CN109678987A

CN109678987A - 一种硫化氢释放剂ha-adt、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN109678987A
Application number: CN201811466003.9A
Authority: CN
Inventors: 段少峰; 吴东栋; 董茜; 韩举国; 杨波; 余海兰; 姬新颖; 胡玉荣; 张梦梦; 张欣; 刘玮; 张师慧
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2038-12-03
Also published as: CN109678987B

Abstract

一种硫化氢释放剂HA‑ADT、其制备方法及应用，所述硫化氢释放剂HA‑ADT的结构式如下：，其中，p=4~6，q=16~22。通过酶联免疫吸附试验，检测上述细胞加药后在48h内细胞上清中H₂S浓度的变化及细胞加药24h时细胞中及上清液的H₂S的浓度。通过蛋白免疫印迹法、MTT法、EDU法、Tunel法检测发现，加入200µmol/L的HA‑ADT作用于人乳腺癌细胞MCF‑7和MDA‑MB‑231时，可促进细胞凋亡，抑制细胞生长；通过划痕、transwell法及invasion法检测时，HA‑ADT可抑制细胞迁移；通过裸鼠成瘤实验表明，HA‑ADT能够抑制人乳腺癌细胞的生长。

Description

一种硫化氢释放剂HA-ADT、其制备方法及应用

技术领域

本申请属于生物制药技术领域，具体涉及一种硫化氢释放剂HA-ADT，其制备方法及应用。

背景技术

乳腺癌(breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，在妇女仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要病因。近年来，乳腺癌的发病率及病死率不断升高，有统计数据显示，约九个女性中，平均至少有一个深受其害。全世界每年新诊断为乳腺癌的患者大约有 140 万，在中国其中约有 50 万人死于该病。因此，各国学者对乳腺癌的关注也日益密切。目前，化疗是乳腺癌综合治疗中的主要手段，然而化疗法不仅费用昂贵，且有很多副作用。因此，研发新低毒、价格低廉的潜在替代疗法以实现更有效的临床结果，同时降低治疗的发病率具有重要意义和科学价值。

透明质酸 (hyaluronic acid) 广泛存在于动物和人体的不同组织中,是一种天然的带负电的由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大分子链状黏多糖。因其高度亲水性、高粘弹性、生物可降解性、低致敏性、良好的生物相容性以及与细胞表面特异受体专一性结合的能力而可以作为药物载体。研究发现，HA的特异性受体CD44能在多种癌细胞表面表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌等。利用HA可以与其特异性受体结合这一特性，可将各种药物靶向递送至各病理部位，减少对正常细胞的毒副作用，提高药物的生物利用度及疗效，减少给药频率，降低不适应性。目前，HA及其衍生物已被用作各种抗癌药物、多肽和蛋白类药物的运送载体。

硫化氢（Hydrogen sulfide，H₂S）是一种具有臭鸡蛋气味的无色气体，被认为是继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后的第三种气体信号分子，广泛存在哺乳动物和非哺乳动物细胞的体外和体内。内源性硫化氢（H₂S）的合成至少有三种必须的酶参与：胱硫醚-β-裂解酶(CSE)、胱硫醚-γ-合成酶(CBS)及巯基丙酮酸转移酶（MPST)且这三种酶已在许多癌症中被发现，包括结肠癌，肝癌，乳腺癌等。在有关H₂S的早期研究中，通常以小分子硫化氢释放源作为H₂S供体来进行生物学研究，但是由于水溶解性差、体内循环时间短、缺乏靶向性等缺点，很难成为理想的H₂S供体。近年来，人们先后发现或合成了一些新的硫化氢供体，在体内环境，这些药物分子同时具备硫化氢的生物学作用和其母体药物本身的疗效从而达到更好的治疗效果。因此在本申请中，将水溶性透明质酸（HA）作为药物载体材料，通过化学反应制备H₂S供体药物，用人源性的乳腺癌细胞进行建造模型以及相关实验深入系统探究该化合物对肿瘤生长的调控作用及其分子机制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硫化氢释放剂HA-ADT，其制备方法及应用。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种硫化氢释放剂HA-ADT，其特征在于，结构式如下：

，其中，p=4~6，q=16~22。

上述硫化氢释放剂HA-ADT的制备方法，合成路线如下：

HA代表透明质酸，透明质酸的平均分子量为8000-10000（即n=20~28），p=4~6，q=16~22，且n=p+q；

合成步骤如下：

（1）将化合物1和硫磺在二甲基乙酰胺140~150℃加热反应至完全，冷却至室温，经后处理得到化合物2（简称ADT）；

（2）将盐酸吡啶和化合物2在氩气保护下210~220℃加热至熔融15~30min，冷却至100℃，加入70℃温水并趁热过滤，将滤饼先用碱洗，再溶于水中，用盐酸调pH为2，过滤，沉淀用水洗至中性，干燥，得化合物3（简称ADT-OH）；

（3）将透明质酸溶于体积比为1︰1的DMF / ddH₂O中，加入EDC·HCl和DMAP并将温度保持在0℃，1小时后，加入化合物3的DMF溶液，0℃反应30分钟，然后在室温下反应完全（约12h），将粗产物进行透析，将透析后的上清液通过0.45µm孔径的微孔膜过滤然后将产物先放到-60℃冷冻6小时，然后在20℃真空干燥24小时，即得目标化合物HA-ADT。

进一步地，所述步骤（1）中化合物1和硫磺的摩尔比为1︰7，所述后处理的具体过程如下：向反应后的溶液中加入水，然后用乙醚萃取，合并有机相依次用水和盐水洗涤，然后无水Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，然后用乙酸乙酯结晶，得到化合物2。

进一步地，所述步骤（2）中化合物2和盐酸吡啶的摩尔比为1︰6，所述碱洗是指用10wt% NaOH洗涤，所述盐酸为36~38wt%的浓盐酸。

进一步地，所述步骤（3）中透明质酸、EDC•HCl、DMAP和化合物3的摩尔比为3︰3︰1︰2，所述透析的具体过程如下：将反应后的粗产物用DMF透析5小时，然后用体积比为1︰1的水/ DMF透析10小时，用3.5kDA透析袋用水透析2天，将得到的上清液通过0.45µm孔径的微孔膜过滤。

上述化合物在制备抗人乳腺癌药物中的应用。

上述化合物在制备抑制人乳腺癌细胞增殖、生长或迁移药物中的应用上述化合物在制备抑制人乳腺癌细胞生长药物中的应用。上述化合物在制备促进人乳腺癌细胞凋亡或降低人乳腺癌细胞迁移能力或侵袭能力药物中的应用。

所述人乳腺癌细胞为人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231。

能有效抑制人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖、生长或迁移的HA-ADT浓度为200µmol/L或200 µg/kg。

本申请首先通过化学合成的方法将ADT接枝到HA上合成一种新型H₂S供体HA-ADT，通过体内外实验，证明该化合物具有良好的抗癌效果。

通过酶联免疫吸附试验（ELISA），检测上述细胞加药后在48h内细胞上清中H₂S浓度的变化及细胞加药24h时细胞中及上清液的H₂S的浓度。通过蛋白免疫印迹（Westernblot）法、MTT法、EDU法、Tunel法检测发现，加入200 µmol/L的HA-ADT作用于人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231时，可促进细胞凋亡，抑制细胞生长；通过划痕、transwell法及invasion法检测时，HA-ADT可抑制细胞迁移；通过裸鼠成瘤实验表明，HA-ADT能够抑制人乳腺癌细胞的生长。

附图说明

图1为HA-ADT的合成路线图；

图2为化合物2的¹H-NMR图谱；

图3为化合物3的¹H-NMR图谱；

图4为目标产物HA-ADT的¹H-NMR图谱；

图5为HA-ADT对人乳腺癌细胞生长的影响，其中图A-D为ELISA法检测给药24时人乳腺癌细胞内及上清中H₂S的浓度；图E-F为 ELISA法检测人乳腺癌细胞给药48h内上清液中H₂S浓度的变化；

图6为HA-ADT对人乳腺癌细胞增殖的影响，其中图A-B为EDU法检测时，HA-ADT对人乳腺癌细胞增殖的影响；图C为采用MTT法时HA-ADT对人乳腺癌细胞存活率的影响；

图7为HA-ADT对人乳腺癌细胞凋亡的影响，其中图A-B为Tunel法检测时，HA-ADT对人乳腺癌细胞凋亡的影响；图C-E为Western blot检测凋亡蛋白表达水平；

图8为HA-ADT对人乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响，其中图8中的A-B为划痕法检测时，HA-ADT对人乳腺癌细胞迁移的影响；图8中的C-D为transwell法检测时，HA-ADT对人乳腺癌细胞迁移的影响；图8中的E-F为invasion法检测时，HA-ADT对人乳腺癌细胞侵袭的影响；

图9为裸鼠成瘤实验时，HA-ADT对人乳腺癌细胞细胞生长的影响，图A为人乳腺癌细胞在裸鼠腋下注射后2周将肿瘤取出图；图B为2周内肿瘤体积变化趋势；图C为肿瘤的重量；图D为抑瘤率；图E为2周内裸鼠体重变化趋势；

图10为人乳腺癌细胞肿瘤组织染色结果，图A为肿瘤HE染色结果图；图B肿瘤为Ki67免疫组化染色结果图；图C为CD31免疫组化染色结果图；图D、E分别为Ki67、CD31染色结果统计图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，对本发明所用到的主要实验试剂及仪器设备简要介绍如下。

实施例1

HA-ADT的合成，首先通过茴香脑与硫磺在二甲基乙酰胺反应合成ADT；然后利用吡啶盐酸盐进行ADT脱甲基反应形成ADT-OH；最后在适量的EDC·HCl和DMAP下，将HA和ADT-OH反应，合成HA-ADT。

具体过程如下：

透明质酸购自山东福瑞达公司，无需进一步纯化即可使用。合成过程中所有其他试剂购自Sigma Chemical Co.（St.Louis，MO）或Aladin Chemical Reagent Inc. ofShanghai。在所有实验中使用蒸馏水。

（对甲氧基苯基）-3H-1,2-二硫杂环戊-3-硫酮（化合物2，ADT）的合成

将茴香脑（化合物1，8g，54mmol）和硫磺（96.93g，377.2mmol）在145℃下在二甲基乙酰胺（30 mL）中反应6小时；然后将混合物冷却至室温，加入100 mL H₂O，用乙醚（2×80 mL）萃取产物，合并的有机相用水（3×100 mL）和盐水（100 mL）洗涤。然后用Na₂SO₄干燥。减压除去溶剂，然后用乙酸乙酯结晶，得到所需化合物（图1），用¹H-NMR验证分子结构。

¹H-NMR (DMSO-d ₆, 300MHz)：δ=7.88 (d, J = 8.1 Hz, 2H, Ar-H), 7.77 (s,1H, =CH), 7.08 (d, J = 7.7 Hz, 2H, Ar-H), 3.86 (s, 3H，-OCH₃)。

（对羟基苯基）-3H-1,2-二硫杂环戊-3-硫酮（化合物3，ADT-OH）的合成

将盐酸吡啶（32.74g，283.28mmol）和ADT（化合物2，11.33g，47.21mmol）加入到干燥烧瓶中的中，混合，然后在氩气保护下215℃加热至熔融20分钟。冷却至100℃后，加入70℃温水（150mL）并趁热过滤。将滤饼置于烧杯中，并加入10wt%NaOH溶液（150mL）。将其搅拌4小时，过滤，将滤饼溶于水（1L）中，然后用36~38wt%浓盐酸将pH调节至2。过滤红色沉淀，用水洗涤至中性，然后在真空干燥器中干燥，得到化合物3（ADT-OH），所得分子的分子结构通过¹H-NMR测定。

¹H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz) :δ=10.53 (s, 1H,-OH), 7.78 (d, J = 8.8 Hz,2H, Ar-H), 7.71 (s, 1H, =CH), 6.91 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar-H)。

HA-ADT的合成

将透明质酸（HA，1.5g，分子量8~10kDa，以单体计，3.98mmol）溶于DMF / ddH₂O（1︰1，v/ v）中，形成均相溶液后，加入EDC·HCl（0.76g，3.96mmol）和DMAP（0.16g，1.33mmol）并将温度保持在0℃。1小时后，加入ADT-OH（0.6g，2.66mmol）的DMF溶液，反应在0℃下进行30分钟，然后在室温下进行反应12h。将粗产物用3.5kDA透析袋DMF透析5小时，然后用水/ DMF（1︰1，v / v）透析10小时，再用水透析2天。将上清液通过0.45µm孔径的微孔膜过滤然后将产物先放到-60℃冷冻6小时，然后在20℃真空干燥24小时，得到HA-ADT，产率为79%，通过¹H-NMR测定分子结构且接枝率为25%。

¹H-NMR (D₂O, 300 MHz) :δ=1.89 (s,NHCOCH₃ ), 1.0-4.4（m, HA-H）, 6.76( d,Ar-H),7.80(s, =CH),7.88（d, Ar-H）。

合成路线详见图1。

应用试验主要试剂、药品及样品：

乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231细胞购自中国科学院细胞库；

NaHS购于美国Sigma公司；

GYY4137购于美国Sigma公司；

MTT购于北京Solarbio公司；

细胞增殖检测试剂盒购自锐博生物科技有限公司；

细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；

Transwell小室购自Corning公司；

其余未说明试剂、药品等均为实验室常用分析纯类制品，不再赘述。

主要仪器设备：

荧光倒置显微镜（型号：ICES-3），购自Nikon公司。

实施例2

H₂S浓度检测

将人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231分为阴性对照组、阳性对照组NaHS组、阳性对照组GYY4137组、HA-ADT组，MCF-7细胞用10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，MDA-MB-231用10%的胎牛血清的DMEM(H)培养基培养，待细胞生长至对数生长期，各组更换相同体积不同药物的无血清培养基：阴性对照组加入生理盐水，阳性对照组NaHS组加入200 µmol/L NaHS（称取5.6mg的NaHS溶于5 mL的无血清的培养基后，再用培养基稀释100倍得200 µmol/LNaHS），阳性对照组GYY4137组加入200 µmol/L GYY4137（称取3.76mg的GYY4137溶于5 mL的无血清的培养基后，再用培养基稀释10倍得200 µmol/L GYY4137），HA-ADT组加入200 µmol/L HA-ADT（称取1.74mg的HA-ADT溶于5 mL的无血清的培养基后得200 µmol/L HA-ADT）。

分别提取阴性对照组、阳性对照组NaHS组、阳性对照组GYY4137组、HA-ADT组的总蛋白，对其浓度进行测定后， ELISA检测细胞中及细胞上清中H₂S的浓度；ELISA进一步检测细胞上清中给药48h内H₂S的浓度。

结果如图5所示，在不同药物刺激人乳腺细胞24 h后，HA-ADT组在MCF-7和MDA-MB-231细胞中H₂S的浓度分别高达274.76 nmol/L和248.57 nmol/L、在细胞上清中H₂S的浓度分别高达65nmol/L和52.67 nmol/L，远高于阳性对照组NaHS组、阳性对照组GYY4137组；图E-F表明，NaHS组释放的H₂S在约20分钟内迅速达到峰值并降至不可检测的水平。同时，HA-ADT组的H₂S释放明显要低但比GYY4137组释放的高，且持续存在，并且在48小时内释放相对稳定。上述结果表HA-ADT具有持续释放作用。

实施例3

为检测HA-ADT对人乳腺癌细胞增殖的影响，发明人做了进一步的检测实验，相关过程介绍如下。

（1）首先采用MTT法确定HA-ADT对肿瘤细胞生存的影响，具体过程如下：

收集对数期的细胞用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，用计数板进行计数后调整细胞浓度到所需的细胞数，以每孔 5×10³个/100 µL接种于 96孔板内，置于含体积分数 5% 的 CO₂培养箱中 37 ℃ 培养，待细胞贴壁后，加含药培养基100 µL/孔（其中阴性对照组加入生理盐水，阳性对照组NaHS组加入200 µmol/L NaHS，阳性对照组GYY4137组加入200 µmol/L GYY4137，HA-ADT组加入200 µmol/L HA-ADT。），每一组设3个复孔。继续培养24 h后，每孔加入 10 µL MTT，温育 4 h，吸出上清液，向每孔中加入 100 µL DMSO，室温下振摇，使用酶标仪490nm处测定各孔的吸光值（简称A值），根据吸光值计算细胞活力：

细胞活力（% of control）=（药物组A值-调零孔A值）/（对照孔A值-调零孔A值）×100%

实验结果如图6C所示，从图6C可以看出，HA-ADT作用于人乳腺癌细胞后，细胞生存率显著低于对照组的肿瘤细胞，可以认为HA-ADT降低肿瘤细胞的生存率。

（2）采用EDU法确定HA-ADT对肿瘤细胞增殖的影响，具体过程如下：

取对数生长期人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231，以每孔4000细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段，各组分别用生理盐水、200µmol/L NaHS、200µmol/L GYY4137和200µmol/L HA-ADT处理。每一组设3个复孔。

EdU标记（96孔板操作）：用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50 µM EdU培养基；每孔加入100 µL 50 µM EdU培养基孵育2 h，弃培养基；PBS清洗细胞2次，每次5min。

细胞固定：每孔加入50 µL 细胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）室温孵育30 min，弃固定液；每孔加入50 µL 2 mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5 min，弃甘氨酸溶液；每孔加入100 µL PBS，清洗1次，5 min，弃PBS；（加强）每孔加入100 µL渗透剂（0.5% Triton-X 100的PBS）脱色摇床孵育10 min，PBS清洗1次，5 min。

Apollo染色：每孔加入100 µL的1×Apollo染色反应液（一定要按顺序配，现用现配，30 min用完），避光，室温，脱色摇床孵育30 min，弃染色反应液；

Apollo染色反应液配制：1.5mL

加入100 µL渗透剂（0.5% Triton-X 100的PBS）脱色摇床清洗2次，每次10min，弃渗透剂；（加强）每孔每次加入100 µL甲醇清洗1-2次，每次5 min，PBS洗1次，每次5 min。

DNA染色：用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100 µL 1×Hoechst33342反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；每孔每次加入100 µL PBS洗3次，每次5 min；每孔加100 µL PBS保存，拍照，计数细胞增值率。

结果如图6A-B所示。在不同药物刺激人乳腺细胞24 h后，HA-ADT组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞存活率分别为19.55%和31.19%，增殖率分别为2.76%和4.30%，远低于阳性对照组NaHS组、阳性对照组GYY4137组的细胞存活率和增殖率，这表明HA-ADT可以抑制肿瘤细胞的生长。

实施例4

为检测HA-ADT对人乳腺癌细胞凋亡的影响，进行了TUNEL实验，相关过程介绍如下。

（1）采用TUNEL法确定HA-ADT对肿瘤细胞凋亡的影响，具体过程如下：

将细胞消化计数，铺至24孔培养板中，接种量为5×10⁴个/孔，每一组设3个复孔。于5%CO₂、37℃培养箱内孵育；

待细胞贴壁12小时后，各组分别用生理盐水、200µmol/L NaHS、200µmol/L GYY4137和200µmol/L HA-ADT处理24h。用PBS将细胞清洗1次；用4%多聚甲醛固定30min；PBS清洗1次；

加入含0.3%Triton-X 100的PBS，室温孵育5min；PBS洗2次，配750µL Tunel检测液：75µL TdT酶+675µL 荧光标记液；在样品上加50µL Tunel检测液，37℃避光孵育60min；PBS洗3次；

DAPI染色：5%BSA 1:1000稀释，3min；每孔加200µLPBS保存，荧光显微镜下观察，拍照，计数细胞凋亡率。

结果如图7A-B所示。在不同药物刺激人乳腺细胞24 h后，HA-ADT组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞凋亡率分别为8.13%和2.65%，远高于阳性对照组NaHS组、阳性对照组GYY4137组的细胞凋亡率，这表明HA-ADT可以促进肿瘤细胞的凋亡。

（2）凋亡蛋白水平的检测

分别消化计数人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231，铺至60 mm培养皿中，待细胞生长至对数生长期，各组更换无血清培养基，其中对照组加入生理盐水，阳性对照组NaHS组加入200µmol/L NaHS，阳性对照组GYY4137组加入200 µmol/LGYY4137，HA-ADT组在加入200 µmol/LHA-ADT，培养24 h后提取蛋白，Western Blot实验检测Bax、Bad、Bcl-2、Bcl-xl、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-9相关凋亡蛋白的表达情况。

Western Blot实验检测凋亡信号通路相关蛋白的表达情况，如图7C-E，结果表明HA-ADT会诱导人乳腺癌细胞凋亡蛋白水平的增加。

实施例5

为检测HA-ADT对肿瘤细胞迁移、侵袭的影响，发明人做了划痕、Transwell、Invasion检测实验，相关过程介绍如下。

（1）采用划痕法确定HA-ADT对肿瘤细胞迁移的影响，具体过程如下：

分别消化计数人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231，铺至6孔培养板中，接种量为5×10⁵个/孔，每孔加入3 mL的培养基，培养箱中37℃孵育；待细胞生长至对数生长期，进行划痕操作，划痕结束后用PBS洗3次，各组更换不同药物无血清培养基，其中对照组加入生理盐水，阳性对照组NaHS组在加入200 µmol/L NaHS，阳性对照组GYY4137组加入200 µmol/LGYY4137，HA-ADT组在加入200 µmol/L HA-ADT，0h、12h，24 h在100×镜下进行拍照。计算细胞迁移率：

细胞迁移率（%）=（划痕0 h的距离-划痕24 h的距离）/划痕0 h的距离×100%

（2）采用Transwell法确定HA-ADT对肿瘤细胞迁移的影响，具体过程如下：

将小室置于24孔板中，小室下层加入600 µL含20%血清的培养基，上层加入200 µL不含血清的培养基，每孔4×10⁴个细胞，37℃培养箱内孵育24 h；

取出培养板，弃去培养基，每孔加75%酒精固定15 min，PBS洗2次；

结晶紫染色10 min，自来水冲洗，将结晶紫洗去，用棉签将小室上层擦干净，用刀片轻轻刮下薄膜放于载玻片上，用中性树胶固定，100×镜下拍照。

（3）采用Invasion法确定HA-ADT对肿瘤细胞侵袭的影响，具体过程如下：

具体操作同（2），不同的是小室上有基质胶，每孔8×10⁴个细胞。

划痕迁移结果如图8A-B所示，在不同药物刺激人乳腺细胞24 h后，HA-ADT组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞迁移率分别为-2.55%和9.53%，与对照组相比，HA-ADT处理后的肿瘤细胞的迁移能力明显降低；迁移结果如图8C-D所示，在不同药物刺激人乳腺细胞24h后，HA-ADT组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞迁移个数分别为243和225，与对照组相比，HA-ADT处理后的肿瘤细胞的迁移能力明显降低；侵袭结果如图8E-F所示，在不同药物刺激人乳腺细胞24 h后，HA-ADT组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞侵袭个数分别为8和4，与对照组相比，HA-ADT处理后的肿瘤细胞侵袭能力明显降低，因此表明HA-ADT可以抑制人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231迁移和侵袭。

实施例6

为证明在体内HA-ADT能够抑制人乳腺癌细胞的生长，进行了裸鼠成瘤实验，相关过程介绍如下。

采用裸鼠成瘤实验确定HA-ADT体内抑制人乳腺癌细胞的生长，具体过程如下：

将细胞消化计数，用PBS重悬细胞配制成2.5×10⁷个/mL的细胞悬液，采用1 mL注射器取细胞悬液0.2 mL注射于裸鼠腋下；接种后24 h，分别将接种有人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的裸鼠按体重随机分为4组，每组6只：阴性对照组（生理盐水NS），阳性对照组NaHS组（200 µg/kg/d)，阳性对照组GYY4137组（200 µg/kg/d)，HA-ADT组（200 µg/kg/d)，各组均采用皮下注射，给药体积按照0.1 mL/10g进行，共给药14天，实验期间裸鼠自由进食和饮水。每日测量裸鼠体重及肿瘤的长(a)短(b)径，并按公式:体积= a × b²/2计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。裸鼠处死后，取出肿瘤并称重，按下列公式计算肿瘤生长抑制率，肿瘤生长抑制率(Inhibition rate, IR) = (1-给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%。裸鼠肿瘤体积增长曲线、肿瘤质量及各组药物抑瘤率见图9。

结果如图9所示，图9A为在人乳腺癌细胞在裸鼠腋下注射后2周将肿瘤取出图；图9B为14天内肿瘤体积变化，14天时，MCF-7细胞阴性对照组的肿瘤体积，NaHS组的肿瘤体积，GYY4137组的肿瘤体积和HA-ADT组的肿瘤体积分别为227.67mm²，189.73mm²， 124.31mm²和34.84 mm²；MDA-MB-231细胞阴性对照组的肿瘤体积，NaHS组的肿瘤体积，GYY4137组的肿瘤体积和HA-ADT组的肿瘤体积分别为1710.83mm²，1566.94mm²， 1091.58mm²和403.93 mm²，结果表明HA-ADT组肿瘤体积增速明显减慢；图9C为肿瘤取出后测得的瘤重，MCF-7细胞阴性对照组的肿瘤重量，NaHS组的肿瘤重量，GYY4137组的肿瘤重量和HA-ADT组的肿瘤重量分别为0.25g，0.21g，0.12g和0.03g；MDA-MB-231细胞阴性对照组的肿瘤重量，NaHS组的肿瘤重量，GYY4137组的肿瘤重量和HA-ADT组的肿瘤重量分别为0.97g，0.72g，0.48g和0.29g，结果表明HA-ADT组肿瘤重量明显减轻；图9D是根据瘤重统计得出的抑瘤率，给药2周后，HA-ADT组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的肿瘤抑制率分别为83.31%和69.76%，远高于阳性对照组NaHS组、阳性对照组GYY4137组的细胞的肿瘤抑制率，可见HA-ADT对肿瘤形成有明显抑制作用；图9E为2周内裸鼠体重变化，结果表明与对照组相比，HA-ADT对裸鼠体重无明显影响。

图10A-E为人乳腺癌细胞肿瘤组织HE、Ki67、CD31染色结果及统计图，HA-ADT组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的肿瘤增殖指数分别为9.35%和16.5%，远低于阳性对照组NaHS组、阳性对照组GYY4137组的细胞的肿瘤增殖指数，HA-ADT组的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的微血管密度分别为9.83和13.83，远低于阳性对照组NaHS组、阳性对照组GYY4137组的细胞的微血管密度，结果表明与对照组相比，HA-ADT组肿瘤生长能力明显减慢。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种硫化氢释放剂HA-ADT，其特征在于，结构式如下：

，其中，p=4~6，q=16~22。

2.根据权利要求1所述硫化氢释放剂HA-ADT的制备方法，其特征在于，合成路线如下：

HA代表透明质酸，透明质酸的平均分子量为8000-10000，p=4~6，q=16~22；

合成步骤如下：

（1）将化合物1和硫磺在二甲基乙酰胺140~150℃加热反应至完全，冷却至室温，经后处理得到化合物2；

（2）将盐酸吡啶和化合物2在氩气保护下210~220℃加热至熔融15~30min，冷却至100℃，加入水并趁热过滤，将滤饼先用碱洗，再溶于水中，用盐酸调pH为2，过滤，沉淀用水洗至中性，干燥，得化合物3；

（3）将透明质酸溶于DMF和ddH₂O组成的混合溶剂中，加入EDC·HCl和DMAP并将温度保持在0℃ 50~70min，加入化合物3的DMF溶液，0℃反应25~40分钟，室温反应完全，将粗产物进行透析，将透析后的上清液通过0.45µm孔径的微孔膜过滤并冷冻干燥，即得目标化合物HA-ADT。

3.权利要求2所述硫化氢释放剂HA-ADT的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中化合物1和硫磺的摩尔比为1︰7，所述后处理的具体过程如下：向反应后的溶液中加入水，然后用乙醚萃取，合并有机相依次用水和盐水洗涤，然后无水Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，然后用乙酸乙酯结晶，得到化合物2。

4. 权利要求2所述硫化氢释放剂HA-ADT的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中化合物2和盐酸吡啶的摩尔比为1︰6，所述碱洗是指用10wt% NaOH洗涤，所述盐酸为36~38wt%的浓盐酸。

5. 权利要求2所述硫化氢释放剂HA-ADT的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中透明质酸、EDC·HCl、DMAP和化合物3的摩尔比为3︰3︰1︰2，所述透析的具体过程如下：将反应后的粗产物用3.5kDA透析袋DMF透析，然后用体积比为1︰1的水/ DMF透析，用3.5kDA透析袋用水透析，将得到的上清液通过0.45µm孔径的微孔膜过滤。

6.权利要求1所述化合物在制备抗人乳腺癌药物中的应用。

7.根据权利要求6所述化合物在制备抑制人乳腺癌细胞增殖、生长或迁移药物中的应用。

8.根据权利要求6所述化合物在制备促进人乳腺癌细胞凋亡或降低人乳腺癌细胞迁移能力或侵袭能力药物中的应用。

9.根据权利要求6至8任一所述的应用，其特征在于，所述人乳腺癌细胞为人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231。

10. 根据权利要求6至8任一所述的应用，其特征在于，HA-ADT浓度为200µmol/L或200µg/kg。