旋蒸除去有机溶剂，获得薄膜；
2）将顺铂溶于生理盐水溶液中，获得水相，在步骤1）所得产物中加入水相，然后于25-55℃水化，冰浴超声，经过滤即得。
2.如权利要求1所述新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述脂质体载体为1,2-二油酸甘油-3-磷脂酰乙醇胺、胆甾醇半琥珀酸酯、胆固醇、氢化大豆磷脂和DSPE-mPEG2000中的一种或两种以上的混合物。
3.如权利要求1所述新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其特征在于，步骤1）中，新鱼腥草素钠与脂质体载体的质量比为1:5-13。
4.如权利要求1所述新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述有机溶剂由体积比1:1.5的甲醇和二氯甲烷混合组成。
5.如权利要求1所述新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其特征在于，油相与水相的体积比为1:1-3。
6.如权利要求1所述新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂的制备方法，其特征在于，步骤2）中，超声总功率为 130w，超声功率/能量为20%-100%，超声时间为3-10min；过滤时选用0.45 µm的微孔滤膜。
7.采用权利要求1至6任一所述制备方法制备获得的新鱼腥草素钠及顺铂共载药酸性敏感脂质体制剂。
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