CN110575437B - 替加环素脂质体制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种替加环素脂质体制剂。所述制剂中含有替加环素脂质体颗粒，所述脂质体颗粒包括载体，所述载体为具有双分子结构的脂质体膜，所述替加环素位于脂质体膜内或者脂质体膜中。本申请中的制剂在保证替加环素稳定性和缓释的前提下，改善替加环素的体内分布，提高炎症部位的局部浓度，降低毒副作用，具有较好的临床应用前景。

Description

替加环素脂质体制剂

技术领域

本发明属于纳米药物输送技术领域，具体涉及一种替加环素脂质体制剂及其制备方法。

背景技术

替加环素(Tigecycline)是一种新型甘氨酰环素类抗生素，也是第三代四环素结构类似物，具有超广谱抗菌活性。其作用机制是通过与细菌的30S核糖体亚基发生较强结合，抑制肽链延长从而阻断细菌蛋白质合成。相比于其他四环素类药物，替加环素独特的9-叔丁基甘氨酰胺基团所产生的空间位阻，使其能够逃避细菌对四环素类药物的耐药机制，包括核糖体保护及主动外排系统等。除此之外，替加环素不受β-内酰胺酶、靶位修饰、酶靶位改变等耐药机制的影响。因此替加环素能够对抗多重耐药细菌，例如，耐甲氧西林金黄葡萄球菌、肺炎链球菌、耐万古霉素肠球菌等。

替加环素具有抗菌谱广、可对抗多重耐药菌、无交叉耐药性、半衰期较长等优点，临床上将替加环素作为抗感染领域的最后一道防线。目前用于治疗复杂性腹腔内感染、社区获得性肺炎、复杂皮肤及软组织感染，不良反应常见为恶心、呕吐、头痛等。

替加环素由惠氏(Wyeth)公司研发，商品名为Tygacil，为冻干粉针剂型，于2005年获得FDA批准上市。目前Tygacil制剂存在以下两点问题：一是替加环素冻干粉在溶解后稳定性较差，易发生氧化降解及差向异构化；二是替加环素在体内具有较为广泛的组织分布，静脉注射后能分布于骨、脾、肝、肾等器官中，导致局部浓度较低，易引发除患处外的不良反应及耐药性。

采用脂质体作为替加环素载体具有以下突出优点：

(1)可通过改变脂质体的脂质组成、配比以及脂质体的粒径和表面电荷等性质，改善脂质体及其所携带的替加环素的药代动力学和体内分布行为，从而减小给药剂量，降低全身分布所产生的毒副作用。同时，还可以根据炎症部位靶点的特征，对脂质体进行修饰，制备为具有主动靶向性的替加环素脂质体。

(2)炎症部位具有类似于肿瘤组织的EPR效应。抗生素脂质体可以通过被动靶向方式，将较高浓度的替加环素稳定、有效地输送到炎症组织。进而在细菌生物膜微环境(如表面活性剂脂质和低pH值)的刺激下释放药物，提高替加环素在炎症组织中的局部浓度，并延长替加环素与致病菌的作用时间，从而提高对细菌的杀伤效果，并避免诱导耐药菌的产生。

(3)可以利用脂质体与细菌生物膜的亲和性，将替加环素靶向至生物膜，并增加对生物膜的穿透性，进而破坏细菌生物膜的耐药机制。

(4)将替加环素装载于脂质体中可以减少替加环素的氧化降解，同时通过调整内水相物质及pH抑制替加环素发生差向异构化，进而提高稳定性。

基于上述原因，我们提出了一种以钙离子水溶液作为内水相的替加环素脂质体，通过钙离子与替加环素的螯合作用，使替加环素包封于脂质体内水相中，达到缓释和炎症组织被动靶向的效果，并有利于降低用药剂量及全身毒副作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的替加环素制剂，在保证替加环素稳定性和缓释的前提下，改善替加环素的体内分布，提高炎症部位的局部浓度，降低毒副作用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种替加环素脂质体制剂，所述制剂中含有替加环素脂质体颗粒，所述脂质体颗粒包括载体，所述载体为具有双分子结构的脂质体膜，所述替加环素位于脂质体膜内或者脂质体膜中。

所述替加环素脂质体制剂包括：替加环素、载体、位于脂质体膜内的内水相和位于脂质体膜外的外水相，所述替加环素被包封于所述内水相中。

进一步地，所述脂质体膜内的内水相和膜外的外水相之间存在钙离子梯度。

进一步地，所述脂质体制剂中含有醋酸钙、氯化钙、乳酸钙、碳酸氢钙、磷酸氢钙、硝酸钙等。优选为醋酸钙。上述钙离子即来自于此。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体为单室脂质体。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体颗粒的粒径范围是30nm～200nm、50～120、70nm～90nm、79-84nm。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体颗粒的粒度分布指数PDI小于等于0.1。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体的平均粒径小于等于200nm，脂质体的粒度分布指数PDI小于等于0.1。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体的平均粒径小于等于120nm，脂质体的粒度分布指数PDI小于等于0.1。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体的平均粒径小于等于90nm，脂质体的粒度分布指数PDI小于等于0.1。

于本发明的一个实施例中，所述内水相包括醋酸钙水溶液；所述外水相为生理等渗溶液。

于本发明的一个实施例中，所述内水相包括氯化钙水溶液；所述外水相为生理等渗溶液。

于本发明的一个实施例中，所述内水相包括乳酸钙水溶液；所述外水相为生理等渗溶液。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体内水相中钙离子浓度可为100mM～300mM、300mM～700mM、或700mM～800mM。

于本发明的一个实施例中，所述生理等渗溶液选自10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体内水相的pH值为4.0～5.5、5.5～7.0、7.0～7.5、或7.5～8.0。

于本发明的一个实施例中，在所述替加环素脂质体制剂中，所含替加环素的浓度为1.8-3.56mg/mL或3.56-5.11mg/mL。

于本发明的一个实施例中，所述替加环素制剂的药脂摩尔比为0.1-0.2或0.2-0.3。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体膜的组分包括磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂。

于本发明的一个实施例中，所述聚乙二醇化磷脂中的聚乙二醇的分子量为50～10000。

于本发明的一个实施例中，所述聚乙二醇化磷脂中的聚乙二醇的分子量为2000。

于本发明的一个实施例中，所述磷脂、所述胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂之间的摩尔比为(30～80)：(0.1～40)：(0.1～30)。

于本发明的一个实施例中，所述磷脂、所述胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂之间的摩尔比为65:40:5。

本发明的另一方面提供了上述替加环素脂质体制剂的制备方法，所述方法为主动载药的方法，包括以下步骤：

(3)提供内水相含有钙离子的空白脂质体；

(4)将替加环素水溶液与空白脂质体混合，搅拌，除去游离药物，加入含有外水相溶剂稀释。

于本发明的一个实施例中，所述替加环素与空白脂质体的摩尔比大于等于0.3。

于本发明的一个实施例中，所述步骤(2)中的空白脂质体经过外水相透析处理过。

于本发明的一个实施例中，所述外水相为生理等渗溶液，如蔗糖溶液。更进一步地，其质量浓度10％。

于本发明的一个实施例中，所述脂质体内水相的pH值为4.0～5.5、5.5～7.5或7.5～8.0。

本发明的另一方面提供了上述替加环素脂质体制剂用于制备抗菌药物的用途。

进一步地，所述抗菌药物是指具有光谱抗菌作用的药物。

本发明的有益技术效果：

替加环素分子中的“酚羟基-酮基-烯醇基”结构(图1)可以与金属离子发生螯合，以此为参考，本申请提出以不同pH的钙离子水溶液作为主动载药梯度，制备替加环素脂质体。其基本原理为：钙离子可以与穿透脂质体膜进入内水相的替加环素发生螯合，形成较为稳定的金属螯合物，由于金属螯合物不易穿透脂质体膜，从而实现对药物的稳定包封。同时，钙离子与替加环素稳定的螯合作用，使得替加环素脂质体在生理盐水和模拟血浆的释放实验中，均表现出了良好的缓释作用(图5，图6)。

我们通过高灵敏度DSC检测了不同药脂比及不同内水相pH替加环素脂质体的热力学行为(图7)，发现随着药脂比的提高，不同内水相pH的替加环素脂质体的脂质峰均出现了较为明显的裂分，并在较高温度出现了熔融峰，提示替加环素钙离子螯合物在脂质体内水相中形成了规整结构，使替加环素缓慢释放；并可能有部分替加环素影响了脂质膜的结构。

附图说明

图1替加环素的化学结构

图2替加环素水溶液UV标准曲线图；

图3以三组不同投药药脂比，采用不同内水相pH的醋酸钙脂质体制备替加环素脂质体，其投药药脂比与载药药脂比的关系曲线图；

图4验证替加环素与钙离子在水溶液及脂质体内水相中发生螯合作用的UV谱图；

图5不同内水相pH的替加环素脂质体在不同pH生理盐水中的累积释放速率图；

图6不同内水相pH的替加环素脂质体在白蛋白生理盐水中的累积释放速率图；

图7不同投药药脂比及不同内水相pH的替加环素脂质体的差示扫描量热图；

图8游离替加环素与替加环素脂质体对MRSA生物膜的分散作用；

图9游离替加环素与替加环素脂质体对MRSA生物膜内细菌的消除作用。

具体实施方式

替加环素是一种新型甘氨酰环素类的超广谱抗生素，临床上将替加环素作为抗感染领域的最后一道防线，目前用于治疗复杂性腹腔内感染、社区获得性肺炎、复杂皮肤及软组织感染。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的药剂学，药物分析学，药物化学，分析化学，分子生物学、生物化学及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。

实施例1替加环素的检测方法

本实施例中建立替加环素标准曲线，具体过程如下：

采用紫外(ultraviolet，UV)检测分析方法：检测仪器为TECAN

200 PRO；检测波长为350nm；检测温度为23℃；检测孔板为

96 well plates,UV-transparent；检测体积为200μL。

1.1替加环素在生理盐水中的UV标准曲线

精密称量2.51mg替加环素，用生理盐水将其溶解于25mL容量瓶中，得到浓度为0.10mg/mL的替加环素水溶液；用生理盐水将替加环素溶液进行梯度稀释，得到浓度为15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL和50μg/mL的替加环素标准溶液。采用UV法检测上述浓度的替加环素标准溶液，检测结果如表1所示。

表1不同浓度的替加环素水溶液UV检测值

根据表1所示的结果建立标准曲线并考察回收率。工作曲线如图2中(a)所示。替加环素水溶液的UV标准曲线为Y₁＝0.0122X+0.0233(n＝7)，R²＝0.9999，回收率均在95％～105％，标曲线拟合良好。

1.2替加环素在甲醇中的UV标准曲线

精密称量2.50mg替加环素，用甲醇将其溶解于25mL容量瓶中，得到浓度为0.10mg/mL的替加环素甲醇溶液；用甲醇将替加环素溶液进行梯度稀释，得到浓度为20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、40μg/mL和50μg/mL的替加环素标准溶液。采用UV法检测上述浓度的替加环素标准溶液，检测结果如表2所示。

表2不同浓度的替加环素水溶液UV检测值

根据表2所示的结果建立标准曲线并考察回收率。工作曲线如图2中(b)所示。替加环素水溶液的UV标准曲线为Y₂＝0.0134X+0.0094(n＝5)，R²＝0.9997，回收率均在95％～105％，标准曲线拟合良好。

实施例2以pH为4.0～7.0的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体的制备和表征

本实施例中使用的磷脂均购自德国Lipoid公司。具体为氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)；聚乙二醇化磷脂具体为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)；胆固醇(CHOL，分子量386.7)；使用的替加环素购自TCI公司；使用的醋酸钙购自上海百灵威化学技术(J&K SCIENTIFIC)有限公司；使用的醋酸购自国药集团化学试剂有限公司。

需要说明的是，在后续的实施例中所使用的磷脂均为Lipoid公司的氢化豆磷脂；所使用的聚乙二醇化磷脂均为Lipoid公司的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；所使用的胆固醇均为Lipoid的胆固醇；所使用的替加环素均购自TCI公司；使用的醋酸钙均购自上海百灵威化学技术(J&K SCIENTIFIC)有限公司。

2.1替加环素脂质体的制备

具体制备过程如下：

步骤(1)：精密称量160.1mg胆固醇，480.2mg氢化豆磷脂和160.1mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，加入适量无水乙醇充分溶解混合，得到脂质的乙醇混合溶液；

步骤(2)：精密称取1.5855g CaAc₂·H₂O，加入适量去离子水，用1M醋酸溶液调pH至4.0/5.5/7.0，加去离子水定容至30mL，得到pH为4.0/5.5/7.0的300mM醋酸钙缓冲液；

步骤(3)：将步骤(1)所得乙醇混合溶液加入10mL pH为4.0/5.5/7.0的300mM醋酸钙缓冲液，并置于70摄氏度水浴中搅拌30分钟，充分水合脂质，得到较均匀的脂质体混悬液；

步骤(4)：利用脂质体挤出仪，将步骤(3)所得脂质体混悬液依次挤压通过孔径为200nm，100nm，50nm聚碳酯膜，分别5次、10次、15次，最终得到粒径大小约为75nm左右，粒径分布均匀的空白脂质体；

步骤(5)：将步骤(4)所制得的脂质体置于截留分子量为10000的透析袋中，以10％蔗糖水溶液作为透析介质，4℃透析过夜。样品与透析介质体积比为1:1000，透析期间换三次透析液，完全除去脂质体外水相中的醋酸钙，得到由10％的蔗糖构成的外水相、醋酸钙溶液构成的内水相，以及磷脂双分子层构成的空白脂质体，脂质体内外水相具有一定的醋酸钙浓度梯度。具体地，空白脂质体内水相为300mM醋酸钙水溶液(pH＝4.0/5.5/7.0)、空白脂质体外水相为质量分数为10％的蔗糖水溶液；

步骤(6)：将步骤(5)中所得的内水相为醋酸钙溶液的空白脂质体混悬液，与浓度为10mg/mL的替加环素水溶液，按照0.1/0.2/0.3的投药药脂比(摩尔比)混合，并于60℃中搅拌10～30分钟，得到内水相含替加环素的脂质体。

2.2替加环素脂质体的表征

2.2.1替加环素脂质体的粒径测定

将本实施例制备的替加环素脂质体，用去离子水稀释200倍，利用Zetasizer ZS90(马尔文公司)对粒径进行分析，具体结果如表3所示。表3表明，载药后的脂质体粒径均在80nm左右，粒度分布(PDI)均小于0.1。此外，载药前空白脂质体的粒径在80nm左右，粒度分布(PDI)均小于0.1。

2.2.2替加环素脂质体包封率的测定

在制备得到的替加环素脂质体中加入适量纳米羟基磷灰石(HAP，上海麦克林生化科技有限公司)，充分振摇，吸附未包裹的替加环素。离心后取上清200μL，采用UV检测分析方法(实施例1)，测定加入HAP前后脂质体制剂中的替加环素的含量。

替加环素脂质体的包封率(EE％)按以下公式计算：

其中，M_inter是HAP吸附游离药物后的脂质体制剂中替加环素的含量，即被脂质体包封的替加环素的含量；M_total是HAP吸附前的替加环素脂质体制剂中替加环素的含量，即替加环素的投药量。以pH5.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体粒径和包封率的表征结果如表3所示，以pH为4.0和7.0的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体与以pH5.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体性质相似。表3表明，按照本方法制备的替加环素脂质体的包封率良好，可实现较高药脂比载药。

表3以pH5.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体粒径和包封率

另外，调整空白脂质体内水相醋酸钙水溶液为700mM、800mM，pH值为4.0、5.5、7.0，在上述相同条件下按照0.1/0.2/0.3的投药药脂比(摩尔比)混合,制备的脂质体经检测，粒径和包封率均相似。

实施例3以pH为7.0～8.0的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体的制备和表征

本实施例中使用的氢氧化钠购自上海凌峰化学试剂有限公司。

精密称取1.5860g CaAc₂·H₂O，加入适量去离子水，用1M醋酸溶液或1M氢氧化钠溶液调pH至7.5/8.0，加去离子水定容至30mL，得到pH为7.5/8.0的300mM醋酸钙缓冲液。

制备替加环素脂质体，具体制备过程参照实施例2。不同之处在于，在步骤(3)中，往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液应加入10ml、pH为7.5/8.0的300mM醋酸钙缓冲液，而不是pH为4.0/5.5/7.0的醋酸钙缓冲液。

替加环素脂质体的表征方法参照实施例2，以pH7.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体粒径和包封率的表征结果如表4所示，以pH为8.0的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体与以pH7.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体性质相似。表4表明，实施例3制备的替加环素脂质体的包封率约在90％左右。与实施例2结果相比，以pH为4.0～7.0或7.0～8.0的醋酸钙作为内水相的替加环素脂质体包封率相近。根据表3和表4结果，计算实施例2和实施例3中脂质体的载药药脂比，并分别以投药药脂比和载药药脂比为横、纵坐标，绘制载药药脂比与投药药脂比的关系折线图，结果如图3所示。图3表明，以pH为7.5的醋酸钙作为内水相的脂质体与以pH为5.5的醋酸钙作为内水相的脂质体对替加环素的载药能力相近。

表4以pH7.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体粒径和包封率

另外，调整空白脂质体内水相醋酸钙水溶液为700mM、800mM，pH值为7.0、7.5、8.0，在上述相同条件下按照0.1/0.2/0.3的投药药脂比(摩尔比)混合,制备的脂质体经检测，粒径和包封率均相似。

实施例4以氯化钙溶液为内水相的替加环素脂质体的制备和表征

本实施例中使用的氯化钙购自上海麦克林生化科技有限公司，使用的盐酸购自上海凌峰化学试剂有限公司。

精密称取1.3231g CaCl₂·2H₂O，加入适量去离子水，用1M盐酸溶液或1M氢氧化钠溶液调pH至7.5，加去离子水定容至30mL，得到pH为7.5的300mM氯化钙缓冲液。

制备替加环素脂质体，具体制备过程参照实施例2。不同之处在于，在步骤(3)中，往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液应加入10ml、pH为7.5的300mM氯化钙缓冲液，而不是pH为4.0/5.5/7.0的300mM醋酸钙缓冲液。

替加环素脂质体的表征方法参照实施例2，结果如表5所示。表5表明，实施例4制备的替加环素脂质体的包封率约在85％左右。与实施例3的结果相比，以氯化钙缓冲液作为内水相和以醋酸钙缓冲液作为内水相的替加环素脂质体包封率相近。

表5以pH为7.5的氯化钙溶液作为内水相的替加环素脂质体粒径和包封率

另外，调整空白脂质体内水相氯化钙水溶液为700mM、800mM，pH值为4.0、4.5、7.0、8.0，在上述相同条件下按照0.1/0.2/0.3的投药药脂比(摩尔比)混合,制备的脂质体经检测，粒径和包封率均相似。

实施例5以乳酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体的制备和表征

本实施例中使用的乳酸钙购自上海麦克林生化科技有限公司

精密称取1.9641g乳酸钙，加入适量去离子水，用1M盐酸溶液或1M氢氧化钠溶液调pH至7.5，加去离子水定容至30mL，得到pH为7.5的300mM乳酸钙缓冲液。

制备替加环素脂质体，具体制备过程参照实施例2。不同之处在于，在步骤(3)中，往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液应加入10ml、pH为7.5的300mM乳酸钙缓冲液，而不是pH为4.0/5.5/7.0的300mM醋酸钙缓冲液。

替加环素脂质体的表征方法参照实施例2，结果如表6所示。表6表明，实施例5制备的替加环素脂质体的包封率约在85％左右。与实施例3结果相比，以乳酸钙缓冲液作为内水相和以醋酸钙作为内水相的替加环素脂质体的包封率相近。

表6以pH为7.5的乳酸钙溶液作为内水相的替加环素脂质体粒径和包封率

另外，调整空白脂质体内水相乳酸钙水溶液为700mM、800mM，pH值为4.0、4.5、7.0、8.0，在上述相同条件下按照0.1/0.2/0.3的投药药脂比(摩尔比)混合,制备的脂质体经检测，粒径和包封率均相似。

实施例6替加环素与钙离子螯合的UV验证

本实施例使用的乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)购自国药集团化学试剂有限公司。

6.1替加环素与钙离子在水溶液中的螯合及其可逆性研究

步骤(1)：精密称取1.6758g EDTA·2Na，加去离子水定容至30mL，超声30min使其完全溶解，配制成150mM的EDTA溶液。

步骤(2)：精密称取20.04mg替加环素，加生理盐水定容至5mL，并使其溶解，配制成4mg/mL的替加环素水溶液。

步骤(3)：取10μL替加环素溶液(4mg/mL)，加入990μL生理盐水，混合均匀，得到40μg/mL的替加环素溶液，采用紫外(μLtraviolet，UV)检测分析方法：检测仪器为TECAN

200 PRO；扫描波长范围为230nm～500nm；检测温度为23℃；检测孔板为

96 well plates,UV-transparent；检测体积为200μL，得到替加环素溶液在230nm～500nm范围内的紫外-可见光吸收光谱。

步骤(4)：取10μL替加环素溶液(4mg/mL)，加入290μL醋酸钙溶液(300mM)，涡旋30s使二者混合均匀，再向其中加入700μL去离子水，混合均匀，得到溶液A。取溶液A，按照步骤(3)的UV检测分析方法，得到溶液A在230nm～500nm范围内的紫外-可见光吸收光谱。

步骤(5)：取10μL替加环素溶液(4mg/mL)，加入290μL醋酸钙溶液(300mM)，涡旋30s使二者混合均匀，再向其中加入700μL EDTA溶液，涡旋30s使溶液混合均匀，得到溶液B。取溶液B，按照步骤(3)的UV检测分析方法，得到溶液B在230nm～500nm范围内的紫外-可见光吸收光谱。

6.2替加环素与钙离子在脂质体内水相中的螯合及其可逆性研究

步骤(1)：取实施例2～3中所制备的替加环素脂质体(药脂比为0.1)20μL，加生理盐水稀释至1mL，采用紫外(ultraviolet，UV)检测分析方法：检测仪器为TECAN

200 PRO；扫描波长范围为230nm～500nm；检测温度为23℃；检测孔板为

96 wellplates,UV-transparent；检测体积为200μL，得到替加环素脂质体混悬液在230nm～500nm范围内的紫外-可见光吸收光谱。

步骤(2)：取实施例2～3中所制备的替加环素脂质体(药脂比为0.1)20μL，加200μL甲醇，涡旋30s使脂质体破乳，再向其中加入去离子水稀释至1mL，按照步骤(1)的UV检测分析方法，得到替加环素脂质体破乳后在230nm～500nm范围内的紫外-可见光吸收光谱。

步骤(3)：取实施例2～3中所制备的替加环素脂质体(药脂比为0.1)20μL，加200μL甲醇，涡旋30s使脂质体破乳，再向其中加入去离子水稀释至1mL，得到溶液C，按照步骤(1)的UV检测分析方法，得到替加环素脂质体破乳后在230nm～500nm范围内的紫外-可见光吸收光谱。

步骤(4)：取实施例2～3中所制备的替加环素脂质体(药脂比为0.1)20μL，加200μL甲醇，涡旋30s使脂质体破乳，向其中加入适量EDTA溶液，涡旋30s，再用去离子水稀释至1mL，得到溶液D，按照步骤(1)的UV检测分析方法，得到替加环素脂质体破乳并用EDTA置换后，在230nm～500nm范围内的紫外-可见光吸收光谱。

不同替加环素溶液或脂质体的紫外吸收波长结果如表7所示。将实例6中得到的紫外-可见光吸收光谱进行重叠，所得图谱如图4所示。

表7不同替加环素溶液或脂质体的第二吸收波长测定结果

表7及图4表明，在水溶液中和脂质体内水相中，替加环素和钙离子结合会使替加环素第二吸收波长变大，而不影响第一吸收波长，同时，替加环素在脂质体内水相中的第二吸收波长大于其在醋酸钙混合溶液中的第二吸收波长。在替加环素与醋酸钙的混合溶液中，或者替加环素脂质体的甲醇溶液中，加入EDTA将钙离子置换后，可使替加环素第二吸收波长还原。结果表明，替加环素在水溶液或脂质体内水相中均可与钙离子发生可逆螯合，并且二者在脂质体内水相中的螯合强于在水溶液中的螯合。这有利于实现替加环素的稳定包封和稳定储存。

实施例7替加环素脂质体在pH＝7.4的生理盐水中的释放速度

由于不同药脂比时，脂质体内水相中药物的浓度不同，因此药物与钙离子所形成的螯合物可能具有不同的结构，对脂质膜的影响也可能有所不同，因而可能具有不同的药物释放速率。为了比较不同内水相pH及不同药脂比的替加环素脂质体的体外释放速率，本实施例中进行体外释放研究的替加环素脂质体采用0.2和0.3作为投药药脂比，分别进行两次载药，药物浓度及脂质浓度如表3和表4所示。

体外释放研究中所用到的纳米羟基磷灰石(HAP)购自上海麦克林生化科技有限公司；L-组氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司。

体外释放实验具体过程如下：

步骤(1)：精密称量620.6mg L-组氨酸，溶解于适量生理盐水中，用1M NaOH调pH至7.4，加生理盐水定容至80mL；

步骤(2)：取实施例2-3中以不同pH的醋酸钙水溶液(pH为5.5或pH为7.5)为内水相制备的替加环素脂质体；其中，脂质浓度均为24.8mg/mL、药脂比(药物和脂质的摩尔比)为0.2或0.3。

步骤(3)：用pH为7.4的生理盐水溶液将脂质体稀释50倍，加入足量的HAP吸附游离药物，形成漏槽条件，于37℃100rpm摇床(THZ-C恒温振荡器)中震荡。在不同的时间点(0小时、3小时、6小时、9小时、24小时、48小时)，用UV法测定包封在脂质体中的替加环素的含量，计算不同时间点替加环素脂质体的累积释放度。

各组替加环素脂质体的体外累积释放曲线如图5中(a)所示，结果表明，在模拟血浆pH的生理盐水中，以pH5.5或pH7.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体均具备较好的体外缓释效果，且呈现二级释放行为。从24小时累积释放度来看，四组脂质体的释放速率无明显差异，均释放了15％左右。而从48小时累积释放百分率来看，药脂比为0.2的替加环素脂质体的释放速率略小于药脂比为0.3的替加环素脂质体，其中，药脂比为0.2、内水相pH为5.5或7.5的替加环素脂质体的累积释放度分别为15.37％和16.01％；药脂比为0.3、内水相pH为5.5或7.5的替加环素脂质体的累积释放度分别为19.63％和24.97％。内水相pH对替加环素脂质体在模拟血浆pH的生理盐水中的释放无明显影响。

另外，调整空白脂质体内水相乳酸钙水溶液为700mM、800mM，pH值为4.0、4.5、7.0、8.0，在上述相同条件下按照0.2/0.3的投药药脂比(摩尔比)混合,制备的脂质体在模拟血浆pH的生理盐水中进行释放实验，经检测，均具备较好的体外缓释效果，且呈现二级释放行为。

实施例8替加环素脂质体在pH＝6.8的生理盐水中的释放速率

本实施例中使用的盐酸购自上海凌峰化学试剂有限公司。

精密称量620.6mg L-组氨酸，溶解于适量生理盐水中，用1M HCl调pH至6.8，加生理盐水定容至80mL。

用配置好的pH＝6.8的生理盐水溶液将药脂比为0.2和0.3的不同内水相pH(pH为5.5或7.5)的替加环素脂质体稀释50倍，进行体外释放实验，具体过程参照实施例7。

各组替加环素脂质体的体外累积释放曲线如图5中(b)所示，结果表明，在模拟炎症部位pH的生理盐水中，以pH5.5或pH7.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体均具备较好的体外缓释效果，且呈现二级释放行为。从24小时累积释放度来看，四组脂质体的释放速率无明显差异，均释放了15％左右。而从48小时累积释放百分率来看，药脂比为0.2的替加环素脂质体的释放速率略小于药脂比为0.3的替加环素脂质体，其中，药脂比为0.2、内水相pH为5.5或7.5的替加环素脂质体的累积释放度分别为15.77％和14.63％；药脂比为0.3、内水相pH为5.5或7.5的替加环素脂质体的累积释放度分别为23.34％和24.76％。内水相pH对替加环素脂质体在模拟炎症部位pH的生理盐水中的释放无明显影响。

另外，调整空白脂质体内水相乳酸钙水溶液为700mM、800mM，pH值为4.0、4.5、7.0、8.0，在上述相同条件下按照0.2/0.3的投药药脂比(摩尔比)混合,制备的脂质体在模拟炎症部位pH的生理盐水中进行释放实验，经检测，均具备较好的体外缓释效果，且呈现二级释放行为。

实施例9替加环素脂质体在白蛋白生理盐水溶液中的释放速率

本实施例中使用的牛血清白蛋白(BSA)购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。

用白蛋白生理盐水溶液，将药脂比为0.2和0.3的不同内水相pH(pH为5.5或7.5)的替加环素脂质体稀释50倍，进行体外释放实验，具体过程参照实施例7。

体外释放实验具体过程如下：

步骤(1)：精密称取3.2005g BSA粉末，溶解于80mL生理盐水中，配制40mg/mL白蛋白生理盐水溶液(蛋白浓度与50％血浆中蛋白浓度相当)。

步骤(2)：取实施例2-3中以不同pH的醋酸钙水溶液(pH为5.5或7.5)为内水相制备的替加环素脂质体；其中，脂质浓度均为24.8mg/mL、药脂比(药物和脂质的摩尔比)为0.2或0.3。

步骤(3)：用40mg/mL白蛋白生理盐水溶液将脂质体稀释50倍，于37℃100rpm摇床(THZ-C恒温振荡器)中震荡。在不同的时间点(0小时、3小时、6小时、9小时、24小时、48小时)取500μL样品，加入适量HAP，充分振摇，吸附未包裹的替加环素。离心后取上清，以1:3的比例向上清中加入甲醇，涡旋30s，使白蛋白析出，离心后取上清，用UV法测定甲醇溶液中替加环素的含量，即破乳前脂质体中包封的替加环素的含量，计算不同时间点替加环素的累积释放速率。

各组替加环素脂质体的体外累积释放曲线如图6所示。结果表明，在白蛋白生理盐水中，以pH5.5或pH7.5的醋酸钙溶液为内水相的替加环素脂质体均具备较好的体外缓释效果。从24小时累积释放度来看，四组脂质体的释放速率无明显差异，均释放了5％左右。而从48小时累积释放百分率来看，药脂比为0.2的替加环素脂质体的释放速率略小于药脂比为0.3的替加环素脂质体，其中，药脂比为0.2、内水相pH为5.5或7.5的替加环素脂质体的累积释放度分别为5.78％和3.71％；药脂比为0.3、内水相pH为5.5或7.5的替加环素脂质体的累积释放度分别为15.45％和10.51％。内水相pH对替加环素脂质体在白蛋白生理盐水中的释放无明显影响。

实施例10替加环素脂质体的高分辨DSC表征

脂质体内水相中药物的存在形式，以及装载的药物对脂质排列的改变，会影响药物包封的稳定性及释放速率。为了考察脂质体内水相中，钙离子与替加环素的螯合物存在的状态，我们采用高分辨DSC研究了实施例2～3中所制备的替加环素脂质体的热力学行为。进行DSC表征的脂质体样品的投药药脂比分别为0.2和0.3，脂质浓度为24.8mg/mL，平均粒径为100nm且PDI小于0.1。

本实施例使用的差示扫描量热仪(DSC)为美国GE公司的毛细管DSC(CapillaryDSC)。扫描温度为10-120摄氏度，扫描速度为1摄氏度/分钟。

具体过程如下：

取实施例2-3中以pH5.5和7.5的醋酸钙溶液为内水相制备的替加环素脂质体，经0.22um微孔滤膜过滤后，取250μL样品手动加至毛细管DSC的样品池中，以10％蔗糖溶液作为对照，加热扫描并记录热力学图谱。按照文献方法(Wei,X.等,Insights intocomposition/structure/function relationships of

gained from"high-sensitivity"differential scanning calorimetry[J].Eur J Pharm Biopharm 2016,104,260-270)处理所得的热力学图谱并依据各脂质体中包封的替加环素的摩尔浓度计算热力学参数。结果如图7所示。各组替加环素脂质体的主要热力学参数如表8所示。

表8不同内水相pH及不同药脂比的替加环素脂质体的主要药动学参数

DSC实验结果表明，随着内水相中的替加环素浓度增加，内水相中替加环素的钙离子螯合物会逐渐形成稳定的、具有较高熔点的晶体结构。同时，晶体的形成还可能改变了脂质的排列。这种形式有利于药物的稳定装载，同时会导致脂质体出现二级动力学释放行为。结合实施例7～9的体外释放结果，以钙离子溶液作为内水相的替加环素脂质体具备良好的体外缓释效果，并呈现二级动力学释放行为。

实施例11替加环素脂质体对耐甲氧西林金黄葡萄球菌(MRSA)生物膜的体外药效

11.1替加环素脂质体作对MRSA生物膜的分散效果

本实施例中所用到的结晶紫染液购自北京索莱宝科技有限公司。

本实施例中选用ATCC43300作为实验菌株，培养耐甲氧西林金黄葡萄球菌(MRSA)生物膜，并采用结晶紫染色法检测替加环素和替加环素脂质体对生物膜的分散作用。

具体过程如下：

步骤(1)：将ATCC43300细菌单菌落接种于LB划线平板，用BHI脑心浸液肉汤培养，于37℃摇床中以220rpm的转速培养12h-16h，将细菌接种于96孔板中，加入适量葡萄糖溶液，37摄氏度下培养72h，用生理盐水洗去游离细菌。

步骤(2)：取2mg/mL替加环素水溶液，以及实施例3中以pH7.5的醋酸钙溶液为内水相、药脂比为0.1的替加环素脂质体，用培养基稀释至2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、64μg/mL，加至96孔板中，与MRSA生物膜共孵育24h。

步骤(3)：以生理盐水洗去游离细菌和样品溶液，加0.1％的结晶紫染液150μL，室温下染色10min，用去离子水洗去染液，重复两次，室温下干燥10min，每孔加150μL 95％乙醇充分溶解后(室温5min)，于570nm处测吸光度值。

游离替加环素与替加环素脂质体对MRSA生物膜的分散结果如图8所示，结果表明，2～64μg/mL浓度范围内的游离替加环素不能分散生物膜，而替加环素脂质体可以部分分散生物膜，但无明显量效关系。

11.2替加环素脂质体对MRSA生物膜内细菌的消除效果

本实施例中所用到的MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

本实施例中选用ATCC43300作为实验菌株，培养耐甲氧西林金黄葡萄球菌(MRSA)生物膜，并采用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测替加环素和替加环素脂质体对生物膜内细菌的消除效果。

具体过程如下：

步骤(1)：将ATCC43300细菌单菌落接种于LB划线平板，用BHI脑心浸液肉汤培养，于37℃摇床中以220rpm的转速培养12h-16h，将细菌接种于96孔板中，加入适量葡萄糖溶液，37摄氏度下培养72h，用生理盐水洗去游离细菌。

步骤(2)：取2mg/mL替加环素水溶液，以及实施例3中以pH 7.5的醋酸钙溶液为内水相、药脂比为0.1的替加环素脂质体，用培养基稀释至2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、64μg/mL，加至96孔板中，与MRSA生物膜共孵育24h。

步骤(3)：以生理盐水洗去游离细菌和样品溶液，每孔加入10μL MTT溶液，37摄氏度下继续孵育4小时。

步骤(4)：每孔加入100微升Formazan溶解液，适当混匀，37摄氏度下再继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解，在570nm测定吸光度。

游离替加环素与替加环素脂质体对MRSA生物膜内细菌的消除效果如图9所示，结果表明，2～64μg/mL浓度范围内的游离替加环素无法消除生物膜内细菌，而替加环素脂质体可以消除生物膜内的部分细菌，但无明显量效关系。推测可能是由于游离替加环素无法穿透葡萄糖诱导的MRSA生物膜，而脂质体能够部分穿透生物膜，并在生物膜内释放药物，进而抑制或消除生物膜内细菌。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种替加环素脂质体制剂，其特征在于，所述制剂中含有替加环素脂质体颗粒，所述脂质体颗粒包括载体，所述载体为具有双分子结构的脂质体膜，替加环素位于脂质体膜内；所述替加环素脂质体制剂还包括位于脂质体膜内的内水相和位于脂质体膜外的外水相，所述替加环素被包封于所述内水相中；所述脂质体膜内的内水相和膜外的外水相之间存在钙离子梯度；所述内水相选自醋酸钙水溶液、氯化钙水溶液或乳酸钙水溶液 中的任意一种，内水相的pH值为4.0~5.5、5.5~7.0、7.0~7.5或7.5~8.0；所述脂质体膜内的内水相中钙离子浓度为100mM~300mM、300 mM ~700 mM 、或700 mM ~800mM；所述替加环素脂质体制剂中所含替加环素的浓度为1.8-3.56 mg/mL或3.56-5.11mg/mL；所述替加环素制剂的药脂摩尔比为0.2。

2.根据权利要求1所述的替加环素脂质体制剂，其特征在于：所述脂质体颗粒的粒径范围是30nm~200nm；所述脂质体颗粒的粒度分布指数PDI小于等于0.1。

3.根据权利要求2所述的替加环素脂质体制剂，其特征在于：所述脂质体颗粒的粒径范围是50nm~120nm。

4.根据权利要求2所述的替加环素脂质体制剂，其特征在于：所述脂质体颗粒的粒径范围是70nm~90nm。

5.根据权利要求2所述的替加环素脂质体制剂，其特征在于：所述脂质体颗粒的粒径范围是79nm-84nm。

6.如权利要求1-5任意一项所述的替加环素脂质体制剂的制备方法，所述方法为主动载药的方法，包括以下步骤：

（1）提供内水相含有钙离子的空白脂质体；

（2）将替加环素水溶液与空白脂质体混合，搅拌，除去游离药物，加入外水相溶剂稀释。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述脂质体内水相的pH值为4.0~5.5、5.5~7.5或7.5~8.0。

8.如权利要求1-5任意一项所述的替加环素脂质体制剂用于制备抗菌药物的用途。

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