CN111658632A - 全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药学领域，具体涉及一种全反式维甲酸脂质体制剂及其复合脂质体的制备工艺。本发明利用主动载药法制备全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体，所述脂质体由下述方法获得：1)制备pH梯度空白脂质体2)将全反式维甲酸和共载药物溶解于一种能与水混溶的有机溶剂，滴加入空白脂质体中3)一定温度下孵育，全反式维甲酸及共载药物主动进入脂质体内部，获得全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体制剂。该方法具有高包封率、高载药量、稳定性好、安全性高等特点。

Description

全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体制剂的制备方法
技术领域
本发明属于药学领域，具体涉及一种全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体制剂的制备工艺。
背景技术
脂质体是一种由脂质双分子层构成的封闭囊泡。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于包载疏水性或亲水性的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。脂质体具有被动靶向的特点，能够缓慢地释放药物，降低药物的毒性和刺激性，提高药物稳定性。
主动载药法是指药物利用内外水相的不同离子或化合物梯度主动跨过脂质体双分子层，进入脂质体内部。主动载药适用于两亲性药物，如某些弱酸弱碱，其油水分配系数受介质pH和离子强度的影响较大，用被动载药法制得的脂质体包封率低。而主动载药法制得的脂质体包封率高、渗透少，克服了被包裹药物的早期突释和泄漏等问题。
全反式维甲酸(retinoic acid，RA)是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。用于治疗寻常痤疮、银屑病、鱼鳞病、扁平苔癣、毛发红糠疹、毛囊角化病、鳞状细胞癌及黑色素瘤等疾病。全反式维甲酸的临床应用受到两个方面的限制，一是其水溶性极差(0.00477mg/mL)，二是全反式维甲酸半衰期短，性质不稳定，不能维持达到治疗效果所需血药浓度。
目前有关全反式维甲酸的文献及专利报道较多，其中包括很多与本专利关联的脂质体文献、专利。如中国专利CN201010190396.2和文献International Journal ofPharmaceutics 258(2003)45–53中均采用被动载药法制备全反式维甲酸脂质体，但该方法制得的脂质体包封率较低，稳定性较差。中国专利CN201610686883.5中将全反式维甲酸利用聚合物类助溶分子助溶，然后主动载入脂质体内，该方法虽大大提高了全反式维甲酸的包封率，但仍未达到90％以上，并且该技术需要加入PVP、HPMC、环糊精或PEG等助溶分子，不能在制备脂质体的过程中将其有效去除，会产生由助溶分子导致的过敏、溶血等安全性问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体制剂的制备方法，提供了一种利用能与水混溶的有机溶剂主动载药的关键技术，大大提高了脂质体的包封率和载药量，提高了药物的稳定性。
本发明的制备方法为主动载药法，优选地为醋酸钙梯度法。
本发明所述的全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体制剂的制备方法如下：
(1)空白脂质体的制备；
(2)制备内外水相均为醋酸钙水溶液的醋酸钙等度空白脂质体；
(3)通过外水相置换的方法获得脂质体膜内外pH梯度，外水相pH为5.0～7.0；
(4)醋酸钙梯度空白脂质体中添加全反式维甲酸或全反式维甲酸与藤黄酸的混合物溶于有机溶剂获得的有机溶液，孵育；
(5)将获得的载药脂质体采用透析、旋蒸、切向流超滤等方法除去有机溶剂，获得全反式维甲酸脂质体或全反式维甲酸-藤黄酸复合脂质体。
优选地，所述脂质体为单室脂质体。
优选地，所述脂质体的粒径范围是50nm～220nm。更优选地，所述脂质体的粒径范围是90nm～150nm。
步骤(1)中空白脂质体利用注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法、微流控技术(Microfluidics)等方法制备，其内水相为pH 7.0～11.0溶液。
步骤(2)中醋酸钙水溶液浓度为50mM～500mM、pH为7.0～11.0。
步骤(3)中所述的外水相溶液为与醋酸钙内水相等渗的pH 5.0～7.0溶液，优选为硫酸钠溶液。
步骤(4)中所述的溶剂为能与水混溶的有机溶剂。
进一步，所述与水混溶的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的任意一种或多种的组合。
进一步优选地，所述与水混溶的有机溶剂优选为甲醇、乙醇、DMSO。
所述加入的有机溶剂与醋酸钙梯度空白脂质体溶液之间的体积比范围是：(0.3～0.01)：1，优选为(0.1～0.05)：1。
所述全反式维甲酸或全反式维甲酸-藤黄酸与空白脂质载体之间的质量比范围是1：(1～30)。
进一步地，所述方法包括步骤：
(1)按一定比例称取用于制备脂质体的各种原料混合后，用氯仿溶解；
(2)将步骤(1)中的氯仿混合物旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂膜；
(3)将步骤(2)中脂膜中加入浓度为50mM～500mM、pH为7.0～11.0的醋酸钙水溶液，获得脂质体囊泡；
(4)将步骤(3)所制得的脂质体囊泡依次通过孔径为400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜，获得内外水相均为醋酸钙水溶液的空白脂质体；
(5)将步骤(4)所制得的内外水相均为醋酸钙水溶液的空白脂质体置于琼脂糖凝胶Sepharose G-50上洗脱置换，洗脱液为pH 5.0～7.0的等渗硫酸钠溶液；
(6)将步骤(5)获得的醋酸钙梯度空白脂质体中添加全反式维甲酸或全反式维甲酸-藤黄酸的乙醇溶液，孵育；
(7)将步骤(6)获得的载药脂质体采用切向流超滤装置除去乙醇，获得全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体。
本发明利用主动载药方法包封全反式维甲酸及其复合物，形成包封率达到99％以上、载药量达到4.3％以上、4℃条件下样品放置两个月主要指标无明显变化的脂质体。
附图说明
图1为4T1乳腺癌细胞荷瘤BALB/c小鼠给药后各指标的变化；
(a)为给药四次后各组小鼠肿瘤体积随天数的变化曲线(b)每组小鼠荷瘤率情况：荷瘤率％＝(肿瘤重量g/小数平均体重g)×100％(c)给药四次后各组小鼠体重随天数的变化曲线(d)各组小鼠肝肾毒性评价情况(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,n＝5)；
图2为4T1乳腺癌细胞荷瘤BALB/c小鼠给药后各主要器官H&E染色图片及肿瘤照片
(a)各组小鼠肿瘤及各主要器官(心、肝、脾、肺、肾)H&E染色显微镜下照片(b)各组小鼠肿瘤照片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1全反式维甲酸脂质体的制备
一、制备
以二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇，和DSPE-PEG2000作为膜材，质量比为10:2:3。
(1)溶解：膜材置茄形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发除去氯仿，在茄形瓶底部形成均一薄膜；
(2)水化：在65摄氏度下将磷脂薄膜与醋酸钙水溶液(120mM)混合，脂膜遇到内水相形成脂质体囊泡分散在水化液中，构成水化产物；
(3)挤出：在65摄氏度下将所制得的脂质体囊泡依次通过孔径为400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜，获得粒径小而均一的脂质体；
(4)置换外水相：用3～5个柱体积的120mM硫酸钠水溶液将琼脂糖凝胶SepharoseG-50预饱和，将步骤(3)制得的等度空白脂质体上样于琼脂糖凝胶柱，用120mM硫酸钠水溶液以2mL/min的速度洗脱，获得梯度空白脂质体；
(5)载药：65摄氏度条件下，向步骤(4)中获得的梯度脂质体中缓慢滴加8mg/mL的全反式维甲酸的乙醇溶液，并以80r～120r/min的速度搅拌，加入的全反式维甲酸乙醇溶液与梯度空白脂质体的体积比为1:12，孵育40min，孵育结束后于5000r/min离心取上清，并用Sephadex G50葡聚糖凝胶除去游离药物，最终得到全反式维甲酸脂质体。
(6)除有机溶剂:将获得的载药脂质体通过切向流装置除去乙醇并浓缩，获得全反式维甲酸脂质体。
二、表征
(1)包封率的测定
将纯化后的维甲酸脂质体用9倍体积的10％TritonX-100破坏，用紫外检测器的高效液相色谱仪测定包封率。测定条件：ODS柱(Kromasil，5μm，150*3.0mm)；检测器温度为40摄氏度；检测波长为360nm；流速为1.0mL/min；流动相为甲醇：0.5％冰醋酸-水＝89:11.全反式维甲酸包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(Wi/Wt)*100％，其中Wi是纯化后被10％TritonX-100破坏的脂质体制剂中全反式维甲酸的质量，Wt是过纯化前脂质体中全反式维甲酸的质量。结果显示全反式维甲酸脂质体的包封率为99.9％。
(2)粒径
全反式维甲酸脂质体的粒径实验显示全反式维甲酸脂质体制剂平均粒径为130nm左右，粒度分布(PDI)均<0.2。
实施例2主动载药制备全反式维甲酸脂质体处方筛选
一、有机溶剂种类对脂质体的影响
按照实施例1中处方组成的用量来制备空白脂质体及载药脂质体，制备方法同实施例1所述方法，所不同的是载药时分别采用不同种类的有机溶剂替换实施例中的乙醇，测定制备的脂质体样品的包封率、载药量及粒径，结果见下表。实验结果表明，利用乙醇、甲醇和DMSO制备的脂质体包封率均在90％以上，但考虑到甲醇和DMSO有一定毒性，且DMSO沸点较高不易去除，因此优选乙醇作为载药的有机溶剂。
表1.有机溶剂种类对脂质体的影响
Figure BDA0001985329120000051
二、有机溶剂用量对脂质体的影响
按照实施例1中处方组成的用量来制备空白脂质体及载药脂质体，制备方法同实施例1所述方法，所不同的是载药时向空白脂质体中分别加入2％、5％、10％、30％(v/v)的乙醇，测定制备的脂质体样品的包封率、载药量及粒径，结果见下表。实验结果表明，当加入5％-10％(v/v)乙醇时，制剂的包封率最高，当乙醇含量增多时会对包封率有一定影响。
表2.有机溶剂用量对脂质体的影响
Figure BDA0001985329120000061
由上述结果可知，当所用有机溶剂为乙醇，且加入的乙醇用量为5-10％(v/v)时，脂质体的包封率在95％以上，载药量在4.30％以上。而当加入的乙醇用量为5％(v/v)时为最优条件，脂质体包封率为99.9±1.5％，载药量为4.39±0.07％，粒径范围为129.5±2.8nm。
实施例3主动载药制备全反式维甲酸脂质体与被动载药制备全反式维甲酸脂质体比较
一、主动载药法及被动载药法制备全反式维甲酸脂质体
1.使用溶剂主动载药法制备全反式维甲酸脂质体
以二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)(购自上海艾伟特医药科技有限公司)，胆固醇(购自上海艾伟特医药科技有限公司)，和DSPE-PEG2000(购自上海艾伟特医药科技有限公司)作为膜材，质量比为10:2:3。
(1)溶解：膜材置茄形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发除去氯仿，在茄形瓶底部形成均一薄膜；
(2)水化：在65摄氏度下将磷脂薄膜与醋酸钙水溶液(120mM)混合，脂膜遇到内水相形成脂质体囊泡分散在水化液中，构成水化产物；
(3)挤出：在65摄氏度下将所制得的脂质体囊泡依次通过孔径为400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜，获得粒径小而均一的脂质体；
(4)置换外水相：用3～5个柱体积的120mM硫酸钠水溶液将琼脂糖凝胶SepharoseG-50预饱和，将步骤(3)制得的等度空白脂质体上样于琼脂糖凝胶柱，用120mM硫酸钠水溶液以2mL/min的速度洗脱，获得梯度空白脂质体；
(5)载药：65摄氏度条件下，向步骤(4)中获得的梯度脂质体中缓慢滴加8mg/mL的全反式维甲酸的乙醇溶液，并以80r～120r/min的速度搅拌，加入的全反式维甲酸乙醇溶液与梯度空白脂质体的体积比为1:12，孵育40min，孵育结束后于5000r/min离心取上清，并用Sephadex G50葡聚糖凝胶除去游离药物，最终得到全反式维甲酸脂质体。(作为1号制剂)
2.使用助溶分子主动载药法制备全反式维甲酸脂质体
以二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)(购自上海艾伟特医药科技有限公司)，胆固醇(购自上海艾伟特医药科技有限公司)，和DSPE-PEG2000(购自上海艾伟特医药科技有限公司)作为膜材，质量比为10:2:3。
(1)溶解：膜材置茄形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发除去氯仿，在茄形瓶底部形成均一薄膜；
(2)水化：在65摄氏度下将磷脂薄膜与醋酸钙水溶液(120mM)混合，脂膜遇到内水相形成脂质体囊泡分散在水化液中，构成水化产物；
(3)挤出：在65摄氏度下将所制得的脂质体囊泡依次通过孔径为400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜，获得粒径小而均一的脂质体；
(4)置换外水相：用3～5个柱体积的120mM硫酸钠水溶液将琼脂糖凝胶SepharoseG-50预饱和，将步骤(3)制得的等度空白脂质体上样于琼脂糖凝胶柱，用120mM硫酸钠水溶液以2mL/min的速度洗脱，获得梯度空白脂质体；
(5)载药：65摄氏度条件下，向步骤(4)中获得的梯度脂质体中缓慢滴加8mg/mL的全反式维甲酸PVP混悬液，并以80r～120r/min的速度搅拌，加入的全反式维甲酸PVP混悬液与梯度空白脂质体的体积比为1:12，孵育40min，最终得到全反式维甲酸脂质体。(作为2号制剂)
3.使用被动载药法制备全反式维甲酸脂质体
(1)溶解：膜材与一定量的全反式维甲酸固体置茄形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发除去氯仿，在茄形瓶底部形成均一薄膜；
(2)水化：在65摄氏度下注入pH 7.4的PBS溶液，水化30min，形成脂质体囊泡分散在水化液中；
(3)挤出：在65摄氏度下将所制得的脂质体囊泡依次通过孔径为400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜，获得粒径小而均一的脂质体。(作为3号制剂)二、三种维甲酸脂质体制剂对比
1、包封率
将纯化后的三种维甲酸脂质体用9倍体积的10％TritonX-100破坏，用紫外检测器的高效液相色谱仪测定包封率。测定条件：ODS柱(Kromasil，5μm，150*3.0mm)；检测器温度为40摄氏度；检测波长为360nm；流速为1.0mL/min；流动相为甲醇：0.5％冰醋酸-水＝89:11.全反式维甲酸包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(Wi/Wt)*100％，其中Wi是纯化后被10％TritonX-100破坏的脂质体制剂中全反式维甲酸的质量，Wt是过纯化前脂质体中全反式维甲酸的质量。
2、载药量
载药量计算公式为DL(％)＝(We/Wm)*100％
We表示包封于脂质体内的药量；Wm表示载药脂质体的总重量。
3、粒径
三种制剂稀释相同倍数后用Malvern ZetaSizer(美国Malvern公司)检测。4、长期稳定性
根据药物稳定性试验指导原则，分别制备三批1号、2号、3号制剂，在4摄氏度条件下避光保存，分别于0、1、2和3个月取样，考察各脂质体制剂的粒径与包封率的变化。
5、溶血试验
(1)稀释抗凝兔血的制备
健康家兔心脏采血20ml，加2％草酸钾溶液1ml，制备成新鲜抗凝兔血，取新鲜抗凝兔血8ml，加0.9％氯化钠注射液10ml稀释，将稀释抗凝兔血贮存于4摄氏度冰箱中备用。
(2)阴性及阳性对照试样的制备
每个试管内放置10ml生理盐水为阴性对照试样，10ml蒸馏水为阳性对照试样，各制备3个平行样。
(3)供试品的制备
向试管中加入等体积的三种脂质体制剂(各三份)，每个试管中加入10ml0.9％氯化钠注射液。
(4)溶血率的测定
将上述试管置于温度为37摄氏度的恒温水浴中，保温30min，然后在每个试管内分别加入稀释抗凝兔血0.2ml，轻轻混匀。继续于恒温水浴中保温60min。倒出管内液体，2500转/min离心5min后吸取上清液，置紫外分光光度计比色皿中，于545nm处测定各管吸光度，计算其溶血率。
溶血率(％)＝(供试品吸光度－阴性对照组吸光度)/(阳性对照吸光度－阴性对照组吸光度)×100％
结果附表
表3.三种维甲酸脂质体制剂包封率、载药量、粒径的对比
Figure BDA0001985329120000091
表4.三种维甲酸脂质体制剂长期放置粒径变化
Figure BDA0001985329120000092
表5.三种维甲酸脂质体制剂长期放置包封率变化
Figure BDA0001985329120000093
表6.三种维甲酸脂质体制剂溶血实验结果
Figure BDA0001985329120000094
由实验结果可知，利用该专利方法制备的维甲酸脂质体包封率最高、稳定性最好，且利用乙醇实现难溶性药物的主动载药，避免了助溶分子引起的溶血现象。
实例4主动载药制备全反式维甲酸-藤黄酸脂质体实现协同治疗
有机溶剂主动载药法也可用于与两个或两个以上药物联合装载,实现协同治疗的目的。
藤黄酸(gambogic acid,GA)来源于藤黄科植物藤黄树的干燥树脂，不溶于水，溶于乙醇、甲醇。研究表明藤黄酸具有明显的抗癌活性，它作为蛋白酶激活和凋亡诱导剂，会捕获细胞周期的G2/M期，而且造成不可逆。
一、体外细胞实验筛选维甲酸、藤黄酸最佳协同比例
利用MTT实验体外筛选维甲酸、藤黄酸最佳协同比例。选用小鼠乳腺癌细胞4T1细胞作为实验对象。4T1细胞以1000个/孔接种于96孔细胞培养板中，在37摄氏度，5％CO2条件下培养24小时后，分别向96孔板中加入不同质量比的维甲酸、藤黄酸溶液(藤黄酸；维甲酸-1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10)然后在培养箱中继续培养。48小时后，将96孔板中的旧培养液吸走，每孔加入20微升浓度为5mg/mL的MTT溶液，放在37摄氏度恒温箱中孵育4小时，倒掉培养液，每孔加100微升DMSO，震荡10min时甲瓒溶解，用酶标仪测定490nm波长下的吸光度值。细胞存活率计算方法如下：
Cell viability(％)＝(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100％
其中，Asample为样品吸光度值，Ablank为不加药的孔的吸光度值，Acontrol为无药无细胞的孔的吸光度值。通过GraphPad Prism 5.0计算各比例的IC50值。联合指数CI(Combination Index)用于评价两种药物协同治疗的效果，CI计算方法如下：
CI＝(IC50A/IC50AS)+(IC50B/IC50BS)
其中，IC50A和IC50B代表了药物A和B联合时产生协同作用的IC50，IC50AS和IC50BS表示药物A和B单独的IC50。当CI<1时，两药产生协同作用。
表7.藤黄酸-维甲酸协同比例筛选结果
Figure BDA0001985329120000111
由上表结果可知，藤黄酸、维甲酸产生协同作用的比例为1：2-1：10，最佳比例为1:2，CI值为0.818。当藤黄酸剂量高于维甲酸时(如藤黄酸：维甲酸＝2:1,4:1)不产生协同作用。
二、全反式维甲酸-藤黄酸脂质体的制备及处方筛选
以二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇，和DSPE-PEG2000作为膜材，质量比为10:2:3。
(1)溶解：膜材置茄形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发除去氯仿，在茄形瓶底部形成均一薄膜；
(2)水化：在65摄氏度下将磷脂薄膜与醋酸钙水溶液(120mM)混合，脂膜遇到内水相形成脂质体囊泡分散在水化液中，构成水化产物；
(3)挤出：在65摄氏度下将所制得的脂质体囊泡依次通过孔径为400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜，获得粒径小而均一的脂质体；
(4)置换外水相：用3～5个柱体积的120mM硫酸钠水溶液将琼脂糖凝胶SepharoseG-50预饱和，将步骤(3)制得的等度空白脂质体上样于琼脂糖凝胶柱，用120mM硫酸钠水溶液以2mL/min的速度洗脱，获得梯度空白脂质体；
(5)载药：65摄氏度条件下，向步骤(4)中获得的梯度脂质体中缓慢滴加10mg/mL的全反式维甲酸的乙醇溶液，并以80r～120r/min的速度搅拌，加入的全反式维甲酸乙醇溶液与梯度空白脂质体的体积比为1:15，孵育15min后，再滴加10mg/mL的藤黄酸的乙醇溶液，加入的藤黄酸乙醇溶液与梯度空白脂质体的体积比为1:30，继续孵育30min。孵育结束后于5000r/min离心取上清，并用Sephadex G50葡聚糖凝胶除去游离药物，最终得到全反式维甲酸-藤黄酸复合脂质体。
(6)除有机溶剂:将获得的载药脂质体通过切向流装置除去乙醇并浓缩，获得全反式维甲酸-藤黄酸复合脂质体。
按照实施例4中处方组成的用量来制备全反式维甲酸-藤黄酸复合脂质体，制备方法同实施例4所述方法，所不同的是载药时全反式维甲酸和藤黄酸加入的顺序和时间有所变化，将制备的脂质体样品测定包封率，结果见下表。实验结果表明，先加全反式维甲酸孵育15min再加藤黄酸孵育30min制备的脂质体样品包封率最高。
表8.不同加药方式对全反式维甲酸-藤黄酸复合脂质体包封率的影响
Figure BDA0001985329120000121
三、藤黄酸-维甲酸复合脂质体对4T1细胞荷瘤BALB/c小鼠体内药效试验
小鼠乳腺癌细胞4T1细胞以0.2mL/20g小鼠体重移植到小鼠右侧腋下皮下，用游标卡尺监测肿瘤体积大小，待肿瘤体积长到120mm3左右时，将BALB/c小鼠随机分为5组每组六只，分别尾静脉注射生理盐水、藤黄酸-全反式维甲酸溶液(GRS)、藤黄酸脂质体(GL)、全反式维甲酸脂质体(RL)和藤黄酸-全反式维甲酸复合脂质体(GRL)(GA 8mg/mL；RA 16mg/mL)，每三天给药一次，共计给药4次，期间每天测量小鼠肿瘤体积与体重变化。在第12天时，每组随机取三只进行眼眶取血，测定丙氨酸转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、肌酐(CREA)和尿素(URE)，用于评价两药的肝肾毒性。实验结束后，所有小鼠均被处死，并摘取主要器官(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)，固定于4％多聚甲醛中，制备H&E染色切片。
通过实验结果可知，在为期12天的实验中，PBS组肿瘤大小增长了近1000mm3，而联合脂质体组肿瘤大小只增长了100mm3左右。与单独藤黄酸脂质体相比，两药连用在体内具有明显的抗肿瘤活性(**p<0.01)，说明藤黄酸-维甲酸复合脂质体与单独脂质体或溶液剂相比均表现出了良好的协同作用。实验期间小鼠体重结果可知，给药后各组小鼠体重无明显变化，小鼠血液生化指标检测结果表明，与空白对照组相比，给药组小鼠血液中各项指标与对照组并无显著差异。复合脂质体组小鼠肿瘤切片中可见大量肿瘤细胞凋亡，而各主要器官中并无明显病灶。以上实验结果均可说明，藤黄酸-维甲酸复合脂质体在小鼠体内具有明显的协同抗肿瘤效果，且对各主要器官和系统无明显毒性。

Claims (10)

1.一种全反式维甲酸脂质体及其复合脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体制剂通过如下方法制备：
(1)空白脂质体的制备；
(2)制备内外水相均为醋酸钙水溶液的醋酸钙等度空白脂质体；
(3)通过外水相置换的方法获得脂质体膜内外pH梯度，外水相pH为5.0～7.0；
(4)醋酸钙梯度空白脂质体中添加全反式维甲酸或全反式维甲酸与藤黄酸的混合物溶于有机溶剂获得的有机溶液，孵育；
(5)将获得的载药脂质体采用透析、旋蒸、切向流超滤等方法除去有机溶剂，获得全反式维甲酸脂质体或全反式维甲酸-藤黄酸复合脂质体。
2.如权利要求1或2所述的脂质体制剂，其特征在于，步骤(2)中醋酸钙水溶液浓度为50mM～500mM、pH为7.0～11.0。
3.如权利要求1-3任何一项所述的脂质体制剂，其特征在于，步骤(3)中所述的外水相溶液为与醋酸钙内水相等渗的pH 5.0～7.0溶液，优选为硫酸钠溶液。
4.如权利要求1-4任何一项所述的脂质体制剂，其特征在于，步骤(4)中所述的溶剂为能与水混溶的有机溶剂，选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的任意一种或多种的组合，优选为甲醇、乙醇、DMSO。
5.如权利要求1-5任何一项所述的脂质体制剂，其特征在于，所述加入的有机溶剂与醋酸钙梯度空白脂质体溶液之间的体积比范围是：(0.3～0.01)：1，优选为(0.1～0.05)：1。
6.如权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于，步骤(2)中的醋酸钙还可以为醋酸锌溶液、醋酸铜溶液。
7.如权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于，所述全反式维甲酸或全反式维甲酸-藤黄酸与空白脂质载体之间的质量比范围是1：(1～30)。
8.如权利要求1-8任何一项所述的脂质体制剂，其特征在于，全反式维甲酸与藤黄酸1：2-1：10。
9.如权利要求1-8任何一项所述的脂质体制剂，其特征在于，在步骤(4)中，当向梯度空白脂质体中滴加全反式维甲酸与藤黄酸有机溶剂溶液时，应先滴加全反式维甲酸溶液，孵育一段时间后，再滴入藤黄酸溶液，孵育。
10.如权利要求1-9任何一项所述的脂质体制剂，其特征在于，以二硬脂酰基磷脂酰胆碱，胆固醇，DSPE-PEG2000作为膜材，质量比为10-12:2-3:3-5。
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