CN107753427A - 一种全反式维甲酸脂质体制剂及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种全反式维甲酸脂质体制剂及其制备工艺。所述全反式维甲酸脂质体制剂包括全反式维甲酸和脂质体载体。本发明应用主动载药法制备全反式维甲酸脂质体制剂，形成载药量高、体内稳定的全反式维甲酸制剂。本发明所制备的全反式维甲酸脂质制剂大大提高了全反式维甲酸体内应用的血药浓度，延长了半衰期。

Description

一种全反式维甲酸脂质体制剂及其制备与应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种全反式维甲酸脂质体制剂及其制备与应用。
背景技术
维甲酸为体内维生素A代谢产物。全反式维甲酸(ATRA)作为药物被用来治疗粉刺，同时也是临床上治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的重要药物。全反式维甲酸(ATRA)通过结合至细胞内的特定受体(RARs，RXRs和RORs)从而影响基因表达，在急性早幼粒细胞白血病治疗中，可以促进APL细胞分化和PML/RARαgene的降解，达到治疗的效果。
然而，全反式维甲酸的药物的临床应用受到以下几个方面的限制：1全反式维甲酸的水溶性极低(4.77e-03g/l)；2全反式维甲酸血浆半衰期较短，而发挥其药效需要在一个较长的时间内维持一定的血药浓度，和在靶器官中的药效浓度。因此，选择一种适于全反式维甲酸的药物输送方式尤为重要。
脂质体作为一种纳米药物输送载体，自从提出至今已有30余年。多种基于脂质体输送系统的抗癌药物已广泛应用于临床治疗肿瘤中。其中最为成功的药物便是阿霉素脂质体，脂质体作为药物输送系统优势主要在于其改变了药物的生物分布，降低药物的系统毒性，并可通过脂质体上的特定修饰而达到长循环/靶向的效果，提高了靶组织的药物浓度。
此前报道的全反式维甲酸脂质体制剂大多将全反式维甲酸嵌合于磷脂双脂层中。受全反式维甲酸的物理性质限制，此方法所制成的全反式维甲酸脂质体在载药量与体内稳定性方面表现并不理想。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种全反式维甲酸制剂及其制备与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种全反式维甲酸脂质体制剂，所述全反式维甲酸脂质体制剂包括全反式维甲酸和脂质体载体。
优选地，所述全反式维甲酸脂质体制剂还含有用于增加全反式维甲酸溶解度的助溶分子。
进一步优选地，所述助溶分子选自PVP、HPMC、环糊精、PEG中的任一种或多种的组合。
进一步优选地，所述助溶分子与全反式维甲酸之间的摩尔比例范围是：(38～0.075)：1。
本发明一优选例中，所述环糊精选用羟丙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精或甲基-β-环糊精。
本发明一优选例中，所述PEG选用PEG-400。
当助溶分子选用环糊精时，所述助溶分子与全反式维甲酸之间的摩尔比例范围可以是(20～2)：1。
当助溶分子选用PVP时，所述助溶分子与全反式维甲酸之间的摩尔比例范围可以是(1.5～0.075)：1。
当助溶分子选用PEG-400时，所述助溶分子与全反式维甲酸之间的摩尔比例范围可以是(38～9.5)：1。
优选地，所述全反式维甲酸和脂质体载体之间的药脂摩尔比范围是1：(5～20)。
优选地，所述脂质体的原料含有磷脂、胆固醇和聚乙二醇化的磷脂。
进一步优选地，所述脂质体的原料中含有磷脂、胆固醇和聚乙二醇化的磷脂之间的摩尔比例范围是：(30～80)：(0.1～40)：(0.1～30)。
进一步优选地，所述脂质体的原料中含有HSPC、CHOL和DSPE-PEG。
进一步优选地，所述脂质体的原料中HSPC、CHOL、DSPE-PEG之间的摩尔比例范围是(30～80)：(0.1～40)：(0.1～30)。更优选地，所述脂质体的原料中HSPC、CHOL、DSPE-PEG之间的摩尔比例范围是57:38:5。
优选地，所述DSPE-PEG中PEG的分子量范围是50～10000。更优选，所述DSPE-PEG中PEG的分子量是2000。
优选地，所述脂质体为单室脂质体。
优选地，所述脂质体的粒径范围是30nm～200nm。更优选地，所述脂质体的粒径范围是50～150nm。更优选地，所述脂质体的粒径是70nm～130nm。
优选地，所述脂质体的粒径分布窄，其D95(粒径小于其占脂质体总量的95％)为小于等于120nm。更优选地，D95小于等于110nm，更优选地，D95小于等于95nm。
优选地，所述全反式维甲酸脂质体制剂中，所述全反式维甲酸的浓度大于等于0.1mg/ml。进一步优选地，所述全反式维甲酸脂质体制剂中，所述全反式维甲酸的浓度大于等于0.5mg/ml。更优选地，所述全反式维甲酸脂质体制剂中，所述全反式维甲酸的浓度范围是0.5～5mg/ml。
优选地，所述全反式维甲酸脂质体制剂为注射给药制剂。
进一步优选地，所述注射给药制剂选自皮下注射剂型、静脉注射剂型、肌肉注射剂型或盆腔注射剂型。
本发明的第二方面，提供了全反式维甲酸脂质体制剂的制备方法，为主动载药法。
优选地，所述制备方法为醋酸钙梯度法。
进一步优选地，所述方法包括步骤：
(1)按配比取用于制备脂质体的各原材料，用乙醇溶解，获得乙醇混合物；
(2)将步骤(1)中的乙醇混合物中加入pH为7.0～11.0的醋酸钙水溶液，获得脂质体囊泡；
(3)将步骤(2)中所得脂质体囊泡依次挤压通过不同孔径的聚碳酯膜，获得内外水相均为醋酸钙水溶液的空白脂质体；
(4)将步骤(3)所制得的内外水相均为醋酸钙水溶液空白脂质体置于pH为6.0～7.0的等渗溶液中透析，得到内外水相之前存在醋酸钙梯度的空白脂质体；
(5)在步骤(4)所得内外水相之前存在醋酸钙梯度的空白脂质体中添加全反式维甲酸混悬液，孵育，去除游离全反式维甲酸，即得全反式维甲酸脂质体制剂。
优选地，步骤(2)中，醋酸钙水溶液中醋酸钙的浓度是120mM～360mM。
优选地，当全反式维甲酸脂质体制剂含有助溶分子时，步骤(2)中，醋酸钙水溶液中含有助溶分子。
优选地，步骤(4)所得脂质体的内水相为pH为7.0～11.0的醋酸钙水溶液，外水相为pH为6.0～7.0的等渗溶液。
进一步优选地，所述等渗溶液选自：含有0.9％NaCl或10％蔗糖的浓度为10mM的HEPEs缓冲溶液。
本发明发现，所述方法能够用于提高全反式维甲酸脂质体制剂中全反式维甲酸的溶解度或药物浓度。
本发明还发现，所述方法能够用于提高全反式维甲酸脂质体制剂中全反式维甲酸作用于肿瘤相关巨噬细胞的效果。
本发明还发现，所述方法能够用于提高全反式维甲酸脂质体制剂中全反式维甲酸作用于髓系抑制细胞的效果。
本发明的第三方面，提供前述全反式维甲酸制剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。
优选地，所述肿瘤治疗药物为针对肿瘤病人中异常的髓系抑制性细胞、诱导髓系抑制性细胞分化、抑制肿瘤增殖和复发的药物。
进一步优选地，所述髓系抑制性细胞为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、基底细胞癌、黑色素瘤、滤泡性淋巴癌或小淋巴细胞瘤的髓系抑制性细胞。
本发明还提供了全反式维甲酸或前述全反式维甲酸在制备药物中的用途，所述用途选自以下任一项或多项：
(1)促进肿瘤部位细胞MDSC分化为成熟DC；
(2)促进肿瘤部位T细胞增殖；
(3)减少肿瘤浸润髓源细胞中的CD33+HLA-DR-MDSC数量；
(4)减少肿瘤部位MDSC的数量。
进一步地，所述用途选自以下任一项或多项：
(1)促进肿瘤部位细胞MDSC分化为成熟DC；
(2)促进头颈部黏膜鳞状细胞癌PBMC中T细胞增殖；
(3)减少膀胱癌肿瘤浸润髓源细胞中的CD33+HLA-DR-MDSC数量；
(4)减少肿瘤部位MDSC的数量。
本发明的第四方面，提供一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：给患者施用前述全反式维甲酸制剂。具体给药剂量在本领技术人员所熟知的范围内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明首次应用主动载药法装载全反式维甲酸，形成载药量高、体内稳定的全反式维甲酸脂质体制剂。根据本发明，其中所述全反式维甲酸药物被嵌入脂质体磷脂双层膜中或者结合在脂质体磷脂双层膜上或者包裹于脂质体内囊之中。所述全反式维甲酸药物被嵌入结合在脂质体磷脂双层膜上是指全反式维甲酸通过疏水作用部分或全部包裹在磷脂双层膜的疏水层中；所述全反式维甲酸结合在脂质体磷脂双层膜上是指全反式维甲酸通过电荷作用，疏水作用，物理或化学吸附作用与磷脂双分子层相互作用而结合在脂质体磷脂双层膜上；所述全反式维甲酸药物被包裹在脂质体内囊之中是指全反式维甲酸以溶解或全反式维甲酸单分子或全反式维甲酸盐沉淀形式被脂质体磷脂双分子层包裹在脂质体内囊之中。
(2)通过长期实验发现并证明本发明所制备的全反式维甲酸脂质相比与其他类型的全反式维甲酸脂质具有更加高的载药量及更好的体内稳定性。并且，本发明所制备的全反式维甲酸脂质将全反式维甲酸的溶解度由现有技术中的0.01mg/ml，提升至少0.1mg/ml以上，提高了至少100倍。
附图说明
图1：载药前后，脂质体的粒径。
图2：乙酸钙水相脂质体及非乙酸钙水相脂质体在去除游离药物后所达到的最终载药量。
图3：比较2种处方的累计释放率。
图4：全反式脂质体制剂对小鼠肿瘤部位细胞MDSC抑制实验。
图5A：全反式脂质体制剂促进小鼠肿瘤部位细胞MDSC分化为成熟DC。
图5B：全反式脂质体制剂促进小鼠肿瘤部位细胞MDSC分化为成熟DC。
图6：本发明的全反式维甲酸脂质体促进头颈部黏膜鳞状细胞癌病人血液中MDSC向DC系细胞分化。
图7：本发明全反式维甲酸脂质体作用于肿瘤病人体内的肿瘤组织，可以明显减少膀胱癌肿瘤浸润髓源细胞中的CD33+HLA-DR-MDSC数量。
图8：本发明全反式维甲酸脂质体作用于肿瘤病人体内的肿瘤组织，能够促进头颈部黏膜鳞状细胞癌PBMC中T细胞增殖。
图9：实施例6尾静脉注射给药时大鼠的pK曲线图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1全反式维甲酸脂质体的制备和鉴定
氢化豆磷脂(HSPC)购自日本油脂公司(NOF Corporation)，聚乙二醇化磷脂：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及胆固醇购自美国Avanti PolarLipids公司；全反式维甲酸购自美国西格玛公司。
一、全反式维甲酸脂质体的制备
(1)称取121.742克氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)、38.22克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及40.04克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解，并于70摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合，获得乙醇混合物；
(2)将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
(3)将步骤(2)所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为400nm，200nm，100nm，50nm聚碳酯膜各8次，最终得到平均粒径约为90nm左右的水相为乙酸钙的脂质体；
(4)将步骤(3)所制得的脂质体通过10000孔径透析膜置于10％质量分数且pH为6～7的蔗糖水溶液中透析，将脂质体的外水相置换为10％质量分数且pH为6～7的蔗糖水溶液，得到具有磷脂双层膜、且双侧膜内外水相具有一定pH梯度和离子梯度的乙酸钙脂质体。具体地，双层膜内水相为乙酸钙水溶液(pH9.0，浓度200mM)、双层膜外水相为蔗糖水溶液(pH为6～7，质量分数10％)。
(5)往步骤(4)中所得乙酸钙脂质体中添加4mg/ml的全反式维甲酸的混悬液，加入的全反式维甲酸的混悬液与乙酸钙脂质体的体积比为1:1，并于60摄氏度中孵育45分钟，孵育结束后再次用10000孔径透析膜将未载入脂质体的游离全反式维甲酸去除，最终得到全反式维甲酸脂质体，记为1号制剂。
二、全反式维甲酸脂质体的表征
1、全反式维甲酸脂质体包封率的检测
将纯化后的全反式维甲酸脂质体制剂用9倍体积甲醇破坏，用紫外检测器的高效液相色谱测定包封率。测定条件：ODS柱(Diamonsil，5μm，250*4.6mm)；检测温度为25摄氏度；检测波长为340nm；流速为1.0ml/min；流动相为pH＝4三乙胺盐酸缓冲液/乙腈/甲醇(体积比为17.5:57.5:25)。全反式维甲酸包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(Wi/Wtotal)*100％，其中，Wi是纯化后被甲醇破坏的脂质体制剂中全反是维甲酸的质量，Wtotal是透析分离游离药物前并与透析后全反式维甲酸相同体积的全反式维甲酸质量。结果显示全反式维甲酸脂质体的包封率约为80％。
2、全反式维甲酸脂质体的粒径
全反式维甲酸脂质体制剂的粒径实验重复三次取平均值±标准差。结果(如图1所示)显示全反式维甲酸脂质体制剂平均粒径为70nm左右，粒度分布(PDI)均<0.3。
此外，还分别以全反式维甲酸和脂质体载体之间的药脂摩尔比为1:5和1:20，参照上述方法制备全反式维甲酸脂质体，亦即：
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的药脂摩尔比为1:5时，步骤(1)为：
称取60.87092克氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)、19.1094克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及20.01967克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解，并于70摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合，获得乙醇混合物。
此条件制备的空白脂质体与20mg全反式维甲酸制备获得的全反式维甲酸脂质体，记为2号制剂，其包封率为86％。全反式维甲酸脂质体制剂平均粒径为75nm左右，粒度分布(PDI)均<0.3。
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的药脂摩尔比为1:20时，步骤(1)为：
称取243.48369克氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)、76.43760克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及80.07870克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解，并于70摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合，获得乙醇混合物。
此条件制备的空白脂质体与20mg全反式维甲酸制备获得的全反式维甲酸脂质体，记为3号制剂，其包封率为75％。全反式维甲酸脂质体制剂平均粒径为75nm左右，粒度分布(PDI)均<0.3。
实施例2、主动载药制备全反式维甲酸脂质体与被动载药制备全反式维甲酸脂质体比较
一、主动载药法及被动载药法制备全反式维甲酸脂质体
1.使用主动载药法制备全反式维甲酸脂质体
(1)称取121.742克氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)、38.22克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及40.04克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解，并于70摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合，获得乙醇混合物；
(2)将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
(3)将步骤(2)所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为400nm，200nm，100nm，50nm聚碳酯膜各8次，最终得到平均粒径约为90nm左右的水相为乙酸钙的脂质体；
(4)将步骤(3)所制得的脂质体通过10000孔径透析膜透析将水相置换为10％质量分数且pH为6～7的蔗糖溶液中，得到具有磷脂双层膜内外水相具有一定pH梯度和离子梯度的乙酸钙脂质体；
(5)往步骤(4)中所得乙酸钙脂质体中添加4mg/ml的全反式维甲酸的混悬液，加入的全反式维甲酸的混悬液与乙酸钙脂质体的体积比为1:1，并于60摄氏度中孵育45分钟，孵育结束后再次用10000孔径透析膜将未载入脂质体的游离全反式维甲酸去除，最终得到全反式维甲酸脂质体。
2.使用被动载药法制备维甲酸脂质体
(1)称取121.742克氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)、38.22克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及40.04克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解，并于70摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合，获得乙醇混合物；
(2)将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升纯水溶液，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
(3)将步骤(2)所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为400nm，200nm，100nm，50nm聚碳酯膜各8次，最终得到平均粒径约为90nm左右的水相为非乙酸钙的脂质体；
(4)往步骤(3)所得乙酸钙脂质体中添加4mg/ml的全反式维甲酸的混悬液，加入的全反式维甲酸的混悬液与乙酸钙脂质体的体积比为1:1，并于60摄氏度中孵育45分钟，孵育结束后再次用10000孔径透析膜将未载入脂质体的游离全反式维甲酸去除，最终得到全反式维甲酸脂质体。
3.主动载药法与被动载药法载药量对比
将纯化后的全反式维甲酸脂质体用9倍体积甲醇破坏，用紫外检测器的高效液相色谱测定包封率。测定条件：ODS柱(Diamonsil，5μm，250*4.6mm)；检测温度为25摄氏度；检测波长为340nm；流速为1.0ml/min；流动相为pH＝4三乙胺盐酸缓冲液/乙腈/甲醇(体积比为17.5:57.5:25)。全反式维甲酸包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(Wi/Wtotal)*100％，其中，Wi是纯化后被甲醇破坏的复合物中全反是维甲酸的质量，Wtotal是透析分离游离药物前并与透析后全反式维甲酸相同体积的全反式维甲酸质量。结果如图2所示，主动载药法制备的全反式维甲酸脂质体的载药量约为1.6mg/ml，被动载药法制备的全反式维甲酸脂质体的载药量约为0.7mg/ml。
由此可见，对比不同水相条件下制备获得的脂质体的载药效率，除去游离药物后，最终得到的全反式维甲酸脂质体在载药量上存在着显著的差别。结果说明乙酸钙水相脂质体在载药量上具有明显的优势。
4.主动载药法与被动载药法体外模拟累计释放对比
(1)配置含10％血清的PBS透析液；
(2)将上步提及的2种不同方法制备的全反式维甲酸脂质体各量取400μl装入透析管(选用10000透析袋)，并置于1000ml透析液内，在37℃、200rmp条件下放于溶出仪透析；
(3)分别在0.5h、2h、4h、8h、12h、24h、48h时间点取20μl透析管内脂质体溶液，加入180μl色谱纯甲醇，于votex上放置5min破膜萃取全反式维甲酸；
(4)将萃取过的甲醇溶液置于离心机中，10000rmp条件下离心30min以沉淀破乳后沉淀的脂质材料，取40μl上清进行按上步HPLC条件进行检测，比较2种处方的累计释放率。结果如图3所示，主动载药法制备获得的全反式维甲酸脂质体与被动载药法制备的全反式维甲酸脂质体在缓释上更有优势。具体地，非乙酸钙水相全反式维甲酸脂质体在体外模拟释放中在24h基本释放完毕，而乙酸钙水相的全反式维甲酸脂质体在48h时仍保持50％未释放。
此外，还分别以全反式维甲酸和脂质体载体之间的药脂摩尔比为1:5和1:20，参照上述方法分别采用主动载药法和被动载药法制备全反式维甲酸脂质体，进行比较。主动载药法制备获得的全反式维甲酸脂质体与被动载药法制备的全反式维甲酸脂质体在缓释上更有优势。具体地，非乙酸钙水相全反式维甲酸脂质体在体外模拟释放中在24h基本释放完毕，而乙酸钙水相的全反式维甲酸脂质体在48h时仍保持50％未释放。
实施例3、全反式维甲酸脂质体体外诱导肿瘤髓系抑制性细胞分化
1.Balb/c小鼠的肿瘤模型建立
(1)CT-26细胞培养至对数生长期时使用胰酶消化，将消化下的细胞收集并于离心机中以300g转速离心5min，倒去上清液，并用无菌PBS重悬细胞，细胞计数，并调整细胞浓度为1*107个细胞/毫升；
(2)购买6周大小的Balb/c白鼠，将皮下接种的一侧皮毛事先剃干净，用4％的水合氯醛200μl腹腔注射麻醉小鼠，麻醉后于右侧腋下部位皮下注射消化下来的CT-26悬液，细胞接种量为5*105-1*106/只，接种后继续饲养；
(3)大约饲养2-3周后，使用游标卡尺测量肿瘤长径及短径，通过肿瘤体积计算公式计算肿瘤大小：V＝1/2*长径*短径2，肿瘤体积约生长至100mm3时即可进行实验。
2.肿瘤相关淋巴细胞MDSC表征和分选
(1)断颈处死小鼠，使用镊子与剪刀从皮下去除肿瘤，并于40μm细胞滤网上剪碎，注意剪碎肿瘤组织时应小心避免剪切力对肿瘤细胞的损伤，同时在剪碎组织的过程中用含有5％的PBS不断冲洗组织；
(2)剪碎组织后将所有组织及冲洗PBS液一起离心，盗去上清后将所有组织一起转移至含1ml肿瘤组织消化液的15ml离心管中，于37℃、200rpm/min的摇床条件下消化1h；
(3)消化后的细胞再次通过40μm细胞滤网，使用PBS清洗细胞以去除残留的肿瘤组织消化液及细胞碎片与死细胞(清洗后离心时的条件为转速:1000rpm离心时间:5min)，清洗2-3遍。最终使用PBS重悬，此时得到肿瘤单细胞悬液。
(4)以每107个细胞/90μl体积的比例加入分选buffer并以每107个细胞/10μl体积的比例加入CD11b磁珠；
(5)将磁珠与细胞充分混匀，于4℃避光条件下孵育30min；孵育结束后按每107个细胞/1ml体积的比例加入90μl Buffer，1000rpm条件下离心5min，离心结束后使用Buffer继续清洗2遍；
(6)最终加入500μl Buffer重悬制得孵育磁珠的肿瘤单细胞悬液；
(7)将MS柱放入配套的磁铁中，预先使用Buffer进行润洗，使MS柱得到充分饱和；
(8)润洗结束后将孵育磁珠的肿瘤单细胞悬液从MS柱上方加入，并用1ml Buffer冲洗MS柱以将未结合磁珠的细胞冲洗下柱子；
(9)反复冲洗3-5遍后取下MS柱，放入15ml离心管中，加入1ml Buffer并用MS柱配套仪器将其快速推下，此时收集到的是停留在MS柱上的CD11b阳性细胞。
(10)将上一步得到的CD11b阳性细胞悬液进行细胞计数，将细胞浓度调整至107/ml，制备流式细胞术样品；
(11)流式细胞样品分为:阴性组、Gr-1单阳性组、CD11b单阳性组、待测样品组。每组设置2-3个平行管。其中阴性组不加任何荧光抗体以设置阴性条件，2个单阳性分别加入单一荧光抗体以便后续荧光补偿，待测样品组加入待测的荧光抗体；
(12)所有流式管中各加入100μl体积使用流式Staining Buffer重悬的细胞(约106个)，阴性对照组中不加入任何荧光抗体，Gr-1单阳性组加入Gr-1抗体，CD11b单阳性组加入CD11b抗体，待测样品组同时加入Gr-1与CD11b抗体；
(13)于4℃避光条件下孵育30min，孵育结束后加入1ml Staining Buffer离心以洗去未结合至细胞上的抗体，并接着使用Staining Buffer清洗细胞2次，最后用500μl体积Staining Buffer进行细胞重悬；流式细胞仪检测。
3.全反式维甲酸脂质体对外周血中淋巴细胞及肿瘤部位淋巴细胞的诱导分化作用
(1)按实施例1的方法，制备全反式维甲酸脂质体(包括：1号制剂、2号制剂和3号制剂)；
(2)分选肿瘤组织的中的MDSC细胞，细胞计数后将细胞浓度调整为调整107/ml，将分选后的收集到的细胞接种到24孔版中，使得每孔最终细胞浓度为106/孔；
(3)向铺好细胞的孔板中依次加入20μl PBS、20μl ATRA-Liposome、50μl ATRA-Liposome，37℃中孵育24h；
(4)孵育1天后使用Gr-1及CD11b、CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ抗体对细胞进行孵育，并通过流式细胞仪以观察细胞中MDSC及DC的变化，在流式样品处理过程中注意加入同型对照及做好荧光补偿。
1号制剂：如图4所示，通过给予不同剂量的药物我们可以观察到，Gr-1hi这一群细胞发生了显著的下降，在高剂量给药组(全反式维甲酸脂质体)中比例从对照组中17.5％下降至9.10％，而Gr-1int这一群细胞在比例上变化看起来并不明显，但可能是由于高表达的Gr-1在全反式维甲酸的诱导作用下转变为了中低表达。而Gr-1low这一群在的细胞比例随着给药剂量的增加而上升，进一步说明全反式维甲酸诱导MDSC发生分化，从而导致Gr-1表达量下降，所以Gr-1low在高剂量的给药下比例逐渐增高。由于肿瘤部位大部分浸润的MDSC具有Gr-1hi或Gr-1int的表征，因此我们可以推断全反式维甲酸脂质体能够诱导肿瘤部位MDSC发生分化从而导致MDSC数量的减少。
如图5A所示，进一步我们可以从成熟DC细胞的表面标记MHC-Ⅱ、CD11c、CD80、CD86中的表达情况看出，通过给药以后成熟DC的细胞比例发生显著上升，其中CD80、CD86双阳性细胞由对照组18.85％上升至39.39％。而如图5B所示，MHC-Ⅱ、CD11c双阳性细胞由21.34％上升至30.08％。
对于2号制剂和3号制剂，也分别获得了一致的实验效果。
实施例4、全反式维甲酸脂质体促进头颈部黏膜鳞状细胞癌PBMC中T细胞增殖
取2ml抗凝血加入2ml PBS稀释一倍，将4ml稀释血液沿试管内壁缓缓加入3ml人淋巴细胞分离液内，使稀释血液标本叠加在人淋巴细胞分离液上。室温每分钟300g离心力30min(加速2,减速1)，用吸管将单个核细胞层全部吸出，用PBS液稀释至10ml，300g离心洗涤2次。弃上清后加入少量PBS，得到大量PBMC，4℃备用。参照磁珠分离设备操作手册，用CD33抗体标记的磁珠分离获得PBMC细胞中的髓源性细胞。按照每孔5x105个细胞，用RPMI1640完全培养基(添加10％FBS)培养细胞至12孔细胞板，加入实施例1制备获得的制备好的全反式维甲酸脂质体药物培养24小时。然后运用流式细胞仪检测HLA-DR+CD11c+表型DC细胞群在髓源性细胞中所占百分比。
1号制剂，结果如图6所示，与头颈部黏膜鳞状细胞癌病人血液中的PBMC作用，本发明的全反式维甲酸脂质体促进其中MDSC向DC系细胞分化。
对于2号制剂和3号制剂，也分别获得了一致的实验效果。
实施例5、全反式维甲酸脂质体明显减少膀胱癌肿瘤浸润髓源细胞中的CD33+HLA-DR-MDSC数量
尽量剔除周围的坏死组织以减少实验影响，无菌盐水冲洗干净后放入4℃含10％胎牛血清的RPMI 1640(含青霉素100μg/ml,链霉素100μg/ml)细胞培养液中，送入实验室处理。将肿瘤置于2ml培养基中冰上切碎组织，转移至含2ml酶消化液(胶原蛋白酶I和IV消化液,0.6～1mg/ml)的15ml离心管中，轻轻的涡旋混匀。37℃恒温摇床，200rpm，2h。然后用无菌PBS缓慢冲洗，过40μm膜至50ml离心管。300g离心10min后用PBS重悬细胞并计数。参照磁珠分离设备操作手册，用CD33抗体标记的磁珠分离获得肿瘤组织浸润细胞中的髓源性细胞。按照每孔5x105个细胞，用RPMI1640完全培养基(添加10％FBS)培养细胞至12孔细胞板，加入实施例1制备好的全反式维甲酸脂质体药物培养24小时。然后运用流式细胞仪检测CD33+HLA-DR-MDSC细胞群在髓源性细胞中所占百分比。
1号制剂，结果，如图7所示，本发明全反式维甲酸脂质体作用于肿瘤病人体内的肿瘤组织，可以明显减少膀胱癌肿瘤浸润髓源细胞中的CD33+HLA-DR-MDSC数量。如图8所示，本发明全反式维甲酸脂质体作用于肿瘤病人体内的肿瘤组织，能够促进头颈部黏膜鳞状细胞癌PBMC中T细胞增殖。
对于2号制剂和3号制剂，也分别获得了一致的实验效果。
实施例6、通过静脉注射或静脉滴注给药时，该发明全反式维甲酸脂质体的血浆终末半衰期可达到8-12h
1.制备实施例1中制得的全反式维甲酸制剂，先取1号制剂，测定其药物浓度；
2.实验用SD大鼠购买自维通利华实验动物有限公司，共3只，分别编号为IV-1、IV-2、IV-3号。实验前一天，SD大鼠禁食过夜。实验当天，A组SD大鼠分别尾静脉注射10mg×kg-1全反式维甲酸脂质体制剂，于给药前及给药后5、15、30min、1、2、4、8、24和48h，由颈静脉采血0.20mL，置于烘干后的肝素化试管中。离心(5500转/分)10min后分离血浆，保存在低于-20℃冰箱。SD大鼠给药4h后可恢复进食，实验过程中可自由饮水。
3.血药浓度的生物分析根据苏州圣苏新药开发有限公司SOP-RS-04-001/01(Bioanalytical Method Validation for Quantification of Early Drug DiscoveryCompounds Using LC-MS/MS Methods)要求，建立测定SD大鼠血浆中全反式维甲酸的LC-MS/MS分析方法，用于本实验获得的生物样品的浓度测定。采用Pharsight Phoenix 6.3中的非房室模型计算药代动力学参数。
表1尾静脉注射给药时大鼠的pK数据
由表1和图9所示，1号制剂的血浆终末半衰期可达到8-12h。
参照上述方法，测得2号制剂的血浆半衰期可达8-12h。
参照上述方法，测得3号制剂的血浆半衰期可达8-12h。
实施例7含有助溶分子的全反式维甲酸制剂
一、内水相含有羟丙基-β-环糊精的全反式维甲酸脂质体
(1)称取121.742克氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)、38.22克二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及40.04克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解，并于70摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合，获得乙醇混合物；
(2)将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-β-环糊精(12％，w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-β-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
(3)将步骤(2)所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为400nm，200nm，100nm，50nm聚碳酯膜各8次，最终得到平均粒径约为90nm左右的水相为乙酸钙的脂质体；
(4)将步骤(3)所制得的脂质体通过10000孔径透析膜置于10％质量分数且pH为6～7的蔗糖水溶液中透析，将脂质体的外水相置换为含有10％质量分数且pH为6～7的蔗糖水溶液，得到具有磷脂双层膜、且双侧膜内外水相具有一定pH梯度和离子梯度的乙酸钙脂质体。具体地，双层膜内水相为乙酸钙水溶液(pH9.0，浓度200mM)、双层膜外水相为蔗糖水溶液(pH为6～7，质量分数10％)。
(5)往步骤(4)中所得乙酸钙脂质体中添加5mg/ml的全反式维甲酸的混悬液，加入的全反式维甲酸的混悬液与乙酸钙脂质体的体积比为1:1，并于60摄氏度中孵育45分钟，孵育结束后再次用10000孔径透析膜将未载入脂质体的游离全反式维甲酸去除，最终得到全反式维甲酸脂质体。
(6)通过紫外检测器的高效液相色谱测定全反式维甲酸的浓度。
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的羟丙基-β-环糊精与药物摩尔比为2:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-β-环糊精(4％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-β-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的羟丙基-β-环糊精与药物摩尔比为20:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-β-环糊精(40％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-β-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
此外，当脂质体载体内水相之间含有其他不同种类的增溶剂中的一种或多种时，参照上述方法制备全反式维甲酸脂质体，亦即
二、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有HPMC时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有HPMC(1％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、HPMC和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
三、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有PVP时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有PVP(2％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、PVP和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的PVP与药物摩尔比为0.075:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有PVP(1％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、PVP和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的PVP与药物摩尔比为1.5:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有PVP(20％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、PVP和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
四、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有PEG-400时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有PEG-400(17％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、PEG-400和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的PEG-400与药物摩尔比为9.5:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有PEG-400(5％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、PEG-400和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的PEG-400与药物摩尔比为37.5:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有PEG-400(20％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、PEG-400和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
五、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有羟丙基-β-环糊精与PEG-400时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-β-环糊精(12％，w/v)+PEG-400(5％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-β-环糊精、PEG-400与水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
六、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有羟丙基-β-环糊精与HPMC时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-β-环糊精(12％，w/v)+HPMC(0.5％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-β-环糊精、HPMC与水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
七、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有羟丙基-β-环糊精与PVP时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-β-环糊精(12％，w/v)+PVP(0.5％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-β-环糊精、PVP与水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡。
八、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有磺丁基-β-环糊精时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有磺丁基-β-环糊精(10％，w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、磺丁基-β-环糊精与水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡。
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的磺丁基-β-环糊精与药物摩尔比为2:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有磺丁基-β-环糊精(4％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、磺丁基-β-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的磺丁基-β-环糊精与药物摩尔比为20:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有磺丁基-β-环糊精(40％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、磺丁基-β-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
九、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有甲基-β-环糊精时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有甲基-β-环糊精(20％，w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、甲基-β-环糊精与水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡。
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的甲基-β-环糊精与药物摩尔比为2:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有甲基-β-环糊精(4％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、甲基-β-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的甲基-β-环糊精与药物摩尔比为20:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有甲基-β-环糊精(40％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、甲基-β-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
十、当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有羟丙基-γ-环糊精时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-γ-环糊精(12％，w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-γ-环糊精与水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡。
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的羟丙基-γ-环糊精与药物摩尔比为2:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-γ-环糊精(4％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-γ-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
当全反式维甲酸和脂质体载体之间的含有的羟丙基-γ-环糊精与药物摩尔比为20:1时，步骤(2)为：将步骤(1)所得乙醇混合物加入6.4毫升的含有羟丙基-γ-环糊精(40％,w/v)的乙酸钙缓冲液(pH为9.0，其由200mM乙酸钙、羟丙基-γ-环糊精和水组成)，并置于70摄氏度中水浴30分钟，得脂质体囊泡；
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (16)

1.一种全反式维甲酸脂质体制剂，所述全反式维甲酸脂质体制剂包括全反式维甲酸和脂质体载体。
2.根据权利要求1所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述全反式维甲酸脂质体制剂还含有用于增加全反式维甲酸溶解度的助溶分子。
3.根据权利要求2所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述助溶分子选自PVP、HPMC、环糊精或PEG中的任一种或多种的组合。
4.根据权利要求2所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述助溶分子与全反式维甲酸之间的摩尔比例范围是：(38～0.075)：1。
5.根据权利要求1所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述全反式维甲酸和脂质体载体之间的药脂摩尔比范围是1：(5～20)。
6.根据权利要求1所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体的原料含有磷脂、胆固醇和聚乙二醇化的磷脂。
7.根据权利要求6所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体的原料中含有磷脂、胆固醇和聚乙二醇化的磷脂之间的摩尔比例范围是：(30～80)：(0.1～40)：(0.1～30)。
8.根据权利要求6所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体的原料中含有HSPC、CHOL和DSPE-PEG。
9.根据权利要求1～9任一权利要求所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体的粒径范围是30nm～200nm。
10.根据权利要求1～9任一权利要求所述的全反式维甲酸脂质体制剂，其特征在于，所述全反式维甲酸的浓度大于等于0.1mg/ml。
11.如权利要求1～10任一权利要求所述全反式维甲酸脂质体制剂的制备方法，为主动载药法。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)按配比取用于制备脂质体的各原材料，用乙醇溶解，获得乙醇混合物；
(2)将步骤(1)中的乙醇混合物中加入pH为7.0～11.0的醋酸钙水溶液，获得脂质体囊泡；
(3)将步骤(2)中所得脂质体囊泡依次挤压通过不同孔径的聚碳酯膜，获得内外水相均为醋酸钙水溶液的空白脂质体；
(4)将步骤(3)所制得的内外水相均为醋酸钙水溶液空白脂质体置于pH为6.0～7.0的等渗溶液中透析，得到内外水相之前存在醋酸钙梯度的空白脂质体；
(5)在步骤(4)所得内外水相之前存在醋酸钙梯度的空白脂质体中添加全反式维甲酸混悬液，孵育，去除游离全反式维甲酸，即得全反式维甲酸脂质体制剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，醋酸钙水溶液中醋酸钙的浓度是120mM～360mM。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(4)所得脂质体的内水相为pH为7.0～11.0的醋酸钙水溶液，外水相为pH为6.0～7.0的等渗溶液。
15.如权利要求1～14任一权利要求所述全反式维甲酸脂质体制剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。
16.全反式维甲酸或如权利要求1～14任一权利要求所述全反式维甲酸脂质体制剂在制备药物中的用途，所述用途选自以下任一种或多种：
(1)促进肿瘤部位细胞MDSC分化为成熟DC；
(2)促进肿瘤部位T细胞增殖；
(3)减少肿瘤浸润髓源细胞中的CD33+HLA-DR-MDSC数量；
(4)减少肿瘤部位MDSC的数量。
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