CN108904518A

CN108904518A - 索拉菲尼联合金诺芬在制备治疗肝癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN108904518A
Application number: CN201811086917.2A
Authority: CN
Inventors: 唐霓; 汪凯; 张桂冀; 高庆祝; 郑亚秋
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2018-11-30

Abstract

本发明涉及索拉菲尼联合金诺芬在制备治疗肝癌的药物中的应用，通过将金诺芬与索拉菲尼联用，克服现有肝癌治疗药物和技术的缺陷与不足，能显著提高索拉菲尼对肝癌的疗效，为临床优化肝癌的治疗策略提供新的手段，具有很好的应用前景。

Description

索拉菲尼联合金诺芬在制备治疗肝癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及索拉菲尼联合金诺芬在制备治疗肝癌的药物中的应用。

背景技术

2017年中国癌症统计数据显示，肝癌发病率居我国癌症发病第三位，死亡率居我国癌症死亡第二位。肝炎病毒感染，非酒精性脂肪性肝病，酒精性肝病，黄曲霉毒素是公认的肝癌高危因素。目前肝癌的治疗方法主要包括手术切除、肝移植、局部消融、介入治疗、放疗、靶向治疗、免疫生物治疗等。肝癌的早期诊断较为困难，大部分病人就诊时已处于肝癌晚期，不适合手术治疗，只有不到30％的患者能够接受手术治疗或肝移植等治愈性疗法，且术后极易转移和复发，因此肝癌的治疗仍是一个医学难题。

随着精准医学时代的到来，肿瘤的靶向治疗越来越受到人们的重视，索拉菲尼的问世开辟了肝癌靶向治疗的新时代。索拉菲尼是由拜耳和ONYX公司共同研制的一种口服多靶点激酶抑制剂。2005年美国FDA批准索拉非尼上市，用于治疗晚期肾细胞癌。2007年FDA增加了索拉非尼的新适应证，用于治疗未能进行手术的肝细胞癌。索拉菲尼通过抑制RAS/RAF/MEK/ERK信号通路抑制肿瘤细胞增殖，还通过抑制几种酪氨酸激酶受体(VEGFR-2，VEGFR-3，PDGFR-β，C-KIT和FLT3)抑制肿瘤血管生成。目前索拉非尼仍然是晚期肝癌的标准一线治疗药物。

然而，索拉菲尼使病人获益有限，中位生存期约为3个月。因此，亟需发现新的肝癌治疗策略，提高索拉菲尼治疗疗效，提高病人的生存期和生活质量。

金诺芬是由Smith Kline&French公司研制的一类口服金制剂，因其显著的抗炎免疫属性，早在1985年就被FDA批准用于治疗类风湿性关节炎。后续研究发现，金诺芬具有治疗其他疾病的潜能，但是并无金诺芬用于肝癌治疗的报道。

临床上新药的发现、研发和注册是一个昂贵费时，且成功率较低的过程。而药物“再利用”是对药物新的治疗应用的认可，可以减少药物成本，有效缩短药物研发和审批时间，比新药研发更容易实现。索拉菲尼和金诺芬都是FDA已经批准的药物，因而可以更快地进入临床试验，具有重要的现实意义和开发优势。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供索拉菲尼联合金诺芬在制备治疗肝癌的药物中的应用，克服现有肝癌治疗药物和技术的缺陷与不足，通过提供金诺芬与索拉菲尼联合用药方案，可以显著提高索拉菲尼对肝癌的疗效，为临床优化肝癌的治疗策略提供新的手段，具有很好的应用前景。

索拉菲尼联合金诺芬在制备治疗肝癌的药物中的应用。

进一步，索拉菲尼联合金诺芬在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。

进一步，索拉菲尼联合金诺芬在制备抑制肝癌细胞克隆形成的药物中的应用。

进一步，索拉菲尼联合金诺芬在制备促进肝癌细胞凋亡的药物中的应用。

进一步，索拉菲尼联合金诺芬在制备抑制肝癌细胞转移的药物中的应用。

进一步，索拉菲尼联合金诺芬在制备促进肝癌细胞凋亡标志分子的应用。

进一步，所述细胞凋亡标志分子为Bax，Bcl2和caspase9中的一种或多种。

进一步，所述肝癌细胞为HepG2和MHCC-97H。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种治疗肝癌的联合用药新方案，即索拉菲尼和金诺芬联合用药方案。这种联合用药方案显示出了协同增效的结果，具有提高索拉菲尼单独用药抑制肝癌的效果，为肝癌的临床治疗提供了新的治疗思路和方案策略。

索拉菲尼和金诺芬联合用药有进一步提高索拉菲尼对肝癌患者的疗效及肝癌患者的生存获益的潜力，对于索拉菲尼单药治疗疗效有限的患者，可以考虑进行索拉菲尼和金诺芬联合用药治疗方案，以提高索拉菲尼的疗效，提高患者的生存质量和生存时间，该联合用药方案具有推向肝癌临床治疗的巨大开发潜力和应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为肝癌细胞HepG2和MHCC-97H对索拉菲尼(简称Sora)和金诺芬(简称Aura) 单药的药物敏感性。

图2中A图为肝癌细胞HepG2和MHCC-97H中索拉菲尼和金诺芬单药及联合用药的细胞生长增殖(MTS)分析；B图为肝癌细胞HepG2和MHCC-97H中索拉菲尼和金诺芬单药及联合用药的克隆形成分析。

图3为肝癌细胞MHCC-97H中，索拉菲尼或金诺芬单药，以及联合用药的细胞凋亡分析。

图4为联合用药方案对MHCC-97H细胞裸鼠皮下成瘤的治疗效应(A图为肿瘤生长的大体图；B图为裸鼠皮下种瘤生长曲线图；C图为剥取裸鼠皮下肿瘤并进行称重得到的瘤体重量； D图为裸鼠皮下肿瘤组织切片的Ki-67染色图；E图为裸鼠皮下肿瘤组织切片的TUNEL染色图； F图为裸鼠皮下肿瘤组织切片的ROS染色图)。

图5为联合用药方案对HepG2细胞裸鼠肝脏原位成瘤的治疗效应(A图为肝脏原位肿瘤的大体图；B图为计数各组肝脏肿瘤结节的数量；C图为肿瘤组织切片的Ki-67染色图；D图为肿瘤组织切片的ROS染色图；E图为肿瘤组织切片的TUNEL染色图)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、治疗肝癌的联合用药方案

1、药物敏感性

HepG2和MHCC-97H肝癌细胞分别接种96孔板，贴壁过夜后，配制一系列从高到低浓度的药物，并设置对照组，每个浓度设置3个复孔。在细胞培养箱中孵育48小时之后，用细胞动态检测仪(escolifesciences,CCL-170T-8)监测细胞的增殖情况，并绘制细胞生长曲线。HepG2 细胞中索拉菲尼(简称Sora)和金诺芬(简称Aura)药物治疗浓度分别为：5μM，0.4μM，MHCC-97H细胞中索拉菲尼和金诺芬药物治疗浓度分别是：7μM，0.6μM(如图1中A-B)。

2、细胞生长曲线

众所周知，金诺芬是硫氧还蛋白还原酶(TrxR)抑制剂，TrxR属于硫氧还蛋白(Trx)系统，该系统是细胞内两大还原系统之一。且Trx系统在肿瘤组织中高表达，因此开发Trx系统的抑制剂必然特异性靶向肿瘤组织，有望提高索拉菲尼的治疗疗效，具有潜在的临床应用前景。

我们分别建立了稳定敲减编码TrxR基因(TXNRD1)的HepG2细胞(HepG2-shTXNRD1)和MHCC-97H细胞(MHCC-97H-shTXNRD1)，将HepG2细胞分为四组：对照组、索拉菲尼单药组、shTXNRD1组以及索拉菲尼联合shTXNRD1组。MHCC97H细胞分为六组：对照组、索拉菲尼单药组、金诺芬单药组、shTXNRD1组、索拉菲尼联合shTXNRD1以及索拉菲尼联合金诺芬组，每组三个复孔。分别加入对应的培养基或者药物溶液。共孵育5天，期间每24 小时用细胞动态检测仪监测细胞增殖情况，并绘制细胞生长曲线。结果显示，HepG2细胞中，与对照组以及单药组相比较，索拉菲尼联合shTXNRD1组细胞生长速率最慢；在MHCC97H细胞中，与对照组、单药组、及shTXNRD1组相比较，索拉菲尼联合shTXNRD1、索拉菲尼联合金诺芬组细胞生长速率最慢(图2A)。因此，上述实验结果提示联合用药对肝癌细胞的增殖具有明显的协同抑制作用。

3、细胞克隆形成实验

将HepG2和MHCC-97H细胞接种6孔板，细胞贴壁后，将HepG2细胞分为四组：对照组、索拉菲尼单药组、shTXNRD1、及索拉菲尼联合shTXNRD1组。MHCC97H细胞分为六组：对照组、索拉菲尼单药组、金诺芬单药组、shTXNRD1组、索拉菲尼联合shTXNRD1以及索拉菲尼联合金诺芬组，分别加入对应的培养基或者药物溶液孵育14天，检测细胞平板克隆形成情况，结果如图2B所示。结果显示，与对照组以及单药组相比较，索拉菲尼联合shTXNRD1 组对HepG2细胞克隆形成具有明显的抑制作用；在MHCC97H细胞中，与对照组、单药组、及 shTXNRD1组相比较，索拉菲尼联合shTXNRD1、及索拉菲尼联合金诺芬组对细胞克隆形成具有明显的协同抑制作用。克隆形成实验结果表明：联合用药组细胞克隆数量最少，体积最小。

4、细胞凋亡分析

(1)细胞凋亡情况

将MHCC-97H细胞接种于6cm培养皿，贴壁后细胞分为六组：对照组、索拉菲尼单药组、金诺芬单药组、shTXNRD1组、索拉菲尼联合shTXNRD1、及索拉菲尼联合金诺芬组，每组三个复孔。分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育48小时，收集细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果如图3A所示。结果显示，与对照组、单药组或shTXNRD1组相比较，索拉菲尼联合shTXNRD1、及索拉菲尼联合金诺芬组对细胞凋亡具有明显的协同促进作用，联合用药组细胞凋亡比例最多。

(2)细胞凋亡相关分子表达情况

将MHCC-97H肝癌细胞接种于6cm培养皿，贴壁后细胞分为六组：对照组、索拉菲尼单药组、金诺芬单药组、shTXNRD1组、索拉菲尼联合shTXNRD1、及索拉菲尼联合金诺芬组，每组三个复孔。分别加入对应的培养基或者药物溶液，孵育48小时，然后收集各组细胞，提取细胞蛋白，Western Blot方法检测细胞凋亡标志性分子Bax，Bcl2，Caspase9的表达情况，结果如图3中B所示。结果显示，与对照组或单药治疗组相比较，索拉菲尼联合shTXNRD1、索拉菲尼联合金诺芬组明显促进了细胞凋亡，Bax和剪切形式的Caspase9明显增加。

5、联合用药方案在肝癌细胞裸鼠成瘤模型中的治疗效应

MHCC97H细胞皮下接种裸鼠构建肝癌皮下成瘤模型，待模型构建成功，瘤体体积为40mm³之后，将小鼠随机分为六组，对照组、索拉菲尼单药组、金诺芬单药组、shTXNRD1 组、索拉菲尼联合shTXNRD1以及索拉菲尼联合金诺芬组，索拉菲尼采用腹腔内注射给药，剂量为40mg/kg/day；金诺芬采用腹腔内注射给药，剂量10mg/kg/day；共给药14天。每天测量肿瘤大小。

肝癌皮下成瘤结果显示(如图4中A-F)，与对照组、单药组、及shTXNRD1组相比较，索拉菲尼联合shTXNRD1、及索拉菲尼联合金诺芬组对肿瘤生长具有明显的抑制作用。联合用药组肿瘤生长速度最慢，最终剥取的肿瘤体积最小。Ki-67染色结果显示，Ki-67染色阳性细胞明显减少和染色强度明显降低。通过检测ROS发现联合用药组ROS明显升高，TUNEL进行凋亡染色的结果显示联合用药组凋亡肿瘤细胞明显增加。

以HepG2细胞作为对照细胞，将构建的shTXNRD1稳定细胞系通过肝脏原位接种，建立裸鼠肝癌原位成瘤模型。模型构建成功4周后，将小鼠随机分为4组：对照组、索拉菲尼单药组、shTXNRD1组、索拉菲尼联合shTXNRD1组，进行给药处理，索拉菲尼腹腔内注射给药，剂量为40mg/kg/day，共给药21天。

肝癌原位成瘤结果显示(如图5中A-E)，与对照组及单药组相比较，索拉菲尼联合shTXNRD1组对肿瘤生长具有明显的抑制作用，索拉菲尼联合shTXNRD1组肿瘤结节明显减少。Ki-67染色结果显示，索拉菲尼联合shTXNRD1组Ki-67染色阳性细胞明显减少和染色强度明显降低，TUNEL进行凋亡染色的结果显示索拉菲尼联合shTXNRD1组肿瘤细胞凋亡明显增加，ROS染色结果发现索拉菲尼联合shTXNRD1组细胞内ROS明显升高。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.索拉菲尼联合金诺芬在制备治疗肝癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：索拉菲尼联合金诺芬在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：索拉菲尼联合金诺芬在制备抑制肝癌细胞克隆形成的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：索拉菲尼联合金诺芬在制备促进肝癌细胞凋亡的药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：索拉菲尼联合金诺芬在制备促进细胞凋亡标志分子的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：索拉菲尼联合金诺芬在制备抑制肝癌细胞转移的药物中的应用。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细胞凋亡标志分子为Bax，Bcl2和caspase9中的一种或多种。

8.根据权利要求2～4任一项所述的应用，其特征在于：所述肝癌细胞为HepG2和MHCC-97H。